BR112015025787B1

BR112015025787B1 - uso de uma composição que compreende uma combinação de óleo de peixe e suco em uma emulsão de óleo-em-água

Info

Publication number: BR112015025787B1
Application number: BR112015025787-9A
Authority: BR
Inventors: Janne Sande Mathisen
Original assignee: Smartfish As
Priority date: 2013-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2021-01-12
Also published as: AU2014258007A1; DK2991507T3; US9877944B2; CN105120683A; SI2991507T1; BR112015025787A2; PL2991507T3; US20160067202A1; KR20160008200A; ES2753387T3; PT2991507T; BR112015025787A8; JP6495245B2; WO2014175748A1; CA2909409A1; HK1221874A1; KR102253929B1; HUE046885T2; US20180110749A1; AU2014258007B2

Abstract

COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO E/OU PÓS-TRATAMENTO DO CÂNCER E USO DE UMA COMBINAÇÃO DE ÓLEO DE PEIXE E SUCO NA FABRICAÇÃO DE TAL COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo óleo de peixe e suco em uma emulsão óleo-em-água para uso no tratamento e pós-tratamento do câncer.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção fornece uma composição compreendendo óleo de peixe e um suco em uma emulsão de óleo-em-água para uso no tratamento e no pós-tratamento do câncer.COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO E/OU PÓS-TRATAMENTO DO CÂNCER E USO DE UMA COMBINAÇÃO DE ÓLEO DE PEIXE E SUCO NA FABRICAÇÃO DE TAL COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a uma composição compreendendo óleo de peixe e suco em uma emulsão óleo-em-água para uso no tratamento e pós-tratamento do câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os potenciais benefícios do óleo de peixe surgiram a partir da observação de que as doenças cardiovasculares e as taxas de incidência de câncer eram geralmente baixas em esquimós do Alasca e da Groenlândia. Estas populações têm uma dieta rica em peixes e pobre em hidratos de carbono que está em oposição às dietas da Europa e da América do Norte.

[003] O óleo de peixe é a mais rica fonte alimentar de ácidos gra- xos poli-insaturados de cadeia longa ômega-3 (AGPI). Os ácidos graxos são os blocos de construção de gorduras alimentares, e são armazenados, substancialmente sob a forma de triglicerídios. O corpo não pode, contudo, produzir esses ácidos graxos e deve obtê-los a partir de fontes de alimentos ou de suplementos. Três ácidos graxos compõem a família ômega-3: ácido alfa-linolênico (ALA), ácido icosapentanoico (EPA) e ácido docosa-hexanoico (DHA). O ALA é encontrado em, por exemplo, nozes, alguns tipos de grãos e azeites. EPA e DHA são encontrados em peixes, incluindo óleo de peixe e suplementos.

[004] Os ácidos graxos ômega-3 são essenciais à vida em qual quer fase, mesmo antes do nascimento. Eles são blocos de construção essenciais da membrana de cada célula do corpo e suas presenças são uma necessidade para a manutenção adequada de uma membrana celular. Eles também contribuem na regulação da maioria das fun- ções biológicas. Há evidências epidemiológicas substanciais de que o consumo de peixes ou poli-insaturados PUFA n-3 de cadeia longa, es-pecialmente EPA e DHA protegem contra doenças cardiovasculares nas populações ocidentais. Os PUFA n-3 de cadeia longa reduzem as concentrações plasmáticas de triacilglicerol em jejum e reduzem a resposta lipêmica pós-prandial. O óleo de peixe também fornece efeitos anti-inflamatórios e antiagregantes, que desempenham um papel crucial no tratamento de aterosclerose e da trombose.

[005] Embora tenham sido apresentados resultados convincentes onde o ômega-3 foi empregado no tratamento de diferentes condições, estão disponíveis dados muito limitados relativos ao ômega-3 ou ao óleo de peixe no tratamento do câncer. Parece, até agora, que os resultados são ambíguos.

[006] A American Cancer Society declara, no entanto, que alguns resultados promissores sobre o óleo de peixe e o câncer foram apresentados e que estes resultados merecem estudos mais aprofundados.

[007] Em um estudo de um modelo de câncer induzido por subs tância cancerígena mostrou-se que uma alta ingestão de óleo de peixe reduziu significativamente a incidência de câncer em estudos com animais, em comparação com animais alimentados tanto com dietas de baixa gordura ou dietas com elevado teor de óleo de milho (Welsch, CW. Cancer Res., 52 : 2040S-2048s, 1992).

