KR20160025116A - 미녹시딜 수용액 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아포지단백질, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도 지단백질 및 미녹시딜을 물에 첨가하여 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미녹시딜을 아포지단백질, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합한 재조합 고밀도 지단백질로 제형화 할 경우, 수용액에서 고농도의 미녹시딜의 용해도가 향상되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 미녹시딜 수용액은 기존의 유기용매에 용해시켜 제품화하였던 기존의 미녹시딜 발모제의 피부 부작용을 감소시키고 탈모증 치료에 보다 효과적인 약학조성물로 이용될 수 있다.

Description

미녹시딜 수용액 제조방법{Preparation method of minoxidil solution}

본 발명은 재조합 고밀도 지단백질을 이용하여 고농도의 미녹시딜 용해도를 향상시킨 미녹시딜 수용액 제조방법에 관한 것이다.

인체의 모발은 약 10만 내지 15만 개 정도로 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며, 성장기, 퇴행기 및 휴지기를 거쳐 성장 및 탈락하게 된다. 이러한 주기는 3년 내지 6년에 걸쳐 반복되므로, 일일 평균 50 내지 100개의 모발이 정상적으로 탁락하게 된다. 일반적으로 탈모증은 이러한 주기 중 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 많아져 비정상적으로 모발이 탈락하는 숫자가 많아지는 것을 의미한다.

이러한 탈모증은 크게 대머리라 불리는 남성형 탈보증과 면역시스템 불균형 등에 의해 발생하는 원형 탈모증의 두 가지로 나뉘며, 그 탈모의 원인은 아직까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 두피 내 혈액순환 불량, 남성 호르몬의 과잉작용, 피지분비 과잉, 유전, 노화, 스트레스 등에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 기존에는 중, 장년 남성들만의 문제로 치부되는 경향이 있었으나, 최근에는 환경 오염과 과도한 스트레스 등의 이유로 여성 및 젊은 층의 탈모가 증가하고 있는 추세이다.

탈모증의 치료와 예방에 있어서, 현재까지는 미국 식품의약품안정청(FDA)의 승인을 받은 제제로 외용제로 사용되는 미녹시딜과 경구제로 사용되는 피나스테리드가 있다.

미녹시딜은 1979년 경구용 고혈압 치료제로서 미국 식품의약품안정청(FDA)에 승인을 받은 이후 고혈압 치료제로서의 임상시험 부작용으로 다모증이 관찰됨에 따라 발모제로 개발되어 사용되고 있다. 그러나, 미녹시딜은 모근 내의 혈류를 증가시킴으로써 발모 효력을 나타내는 약물로 피부에 지속적으로 저류하지 않을 경우에는 효과가 만족스럽지 못하며, 동시에 전신 혈류로의 흡수에 의해 피부 자극성 등의 부작용을 일으킬 수 있다는 단점을 가지고 있다.

주로 외용제로 사용되는 미녹시딜은 활성 성분이 매질 중에 용해되지 않고 단지 현탁되어 있는 현탁액 형제의 국소제제로 사용되고 있는데, 이러한 국소제제의 사용은 활성 성분인 미녹시딜이 충분한 양으로 체내 흡수되지 못하고 생체 이용율이 떨어져 미녹시딜의 치료 효과를 충분히 발현할 수 없다.

또한 미녹시딜은 수용액에 잘 녹지 않아 유기용매에 녹여 판매하고 있는데, 유기용매는 피부에 비교적 큰 자극을 나타내어 피부의 염증 유발과 같은 부작용을 일으킬 수 있다.

한국공개특허 제10-2009-0088275호

상기 전술한 바와 같이, 본 발명은 미녹시딜의 낮은 수용액 용해도를 증가시켜 기존 유기용매를 이용한 미녹시딜 제제에 의한 피부 부작용을 감소시키고, 고농도의 미녹시딜 제제를 제공하여 발모효과를 향상시킬 수 있는 미녹시딜 수용액을 제공하고자 한다.

본 발명은 아포지단백질, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도 지단백질 및 미녹시딜을 물에 첨가하여 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고농도 미녹시딜 수용액 제조방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 고밀도 지단백질 0.1 내지 10 중량부, 미녹시딜 1 내지 200 중량부, 물 0.1 내지 10 중량부 및 소듐 콜레이트 0.2 내지 20 중량부를 유효성분으로 포함하는 미녹시딜 약물 제제를 제공한다.

