KR20160008200A - 암의 치료―후 처치 및／또는 치료를 위한 주스 및 생선 오일을 포함하는 조성물의 용도 - Google Patents
암의 치료―후 처치 및／또는 치료를 위한 주스 및 생선 오일을 포함하는 조성물의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암의 치료 후 처치 및 치료에 사용되기 위한 수중유적형 에멀젼인 생선 오일 및 주스를 포함하는 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 암의 치료-후 처치 및 치료에의 이용을 위한 수중유적형 에멀젼 내 주스 및 생선 오일을 포함하는 조성물을 제공한다.
심혈관(cardiovascular) 질환들 및 암 발생률들이 알라스카 및 그린랜드의 에스키모들에게서 일반적으로 낮다는 관찰로부터 생선 오일(oil)의 잠재적 이득이 알려졌다. 이들 인구들은 생선이 풍부하고 탄수화물들이 적은 식단을 갖는데, 이는 유럽 및 북미의 식습관과 대조적이다.
생선 오일은 긴 사슬 오메가(omega)-3 고도불포화(polyunsaturated) 지방산들(fatty acids) (PUFA)의 가장 풍부한 식이성 공급원(source)이다. 지방산들은 식이지방들의 구성요소들이며, 주로 트리글리세라이드들(triglycerides)의 형태로 저장된다. 그러나 신체는 이들 지방산들을 생산할 수 없으며, 그것들은 음식원 또는 보충제들(supplements)로부터 얻어야 한다. 이들 지방산들은 오메가-3 패밀리를 포함한다(compose): 알파(alpha)-리놀렌산(linolenic acid) (ALA), 아이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid) (EPA) 및 도코사헥사노익산(docosahexanoic acid) (DHA). ALA는 예컨대, 월넛들, 콩들의 몇몇 타입들 및 올리브 오일들에서 발견된다. EPA 및 DHA는 보충제들 및 생선 오일을 포함하는, 생선에서 발견된다.
오메가-3 지방산들은 심지어 출생 전인, 인생의 임의의 단계에 필수적이다. 그것들은 신체의 모든 세포의 멤브레인의 필수 구성요소이고, 그것들의 존재는 적절한 세포 멤브레인을 유지하는데 필요하다. 그것들은 또한 대부분의 생물학적 기능들의 조절에 기여한다. 특히 EPA 및 DHA인, 긴 사슬 n-3 고도불포화 PUFA의, 또는 생선의 소비는 서양인들에게서 심혈관 질환에 대하여 보호한다는 상당한 역학(epidemiological) 증거가 있다. 긴 사슬 n-3 PUFA 는 공복(fasting) 혈장(plasma) 트라이아실글리세롤(triacylglycerol) 농도를 낮추고 식후(postprandial) 지방혈증(lipaemic) 반응을 감소시킨다. 생선 오일은 또한 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 혈전증(thrombosis)의 치료에 결정적인 역할을 하는, 항염증 및 응집억제(antiaggregatory) 효과들을 제공한다.
비록 다른 질병들의 치료에 오메가-3가 이용되어 왔을 때 확실한 결과들이 제시되어 왔을지라도, 암 치료에서 생선 오일 또는 오메가-3에 관련된 매우 한정된 데이터들이 이용가능하다. 지금까지 결과들은 애매한 것으로 보인다.
그러나 미국(American) 암(Cancer) 학회(Society)는 생선 오일 및 암과 관련된 유망한 결과들이 제시되어 왔으며, 이들 발견들은 추가의 연구들을 할 만 하다는 것을 선언한다.
한 연구에서, 발암물질(carcinogen)-유도된 암 모델은, 저지방 식이 또는 높은 옥수수 기름(oil corn) 식이들을 먹인 동물들에 비하여, 동물 연구들에서 생선 오일의 높은 섭취가 암 발생률을 낮추었다는 것을 보였다(Welsch, CW. Cancer Res., 52:2040s-2048s, 1992).
Gleissman H., et al, (Experimental Cell Research 316 (2010) 1365-1373)에 의한 리뷰 논문에서, 종래의 화학요법들(chemotherapeutics)은, 그것들이 암 세포들을 죽일 뿐 아니라 건강한 세포들도 공격하여 심각한 상태(morbidity) 및 때로는 죽음(mortality) 또한 야기하기 때문에, "양날의 검들"로 여겨진다. 이 설정에서 오메가-3가 암 세포들에 세포독성인 것에 의하여, "검과 방패"로서 작용하고, 그리고 동시에 이들 유해한 영향들로부터 건강한 세포들을 보호할지 여부가 더 토론된다.
NO 324262는 수중유적형 에멀젼 내 저(low) 산화된 생선 오일 및 주스를 포함하는 조성물을 공개한다.
본 발명으로 이끄는 조사로부터, 수중유적형(oil-in-water) 에멀젼 내 저 산화된 생선 오일 및 주스를 포함하는 조성물이 암 치료에 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 하기 설명된 결과들은 암 세포 세포자멸사(apoptosis)의 증가 및 암 세포 증식의 감소도, 주스 및 생선 오일을 포함하는 본 발명의 조성물로 하는 치료 후, 종양 발달의 지연도 보여주었다.
암의 치료 후 처치 및/또는 치료에의 이용을 위한 생선 오일 및 주스을 포함하는 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 암의 치료 후 처치 및 치료에 사용되기 위한 수중유적형 에멀젼인 생선 오일 및 주스를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하여, 수중유적형 에멀젼 내 주스 및 생선 오일을 포함하는 조성물이 암 치료에 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
도 1은 Caco-2, HT-29 및 HCT116 암 세포주들의 세포 증식에 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutnfriend) 1100)이 미치는 영향을 보여준다. 세포 증식이 (세포 배지(medium)과 배양된) 대조군 세포들에 대하여 상대적으로 측정되기 전, 세포들은 조성물(뉴트리프렌드(Nutnfriend) 1100)의 증가하는 농도들을 갖고, 24 시간 동안 배양되었다. 값들은 3 개의 독립적인 실험들의 표준 편차를 갖는 평균이다. 데이터들은 통계 프로그램 MINITAB 16을 이용하여, 터키의(Tukey's) 다중(multiple) 비교(comparison) 테스트(test)와 함께 일방적(one-way) ANOVA 로 분석되었다. 대조군 값들과 비교한 중요성(significance)은 p ≤ 0.05 (*)에서 설정되었다.
도 2는 Caco-2 암 세포주에서 세포자멸사의 유도에 대한 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드 1100)의 영향을 나타낸다. 세포들은 세포자멸사가 (세포 배지(medium)와 배양된) 대조군 세포들에 관하여 측정되기 전 본 조성물(뉴트리프렌드 1100)의 증가하는 농도들로 4 시간 동안 배양되었다. 값들은 두 개의 독립적인 실험들의 표준 편차를 갖는 평균이다. 데이터들은 통계 프로그램 MINITAB 16을 이용하여, 터키(Tukey's) 다중(multiple) 비교(comparisons) 테스트(test)와 함께 일방적(one-way) ANOVA로 분석되었다. 대조군 값들과 비교한 중요성은 p ≤ 0.05 (*)에서 설정되었다.
도 3은 Caco-2, HT-29 및 HCT116 암 세포주들의 세포 증식에 대한 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100) 및 두 생선 오일 샘플들, 즉 좋은 생선 오일 및 산화된 생선 오일의 영향을 나타낸다. 세포 증식이 (세포 배지(meidum)과 배양된) 대조군 세포들에 대하여 측정되기 전, 세포들이 샘플들의 증가하는 농도들과 24 시간 동안 배양되었다. 값들은 3개의 독립적인 실험들의 표준편차를 갖는 평균이다.