[008] Em um artigo de revisão de Gleissman H., et al, (Experi mental Cell Research 316 (2010) 1365-1373), é apresentado que qui- mioterápicos convencionais são considerados "espadas de dois gumes", já que eles matam as células cancerosas, mas também atacam as células saudáveis causando patologias graves e, por vezes, também a morte. É ainda discutido se o ômega-3 na presente configuração funciona como "espada e escudo", por ser citotóxico para as célu- las cancerosas, e ao mesmo tempo proteger as células saudáveis desses efeitos deletérios.

[009] A NO 324262 descreve uma composição compreendendo o óleo de peixe de baixa oxidação e suco em uma emulsão de óleo-em- água.

[0010] Da pesquisa que conduziu à presente invenção encontrou- se surpreendentemente que a composição compreendendo o óleo de peixe de baixa oxidação e um suco em uma emulsão de óleo-em-água podem ser utilizados na terapia do câncer. Os resultados que são elaborados abaixo mostraram a diminuição da proliferação de células cancerosas e o aumento da apoptose de células cancerosas, bem como um atraso no desenvolvimento do tumor após o tratamento com uma composição de acordo com a invenção compreendendo óleo de peixe e suco.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção abrange uma composição compreen dendo uma combinação de óleo de peixe e suco em uma emulsão de óleo-em-água, para o uso no tratamento e/ou pós-tratamento do câncer, em que o referido óleo de peixe é selecionado a partir de óleo de peixe com um valor Totox inferior a 20 e teor de ômega-3 superior a 10% em peso com base no peso total do óleo de peixe e em que um emulsionante adequado é usado para estabilizar a emulsão.

[0012] Modalidades preferidas são definidas nas reivindicações dependentes e na descrição pormenorizada da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] Figura 1. Ilustra o efeito de uma composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) sobre a proliferação de células Caco-2, HT-29 e HCT116 de linhagens celulares cancerosas. As células foram incubadas durante 24 horas em concentrações crescentes da composição (Nutrifriend 1100) antes da proliferação celular ser medida em relação às células de controle (incubadas com meio celular). Os valores são a média com o desvio padrão de três experimentos independentes. Os dados foram analisados com ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey, utilizando o programa estatístico MINITAB 16. A significância em comparação com os valores de controle ficou estabelecida em p < 0,05 (*).

[0014] Figura 2. Ilustra o efeito de uma composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) na indução da apoptose sobre a linhagem de células cancerosas Caco-2. As células foram incubadas durante 4 horas com concentrações crescentes da composição Nutrifriend (1100) antes da apoptose ser medida em relação às células de controle (incubadas com meio celular). Os valores são a média com desvio padrão de dois experimentos independentes. Os dados foram analisados com ANOVA de uma via com teste de comparações múltiplas de Tukey, utilizando o programa estatístico MINITAB 16. A significância em comparação com os valores de controle ficou estabelecida em p < 0,05 (*).

[0015] Figura 3. Ilustra o efeito de uma composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) e duas amostras de óleo de peixe, isto é, óleo bom de peixe e óleo oxidado de peixe, sobre a proliferação de células cancerosas das linhagens HT-29, HCT116 e Caco-2. As células foram incubadas durante 24 horas com concentrações crescentes de amostras antes da proliferação celular ser medida em relação às células de controle (incubadas com meio celular). Os valores são a média com o desvio padrão de três experimentos independentes.

[0016] Figura 4. Ilustra os resultados de um estudo em que ca mundongos pelados com xenoenxertos de neuroblastoma de SK-N- BE(2) foram tratados com uma composição da presente invenção (suco Smartfish, Nutrifriend 2000) 15 mg/ml (os camundongos receberam aproximadamente 45 a 60mg de EPA-DHA/dia/camundongo) (3 ca- mundongos, 6 tumores) ou água potável (7 camundongos, 14 tumores) ad libitum. Os gráficos mostram o tempo em dias a partir da injeção subcutânea de 10 x 106 células, até que o tumor ultrapassasse um volume de 0,10 ml (A, D), 0,20 mL (B, E) ou 0,30 ml (C, F). Em A-C: As representações gráficas de Kaplan-Meier e em D-E: O tempo médio com variação; em D: CTRL 14 (11-26) dias e SF (SMARTFISH) 19,5 (9-26) dias, em E: CTRL 18 (12-26) dias e SF 23,5 (11-26) dias e em F: CTRL 19,5 (15-26 SF) dias e 24,5 (13-26) dias.