또한 본 발명에 따른 고농도 미녹시딜 약물 제제를 유효성분으로 함유하는 발모촉진용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 미녹시딜을 아포지단백질, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합한 재조합 고밀도 지단백질로 제형화 할 경우, 수용액에서 고농도의 미녹시딜의 용해도가 향상되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 미녹시딜 수용액은 기존의 유기용매에 용해시켜 제품화하였던 기존의 미녹시딜 발모제의 피부 부작용을 감소시키고 탈모증 치료에 보다 효과적인 약학조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 수용액상에서 미녹시딜의 용해 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 재조합 고밀도 지단백질의 미녹시딜 포집화 특성을 확인한 SDS-PAGE 사진이다.
도 3은 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)의 항산화 활성을 확인한 아가로스 겔 전기영동 결과이다.
도 4는 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)에 의한 세포 노화 및 독성을 확인한 SA-β-gal 염색 결과이다.
도 5는 절단된 제브라피쉬 꼬리 지느러미에서 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)의 조직재생 효과 확인한 결과이다.

본 발명은 아포지단백질, 인지질 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및 상기 재조합 고밀도 지단백질 및 미녹시딜을 물에 첨가하여 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법을 제공한다.

상기 재조합 고밀도 지단백질은 재조합 고밀도 지단백질 총 100 중량부에 대하여, 아포지단백질 0.1 내지 10 중량부, 인지질 1 내지 100 중량부 및 콜레스테롤 0.01 내지 0.5 중량부로 포함할 수 있다.

본 발명의 아포지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K 및 아포지단백질A-I(apoA-I)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 아포지단백질 변이체 V156K일 수 있다. 상세하게는 아포지단백질 변이체 V156K는 아포지단백질A-I(apoA-I)의 156번 위치의 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체일 수 있다.

또한 본 발명의 상기 미녹시딜 수용액은 수용액 총 100 중량부에 대하여, 재조합 고밀도 지단백질 1 내지 100 중량부, 미녹시딜 500 내지 1000 중량부 및 물 0.1 내지 10 중량부를 포함할 수 있으며, 상세하게는 상기 미녹시딜 수용액은 소듐 콜레이트 0.2 내지 20 중량부를 더 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 재조합 고밀도 지단백질 1 중량부, 미녹시딜 10 중량부 및 물 1 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한 본 발명은 재조합 고밀도 지단백질 0.1 내지 10 중량부, 미녹시딜 1 내지 200 중량부, 물 0.1 내지 10 중량부 및 소듐 콜레이트 0.2 내지 20 중량부를 유효성분으로 포함하는 미녹시딜 약물 제제를 제공할 수 있으며, 상기 미녹시딜 약물 제제를 유효성분으로 함유하는 발모촉진용 약학조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 에탄올 유기용매에 용해된 미녹시딜과 본 발명에 따른 미녹시딜 수용액을 피부섬유아세포에 투여하고 24 내지 72시간 동안 배양한 결과, 도 4와 같이 에탄올 유기용매에 용해된 미녹시딜을 투여한 세포군에서는 세포노화가 심각하게 진행되었으며, 세포의 수가 현저하게 감소한 반면, 본 발명의 미녹시딜 수용액을 투여한 세포군에서는 세포 노화가 나타나지 않았으며, 세포 수의 증가가 확인되었다. 또한 꼬리 지느러미를 절단하여 조직 손상을 유도한 제브라피쉬 동물 모델에 본 발명의 미녹시딜 수용액을 처리한 결과, 도 5와 같이 우수한 꼬리 재생효과가 확인됨에 따라, 본 발명에 따른 미녹시딜 수용액은 피부에 안전하고 효과적인 발모촉진 약학조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 미녹시딜 0.05 mg/day 내지 10.0 mg/day의 양을 일일 1회 내지 일일 수회 분복 투여할 수 있다.　

또한, 이러한 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물을 구성하는 미녹시딜은 이미 다른 의학적 용도에 처방되고 있어 안전성이 확보되어 있는 물질이다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 미녹시딜 용해를 위한 재조합 고밀도 지단백질 ( rHDL ) 제조

미녹시딜의 수용액상 용해도를 증가시키기 위해, 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)인 아포지단백-리포솜을 제조하였다.

인지질인 DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 또는 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)에 야생형 아포지단백질A-I(WT apoA-I), 혈청 아포지단백질A-I(plasma apoA-I) 또는 V156K-아포지단백질A-I을 1:0.01 또는 2:0.01의 중량비로 혼합한 후, 혼합된 단백질에 콜레스테롤을 1:0.07 중량비로 첨가하여 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)인 아포지단백-리포솜을 제조하였다.