도 4는 연구의 결과들을 나타내는데, 이때 SK-N-BE(2)로부터 신경아세포종(neuroblastoma) 이종이식들을 갖는 누드 마우스들이 본 발명의 조성물(스마트피쉬 주스, 뉴트리프렌드(Nutrifriend) 2000) 15 mg/ml (마우스들은 거의 45 -60mg EPA-DHA/일(day)/마우스들을 받았다)(3 마우스들, 6 개 종양들) 또는 임의의 음료수(7 마우스들, 14 종양들)로 처리되었다. 그래프들은 종양이 0.10 ml (A, D), 0.20 ml (B, E) 또는 0.30 ml (C, F)의 부피를 초과할 때까지, 10 x 106 세포들의 피하주사로부터의 일(days)인 시간을 보여준다. A-C에서: Kaplan-Meier 플롯들(plots) 및 D-E에서: 범위를 갖는 중위(Median) 시간(time); D에서: CTRL 14 (11-26) 일들(days) 및 SF 19.5 (9-26) 일들, E에서: CTRL 18 (12-26) 일들(days) 및 SF 23.5 (11-26) 일들 및 F: CTRL 19.5 (15-26) 일들(days) 및 SF 24.5 (13-26) 일들.
도 5는 13 명의 암 환자들 사이의 테스트 결과들을 나타내는데, 이때 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100)의 맛있음(tastefulness)이 테스트되었다. 맛은 1 부터 10 까지 점수가 매겨졌다(이 때, 10은 가장 높은 점수이며 최고의 맛이었다). 7 명의 환자들은 그 조성물에 9-10의 점수를 주었고, 3 명의 환자들은 그 조성물에 6-8 로 점수를 매겼고, 그리고 3 명의 환자들은 그 조성물에 4-5로 점수를 매겼다.
도 6은 NK (IL-2) 또는 NK (IL-2/CD16) 세포들을 갖는 L3.6 암 세포들의 공배양에서 카스파제-3 (red)의 유도를 나타낸다. 도면 내 (오메가 3(DHA 및 EPA)로 확인된) 스마트피쉬 뉴트리프렌드 2000 으로 명명된 본 발명의 조성물이 사용되었다. 스마트피쉬 ((B) 및 (C)) 없이, NK 세포들 (작은 녹색 세포들 또는 잔여 세포질을 갖는 파란 핵)을 갖는 MP2 세포들 (큰 녹색 세포들)은 생존을 가리키는 오렌지 팻치들(patches)을 제외한 주로 녹색 세포질을 갖는다. 스마트피쉬를 갖고, ((E) 및 (F)), 암 세포들 및 NK 세포들은 카스파제-3 세포자멸사를 가리키는 주로 노란색 세포질을 갖는다; 몇몇 암세포들 만이 (E)에서 살아 있다.
도 2는 Caco-2 암 세포주에서 세포자멸사의 유도에 대한 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드 1100)의 영향을 나타낸다. 세포들은 세포자멸사가 (세포 배지(medium)와 배양된) 대조군 세포들에 관하여 측정되기 전 본 조성물(뉴트리프렌드 1100)의 증가하는 농도들로 4 시간 동안 배양되었다. 값들은 두 개의 독립적인 실험들의 표준 편차를 갖는 평균이다. 데이터들은 통계 프로그램 MINITAB 16을 이용하여, 터키(Tukey's) 다중(multiple) 비교(comparisons) 테스트(test)와 함께 일방적(one-way) ANOVA로 분석되었다. 대조군 값들과 비교한 중요성은 p ≤ 0.05 (*)에서 설정되었다.
도 3은 Caco-2, HT-29 및 HCT116 암 세포주들의 세포 증식에 대한 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100) 및 두 생선 오일 샘플들, 즉 좋은 생선 오일 및 산화된 생선 오일의 영향을 나타낸다. 세포 증식이 (세포 배지(meidum)과 배양된) 대조군 세포들에 대하여 측정되기 전, 세포들이 샘플들의 증가하는 농도들과 24 시간 동안 배양되었다. 값들은 3개의 독립적인 실험들의 표준편차를 갖는 평균이다.
도 4는 연구의 결과들을 나타내는데, 이때 SK-N-BE(2)로부터 신경아세포종(neuroblastoma) 이종이식들을 갖는 누드 마우스들이 본 발명의 조성물(스마트피쉬 주스, 뉴트리프렌드(Nutrifriend) 2000) 15 mg/ml (마우스들은 거의 45 -60mg EPA-DHA/일(day)/마우스들을 받았다)(3 마우스들, 6 개 종양들) 또는 임의의 음료수(7 마우스들, 14 종양들)로 처리되었다. 그래프들은 종양이 0.10 ml (A, D), 0.20 ml (B, E) 또는 0.30 ml (C, F)의 부피를 초과할 때까지, 10 x 106 세포들의 피하주사로부터의 일(days)인 시간을 보여준다. A-C에서: Kaplan-Meier 플롯들(plots) 및 D-E에서: 범위를 갖는 중위(Median) 시간(time); D에서: CTRL 14 (11-26) 일들(days) 및 SF 19.5 (9-26) 일들, E에서: CTRL 18 (12-26) 일들(days) 및 SF 23.5 (11-26) 일들 및 F: CTRL 19.5 (15-26) 일들(days) 및 SF 24.5 (13-26) 일들.
도 5는 13 명의 암 환자들 사이의 테스트 결과들을 나타내는데, 이때 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100)의 맛있음(tastefulness)이 테스트되었다. 맛은 1 부터 10 까지 점수가 매겨졌다(이 때, 10은 가장 높은 점수이며 최고의 맛이었다). 7 명의 환자들은 그 조성물에 9-10의 점수를 주었고, 3 명의 환자들은 그 조성물에 6-8 로 점수를 매겼고, 그리고 3 명의 환자들은 그 조성물에 4-5로 점수를 매겼다.
도 6은 NK (IL-2) 또는 NK (IL-2/CD16) 세포들을 갖는 L3.6 암 세포들의 공배양에서 카스파제-3 (red)의 유도를 나타낸다. 도면 내 (오메가 3(DHA 및 EPA)로 확인된) 스마트피쉬 뉴트리프렌드 2000 으로 명명된 본 발명의 조성물이 사용되었다. 스마트피쉬 ((B) 및 (C)) 없이, NK 세포들 (작은 녹색 세포들 또는 잔여 세포질을 갖는 파란 핵)을 갖는 MP2 세포들 (큰 녹색 세포들)은 생존을 가리키는 오렌지 팻치들(patches)을 제외한 주로 녹색 세포질을 갖는다. 스마트피쉬를 갖고, ((E) 및 (F)), 암 세포들 및 NK 세포들은 카스파제-3 세포자멸사를 가리키는 주로 노란색 세포질을 갖는다; 몇몇 암세포들 만이 (E)에서 살아 있다.
본 발명의 개요
본 발명은 암의 치료 후 처치(post treatment) 및/또는 치료에의 이용을 위한, 수중유적형 에멀젼(emulsion) 내 생선 오일(oil) 및 주스(juice)의 조합을 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 생선 오일은 생선 오일의 총 중량(weight)에 기초하여 10 중량%(% by weight) 초과(above)의 오메가-3 함량 및 20 미만의(below) 토톡스(totox) 값을 갖는 생선 오일로부터 선택되고, 그리고 적절한 유화제(emulsifier)는 에멀젼을 안정시키는데 사용된다.
바람직한 예들은 본 발명의 상세한 발명의 설명 및 종속항들에 제시되어 있다.