[0017] Figura 5. Ilustra os resultados de um teste entre 13 pacien tes com câncer, em que o sabor agradável de uma composição de acordo com a invenção (Nutrifriend 1100) foi testado. O sabor foi marcado de 1 a 10 (em que 10 eram a pontuação mais alta e o melhor sabor). 7 pacientes deram à composição uma pontuação de 9-10, 3 pacientes pontuaram a composição em 6-8, e 3 pacientes pontuaram a composição em 4-5.

[0018] Figura 6. Ilustra a indução da caspase-3 (vermelho) em co- culturas de células cancerosas L3.6 com células NK (IL-2) ou NK (IL- 2/CD16). Uma composição de acordo com a invenção chamada Smartfish Nutrifriend 2000 (na figura foi utilizado identificado como Ômega 3 (DHA e EPA). Sem Smartfish ((B) e (C)): células MP2 (grandes células verdes) e as células NK (pequenas células verdes ou núcleos azuis com citoplasma residual) têm citoplasma na maior parte verde com exceção de manchas laranja, indicando sobrevivência. Com Smartfish, ((E) e (F)): as células cancerígenas e as células NK têm citoplasma principalmente amarelo indicando apoptose da caspase-3; somente poucas células cancerosas estão sobrevivendo em (E).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] Pela presente invenção, foi surpreendentemente descober to que uma composição compreendendo o óleo de peixe e um suco em uma emulsão de óleo-em-água pode ser utilizado na terapia do câncer.

[0020] Foi surpreendentemente descoberto que o uso de uma composição de acordo com a presente invenção era um forte indutor de apoptose de células cancerosas que revelou um grande potencial no tratamento do câncer.

[0021] Além disso, foi surpreendentemente descoberto que o uso da composição de acordo com a presente invenção contribui para um efeito antiproliferativo em linhagens celulares tumorais, também revelando um grande potencial no tratamento do câncer.

[0022] Um estudo adicional em um modelo animal surpreenden temente revelou um atraso no desenvolvimento de tumores em camundongos que receberam a composição de acordo com a invenção.

[0023] Assim, é um objeto da presente invenção fornecer uma composição compreendendo óleo de peixe e suco para uso no tratamento e/ou no pós-tratamento do câncer.

[0024] Diferentes aspectos de composições compreendendo óleo de peixe e suco encontram-se descritos na Patente Norueguesa NO 324262, embora outras modificações da composição possam ser empregadas na presente invenção.

[0025] As composições da presente invenção foram mostradas possuindo uma elevada estabilidade como emulsão marinha e permite uma baixa oxidação e mantém os nutrientes vulneráveis intactos e potentes, o que por sua vez resulta no aumento da absorção e em elevada biodisponibilidade.

[0026] O óleo de peixe em uma composição muitas vezes contribui para um sabor indesejável e um sabor residual de peixe. A composição para utilização na presente invenção tem a vantagem de ser de sabor agradável, que é um pré-requisito importante quando se tratam pacientes com câncer que sofrem alterações no sabor e perda de apetite. O ensaio ilustrado na Figura 5 ressalta o fato de que a composi- ção foi percebida como sendo de sabor agradável por pacientes cancerosos hospitalizados. No referido teste de 13 pacientes com câncer testaram a composição em relação ao sabor agradável. O sabor foi marcado de 1 a 10 (em que 10 foram a pontuação mais alta e o melhor sabor). 7 pacientes deram a composição uma pontuação de 9-10, 3 pacientes marcou a composição de 6-8, e marcou 3 pacientes a composição de 4-5.

[0027] Verificou-se agora, surpreendentemente, que a composição descrita em NO 324262 pode ser utilizada para o tratamento e pós- tratamento do câncer.

[0028] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma compo sição compreendendo uma combinação de óleo de peixe e suco em uma emulsão de óleo-em-água, para o uso no tratamento e/ou pós- tratamento do câncer, em que o referido óleo de peixe é selecionado a partir de óleo de peixe tendo um valor Totox inferior a 20 e de teor de ômega-3 superior a 10% em peso com base no peso total do óleo de peixe e em que um emulsionante adequado é usado para estabilizar a emulsão.

[0029] O óleo de peixe pode ser selecionado a partir de qualquer preparação de óleo de peixe de qualidade adequada, ou seja, o nível de oxidação deve ser baixo. Para ser de qualidade adequada o nível de oxidação dado como valor Totox (2 vezes o valor de peróxido (PV) adicionado com o valor de anisidina (AV)) deve ser inferior a 20, preferivelmente inferior a 10. Tais óleos de peixe de qualidade adequada são geralmente óleos claros, com um odor e sabor de peixe muito suaves.