< 실시예 2> 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)인 아포지단백 -리포솜을 이용한 미녹시딜 용해도 확인

상기 실시예 1과 같은 방법으로 제조된 아포지단백-리포솜 1 mg/mL과 5 내지 15 mg/mL의 미녹시딜을 물 1 mL에 용해시켜 미녹시딜 용해도를 확인하였다.

그 결과, apoA-I 10 mg이 포함된 재조합 고밀도 지단백질(rHDL) 1 mL당 미녹시딜 10 mg을 용해시킬 경우, 미녹시딜의 용해도가 가장 높게 나타났다.

상기 결과로부터 아포지단백-리포솜은 최대 10 mg/mL 미녹시딜까지 용해시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 1과 같이 10 mg/mL의 미녹시딜을 증류수에 첨가하고 소디움 콜레이트 2 mg/mL과 재조합 고밀도 지단백질인 혈청 아포지단백질A-I(WT apoA-I)-리포솜 또는 V156K-아포지단백질A-I 리포솜을 1 mg/mL씩 첨가한 후 미녹시딜의 용해도를 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 미녹시딜을 증류수에 첨가한 경우, 미녹시딜이 용해되지않고 불투명한 수용액상태로 확인되었으며, 소디움 콜레이트 만을 첨가한 대조군의 경우 미녹시딜이 완전히 용해되지 않고, 미녹시딜 침전물이 확인되었다. 반면, 소디움 콜레이트를 첨가하고 혈청 아포지단백질A-I(WT apoA-I)-리포솜 또는 V156K-아포지단백질A-I 리포솜을 첨가한 실험군에서는 미녹시딜이 수용액상에서 완전히 용해되어 투명한 상태를 나타내었으며, V156K-아포지단백질A-I 리포솜 및 혈청 아포지단백질A-I(WT apoA-I)-리포솜의 용해도를 비교해 볼 때, V156K-아포지단백질A-I 리포솜의 수용액상 미녹시딜 용해도가 V156K-아포지단백질A-I 리포솜보다 높게 확인되었다.

상기 결과로부터 아포지단백-리포솜을 이용하여 미녹시딜을 수용액상에서 용해시킬 경우, 기존의 물 용매에서 2 mg/mL의 용해도를 나타냈던 미녹시딜이 수용액상에서 10 mg/mL까지 용해되어 5배 이상 증가된 용해 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 3> 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질 ( rHDL ) 특성 확인

8-25% 폴리아크릴아마이드 구배 겔 전기영동을 이용하여 선행문헌(J Lipid Res, 46: 589-596, 2005)에 따라 입자 분포를 확인하여 표준 구형 단백질과 비교 분석하였다.

그 결과, 도 2와 같이 미녹시딜을 함유한 V156K-아포지단백-리포솜의 주 밴드는 약 109, 122, 137 Å의 다양한 입자크기를 나타내며, 미녹시딜을 함유하지 않은 V156K 보다 증가하는 경향을 보였다. 그러나, 혈청 아포지단백 A-I(Plasma apoA-I)을 사용하여 합성한 아포지단백-리포솜의 경우, 99Å의 입자크기를 나타낸 반면, 미녹시딜을 함유한 혈청 아포지단백 A-I 리포좀(미녹시딜-apoA-I)은 약간 작은 크기로 나타났다.

상기 결과로부터 V156K-아포지단백A-I 리포솜은 미녹시딜을 포집하고 캡슐화할 수 있는 능력이 혈청 아포지단백 A-I(plasma apoA-I) 리포솜보다 뛰어난 것으로 확인되었다.

< 실시예 4> 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)의 항산화 활성 확인

구리-매개 LDL 산화에 대한 미녹시딜을 함유한 아포지단백-리포솜의 항산화활성을 확인하기 위해, 2.6 mM 미녹시딜 및 2μM의 혈청 아포지단백A-I 또는 V156K-아포지단백A-I를 포함하는 재조합 고밀도 지단백질인 혈청 아포지단백 A-I 리포솜 및 V156K-아포지단백A-I 리포솜에 10μM CuSO₄ 존재하에 300㎍ LDL를 각각 처리하고 4 내지 16 시간 동안 반응시킨 후 LDL 산화 정도를 확인하기 위해, 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 3과 같이 각각의 미녹시딜-아포지단백A-I 리포솜이 처리된 LDL은 느린 이동성을 나타내어 우수한 항산화 효과를 나타내었으며, 미녹시딜을 단독으로 처리한 경우보다 재조합 고밀도 지단백질(rHDL) 형태로 처리한 경우 항산화활성이 농도의존적으로 증가하였다. 특히, 미녹시딜을 함유한 V156K-아포지단백A-I rHDL의 항산화 효과가 혈청 아포지단백 A-I rHDL보다 우수하게 나타났다.