본 발명의 자세한 설명
본 발명에 의하여, 수중유적형 에멀젼 내 주스 및 생선 오일을 포함하는 조성물이 암 치료에 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
본 발명에 따른 조성물의 이용은 암 치료의 엄청난 잠재력을 드러내는 암세포 세포자멸사의 강한 유도 인자였다는 것이 놀랍게도 발견되었다.
나아가, 본 발명에 따른 조성물의 이용이 또한 암 치료의 엄청난 잠재력을 드러내는 암세포주에서 항증식성 효과에 기여한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
동물 모델에서의 추가의 연구는 본 발명에 따른 조성물을 받은 마우스들에서 종양 발전의 연기를 드러냈다.
이와 같이, 암의 치료 후 처치 및/또는 치료에의 이용을 위한 생선 오일 및 주스을 포함하는 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
생선 오일 및 주스을 포함하는 조성물들의 다른 측면은 조성물의 추가의 변형이 본 발명에 사용될 수 있다는 것이긴 하지만, 노르웨이 특허 NO 324262 내에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물들은 해양(marine) 에멀젼으로서 높은 안정성을 갖고, 낮은 산화를 가능하게 하며, 취약한 영양분들을 온전하고 강하게 유지하여 결과적으로 증가된 흡수 및 높은 생물학적이용가능성을 야기한다는 것을 보였다.
조성물 내 생선 오일은 자주 생선의 뒷맛 및 원치 않는 맛에 기여한다. 본 발명의 용도를 위한 조성물은 맛있다는 장점을 갖는데, 이는 입맛의 변화 및 식욕의 상실을 경험하는 암 환자들을 치료할 때 중요한 전제 조건이다. 도 5에 기재된 테스트는 그 조성물이 입원한 암 환자들에 의하여 맛있는 것으로 여겨진다는 사실을 분명히 보여준다. 상기 테스트에서 13 명의 암 환자들은 본 조성물을 맛있음(tastefulness)에 대하여 테스트하였다. 그 맛은 1 부터 10 까지 점수매겨졌다(이 때 10이 가장 높은 점수이며 최고의 맛이다). 7 명의 환자들이 그 조성물에 9-10의 점수를 주었고, 3 명의 환자들이 그 조성물을 6-8로 점수 매겼고, 3 명의 환자들이 4-5로 점수 매겼다.
NO 324262에 공개된 조성물이 암의 치료 후 처치 및 치료에 사용될 수 있다는 것이 놀랍게도 지금 발견되었다.
본 발명의 한 측면은 암의 치료 후 처치 및/또는 치료에 사용되기 위한, 수중유적형 에멀젼 내 생선 오일 및 주스의 조합을 포함하는 조성물로, 이때 상기 생선 오일은 생선 오일의 전체 중량에 기초하여 10 중량% 초과(above)의 오메가-3 함량 및 20 미만(below)의 토톡스(totox) 값을 갖는 생선 오일로부터 선택되고, 그리고 이때 적절한 유화제가 에멀젼을 안정화시키기 위하여 사용된다.
생선 오일은 적절한 질의 임의의 생선 오일 조제용 물질(preparation)로부터 선택될 수 있고, 즉, 산화 수준이 낮아야 한다. 적절한 질이 되기 위하여, 토톡스(totox)-값(아니시딘(anisidine) 값(value) (AV)과 첨가된 2 배의(times) 과산화물(peroxide) 값(value) (PV))으로 주어진 산화의 수준은 20 미만(below)이, 바람직하게는 10 미만(below)이 되어야 한다. 적절한 질을 갖는 이러한 생선 오일들은 보통 매우 약한 비린내 및 맛을 갖는 맑은(clear) 오일들이다.
오메가-3 지방산들의 함량은 다른 생선 오일 조제용 물질들(preparations)에서 매우 다르다. 오메가(omega)-3 함량이 높은 것이 바람직하다. 바람직한 예에 따라, 본 발명의 조성물에 이용되는 생선 오일 내 오메가-3 지방산들의 함량은 생선 오일의 중량에 기초하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 16%, 또는 가장 바람직하게는 30 중량% 초과(above)이다.
본 발명의 바람직한 한 예는 생선 오일의 함량이 조성물의 총 중량에 기초하여 약 0,5 %-15 중량%(% by weight), 더욱 바람직하게는 2% - 7% 범위의, 가장 바람직하게는 약 2% - 5% 이다.
본 발명의 추가의 예들에서, 주스의 함량은 조성물의 총 중량에 기초하여 약 30-95 중량%이다. 용도는 적절하게 높은 수준의 항산화제들(antioxidants)을 갖는 베리들(berries) 및/또는 과일로부터 선택될 수 있다. 과일은 산화제(oxidizing agent)로서 작용하는 금속 이온들을 최소 수준으로 갖는 것이 더 선호된다.
선호되는 주스들은 하기 군으로부터 선택될 수 있다: 석류, 살구, 그레이프프루트(grapefruit), 오렌지, 크랜베리, 로즈힙(rosehip), 파인애플, 블랙(black) 초크베리(chokeberry), 멀베리(mulberry), 클라우드베리(cloudberry), 아세롤라(acerola), 라스베리(raspberry), 수박, 복숭아, 포도, 체리(cherry), 잠볼라오(jambolao), 사과, 망고, 배(pear), 아로니아(aronia), 시계꽃 열매(passion fruit) 및 키위. 나아가, 그 주스는 비트(beetroot), 당근, 월귤(lingonberry)(카우베리(cowberry)), 구아바(quava), 블랙베리(blackberry) 또는 케일(kale)과 같은 푸른 채소(greens), 시금치, 셀러리(celery), 파슬리(parsley) 또는 오이로부터 선택될 수 있다. 그러나 생선 오일의 산화를 안정화시키기에 적절한 임의의 주스가 사용될 수 있다. 주스는 즉석사용되는(ready-to use) 주스를 얻는 주스 퓌레(puree) 및 주스 농축물들에 물을 첨가함으로써 조제될 수 있다. 주스는 또한 신선한 압착한(pressed) 주스일 수 있다.
생선 오일 및 주스를 포함하는 수중유적형 에멀젼을 안정화시키기 위하여 적절한 유화제들이 사용된다. 적절한 유화제들은 하기 군으로부터 선택될 수 있다:
유고형분들(milk solids), 유청(whey) 단백질, 귀리(oat) 단백질 및 완두콩(pea) 단백질. 유화제는 예컨대 그린스테드(Grindsted) 또는 라크프로단(Lacprodan)일 수 있으나, 임의의 적절한 유화제가 이용될 수 있다. 나아가 본 발명은 농조화제(thickening agent)를 포함할 수 있는데, 이는 바람직하게는 펙틴(pectin) 바람직하게는 귀리로부터, 더욱 바람직하게는 예컨대 감귤류(citrus)인 과일로부터일 수 있다.
나아가 본 발명에 따른 조성물은 요구르트 분말, 대마(hemp) 밀크(milk) 파우더(powder), 아몬드(almond) 밀크 파우더 또는 귀리(oat) 밀크 파우더를 포함할 수 있다. 이러한 첨가물들을 첨가함으로써, 본 조성물은 자초하는(inviting) 농도(consistency)를 주며(giving) 진해진다(thinken). 첨가되는 양은 조성물의 총 중량에 기초하여 5 - 10 중량%의 범위 내일 수 있다.
한 예에서 본 조성물은 비타민 D를 더 포함한다. 예로써, 비타민 D의 양은 200 ml의 단위 복용량(unit dose) 당 1 μg 부터 2000 μg 까지, 바람직하게는 200 ml의 단위 복용량(unit dose) 당 5 μg 부터 50 μg 까지, 가장 바람직하게는 200 ml의 단위 복용량(unit dose) 당 10 μg 내지 20 μg 이다.