[0030] O teor de ácidos graxos ômega-3 varia muito em diferentes preparações de óleo de peixe. É preferível que o teor de ômega-3 seja elevado. De acordo com modalidades preferidas, o teor de ácidos gra- xos ômega-3 no óleo de peixe usado na composição de acordo com a invenção deve ser pelo menos 10%, de preferência pelo menos 16%, ou mais preferivelmente acima de 30% em peso, com base no peso de o óleo de peixe.

[0031] Uma modalidade preferida da presente invenção fornece uma composição em que o teor de óleo de peixe é de aproximadamente 0,5% -15% em peso, com base no peso total da composição, mais preferivelmente na faixa de 2% - 7%, mais preferivelmente aproximadamente 2% -5%.

[0032] Em outras modalidades da presente invenção, o teor do suco é de aproximadamente 30-95% em peso, com base no peso total da composição. O uso pode ser selecionado a partir de frutos e/ou bagas tendo um elevado nível de antioxidantes adequados. É ainda preferido que a fruta possua um nível mínimo de íons metálicos que funcionam como agente de oxidação.

[0033] Os sucos preferidos podem ser selecionados a partir do se guinte grupo: romã, damasco, uva, laranja, amora, rosa mosqueta, abacaxi, aronia preta, amora, amora silvestre, acerola, framboesa, melancia, pêssego, uva, cereja, jambolão, maçã, manga, pera, aronia, maracujá e kiwi. Além disso, o suco pode ser selecionado a partir de beterraba, cenoura, aronia, quava, amora ou verduras como couve, espinafre, aipo, salsa ou pepino. Qualquer suco adequado para estabilizar a oxidação do óleo de peixe pode, no entanto, ser utilizado. O suco pode ser preparado por adição de água nos concentrados de suco e polpas para suco obtendo um suco normal pronto para uso. O suco pode também ser um suco prensado fresco.

[0034] Para estabilizar a emulsão de óleo-em-água compreenden do óleo de peixe e suco, devem ser utilizados emulsionantes apropriados. Os emulsionantes adequados podem ser selecionados a partir do seguinte grupo: sólidos do leite, proteínas de soro de leite, proteínas de aveia e proteína de ervilha. O emulsionante pode ser, por exemplo, Grindsted ou Lacprodan, mas qualquer emulsionante adequado pode ser empregado. Além disso, a presente invenção pode compreender de preferência um agente espessante que preferivelmente pode ser a pectina, preferivelmente de aveia, mais preferivelmente de frutas, por exemplo, cítricos.

[0035] Adicionalmente a composição de acordo com a invenção pode compreender iogurte em pó, leite em pó de cânhamo, leite em pó de amêndoa ou leite em pó de aveia. Ao adicionar estes aditivos, a composição engrossa dando uma consistência convidativa. A quantidade adicionada pode estar na faixa de 5 - 10% em peso com base no peso total da composição.

[0036] Em uma modalidade, a composição compreende ainda a vitamina D. Como um exemplo, a quantidade de vitamina D é de 1 μg a 2000 μg por dose unitária de 200 ml, de preferência de 5 μg a 50 μg por dose unitária de 200 ml, mais preferivelmente 10 μg para 20 μg por dose unitária de 200 ml.

[0037] Além disso, a composição de acordo com a invenção pode ter adicionadas proteínas que podem ser favoráveis para os pacientes que sofrem do câncer e/ou dos efeitos adversos associados ao câncer, tais como a caquexia.

[0038] Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a composição pode compreender agentes edulcorantes, aromatizan- tes, conservantes e antioxidantes. O conservante e edulcorante preferidos podem ser o sorbato de potássio e o xilitol, respectivamente.

[0039] Em uma modalidade a composição é isenta de todos os ingredientes do leite.

[0040] Em uma modalidade, na composição não se adiciona ne nhum antioxidante que não seja o já naturalmente presente.

[0041] A composição da presente invenção tem-se mostrado útil no tratamento e no pós-tratamento do câncer. Em um estudo, envol- vendo um adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), as células foram usadas para investigar o efeito potencial apoptótico de uma composição da presente invenção estudando a atividade da caspase-3. A caspase-3 é a enzima ativada nas células apoptóticas, assim, o aumento da atividade da caspase-3 é uma indicação direta do aumento da atividade apoptótica. A atividade da caspase-3 foi estudada tanto em um ensaio enzimático como em um ensaio de imunofluorescência.

