KR20160014315A

KR20160014315A - 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160014315A
Application number: KR1020140096381A
Authority: KR
Inventors: 김윤수; 조철진
Original assignee: 김윤수
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2016-02-11

Abstract

본 발명은 호두 및 밤의 복합 발효추출물을 활성성분으로 함유하는 80 ~ 110nm의 입경을 갖는 나노에멀젼 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 천연물의 발효추출물을 활성성분으로 하기 때문에 피부에 대하여 안전하면서도 피부 친화성과 흡수력이 우수하고 또 장기 안정성도 뛰어나므로 피부의 노화방지 및 주름개선에 대하여 매우 우수한 효과를 나타내며, 또한 입도 조정이 용이하고 경피흡수력이 우수한 나노 에멀젼 방식을 적용하여 피부타입별 적용이 가능하며, 보다 소량의 미용성분을 사용함으로써 피부 트러블 발생 요인을 최소화할 수 있는 특징이 있다.

Description

호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition having anti-wrinkle effect containing Nano emulsion of Walnuts and Chestnuts Fermented extract}

본 발명은 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 호두 및 밤의 혼합물로부터 얻어진 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피부의 주름 및 노화현상은 피부의 수분 함유량, 콜라겐의 함유량, 외부 환경에 대한 면역 작용 능력 등 여러 가지 요소들에 의해 생성되는 것으로 알려져 있으며, 이러한 피부의 주름 및 노화는 현대인은 물론 고령화 사회의 고민 중의 하나로써 주름 및 탈모 등을 완화 및 회복시키기 위한 탈모방지제, 항노화제의 수요가 확대되고 있다.

화장품 분야에서도 이러한 수요자의 요구에 부응하여 화장품도 먹는 화장품, 기능성 화장품(cosmeceutical) 등의 개념이 도입하면서 단순한 미용의 개념에서 진화해 노화예방과 질병치료의 영역으로 확대되어 천연물 내지 생약재의 추출물을 이용한 기능성 화장품에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.

천연물 내지 생약재의 추출물을 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물에 관한 선행기술은 다양하게 알려지고 있으며, 특히 호두, 밤과 관련한 화장료의 선행기술로 예를 들면 국내 등록특허공보 등록번호 10-1334274호에는 호박 추출물과 밤 추출물을 유효성분으로 함유하는 각질 박리 촉진용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

또한 화장품 분야에서는 화장품의 유효성분의 경피흡수를 최적화하고 효능 및 효과의 극대화를 위하여 피부간극 사이로 침투할 수 있도록 리포좀 형태의 소립자를 구성하는 나노사이즈의 나노베지클(nanovesicles)에 대한 개발에도 많은 연구가 진행되고 있으며, 이와 관련되는 선행기술로 예를 들면, 국내 등록특허공보 등록번호 10-490365호에 아보카도 추출물, 퓨미토리 추출물, 당근추출물, 목단피 추출물, 갈근 추출물, 스톤루트 추출물, 레이디스 호스테일 추출물, 레이디맨틸 추출물, 호스테일 추출물, 콩배아 추출물, 밀배아 추출물, 라디쉬 추출물, 참다시마 추출물, 오이풀 추출물, 계피 추출물, 생강 추출물, 산마황 추출물, 허브 추출물, 비타민 F 및 사과씨 추출물로 이루어진 유용성, 수용성 활성물질군에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 0.01~20중량%, 레시친 0.1~10.0중량%, 트리글리세라이드 및 폴리소르베이트 60을 각각 0.1~10중량% 함유하며, 평균입경 100nm~150nm인 화장료용 나노베지클을 함유하는 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 국내 공개특허공보 공개번호 10-2011-76068호에는자기유화형 나노 리포좀 및 다중층 액정을 포함하고, 상기 다중층 액정의 중앙 내부와, 액정층들 사이에 상기 나노 리포좀이 위치하는 것인 자기유화형 나노 리포좀/다중층 액정 함유 베지클을 개시하고 있다.