나아가, 본 발명에 따른 조성물은 악액질(cachexia)과 같은 암과 관련된 악영향들 및/또는 암으로 인하여 고통받는 환자들에게 유리할 수 있는 단백질들이 첨가될 수 있다.
본 발명의 더 바람직한 예에서 그 조성물은 감미료들, 향미제들, 항산화제들(antioxidants) 및 방부제(preservatives)을 포함할 수 있다. 선호되는 방부제 및 감미료는 각각 포타슘(potassium) 솔베이트(sorbate) 및 자일리톨(xylitol)일 수 있다.
한 예에서 조성물은 임의의 우유(milk) 성분이 없다.
한 예에서, 조성물은 자연적으로 존재하지 않는 임의의 추가된 항산화제(antioxidant)가 첨가되지 않는다.
본 발명의 조성물은 암의 치료 후 처치 및 치료에 유용한 것으로 보여졌다. 연구에서 췌장(pancreatic) 관상(ductal) 선암(adenocarcinoma) (PDAC) 세포들이 카스파제(caspase)-3 활성을 연구함으로써 본 발명의 조성물의 잠재적인 세포자멸(apoptotic) 효과를 조사하는데 이용되었다. 효소 카스파제(caspase)-3는 세포자멸사하는(apoptotic) 세포들에서 활성화되며, 그런 식으로 증가된 카스파제-3 활성은 증가된 세포자멸사 활성의 직접적인 조짐이다. 카스파제-3 활성은 효소 분석 및 면역형광법 분석 모두에서 연구되었다.
효소 분석의 결과들은 본 발명의 조성물이 NK 세포들과 함께-배양된(co-cultured) PDAC 세포들 내 9.6 ± 1.10 μM의 수준에서 카스파제-3 발현을 유도하였다는 것을 가리킨다. 비교에서, 카스파제-3의 수준들은 각각 임의의 자극 없이, 리졸빈D1(resolvinDl) 자극 및 DHA 자극으로, 유사한 PDAC 공배양(co-cultures)들에서, 5.5 ± 0.48, 6.3 ± 0.31 및 6.1 ± 0.48 이었다(표 1).
결과들은 본 발명의 조성물의 중요한 효과를 보여주는 면역형광법 연구에서 확인되었다. 도 6에 보여진 대로, 본 발명의 조성물로 자극된 NK 세포들 및 L3.6 암세포들의 공배양의 자극은 증가된 세포자멸사 활성을 보였다(도 6).
인터페론(interferon)-γ (IFNγ)는 NK 세포들에 의하여, 그 때문에(a.o.) 생산되는 면역 시스템의 중요한 사이토카인(cytokine)이고, 면역자극성(immunostimulatory) 및 면역조절(immunomodulatory) 효과들을 갖는 것으로 알려져 있다. 제한된 연구에서, IFNγ의 수준은 NK 세포들과 공배양(co-culture)된 PDAC 세포들에서 조사되었다. 그 결과들은 IFNγ가 NK 세포들 단독으로가 아니라, 158pg/ml의 수준에서 PDAC 세포들과의 공배양인 NK 세포들에 의하여 생산된다는 것을 보여주었다. IFNγ의 생산은 본 발명의 조성물의 처리에 의하여 119 pg/ml로 감소하였다(표 2).
이런 식으로, 본 발명의 조성물로 처리될 수 있는 암들의 선호되는 타입들은 췌장암 특히 췌장(pancreatic) 관상(ductal) 선암(adenocarsinoma)이다.
본 발명자에 의하여 수행된 또다른 세포주 연구에서 3개의 인간 상피(epithelial) 결장(colon) 암 세포주들이 세포자멸사의 유도 및 세포 증식에 미치는 영향을 측정함으로써 해양(marine) 오일들과 비교한, 그 조성물의 잠재적인 항증식 효과를 조사하는데 이용되었다.
그 결과들은 본 발명의 조성물이 3 개 세포주들 모두에서 항증식 효과를 가지며(도 1), 세포 증식의 이 억제가 세포자멸사의 유도 때문이라는 것을 가리킨다(도 2). 가장 큰 효과는 HCT116 세포주 상에서 보였는데, (오일 함량에 대하여) 0.7 mg/ml의 농도였고, 대조군 세포들에 비교하여 세포 증식에서 중요한(약 50%) 감소를 주었다. 대조군 생선 오일 샘플들은 세포 증식의 억제를 보이지 않았다(도 3).
이런 식으로, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 암들의 바람직한 타입들은 대장암 및 직장암과 같은 결장직장암(colorectal cancer)이다.
누드(nude) 마우스들의 연구에서, SK-N-BE(2)로부터 신경모세포종(neuroblastoma) 이종이식들(xenografts)을 갖는 누드 마우스들은 (스마트피쉬(Smartfish) 주스, 뉴트리프렌드(Nutrifriend) 2000) 조성물 15 mg/ml (마우스들은 거의 45 - 60mg EPA-DHA/일(day)/마우스들) 로 받았다) 또는 음료수(7 마우스들, 14 종양들) 임의로 처리되었다. 그 결과들은 물을 받은 대조군과 비교하여 본 조성물을 받은 마우스들에서 종양 발달에 명확한 지연을 보여주었다(도 4).
이런 식으로, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 암들의 선호되는 타입들은 신경아세포종(neuroblastoma)과 같은 신경(neurological) 암들이다.
나아가, 본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 암들의 선호되는 타입들은 유방암, 전립선암, 폐암 및 피부암이다.
본 발명의 조성물로 치료될 수 있는 암들의 더 추가의 예들은, 부신암종(adrenal cancer), 항문암(anal cancer), 담관암(bile duct cancer), 방광암(bladder cancer), 뼈암(bone cancer), 뇌(brain)/CNS 종양들(tumors), 유방암, 백혈병(leukaemia), 림프종(lymphoma), 흑색종암(melanoma cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 횡문근육종(rhabdomysarcoma), 연조직(soft tissue) 육종(sarcoma), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 신경아세포종(neuroblastoma), 빌름스(wilms) 종양, 비호지킨(non Hodkin) 림프종(lymphoma), 호지킨(Hodgkin) 질병(disease), 망막아종(retinoblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 대장(colon)/직장(rectum) 암, 식도암(esophagus cancer), 안암(eye cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 신장암(kidney cancer), 후두(laryngeal) 및 하인두(hypopharyngeal) 암, 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 폐(lung) 암양종(carcinoid), 림프종(lymphoma), 악성(malignant) 중피종(mesothelioma) 암(cancer), 다발성(multiple) 골수종(myeloma) 암(cancer), 코암(nasal cancer), 구멍(cavity) 및 부비동(paranasal sinus) 암(cancer), 비인두암(nasopharyngeal cancer), 구강(oral cavity) 및 구인두(oropharyngeal) 암(cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 하수체종양(pituitary tumors), 전림선(prostate) 암, 망막아종(retinoblastoma), 침샘(salivary gland), 육종(sarcoma), 피부암(skin cancer), 흑색종 피부암(skin cancer melanoma), 피부암(skin cancer) 메르켈(merkel) 세포, 소장(small intestine) 암, 위(stomach) 암, 고환(testicular) 암, 흉선(thymus) 갑상선(thyroid) 암, 자궁육종(uterine sarcoma), 질암(vaginal cancer), 보통암(vulgar cancer), 및 발덴스트롬( Waldenstrom) 마크로글로불린혈증(macroglobulinemia)이다.