[0042] Os resultados do ensaio enzimático indicam que a compo sição da presente invenção, induziu uma expressão da caspase-3 a um nível de 9,6 ± 1,10 μM em células de PDAC cocultivadas com células NK. Em comparação, os níveis de caspase-3 foi de 5,5 ± 0,48, 6,3 ± 0,31 e 0,48 ± 6,1 em coculturas similares respectivamente de PDAC sem qualquer estímulo, estímulo com resolvinaD1 e estímulo com DHA (Tabela 1).

[0043] Os resultados foram confirmados em um estudo de imuno- fluorescência mostrando o efeito significativo da composição de acordo com a invenção. Como mostrado na Figura 6, o estímulo de uma cocultura de células cancerosas L3.6 e células NK estimuladas com uma composição da presente invenção revelaram um aumento da atividade apoptótica (Figura 6).

[0044] O interferon-Y (IFNY) é uma importante citocina do sistema imunológico produzida sob estímulo por células NK, e é conhecida por ter efeitos imunomoduladores e imunoestimuladores. Em um estudo limitado, os níveis de IFNY foram investigados em células PDAC cocul- tivadas com células NK. Os resultados demonstraram que o IFNY não foi produzido pelas células NK por si só, mas em células NK em cocul- tura com células PDAC a um nível de 158 pg/ml. A produção de IFNY foi diminuída por meio de tratamento com uma composição de acordo com a invenção a 119 pg/ml. (Tabela 2)

[0045] Assim, os tipos preferidos do cânceres que podem ser tra- tados com a composição de acordo com a invenção são o câncer do pâncreas, em particular o adenocarsinoma ductal pancreático.

[0046] Em outro estudo de linhagem celular conduzido pelo inven tor, três linhagens celulares epiteliais humanas do câncer do cólon foram utilizadas para investigar o efeito potencial antiproliferativo da composição em comparação com óleos marinhos, medindo o efeito na proliferação das células e na indução da apoptose.

[0047] Os resultados indicaram que a composição da presente in venção tem um efeito antiproliferativo em todas as três linhagens celulares (Figura 1), e que esta inibição da proliferação celular é devida à uma indução da apoptose (Figura 2). O maior efeito foi observado na linhagem celular de HCT116, onde uma concentração de 0,7 mg/ml (em relação ao teor de óleo) forneceu uma diminuição significativa (aproximadamente 50%) na proliferação celular em comparação com células de controle. As amostras de óleo de peixe de controle não mostraram nenhuma inibição da proliferação celular (Figura 3).

[0048] Assim, os tipos preferidos de cânceres que podem ser tra tados com a composição de acordo com a invenção são os cânceres colo retais, tais como câncer do cólon e câncer retal.

[0049] No estudo em camundongos pelados, os camundongos pe lados com xenoenxertos de neuroblastoma de SK-N-BE(2) foram tratados com a composição (suco Smartfish, Nutrifriend 2000) 15 mg/ml (os camundongos receberam aproximadamente 45 - 60 mg de EPA- DHA/dia/camundongo) (3 camundongos, 6 tumores) ou água potável (7 camundongos, 14 tumores) ad libitum. Os resultados mostram um claro atraso no desenvolvimento de tumores nos camundongos que receberam a composição em comparação com o grupo de controle que recebeu água (Figura 4).

[0050] Assim, os tipos preferidos de cânceres que podem ser tra tados com a composição de acordo com a invenção são os cânceres neurológicos, tais como o neuroblastoma.

[0051] Outros tipos preferidos do cânceres que podem ser tratados com a composição de acordo com a invenção são o câncer da mama, câncer da próstata, câncer do pulmão e o câncer de pele.