본 발명은 견과류인 호두, 밤에 함유된 불포화 지방산 및 천연비타민을 유효하게 추출하고, 이들의 복합 발효추출물이 항산화활성과 피부의 광노화와 관련한 효과가 보다 우수한 효과를 나타내는 것을 확인함과 동시에 유효성분을 함유하는 경피흡수 촉진형 나노 베지클을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 견과류인 호두 및 밤의 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유한 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물의 제공을 목적으로 하는 것이며, 보다 구체적으로는 호두 및 밤으로부터 추출된 발효추출물을 콜레스테롤 및 인지질 등을 사용하여 안정화시킨 피부 친화성과 흡수력이 우수한 타겟 지향형 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물의 제공을 목적으로 하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 해결수단으로서, 호두 및 밤 복합 발효추출물의나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물은 화장료 총중량에 대하여 호두 및 밤의 복합 발효추출물 1 ~ 20중량%, 콜레스테롤 1 ~ 3중량%, 레시친 1 ~ 5중량%, 및 포타슘 세틸 포스페이트(Potassium Cetyl Phosphate) 0.1 ~ 1중량%를 함유하고, 80 ~ 110nm의 입경을 갖는 나노 에멀젼을 함유하는 것을 특징으로 하는 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 것으로 이루어진다.

상기한 호두(walnut)는 가래나무과의 낙엽교목인 호두나무(Juglans sinensis)의 열매로서 맛은 달고 영양가가 높다. 특히, 단백질의 함량이 육류보다 많으며, 지질은 불포화지방산이 많고 혈청 콜레스테롤의 저하작용이 있는 필수지방산이 많아 콜레스테롤이 혈관에 불필요하게 부착하는 것을 예방해 준다고 알려져 있으며, 또한 무기질과 비타민B1이 풍부해서 피부 및 머리카락에 윤이 나게 하며, 노화방지에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

또 밤(Chestnut)은 참나무과의 밤나무(Castanea crenata Siebold & Zucc) 열매로서, 구황식량으로 사용될 정도로 많은 영양소를 가지고 있으며, 과실에는 전분, 탄수화물, 지방, 무기질, 비타민, 리파제가 함유되어 있고 최근 생리활성물질로 각광을 받고 있는 폴리페놀 화합물인 폴리페놀성 탄닌이 많이 함유되어 있어 노화방지, 질병예방, 피로회복, 성인병에 유용한 효과를 나타내며, 특히 카테킨이 함유되어 있어 노화와 암 발병에 관련 있는 자유 라디칼 소거 작용으로 폐암 등의 발생을 현저히 감소시키는 것으로 알려져 있다.

상기 본 발명에 따른 호두 및 밤 복합 발효추출물은 호두와 밤의 혼합물을 에탄올 등 유기용매로 추출한 추출물에 영지버섯 균사체(Ganoderma lucidum)을 접종하고, 25℃, pH 7의 조건에서 7일간 발효시켜 얻어지는 발효산물로부터 영지버섯 균사체를 분리하는 것에 의해 발효추출물을 제조하는 것으로 이루어지며, 상기 호두와 밤의 혼합물에 있어서 호두에 대하여 밤의 혼합비율은 중량비로 1: 2 ~ 2.5의 비율로 혼합 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물은 유화보조제 및 분산보조제로 솔비탄 모노 스테아레이트, PEG-5 Rapeseed Sterol, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린이 사용되며, 또 마카다미아오일(Macadamia oil), 대략 8 ~ 10개의 탄소를 지닌 중성지방(MCT; Medium chain triglyceride), shea butter 등의 오일, 지방 및 왁스 등이 추가로 조성되는 것으로 이루어진다.

상기 본 발명의 나노 에멀젼의 제조과정은 하이드로게네이티드 레시친와 포타슘 세틸 포스페이트, 유화보조제, 글리콜류의 분산 보조제로 이루어진 수상부와, 콜레스테롤과 유화제 및 마카데미아오일 및 쉐어버터로 이루어진 유상부를 각각 80℃로 가온상태에서 분산 혼합하여 1차적으로 유화시킨 거대 라멜라를 형성한 다음, 여기에 호두 및 밤 복합 발효추출물을 서서히 투입하면서 1000 ~ 1,500기압으로 강한 전단력(shear)을 가하는 고압유화기기(Microfluidizer, U.S.Patent 4533254)에 통과시켜 나노 리포좀을 형성시키는 것으로 이루어진다.