또한 "암의 치료" 용어에 의하여 포함되는 것은 암 발달과 관련된 악영향들의 개선 또는 악액질(cachexia), 비타민 D 결핍증, 피로, 면역 시스템 등의 자극 등과 같은 계속 진행중인(ongoing) 암 요법(therapy)이다. 그것은 또한 암 요법(therapy) 및 재발의 감소로부터 야기되는 인지적(cognitive) 장애(disorder)들의 치료를 포함한다.
본 발명에 따른 암의 치료 후 처치(post treatment)는 암 치료 또는 암 치료 자체와 관련된 임의의 악영향들의 치료일 수 있다. 본 발명에 따른 암의 치료 후 처치(post treatment)는 악액질(cachexia), 비타민 D 결핍증, 피로, 면역 시스템 등의 자극의 치료일 수 있다. 그것은 또한 재발의 감소 및 암 요법으로부터 야기되는 인지적(cognitive) 장애(disorder)들의 치료를 포함할 수 있다.
암의 치료 후 처치 및 치료 동안의 영양 지원은 암 치료(care)에 널리 사용된다. 본 발명의 조성물은 영양(nutritional) 지원(support), 또한 게다가 질병을 변경하는 영양과 같은 목적을 제공하고, 그리고 이에 의하여 일체형(all in one) 조성물, 암 치료 체제에서 두 중요한 관점들(dimensions)을 보장한다.
본 발명의 조성물과 함께 이러한 식이요법(dietary) 치료는 환자에 어떠한 추가의 위험 없이 새롭고, 비독성이며 쉽게 적용가능한 아쥬반트(adjuvant) 암 치료요법으로서 인간 암의 전통적인 프로토콜들(protocols)에 도입될 수 있다.
본 발명의 추가적인 바람직한 에에서, 조성물은 EPA 및 DHA의 약 600 mg/일(day)부터 약 5000 mg/일(day)까지의 범위, 바람직하게는 약 3000 mg/일(day), 더욱 바람직하게는 약 2000 mg/일(day) 그리고 가장 바람직하게는 약 1100 mg/day의 복용량(dosage)에서 투여될 수 있다. 치료적 효과를 달성하기 위하여, 복용량은 더 낮거나 또는 더 높을 수 있다. 조성물은 50 - 300 ml의 부피 범위, 바람직하게는 100 ml, 더욱 바람직하게는 200 ml의 음료로서 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물을 필요로 하는 사람은 일 또는 몇몇 일(day) 당 단위 복용량의 음료를 마실 수 있다. 체중 등은 복용량(dosage) 계산에 사용되는 파라미터들(parameters)일 것이다; 그러므로 복용량은 사람마다 다를 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, 조성물은 마시거나, 캡슐의 또는 분말 형태일 수 있다.
추가의 예에서 본 발명의 조성물은 수술 후 아쥬반트(adjuvant) 암 치료요법으로서, 또는 화학요법(chemotherapeutic) 제제(agent)들 또는 항염증제들 또는 호르몬계(hormonal) 약물들(drugs) 또는 연명(life extension) 약물들(drugs)과 같은 다른 치료적(therapeutic) 제제들과 조합하여, 사용될 수 있다.
용어 "조합하여(in combination)"는 본 발명의 조성물 및 다른 치료적 제제가, 치료적 효과를 만들기 위하여, 이러한 양으로 그리고 이러한 투여 시간들에 의하여 분리하여 투여되는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물 및 다른 치료적 제제는 암의 치료 및/또는 치료 후 처치에서 사용을 위하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 다른 치료적 제제는 분리된 제형들(formulations) 또는 조합된 제형의 함께 제조된 형태일 수 있다. "다른 치료적 제제"에는 방사선치료(radiotherapy)가 포함된다.
화학요법 제제들의 예들은 하기이다: 독소루비신(doxorubicin)/아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신(epirubicin)/엘렌스(ellence) 탁산(taxane)으로 파클리탁셀(paclitaxel)/탁솔(taxol) 및 도세탁셀(docetaxel)/탁소테레(taxotere)와 같은 것이다. 시스플라틴(cisplatin) (플라티놀(Platinol), 플라티놀(Platinol)-AQ) 및 카보플라틴(carboplatin) ((파라플라틴(Paraplatin)), 비노렐빈(vinorelbine) (나벨빈(Navelbine)), 카페시타빈(capecitabine) (젤로다(Xeloda)), 리포소말(liposomal) 독소루비신(doxorubicin) (독실(Doxil)), 젬시타빈(gemcitabine)((겜자르(Gemzar)), 미톡산트론(mitoxantrone), 이자베필론( ixabepilone)((익셈프라(Ixempra®)), 알부민(albumin)-결합(bound) 파클리탁셀(paclitaxel) (아브락산(Abraxane)®), 에리불린(eribulin) (할라벤(Halaven)®), 사이클로포스프아미드(cyclophosphamide) (사이톡산(Cytoxan), 세오사르(Ceosar)), 폭소루비신(foxorubicin) (아드리아마이신(Adriamycin)), 에토포사이드(etoposide) (베페시드(VePesid)), 플루오로우라실(fluorouracil) (5-FU), 이리노테칸(irinotecan) (캄프토사르(Camptosar)), 메토트렉세이트(methotrexate) (폴렉스(Folex), 멕사트(Mexate), 아메톱테린(Amethopterin)), 파클리탁스(paclitax) 토포테칸(topotecan) (하이캄틴(Hycamtin)), 탁솔(Taxol), 온코빈(Oncovin), 빈카사르(Vincasar) PFS, 및 빈블라스틴(vinblastine) (벨반(Velban))과 같은 백금(platinum) 제제들.
항염증제들의 예들은 스테로이드들 및 글루코코르티코이드들(glucocorticoids)과 같은 스테로이드 항염증 약물들이다. 추가의 예들은 이부프로펜, 아세틸살리실산(acetylsalisylic acid), 셀레코시브(celecoxib) 및 다른 코시브(coxib) 약물들과 같은 비-스테로이드 항염증 약물이다.
호르몬 약물들의 예들은 트립토렐린(triptorelin), 류프로렐린(leuprorelin) 및 고세렐린(goserelin)과 같은 LHRH (황체형성(luteinizing) 호르몬(hormone)-방출(releasing) 호르몬(hormone)) 작용제들(agonists) 및 데가렐릭스(degarelix)와 같은 LHRH 작용제들이다. 추가의 예들은 시프로테론(cyproterone) 아세테이트(acetate)와 같은 스테로이드계 항-안드로겐(anti-androgens)들 및 비칼루타미드(bicalutamide), 닐루타미드(nilutamide), 및 플루타미드(flutamide)와 같은 비-스테로이드 항-안드로겐(androgener)이다.
연명 약물들의 예들은 메트포르민(metformin), 스타틴들(statins), 아세틸살리실산(acetylsalicyclic acid), 타다라필(tadalafil) 및 DHEA (디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone))과 같은 항-당뇨 약물들이다.
추가의 치료제의 양은, 본 발명의 조성물과 조합하여 투여될 때, 주로 치료를 받는 담당의사에 의하여 보통 사용되는 복용량(dosage) 식이요법(regimen) 및 양(amount)이다. 어쨌든, 의사는 환자의 임상 상(clinical picture)에 기초하여 추가적인 약물(또는 추가적인 약물들의 혼합물)의 양을 다르게 할 수 있다.
상기로부터, 본 발명에 따른 조성물의 이용은 세포 증식을 억제하고, 세포자멸사(apoptosis)를 증가시키고, 종양 발전을 억제하는데 명확한 효과들을 보이며, 이와 같이 암 치료에 적합하다.
본 발명은 이제 하기 제한되지 않는 실시예들에 관하여 더 설명될 것이다.