[0052] Ainda exemplos adicionais de tipos do cânceres que podem ser tratados com a composição de acordo com a invenção são o câncer suprarrenal, câncer anal, câncer do duto biliar, câncer da bexiga, câncer dos ossos, tumores cerebrais/SNC, câncer da mama, leucemia, linfoma, melanoma, osteossarcoma, câncer do ovário, rabdomiosar- coma, sarcoma dos tecidos moles, câncer testicular, câncer da tireoide, neuroblastoma, tumor de Wilms, linfoma não Hodgkin, doença de Hodgkin, retinoblastoma, câncer de colo uterino, câncer de cólon/reto, câncer de esôfago, câncer do olho, o câncer da vesícula biliar, o câncer do rim, laringe e hipofaringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, carcinoide de pulmão, linfoma, câncer mesotelioma maligno, câncer mieloma múltiplo, câncer nasal, câncer da cavidade e dos seios para- nasais, câncer de nasofaringe, câncer da cavidade oral e orofaríngea, osteossarcoma, câncer de ovário, câncer do pâncreas, câncer do pênis, tumores hipofisários, câncer de próstata, retinoblastoma, câncer da glândula salivar, sarcoma, câncer de pele, câncer de pele melanoma, câncer de pele das células de Merkel, câncer do intestino delgado, câncer do estômago, câncer testicular, câncer de timo e tireoide, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulgar e macroglobulinemia de Waldenstrom.

[0053] Também englobado pelo termo "tratamento do câncer" está a melhora dos efeitos adversos associados com o desenvolvimento do câncer ou com a terapia do câncer em curso, tais como caquexia, deficiência de vitamina D, a fadiga, a estímulo do sistema imunológico, etc. Também podem incluir o tratamento de distúrbios cognitivos que resultam da terapia do câncer e a redução da reincidência.

[0054] O pós-tratamento do câncer de acordo com a presente in venção pode ser o tratamento de quaisquer efeitos adversos associados com a própria doença do câncer, ou com o tratamento do câncer. O pós-tratamento do câncer de acordo com a presente invenção pode ser o tratamento da caquexia, da deficiência de vitamina D, da fadiga, do estímulo do sistema imunológico, etc. Ele também pode incluir o tratamento de distúrbios cognitivos que resultam da terapia do câncer e a redução da reincidência.

[0055] O suporte nutricional durante o tratamento e pós tratamento do câncer é amplamente utilizado no tratamento do câncer. A composição de acordo com a presente invenção serve ao propósito de ser um dito suporte nutricional, e também adicionalmente ser um alimento para modificação da doença, e, assim, garante duas importantes dimensões em um regime para tratamento do câncer, tudo em uma única composição.

[0056] Tal tratamento dietético com a composição de acordo com a invenção pode ser introduzido em protocolos clássicos de terapia do câncer humano como uma nova terapia adjuvante do câncer, não tóxica e facilmente aplicável, sem qualquer risco adicional para o paciente.

[0057] Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, a composição pode ser administrada a uma dosagem em uma faixa a partir de aproximadamente 600 mg/dia a aproximadamente 5.000 mg/dia de EPA e DHA, preferivelmente aproximadamente 3.000 mg/dia, mais preferivelmente aproximadamente 2.000 mg/dia e mais preferivelmente aproximadamente 1.100 mg/dia. A fim de conseguir o efeito terapêutico, a dose pode ser inferior, ou mesmo mais elevada. A composição pode ser administrada como uma bebida em uma faixa de volume de 50 - 300 mL, de um modo preferido 100 mL, mais preferivelmente de 200 ml. A pessoa que esteja necessitando da composição de acordo com a invenção pode tomar uma ou várias doses unitárias da bebida por dia. O peso corporal, etc., serão parâmetros a serem utilizados no cálculo da dosagem; por conseguinte, a dosagem pode variar de um indivíduo para outro.

[0058] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a composição pode estar na forma de bebida, em cápsula ou em pó.

[0059] Em uma outra modalidade da composição de acordo com a invenção pode ser utilizada como uma terapia adjuvante após a cirurgia do câncer, ou em combinação com outros agentes terapêuticos, tais como agentes quimioterapêuticos ou agentes anti-inflamatórios ou fármacos ou drogas hormôniois para prolongamento da vida.

[0060] O termo "em combinação" significa que a composição de acordo com a invenção e um outro agente terapêutico são administrados em uma tal quantidade e separados por horários de administração para produzir um efeito terapêutico. A composição de acordo com a invenção e o outro agente terapêutico podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente para o uso no tratamento e/ou pós- tratamento do câncer. A composição de acordo com a invenção e o outro agente terapêutico pode estar na forma de formulações separadas ou formulados em conjunto em uma formulação combinada. Incluído no "outro agente terapêutico" está a radioterapia.