상기 고압유화기기 처리과정에서 가해지는 압력이 1,000기압 이하에서는 계에 주는 전단력(shear)이 약하여 입자가 크게 되어 장기 안정성이 좋지 않으므로, 입자의 크기를 80 ~ 110nm의 수준까지 작게하기 위해서는 1,000 ~ 1,500 기압 범위로 가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유한 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라 제조되며, 예를 들면, 약학적 또는 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 화장수, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 바디오일, 로션에 적용될 수 있으며, 부형제는 약학적 또는 피부학적으로 허용 가능한 피부연화제, 피부침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농후제, 용매를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 80 ~ 110nm의 입경을 갖는 나노 에멀젼 화장료 조성물은 천연물의 발효추출물을 활성성분으로 사용하기 때문에 피부에 대하여 안전하면서도 피부 친화성과 흡수력이 우수하고 또 장기 안정성도 뛰어나므로 피부의 노화방지 및 주름개선에 대하여 매우 우수한 효과를 나타낸다.

또한 입도 조정이 용이하고 경피흡수력이 우수한 나노 에멀젼 방식을 적용하여 피부타입별 적용이 가능하며, 보다 소량의 미용성분을 사용함으로써 피부 트러블 발생 요인을 최소화할 수 있는 특징이 있다.

도 1은 본 발명의 복합 발효추출물에 대한 분석 그래프.
도 2는 본 발명에 따른 DPPH assay 시험결과에 대한 도표.
도 3은 본 발명에 따른 NBT assay 시험결과에 대한 도표.
도 4는 본 발명에 따른 콜라겐 생성 촉진 시험결과에 대한 도표.
도 5는 본 발명에 따른 MMP-1 발현 저해 실험결과에 대한 도표.

이하에서는 실시예 및 시험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하기로 하겠으나, 본 발명은 하기에서 설명하는 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1>

a). 호두 및 밤의 혼합물로부터 추출물의 제조

세절하여 음건한 호두 및 밤(혼합비율 중량비로 3:7)을 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 3시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하여 분리한 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 추출물을 얻었다.

b). 호두 및 밤 복합 발효추출물의 제조

상기에서 수득한 호두 및 밤의 추출물과 효모-맥아즙(0.3~1.0% (w/v))이 혼합된 배지에 영지버섯 균사체 5%(v/v)를 접종한 후 발효조 내에서 온도 25℃, 회전수 150rpm, 통기량 1.5vm, pH 7.0의 조건으로 6일간 배양하고, 배양 후 배양액으로부터 영지버섯 균사체를 제거하여 복합 발효추출물을 제조하였다.

상기 영지버섯 균사체는 포테이토덱스트로오즈 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4℃에 보관하고, 1개월마다 계대배양하여 사용하였다.

<시험예 1> 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정

상기 <실시예 1>에서 수득한 생물전환 된 복합 발효추출물 내의 유효성분을 확인하기 위하여 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정하고, 그 결과를 아래 [표 1]에 나타내고 [도 1]로 첨부하였다

a). 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 상기 <실시예 1>에서 제조한 발효 추출물(시료) 1㎖에 증류수 10㎖를 첨가한 후, 2㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent를 첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시키고, 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2㎖ 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 반응시킨 후 725nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며. 이때 지표물질은 탄닌산(tannic acid)을 사용하였다.

b). 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 상기 <실시예 1>에서 제조한 발효 추출물(시료) 0.5㎖에 10% aluminum nitrate 0.1㎖, 1M potassium acetate 0.1㎖, 에탄올 4.3㎖씩 넣고 혼합한 다음, 상온에서 40분간 반응시킨 후 415nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며, 이때 지표물질은 퀘르세틴(quercetin)을 사용하였다.

시료	총 폴리페놀함량 (㎍/㎖)	총 플라보노이드 함량 (㎍/㎖)
추출물 (Before Biotransformation)	585	107.7
복합 발효추출물 (After Biotransformation)	1021	589.4

상기 [표 1]에 나타난 바와 같이 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 생물전환 전의 호두 및 밤의 추출물에 비하여, 생물전환 후의 호두 및 밤의 복합 발효추출물이 각각 1.75배 및 5.5배 정도로 증가되는 것을 알 수가 있다.