실시예들
실시예
1
3 개의 인간 상피 결장(colon) 암 세포주들이 사용되었다. 20% FCS, 1%의 비필수(nonessential) 아미노산들, 100 U/ mL 페니실린(penicillin), 및 100 μg /mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM 내에서 자란 Caco-2. 10% FCS, 1% 의 비필수 아미노산들, 100 U/ mL 페니실린, 및 100 μg /mL 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 내에서 자란 HCT116 및 HT-29. 10% FCS, 1%의 비필수 아미노산들, 100 U/ mL 페니실린, 및 100 μg /mL 스트렙토마이신 (세포 배지(medium))을 포함하는 DMEM이 모든 실험들에서 모든 세포주들에 대하여 사용되었다.
샘플들:
1. (사과, 서양배(pear), 석류, 아로니아(aronia), 패션프루트( passionfruit)로부터 선택되는) 과일 주스, 생선 오일 (7 mg/ml), 우유로부터의 분리 단백질(protein isolate), 펙틴(pectin), 잭프루트(jackfruit)로부터의 아로마(aroma), 로즈마리(rosemary) 추출물, 비타민 E, 비타민 D 및 콩(soya) 레시틴(lecithin)을 포함하는 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100)
2. AV 2, PV 3 및 연어로부터의 좋은(산화되지 않은) 생선 오일 (FCS 및 DMSO 에멀젼 내 7 mg/ml).
3. AV 13, PV 15 및 연어로부터의 산화된 생선 오일(FCS 및 DMSO 에멀젼 내 7mg/ml).
생선 오일들은 하기와 같이 세포들에 첨가되기 전 본 발명의 조성물(Nutrifriend 1100) 에서 사용되는 생선 오일과 동일한 농도인 에멀젼으로서 제조되었다: 7 mg 오일이 10 γl DMSO과 혼합되었고, 볼텍스(vortex)되었고 얼음 상 10 초 동안 40 V 에서 초음파 처리되었다(sonicate). 그리고 나서 1 ml FCS가 첨가되었고, 혼합물은 볼텍스되었고 10 초 동안 40 V 에서 얼음 상에서 초음파 처리되었다.
세포들의 치료 및
항증식
효과들의 측정들
본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 1100) 및 2 개의 오일 에멀젼(emulsions)들이 세포 배지에서 표 1에 나타난 (오일 함량에 대한) 최종 농도들까지 희석되었다.
<표 1>
세포들은 실험 전 24 시간에 100 μl 배지(medium)와 96 웰(well) 플레이트들에 시드(seed)되었다. 실험의 시작에, 성장 배지는 제거되었고, 표시한 샘플들을 포함하는 세포 배지로 대체되었다. 그 다음에 세포들은 세포 증식의 측정을 위하여 24 시간 또는 세포자멸사의 측정을 위하여 4 시간 동안 배양되었다.
세포 증식은 MTT 분석을 이용하여 측정되었다. 샘플들과 함께 배양 24 시간 후 세포들은 PBS와 한 번 세척되어 샘플들의 흔적(traces)을 제거하고, 새로운 세포 배지가 공급되었고(100 μL/웰) 그리고 그 다음에 MTT 표준 용액(15 μl/웰)으로 37 ℃에서 2 시간(h) 동안 처리되었다. 세포 증식률은 테트라졸리움(tetrazolium) 소듐(sodium) 염을 보라색 포르마잔(formazan) 결정들로 자르기 위한, 물질대사의 활성(active) 세포들의 능력에 의하여 결정되었다. MTT 포함하는 배지는 제거되었고, 세포의 보라색 침전물(precipitate)이 2-프로판올(propanol) (100 μL/웰) 내 0.04 M HC1 내에 용해되었다. 흡광(absorbance)은 스펙트로스타(SPECTROstar) 나노(Nano) 플레이트(plate) 리더(reader) (BMG Labtech Gmbh, Germany)에 의하여 562 nm 에서 측정되었다. 모든 샘플은 각 실험에서 3 회 반복으로 측정되었고, 그리고 실험들은 3 회 반복되었다.
게다가, Caco-2 세포주는 카스파제-글로(Caspase-Glo)® 3/7 분석(Assay) (Promega, Madison, WI)을 이용하여 세포자멸사에 대하여 분석되었다. 이 분석은 세포자멸사 동안 발생하는 카스파제-3 및 -7 활성들을 측정하는 상동의(homogenous), 발광(luminescent) 분석이다. 카스파제-3 및 -7의 활성들이 세포자멸사의 초기 상(phase)에서 증가하기 때문에 더 짧은 배양 시간이 사용된다. 샘플들과의 배양 4 시간 후 세포들은 샘플들의 흔적을 제거하기 위하여 PBS로 한 번 세척되었고, 새 세포 배지(100 μl/웰)로 공급되었고, 그리고 그 다음에 1 시간(h) 동안 실온에서 발광인(luminogenic) 카스파제(caspase) 3/7 기질(substrate) (100 μl/웰)로 처리되었다. 카스파제(caspase) 3/7 기질(substrate)은 세포 카스파제(caspase)-3/7 에 의하여 절단되고, 루시페라제(luciferase) (아미노루시페린(aminoluciferin))을 위한 기질이 방출되어 루시페라제 반응 및 빛의 생산을 야기한다. 발광(luminescence)는 Glomax96 Microplate Luminometer (Promega, Madison, WI)를 이용하여 검출되었다(detect).
그 결과들은 본 발명의 조성물,이 모든 3 개 세포주들 상에 항증식(antiproliferative) 효과를 갖는다(도 1)는 것, 그리고 세포 증식의 이 억제가 세포자멸사의 유도 때문이라는 것(도 2)을 가리킨다. 가장 큰 효과는 HCT116 세포주 상에 보여졌고, (오일 함량에 대한) 0.7 mg/ml 의 농도였고, 대조군 세포들에 비교하여 세포 증식에서 큰(약 50%) 감소를 주었다. 도 3으로부터 분명하고 흥미로운, 2 개의 생선 오일 대조군 샘플들은 세포 증식의 억제를 주지 않았다.
실시예
2
조성물로 처리된
SK
-N-
BE
(2) 이종이식(
xenograft
) 종양들을 갖는 마우스들(스마트피쉬(
Smartfish
) 주스)
신경아세포종(neuroblasoma) 이종이식들을 갖는 누드 마우스들은, 15 mg/ml의 복용량으로 (마우스들은 거의 45 - 60mg EPA-DHA/일(day)/마우스들을 받았다) 또는 음료수(7 마우스들, 14 종양들) 임의로, 본 발명의 조성물로 처리되었다(스마트피쉬(Smartfish) 주스, 뉴트리프렌드(Nutrifriend) 2000). 도 4로부터 보여질 수 있듯이, 조성물을 받은 마우스들은 대조군 그룹에 비교하여 종양 발달에서의 지연을 보여주었다.
실시예
3
본 발명의 조성물을 이용할 때 유방암 환자의 체중 증가
(재발(relapse)된) 유방암 환자는 47 kg 의 체중 및 매우 낮은 비타민 D 값을 가졌다. 환자는 본 발명의 조성물(Nutrifriend 1100)에 접해졌고, 하루에 2 회 복용량(doses)으로 취하기 시작했다(각각의 복용량(dose) (200 ml)은 1100 mg EPA/DHA 를 포함한다). 2 주 후, 그녀는 체중 증가 및 식욕의 증가를 경험하였다. 환자는 계속해서 체중이 증가하였으며, 몇 주 후 54 킬로에 도달하였다. 게다가 그녀는 그녀의 힘 및 활력이 되돌아온 것을 느꼈다.