[0061] Exemplos de agentes quimioterapêuticos são: doxorrubici- na/adriamicina, taxanos epirrubicina/ellence tais como paclitaxel/taxol e docetaxel/taxotere. Compostos de platina tais como cisplatina (Plati- nol, Platinol-AQ) e carboplatina ((Paraplatin), vinorelbina (Navelbine), capecitabina (Xeloda), doxorrubicina lipossômica (Doxil), a gemcitabi- na (Gemzar), mitoxantrona, ixabepilona (Ixempra®), albumina ligada a paclitaxel (Abraxane®), eribulin (Halaven®), ciclofosfamida (Cytoxan, Ceosar), foxorubicina (Adriamicina), etoposídio (VePesid), fluorouracila (5-FU), irinotecano (Camptosar), metotrexato (Folex, Mexate, ametop- terina), paclitax topotecano (Hycamtin), Taxol, Oncovin, Vincasar PFS, e vinblastina (Velban).

[0062] Exemplos de agentes anti-inflamatórios são drogas esteroi- des anti-inflamatórias, tais como os esteroides e glicocorticoides. Outros exemplos são drogas anti-inflamatórias não esteroides tais como ibuprofeno, ácido acetilsalicílico, celecoxibe e outras drogas coxibe.

[0063] Exemplos de drogas hormôniois são LFIRH (hormônio libe rador de hormônio luteinizante) tais como agonistas, goserelina, leuprorelina, triptorelina e antagonista e LFIRH tais como degarelix. Outros exemplos são antiandrogênios esteroides, tais como o acetato de ciproterona e não esteroides antiandrogênicos tais como bicaluta- mida, nilutamida, e flutamida.

[0064] Exemplos de fármacos de extensão de vida são fármacos antidiabéticos tais como a metformina, as estatinas, ácido acetilsalicíli- co, tadalafil e DFIEA (desidroepiandrosterona).

[0065] A quantidade de agente terapêutico adicional, quando ad ministrado em combinação com a composição da presente invenção, é substancialmente a quantidade e regime de dosagem empregado geralmente na terapia pelo clínico. De qualquer modo, o clínico pode variar a quantidade adicional de fármaco (ou mistura de drogas adicionais) com base no quadro clínico do paciente.

[0066] A partir da descrição acima, pode-se concluir que o uso da composição de acordo com a presente invenção apresenta efeitos claros na inibição da proliferação de células, aumentando a apoptose e retardando o desenvolvimento do tumor, assim, é adequado no tratamento do câncer.

[0067] A invenção será agora adicionalmente ilustrada com refe rência aos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

[0068] Foram utilizados três linhagens celulares epiteliais humanas de câncer de cólon. Caco-2 cultivadas em DMEM contendo 20% de FCS, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina, e 100 μg/mL de estreptomicina. HT-29 e HCT116 cultivadas em DMEM contendo 10% de FCS, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina, e 100 μg/mL de estreptomicina. DMEM contendo 10% de FCS, 1% de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina, e 100 μg/mL de estreptomicina (meio celular) foi utilizada para todas as linhagens celulares em todos os experimentos. AMOSTRAS: 1. A composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) contendo suco de fruta (de maçã, pera, romã, aronia, maracujá), óleo de peixe (7 mg/ml), isolado de proteína de leite, pectina, aroma de jaca, extrato de rosmaninho, vitamina E, vitamina D e lecitina de soja. 2. Óleo bom (não oxidado) de peixe de salmão, PV 3 e AV 2 (7 mg/ml em uma emulsão de FCS e DMSO). 3. Óleo de peixe oxidado de salmão, PV 15 e AV 13 (7 mg/ml em uma emulsão de FCS e DMSO).

[0069] Os óleos de peixe foram preparadas, como uma emulsão a mesma concentração que o óleo de peixe usado na composição de acordo com a invenção (Nutrifriend 1100) antes da adição às células como se segue: 7 mg de óleo foram misturados com 10 YI de DMSO, agitado em vórtice e colocado sob ultrassom durante 10 seguindos à 40 V em gelo. Em seguida, 1 ml de FCS foi adicionado e a mistura foi submetido a agitação em vórtice e ultrassom durante 10 segundos à 40 V em gelo. Tratamento de células e medições de efeitos antiproliferativo

[0070] A composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) e as duas emulsões de óleo foram diluídas em meio celular para as concentrações finais (em relação ao teor de óleo), como mostrado na Tabela 1. Tabela 1. Diluição das Amostras

[0071] As células foram semeadas em placas de 96 poços com 100 μl médias de 24 horas antes do experimento. No início do experimento, o meio de crescimento foi removido e substituído com meio contendo as amostras de células indicados. As células foram então incubadas durante 4 horas, quer para as medições de apoptose ou 24 horas de medição da proliferação celular.