< 실시예 5> 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)의 세포독성 확인

유기용매인 에탄올 1 mL에 미노시딜 2 mg를 용해시켰으며, 본 발명의 혈청 아포지단백A-I 리포솜 1 mg/mL 및 V156K-아포지단백A-I 리포솜 1 mg/mL에 미녹시딜을 각각 10 mg씩 첨가하여 용해시켰다.

상기 미녹시딜이 용해된 유기용매(EtOH-minoxydil) 1 mg, 혈장 아포지단백A-I 리포솜 1 mg 및 V156K-아포지단백A-I 리포솜1 mg를 각각 2×10⁶ 피부섬유아세포에 투여하여 24 내지 72시간 동안 배양하고 SA-β-gal 염색을 수행하여 세포노화 및 독성을 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 미녹시딜이 용해된 에탄올 유기용매(EtOH-minoxydil)를 투여한 세포군에서는 세포노화가 심각하게 진행되었으며, 세포 수가 현저하게 감소하였다. 반면, 미녹시딜이 포함된 혈청 아포지단백A-I rHDL 및 V156K-아포지단백A-I rHDL을 처리한 세포군에서는 세포노화가 확인되지 않았으며, 생존 세포의 수도 증가하였다. 특히, 미녹시딜이 포함된 V156K-아포지단백A-I rHDL을 처리한 세포군에서 세포노화가 매우 감소하였으며, 가장 많은 세포 생존율을 나타내었다.

< 실시예 6> 미녹시딜을 함유한 재조합 고밀도 지단백질(rHDL)의 조직재생 효과 확인

제브라피쉬 꼬리 지느러미를 절단하여 조직 손상을 유도한 후 미녹시딜 제제의 조직재생 유도 효과를 확인하였다.

한 그룹당 4마리의 꼬리 지느러미가 절단된 제브라피쉬에 미녹시딜 10μg을 각각의 PBS, 혈청 아포지단백A-I rHDL, 야생형 아포지단백A-I rHDL 및 V156K-아포지단백A-I rHDL 10μL에 첨가하여 용해시킨 각각의 미녹시딜 제제를 48시간 마다 총 3회 꼬리 근육에 주사하여, 0-120 시간동안 재생 유도 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 5와 같이 PBS에 용해된 미녹시딜을 처리한 실험군 보다 혈청 아포지단백A-I rHDL(pA-I-minocxydil-rHDL) 및 V156K-아포지단백A-I rHDL(V156K-minocxydil-rHDL)이 처리된 실험군의 제브라피쉬에서 우수한 꼬리 재생 효과가 확인되었으며, 특히, V156K-아포지단백A-I rHDL(V156K-minocxydil-rHDL)은 PBS에 용해된 미녹시딜 보다 약 2배 정도 증가된 조직 재생효과를 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 인지질, 아포지단백질 및 콜레스테롤을 혼합하여 재조합 고밀도 지단백질을 제조하는 단계; 및
   상기 재조합 고밀도 지단백질 및 미녹시딜을 물에 첨가하여 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 고밀도 지단백질은 재조합 고밀도 지단백질 총 100 중량부에 대하여, 아포지단백질 0.1 내지 10 중량부, 인지질 1 내지 100 중량부 및 콜레스테롤 0.01 내지 0.5 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 아포지단백질은 아포지단백질 변이체 V156K 및 아포지단백질A-I(apoA-I)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 아포지단백질 변이체 V156K는 아포지단백질A-I(apoA-I)의 156번 위치의 아미노산이 라이신으로 치환된 아포지단백질 변이체인 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 미녹시딜 수용액은 수용액 총 100 중량부에 대하여, 재조합 고밀도 지단백질 1 내지 100 중량부, 미녹시딜 500 내지 1000 중량부 및 물 0.1 내지 10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
6. 청구항 1 또는 청구항 5에 있어서, 상기 미녹시딜 수용액은 소듐 콜레이트 0.2 내지 20 중량부로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미녹시딜 수용액 제조방법.
7. 재조합 고밀도 지단백질 0.1 내지 10 중량부, 미녹시딜 1 내지 200 중량부, 물 0.1 내지 10 중량부 및 소듐 콜레이트 0.2 내지 20 중량부를 유효성분으로 포함하는 미녹시딜 약물 제제.
8. 청구항 7의 미녹시딜 약물 제제를 유효성분으로 함유하는 발모촉진용 약학조성물.
   
   
   
   
   
   

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