실시예
4
췌장암 세포들 및
NK
-세포들의
공배양(co-culture)에서
카스파제
-3에 의한 세포자멸사의 측정
췌장암을 갖는 환자들은 전이(metastatic) 확장(spread)의 높은 잠재성, 밀도가 높은(dense) 간엽(mesenchymal) 및 염증성(inflammatory) 세포 환경에 의한 보호, 및 종양 세포들에 의한 자연(natural) 살해(killer) (NK) 세포들의 불활성화를 갖는 면역 억제 때문에 좋지 못한 예후(prognosis)를 갖는다. 쿠르쿠민(curcumin)은 보통의 결과들을 갖고 전의 임상 실험에서 테스트되어 왔다. 하기 연구에서, 쿠르쿠민(curcumin)의 첨가와 또는 첨가 없이 본 발명의 조성물이 NK 세포들에 의한 췌장암 세포 살해를 자극하는 그것들의 잠재성에 대하여 테스트되었다.
방법들:
세포 배양: 췌장(pancreatic) 관상(ductal) 선암(adenocarcinoma) (PDAC)으로부터의 L3.6 세포들 및 Mia Paca2 (MP2)이 T. Donahue, UCLA Surgery 로부터 수득되었고, 10% 태아(foetal) 송아지(calf) 혈청(serum)과 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME)에서 번식되었다. 10.000 세포들이 24-웰 플레이트들의 각각의 웰에 플레이트되었고, 테스트 전 거의 융합(confluence)까지 24 시간(h) 및 37 ℃에서 자랐다.
NK 세포들: 이것들은 NK 세포 분리 키트에 의하여 인간 혈액으로부터 분리되었다(Stem cells technologies, Vancouver, Canada). NK 세포들은 Tseng, H. C. et al. "Increased lysis of stem cells but not their differentiated cells by natural killer cells; de-differentiation or reprogramming activates NK cells." PLOS One 5(7): el 1590, 2010 에 기재된 대로 IL-2 또는 IL2/CD16으로의 처리에 의하여 활성화되었다.
본 발명의 조성물-
스마트피쉬
뉴트리프렌드
2000.
DHA (lOOOmg/200 ml) 및 EPA (lOOOmg/200 ml)를 포함하는 본 발명의 조성물(뉴트리프렌드(Nutrifriend) 2000)이 Smartfish AS, Oslo 회사에 의하여 구입되었다. 세포 배양에서 사용하기 위하여, 태아 송아지 혈청으로 1 : 2 희석되었고, 30 초 동안 초음파처리되었고(sonicate), 그리고나서 10% 태아(fetal) 송아지(calf) 혈청(serum)으로 DMEM에서 1 : 100 희석되었다.
세포파괴(cytocidal) 분석: NK 세포들과 L3.6 세포들 또는 MP2 의 공배양: NK 세포들은 1 MP2 세포 당 5 NK 세포들의 비율에서, MP2 또는 L3.6 세포들에 첨가되었다. 공배양들은 스마트피쉬로 처리되었다. (Cayman Chemical company, Ann Arbor, MI로부터의 RvDl, 50nM) 레졸빈(resolvin) Dl 또는 DHA (50nM)의 첨가가 대조군들로서 테스트되었다. 공배양들은 48 시간 동안 자랐고, 수확되었고, 카스파제-3 분석에 의하여 테스트되었다.
카스파제
(
caspase
)-3 분석들:
효소 카스파제-3 분석은 제조업자의 지시에 따라 CaspACE-3 분석(assay) G-7351(Promega Corporation, Madison, WI)에 의하여 수행되었다.
카스파제(caspase)-3 면역형광(immunofluorescent) 현미경(microscopic) 분석: MP2 세포들이 10% 태아 송아지 혈청을 갖는 DME 내 8-웰 챔버 슬라이드들(Corning)에서 부분적 융합(confluence)으로 성장되었고, 기재한 대로 24 시간 처리되었다. 그리고 나서 그것들은 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 의하여 고정되었고, 0.25 트리톤(Triton)을 이용하여 투과성으로 되었고(permeabilize), 1 : 200 희석들(dilutions)에서 토끼 항-카스파제-3 (활성) (Genetex) 으로 간적접 기술을 이용하여 염색되었고, 뒤이어 1 :200 희석들에서 ALEXA-fluor-donkey 항-토끼 568 이 되고 그리고 1 :500 희석에서 FITC-팔로이딘(phalloidin) (Sigma) 이 되고, DAPI (In Vitrogen)으로 프로롱(Prolong) 골드(Gold) 안티페이드(antifade)를 이용하여 얹혀졌다(mount).
통계 분석:
데이터들은 평균들의 범위를 비교함으로써 분석되었다(평균 +/- 2 x 평균의 표준편차). 표시될 때 정확한 값은 피셔(Fisher) 정확한(exact) 테스트(test)에 의하여 계산되었다.
결과들:
효소(
enzymatic
)
카스파제
-3 분석
표 1은 스마트피쉬로 NK 세포들 및 췌장암 세포들 (MP2 세포들)의 공배양의 처리의 결과들을 보여준다. DHA 및 RvDl의 첨가는 대조군들로서 나타나 있다.
<표 1>
표 1에 보여진 대로, MP2 세포들 단독 및 IL-2 자극된 NK 세포들 단독은 매우 낮은 카스파제-3 발현(각각 3.8 μΜ 및 2.2 μΜ)을 보였고, 반면, NK 세포들을 갖는 MP2 세포들의 공 배양에서, 카스파제-3 발현은 더 높았고(5.5 +/-0.48 μΜ), 그리고 RvDl (6.3 +/-0.31 μΜ) 또는 DHA (6.1 μΜ +/- 0.48 μΜ)의 첨가에 의하여 약간 증가되었다. 스마트피쉬(Smartfish)에 의한 NK 세포들를 갖는 암의 공배양의 치료는 세포자멸사 발현을 상당히 증가시켰다(9.6 +/- 1.1 μΜ).
이런 식으로, 스마트피쉬는 암 세포들에 대한 NK 세포들의 세포파괴(cytocidal) 효과들에 힘을 더하는 것으로 보여졌다. 스마트피쉬는 NK 세포들에 의한 췌장암 세포들의 세포자멸사를 강하게 한다.
결과들;
카스파제
(
caspase
-3)
면역형광
(
immunofluorescent
) 현미경 분석
실험 셋업(set up)은 도 6에 나타내어져 있다. 간단히, NK 세포들은 IL-2, 또는 IL-2 및 CD 16의 조합으로 자극되었다. 자극되지 않은 NK 세포들은 대조군 세포들로 제공되었다. 자극된 NK 세포들의 두 그룹들은 췌장암 세포주들(cells line) L3.6과 공배양되었다. 대조군 NK 세포들 및 공배양들은 스마트피쉬(Smartfish)로 더 자극되었다.
면역형광검사(
immunofluorescence)
:
NK 세포를 갖는 L3.6 암세포들 (췌장(pancreatic) 관상(ductal) 선암(adenocarcinoma) (PDAC) 암 세포들)의 공배양은 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) (PFA)를 포함하는 인산염(phosphate) 버퍼된(buffered) 염(salt) 용액(solution) (PBS)에서 고정되었고, 0.25 트리톤(Triton) X-100 (Sigma)/PBS에의하여 투과성이 되었고(permeabilize), 1 :200 희석들(dilutions)에서 1차 항체 항-활성 카스파제(Caspase) 3 (토끼 항-인간 IgG GTX22302, GeneTex)의 정해진 희석으로 30 분, 2차 항체 형광(fluorescent) 당나귀(donkey) 항-토끼 항체(Alexa Fluor 568, Invitrogen) (1 :200 dilution)로 30분, 형광 팔로이딘(Phalloidin) (488, Sigma)의 1 :500 희석에 의하여 20 분 염색되었고, 그리고 DAPI (Prolong Gold antifade; Life Technologies)로 수성 마운팅(mounting) 배지에 얹혀졌다(mount). 20x 및/또는 40x에서 형광 현미경(Olympus)에 의하여 사진들이 찍혔다.