<실시예 2> 내지 <실시예 4>나노 에멀젼 베이스의 제조

아래 [표 2]에 나타낸 바와 같은 조성비에 의해 80㎚, 90㎚ 및 110㎚ 입자크기의 나노 에멀젼 베이스를 제조하였다.

a) 80㎚, 90㎚입자의 나노에멀젼

먼저, 아래 [표 2]에 나타낸 A, B, C 및 상을 별도로 계량하여 준비한 다음, B상과 C상을 별도의 용기에서 80℃로 가온하면서 균질하게 분산시킨 후, 가온된 B상에 A상을 혼합하고 균일하게 분산시키다.

상기 B, A상의 균질한 분산액에 2000rpm(HOMO mixer)의 조건으로 가온된 C상을 서서히 투입하고, 투입이 완료되면 3500rpm(HOMO mixer)의 조건으로 5분간 유화시킨다.

상기 유화액을 HOMO 2000rpm(HOMO mixer)의 조건으로 재차 조정한 후 C상을 서서히 투입하고, 2분간 분산시키 후 MF 2000bar조건으로 2회 처리하여 나노에멀젼 제조하였다.

b). 110㎚입자의 나노 에멀젼

MF 2000bar조건으로 2회 처리단계를 MF 800bar조건으로 하는 것을 제외하고는 상기 80㎚, 90㎚입자의 나노에멀젼과 동일한 제조과정에 따라 나노에멀젼 제조하였다.

원료명	배합비(중량%)			상구분
원료명	실시예2(80㎚)	실시예3(90㎚)	실시예4(110㎚)	상구분
하이드로제네이티드레시틴	3.00	3.00	3.00	A상
에탄올	5.00	5.00	-	A상
포타슘세틸포스페이트	0.60	0.60	0.60	B상
EDTA-2Na(이온봉쇄제)	0.02	0.02	0.02
글리세린(보습제)	10.0	7.50	10.0
1,3-부틸렌그리콜(보습제)	5.00	5.00	5.00
Phenoxyethanol	0.60	0.60	0.60
DI-Water(정제수)	25.28	27.78	20.28
Cholesterol NF	2.00	2,00	2.00	C상
소르비탄스테아레이트	0.50	0.50	0.50
피이지-5레이프씨드스테롤	3.00	3.00	3.00
Macadamia Oil(오일성분)	5.00	5.00	5.00
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 (컨디셔닝제, 오일)	10.00	10.00	10.00
Shea Butter(컨디셔닝제)	-	-	5.00
호두·밤 복합 발효추출물	30.00	30.00	30.00	D상
합 계	100	100	100

<시험예 2> 나노 에멀젼의 안정성 시험

상기 <실시예 2>에서 제조한 80㎚ 입자의 나노 에멀젼에 대하여 안정성 시험을 위하여 나노 에멀젼을 제조한 후 25℃에서 1일간 숙성시킨 다음, 5℃, 25℃ 및 40℃ 조건에서 상분리, 향취, 색상 침전여부 등에 대한 성상변화 및 pH 변화 등을 관찰하고 그 결과를 아래 [표 3]에 나타내었다.

보관조건	시험항목	시험주기
보관조건	시험항목	1주	2주	1개월	2개월	3개월
5℃	성상	Good	G	G	G	G
5℃	pH	6.28	6.27	6.27	6.28	6.27
25℃	성상	G	G	G	G	G
25℃	pH	-	-	-	-	-
40℃	성상	G	G	G	G	G
40℃	pH	6.28	6.27	6.28	6.28	6.28

상기 [표 3]에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 나노에멀젼은 3개월의 기간경과에도 상분리, 향취, 색상 침전여부 등에 따른 성상의 변화가 없는 것을 확인할 수 있었으며, <실시예 3> 및 <실시예 4>에서 제조한 90㎚, 110㎚ 입자의 나노에멀젼에 대해서도 상기 <시험예 2>와 같은 동일한 방법으로 안정성 시험을 하였으나 그의 동일한 결과를 얻었다.

<시험예 3> 노화방지 및 주름개선에 대한 평가시험

상기 <실시예 1>에서 제조한 본 발명에 따른 호두 및 밤 복합 발효추출물을 이용하여 아래와 같이 주름개선에 대한 시험으로 항산화 효과(DPPH assay, NBT assay) 및 콜라겐 생성 촉진 및 MMP-1 발현 저해능에 관하여 평가시험을 아래와 같이 실험하였다.

1).항산화 효과 평가시험

a). Free radical scavenging activity(DPPH assay)

세포막의 지질과산화의 초기 반응의 억제 정도를 평가하기 위한 것으로서 inhibitor가 안정한 라디칼인 DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다.

96well plate에 A, B를 아래 [표 4]와 같이 넣고 빛에 노출되지 않게 하여 10분간 혼합하고, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH assay 결과를 아래 [계산식 1](음성대조군에 대비하여 계산)을 이용하여 계산하고, 그 결과를 [도 2]로 나타내었다.

	Materil	Ctrl	Blank of C	Exp.	Blank of E
A	DDPH용액	180ul	MeOH180UL	180ul	MeOH180UL
B	Sample(용매)	용매 20ul	용매 20ul	20ul	20ul

[계산식1]

저해율(%)={(Ctrl-Blank of C)-(Exp.-Blank of E)}/(Ctrl-Blank of C)X100

[도 2]에 나타난 바와 같이 세가지 샘플 모두 농도 의존적으로 자유라디칼 소거 효과를 나타내었고, 다른 샘플에 비해 호두추출물(B) 1.0%의 농도에서 최대 84%의 라디칼 소거능을 갖는 것을 확인할 수 있으며, Positive control로 BHA를 사용하였고 12.5 ug/ml에서 약 56% 소거율을 나타낸 것으로 실험의 신뢰성을 확인하였다.

b). Superoxide radical scavenging activity (NBT assay)

xanthine oxidase가 xanthine과 반응하여 uric acid로 전환되고 이때 생성되는 O^-2를 소거거하는 활성을 평가하는 것으로, inhibitor가 소거하지 못한 활성 산소를 nitroblue tetrazolium이 반응, diformazan으로 전환되는 정도를 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정한다.

96well plate에 A ~ E를 아래 [표 5]과 같이 넣고 5분간 혼합한다. F를 아래 [표 5]과 같이 넣고 5분간 혼합한 후 38℃에서 15분간 배양하고, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

NBT assay 결과를 아래 [계산식 2](음성대조군에 대비하여 계산)을 이용하여 계산하고, 그 결과를 [도 3]으로 나타내었다.

	Materil	Ctrl	Blank of C	Exp.	Blank of E
A	Buffer	85ul	115ul	85ul	115ul
B	Sample(용매)	용매 20ul	용매 20ul	20ul	20ul
C	NTB	30ul	30ul	30ul	30ul
D	Substrate	20ul	20ul	20ul	20ul
E	Na₂-EDTA	15ul	15ul	15ul	15ul
F	Enzyme	30ul	-	30ul	-

[계산식2]

저해율(%)={(Ctrl-Blank of C)-(Exp.-Blank of E)}/(Ctrl-Blank of C)X100

[도 3]은 밤 발효추출물(A), 호두 발효추출물(B), 호두 및 밤 복합 발효추출물(C)의 활성산소(SOD) 소거효과를 나타낸 결과로써, 상기 3가지 샘플 모두 농도의존적으로 활성산소(SOD) 소거 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있으며, Positive control로 사용한 BHA 25 ug/ml에서 약 52% 소거율을 나타내었는데, 이 보다 다른 3가지 발효추출물이 항산화능이 더 뛰어남을 알 수 있었다.

2). 콜라겐 생성 촉진 평가시험

사람정상피부아세포(HDF)를 PBS로 세척한 후 트립신을 이용해 배양접시에서 떼어낸다. 이를 hematocytometer를 이용하여 카운팅하고 24well plate에 1× 10⁵cells/well로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨다. 시료는 세포 독성 실험을 통해 100% 생존률을 나타내는 농도로 처리하며, 37℃에서 약 48시간 동안 CO₂배양기에서 배양한다. 각 well에서 배양액을 취하여 procollagen type I C-peptide(PIP) EIA kit(Takara) 로 콜라겐 합성량을 측정하고, 그 결과(총 콜라겐 생성량 = Exp./Ctr1 x 100)를 [도 4]로 나타내었다.

[도 4]에 나타난 바와 같이 밤 발효추출물(A), 호두 및 밤 복합 발효혼합물(C)은 평가한 농도에서 유의한 효과가 나타나지 않았으나 호두 발효추출물(B)은 0.125%에서 대조군의 약110% 효능을 나타내었다.