결과들은 면역형광검사 분석에서 NK (IL-2) 또는 NK (IL-2/CD16) 세포들 (=작은 녹색 또는 위축된(shriveled) 세포들)과 밤새 공배양된 L3.6 불멸화된(immortalized) 췌장(pancreatic) 선암(adenocarcinoma) 세포들 (=큰 녹색 세포들)의 배양물에서 세포자멸사(카스파제-3-양성=빨강)의 유도를 보여주는 도 6에 제시된다.
단독으로 배양된 NK 세포들은 위축된(shriveled) 외관을 보인 반면, 스마트피쉬(Smartfish)와 배양된 NK 세포들은 스마트피쉬에 의한 보호를 나타내는 정상적인 녹색 사이토플라스마(cytoplasma)를 보였다(도 6의 패널 A 및 D).
스마트피쉬(Smartfish) 자극을 갖거나 또는 갖지 않는 NK 세포들 (IL-2 자극됨) 및 L3.6 암 세포들의 공배양은 하기를 보였다: L3.6 암 세포들은 그것들이 살아 남았다는 것을 나타내는 주로 녹색의 세포질(cytoplasm)을 가졌고, 반면 스마트피쉬로 자극된 공배양물은 오직 몇몇 암세포들만이 살아 암아, 그것들의 세포자멸사를 나타내는 노란색 또는 오렌지색 세포질을 보였다(도 6의 패널 B 및 F).
스마트피쉬(Smartfish)를 갖거나 또는 갖지 않는 NK 세포들 (TL2 및 CD16 자극됨) 및 L3.6 세포들의 공배양은 하기를 보였다: L3.6 암 세포들은 그것들이 살아남았다는 것을 나타내는 주로 녹색 세포질을 가졌고, 반면 스마트피쉬로 자극된 공배양물은 그 암세포들이 세포자멸사를 보이는 무리(clump)로 있다는 것을 보였다(노란색 또는 빨간색)(도 6의 패널 (C) 및 (E)).
공배양물(co-cultures) 내 NK 세포들 (도 6의 패널 (B), (C), (E), (F))은 세포자멸(apoptotic), 즉, 핵들 또는 빨간 세포질만을 보였다. 이와 같이 암세포들 및 NK 세포들 모두는 싸움에서 죽었으나, 더 많은 암세포들이 본 발명의 조성물의 존재 하 죽었다.
이런 식으로, 본 발명의 조성물이 NK 세포들의 암세포들에 대한 세포파괴 효과들을 강하게 하여, 세포자멸사를 증가시킨다는 것을 보였다.
인터페론(
interferon
)-γ의 유도
NK 세포들에 의한 인터페론(interferon)-γ (INFγ)의 생산에 미치는 영향이 연구되었다. 실험 조건들은 상기에 기재되어 있다. IFNγ은 상업적으로 이용가능한 IFNγ 분석(assay)을 이용하여 측정되었다.
IFNγ 분석은 IFNγ이 NK 세포들 단독에 의하여 생산된 것이 아니고, 158 pg/ml의 레벨에서 MP2 세포들과의 공배양물 내 NK 세포들에 의하여 생산되었다는 것을 보여주었다. 인터페론-γ의 생산은 스마트피쉬(Smartfish)에 의하여 119 pg/ml로 감소되었다. 결과들은 하기 표 2에 나타나 있다.
<표 2>
이런 식으로, 본 발명의 조성물은 IFNγ의 생산을 감소시킬 수 있다는 것이 보여졌다.
이해를 명확히 하기 위한 목적을 위하여 ?이ㅖ 및 설명의 방식으로 몇몇 세부적으로 본 발명이 이제 설명되었고, 당업자에게는 동일한 것이 넓고 등가의 범위의 조건들 및 그것들의 다른 파라미터들을 이용함으로서 본 발명을 변화 또는 수정하여 수행될 수 있고, 이러한 변화 또는 수정들은 첨부된 특허청구범위들의 범위 내 포함되는 것으로 의도된다는 것이 자명할 것이다.
Claims (15)
- 암의 치료 후 처치 및/또는 치료에의 사용을 위한, 수중유적형 에멀젼 내인 생선 오일 및 주스의 조합(combination)을 포함하는 조성물로, 상기 생선 오일은 생선 오일의 총 중량에 기초하여 10 중량% 초과(above)의 오메가-3 함량 및 20 미만(below)의 토톡스(totox) 값을 갖는 생선 오일로부터 선택되고, 그리고 적절한 유화제가 에멀젼을 안정화시키는데 사용되는 조성물.
- 제 1항에 있어서,
췌장암, 결장직장암(colorectal cancer), 신경암(neurological cancer), 유방암, 전립선암, 폐암 및 피부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용되기 위한 조성물.
- 제 1항에 있어서,
암의 상기 치료 후 처치는 악액질(cachexia), D 비타민 결핍, 피로 또는 면역 시스템의 자극의 치료를 포함하는 조성물.
- 암의 치료 후 처치 및/또는 치료를 위한, 제 1항에 따른 조성물 및 치료제의 조합된(combined) 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
생선 오일의 토톡스(totox) 값은 10 미만(below)인 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생선 오일 함량은 조성물의 총 중량에 기초하여 약 0.5 내지 15 중량% 인 조성물.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
주스의 함량은 조성물의 총 중량에 기초하여 약 30 - 95 중량% 인 조성물.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 주스는 항산화제들(antioxidants)의 적절한 높은 수준을 갖는 베리들 및 과일로부터 선택되는 조성물.
- 제 8항에 있어서,
상기 주스는 하기 군으로부터 선택되는 조성물; 석류, 살구, 그레이프프루트(grapefruit), 오렌지, 크랜베리, 로즈힙(rosehip), 파인애플, 블랙(black) 초크베리(chokeberry), 멀베리(mulberry), 클라우드베리(cloudberry), 아세롤라(acerola), 라스베리(raspberry), 수박, 복숭아, 포도들, 체리, 잠볼라오(jambolao), 사과, 망고, 배(pear), 아로니아(aronia), 시계꽃 열매(passion fruit) 및 키위.
- 제 8항에 있어서,
주스는 하기 군으로부터 선택되는 조성물; 비트(beetroot), 당근, 월귤(lingonberry)(카우베리(cowberry)), 구아바, 블랙베리(blackberry) 또는 케일과 같은 푸른 채소, 시금치, 셀러리, 파슬리 또는 오이.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유화제는 하기 군으로부터 선택되는 조성물; 유고형분들(milk solids), 유청 단백질, 귀리(oat) 단백질 및 완두(pea) 단백질.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 펙틴을 더 포함하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 감미료들, 향미제들, 항산화제들 및 방부제들을 더 포함하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 EPA 및 DHA의 약 600 mg/일(day) 부터 약 5000 mg/일(day) 까지의 범위의, 바람직하게는 약 3000 mg/일(day), 더욱 바람직하게는 약 2000 mg/일(day) 및 가장 바람직하게는 약 1100 mg/일의 복용량(dosage)에서 투여되는 조성물.
- 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 마실 수 있거나, 또는 캡슐이거나 또는 분말 형태인 조성물.
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