3). MMP-1 발현 저해능 평가시험

Matrix methaloprotease-1(MMP-1, collagenase) 저해 활성을 가진 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 원료에 대한 MMP 저해활성을 측정하여 활성을 갖는 원료는 주름을 개선하고 탄력있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가 할 수가 있다.

시험과정은 사람정상피부아세포(HDF)를 PBS로 세척한 후 트립신을 이용해 배양접시에서 떼어낸다. 이를 hematocytometer를 이용하여 카운팅하고 24 well plate에 1× 10⁵cells/well로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨다. 세포에 UVA를 4.2J 조사하고, 세포 독성 실험을 통해 100% 생존률을 나타내는 농도로 시료를 처리하여, 시료에 의한 영향만을 확인하기 위해서 FBS가 첨가되지 않은 배지를 이용하여 37℃에서 약 24시간 동안 CO₂배양기에서 배양한다. 양성 대조군으로는 비타민C를 처리한다.

배양한 섬유아세포의 배양 상등액을 이용하여 Amersham 콜라게나제 Human, Biotrak ELISA system(GE healthcare, RPN 2610)로 MMP-1저해량을 측정한다. Stop solution(1N NaOH)은 100ul을 첨가한다.

아래 [계산식 3](음성대조군에 대비하여 계산)에 따라 MMP-1 발현 저해 평가 실험 결과를 [도 5]로 나타내었다

[계산식3]

MMP-1 발현 저해능(%) = (Ctrl - Exp.) / Ctrl X 100

[도 5]에 나타난 바와 같이 밤 발효추출물(A), 호두 발효추출물(B), 호두 및 밤 발효추출물(C)을 단위 단백질 당 콜라겐으로 정량한 결과 유의성 있게 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하여 주름의 생성촉진을 억제함으로써 주름개선의 효력이 있는 것으로 평가되었다. 특히, 호두 및 밤 복합 발효추출물(C)에서 유의하지 않지만 MMP-1 발현 억제능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<제형예 1> 크림

아래 [표 6]에 나타낸 A-1성분, A-2성분, B-1성분, B-2성분 및 C성분을 별도로 계량하여 준비한 한다.

A-1성분을 용기에 투입하고, 80℃로 가열 용해한 후, A-2성분을 투입하고 Stand H/M을 이용하여 30분간 분산시키면서 혼합한다(A상).

별도의 용기에 B-1성분을 투입하고 80℃로 가열하면서 용해시킨 후, 완전히 유화되기 전에 B-2성분을 투입하고 균일하게 교반한다(B상).

상기 A상에 B상을 투입하고 HOMO MIXER로 3000rpm 조건에서 5분간 유화시킨 다음, 50℃로 냉각한다. 여기에 크림제형의 피부보호 특성을 고려하여 실시예3에서 제조한 90nm 에멀젼 베이스인 C성분을 서서히 투입하면서 균일하게 분산시킨 후 30℃로 냉각하면서 탈포하여 화장품(크림)을 제조한다.

원료명	함량 (중량%)	비고
디소듐이디티에이	0.01	A-1성분
메칠파라벤	0.20
디포타슘글리시리제이트	0.05
부틸렌글라이콜	3.00
글리세린/워터/소듐폴리아크릴레이트/피브이엠엠에이코폴리머	10.0
벤조페논-5	0.05
정제수	28.94
산탄검	0.10	A-2성분
정제수	10.0	A-2성분
부틸파라벤	0.10	B-1성분
프로필파라벤	0.10
하이브리드선플라워시드오일	5.00
C12-C15알코올스벤조에이트	4.00
하이드로제네이티드폴리데센	5.50
사이클로펜타실록산	13.0
토코페릴아세테이트	0.05
밀납	1.20
세테아릴올리베이트/소르비탄올리베이트	1.00
글리세릴스테아레이트/피이지-100스테아레이트	1.80
소르비탄스테아레이트	1.00
디이에이-세틸포스페이트	1.00
친유형글리세릴스테아레이트	0.50
피이지-20글리세릴스테아레이트	0.90
올레쓰-10-포스페이트	0.20
스테아릭애씨드	1.50
세틸알코올	0.50
옥틸메톡시신나메이트	0.10	B-2성분
부틸메톡시디벤조일메탄	0.05
트리에탄올아민	0.15
복합 발효추출물 에멀젼(실시예3의 90nm에멀젼 베이스)	10.0	C성분
합계	100

<제형예 2> 로션

아래 [표 7]에 나타낸 A-1성분, A-2성분, A-3성분, B-1성분, B-2성분 및 C성분을 별도로 계량하여 준비한 한다.

A-1을 용기에 투입하고, 80℃로 가열 용해하고, 별도의 용기에 A-2성분 및 A-3성분을 각각 투입하고, Stand H/M을 이용하여 30분간 분산시키면서 각각의 혼합용액을 조제한 다음, A-1성분, A-2성분 및 A-3성분을 유화조에 투입하고, 균일한게 분산시킨다(A상).

또 별도의 용기에 B-1성분을 투입하고 80℃로 가열하면서 용해시킨 후, 완전히 유화되기 전에 B-2성분을 투입하고 균일하게 교반한다(B상).

상기 유화조의 A상에 B상을 투입하고 HOMO MIXER로 3000rpm 조건에서 5분간 유화시킨 다음, 50℃로 냉각한다. 여기에 로션제형의 피부흡수 특성을 고려하여 피부 흡수율이 우수한 실시예2에서 제조한 80nm 에멀젼 베이스인 C성분을 서서히 투입하면서 균일하게 분산시킨 후 30℃로 냉각하면서 탈포하여 화장품(로션)을 제조한다.

원료명	함량 (중량%)	비고
디소듐이디티에이	0.05	A-1성분
디포타슘글리시리제이트	0.05
메칠파라벤	0.05
프로필렌글라이콜	2.00
베타인	1.00
탈크	0.30
디이에이-세틸포스페이트	0.90
정제수	36.94
산탄검	0.08	A-2성분
정제수	10.0	A-2성분
카보머	0.08	A-3성분
정제수	10	A-3성분
부틸파라벤	0.05	B-1성분
프로필파라벤	0.05
하이드로제네이티드디데센	4.00
사이클로펜타실록산	8.00
호호바오일	0.05
세틸옥타노에이트	0.50
토코페릴아세테이트	0.20
친유형글리세릴스테아레이트	0.60
올레쓰-10-포스페이트	0.20
소르비탄스테아레이트	1.30
글리세릴스테아레이트/피이지-100-스테이레이트	1.00
폴리소르베이트60	0.40
소르비탄세스퀴올리에이트	0.60
세틸알코올	0.30
스테아릭애씨드	0.50
옥틸메톡시신나메이트	0.10	B-2성분
부틸메톡시디벤조일메탄	0.05
트리에탄올아민	0.2
복합 발효추출물 에멀젼(실시예2의 80nm에멀젼 베이스)	20.0	C성분
합계	100

상기 본 발명 <제형예 1> 및 <제형예 2>는 이해를 돕기 위한 예시한 것이며, 본 발명이 상기 제형예에 국한되는 것은 아니다.

Claims

화장료 총중량에 대하여 호두 및 밤의 복합 발효추출물 1 ~ 20중량%, 콜레스테롤 1 ~ 3중량%, 레시친 1 ~ 5중량%, 및 포타슘 세틸 포스페이트(Potassium Cetyl Phosphate) 0.1 ~ 1중량%를 함유하고, 80 ~ 110nm의 입경을 갖는 나노 에멀젼을 함유하는 것을 특징으로 하는 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물.
청구항1에 있어서, 호두 및 밤의 복합 발효추출물은 호두와 밤의 혼합물을 유기용매로 추출한 추출물에 영지버섯 균사체(Ganoderma lucidum)을 접종하고, 25℃, pH 7의 조건에서 7일간 발효시켜 얻어지는 발효산물로부터 영지버섯 균사체를 분리하는 것에 의해 발효추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항2에 있어서, 호두 및 밤의 혼합물은 호두에 대한 밤의 혼합비율이 중량비로 1 : 2 ~ 2.5인 것을 특징으로 하는 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물.
청구항3에 있어서, 화장료 조성물은 유연화장수(스킨), 수렴화장수, 영양화장수(로션), 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 겔, 팩, 파우더, 피부외용연고 중 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 호두 및 밤 복합 발효추출물의 나노 에멀젼을 함유하는 피부의 노화방지 및 주름개선용 화장료 조성물.