[0072] A proliferação celular foi medida utilizando o ensaio MTT. Após 24 horas de incubação com amostras, as células foram lavadas uma vez com PBS para remover vestígios de amostras, fornecidos com meio celular novo (100 μl,/poço) e, em seguida, tratada com uma solução de MTT padrão (15 μl/poço) a 37°C durante 2 h. A taxa de proliferação celular foi determinada pela capacidade das células metabólicas ativas para clivar sal sódico tetrazólio dos cristais de formaza- no púrpura. O meio contendo MTT foi removido e o precipitado celular púrpura foi dissolvido em 0,04 M de HCl em 2-propanol (100 μl/poço). A absorbância foi medida a 562 nm por um leitor de nanoplacas SPECTROstar (BMG Labtech Gmbh, Alemanha). Cada amostra foi medida em três repetições em cada experimento, e os experimentos foram repetidos três vezes.

[0073] Além disso, a linhagem de células Caco-2 foi analisada quanto à apoptose utilizando o Ensaio caspase-Glo® 3/7 (Promega, Madison, WI). Este ensaio é um ensaio homogênio, luminescente que mede a caspase-3 e -7 atividades que ocorrem durante a apoptose. Um tempo de incubação mais curto é usado já que as atividades das caspases-3 e -7 aumentam na fase inicial da apoptose. Após 4 horas de incubação com amostras de células foram lavadas uma vez com PBS para remover vestígios das amostras, foi fornecido um novo meio celular (100 poço μl) e depois tratadas com substrato de caspase lu- minogênica 3/7 (100 μl/poço) à temperatura ambiente durante 1 h. O substrato de caspase 3/7 é clivado pela caspase-3/7 celular, e um substrato para a luciferase (aminoluciferina) é liberado, resultando na reação com a luciferase e na produção de luz. A luminescência foi detectada utilizando um Luminômetro Glomax96 para Microplacas (Pro- mega, Madison, WI).

[0074] Os resultados indicam que a composição da presente in venção, tem um efeito antiproliferativo em todas as três linhagens celulares (Figura 1), e que esta inibição da proliferação celular é devida a uma indução da apoptose (Figura 2). O maior efeito foi observado na linhagem celular de HCT116, foi em uma concentração de 0,7 mg/ml (em relação ao teor de óleo) fornecendo uma diminuição significativa (aproximadamente 50%) na proliferação celular em comparação com células de controle. Interessante e, como é evidente a partir da Figura 3, as duas amostras de controle de óleo de peixe não forneceram nenhuma inibição sobre a proliferação das células.

EXEMPLO 2 Camundongos com tumores de xenoenxerto SK-N-BE(2) tratados com a composição (suco Smartfish)

[0075] Camundongos pelados com xenoenxertos de neuroblasto ma foram tratados com a composição da presente invenção (suco Smartfish, Nutrifriend 2000) com uma dosagem de 15 mg/mL (os camundongos receberam aproximadamente 45 - 60 mg de EPA- DHA/dia/camundongo) (3 camundongos, 6 tumores) ou água potável (7 camundongos, 14 tumores) ad libitum. Como pode ser visto na Figu- ra 4 os camundongos que receberam a composição apresentaram atraso no desenvolvimento de tumores em comparação com o grupo de controle.

EXEMPLO 3 O ganho de peso em um paciente com câncer de mama quando se utiliza a composição da presente invenção

[0076] Uma paciente com câncer de mama (com recidiva) chegou a um peso de 47 kg e um valor muito baixo de vitamina D. A paciente foi tratada com a composição da presente invenção (Nutrifriend 1100) e começou a tomar duas doses por dia (cada dose (200ml) compreendendo 1.100 mg de EPA/DHA). Depois de duas semanas ela experimentou o ganho de peso e aumento de apetite. A paciente continuou a ganhar peso e atingiu 54 quilos após algumas semanas. Além disso, ela sentiu que sua força e vitalidade tinham retornado.

EXEMPLO 4 Medição da apoptose por caspase-3 em cocultura de células cancerosas do pâncreas e células NK

[0077] Os pacientes com câncer do pâncreas têm um mau prog nóstico atribuído ao elevado potencial de disseminação metastásica, proteção por mesênquima denso e ambiente de células inflamatórias, supressão imunitária e à desativação das células exterminadoras naturais (NK) de células tumorais. A curcumina foi testada em um ensaio clínico prévio com resultados modestos. No estudo seguinte, uma composição de acordo com a invenção com ou sem adição de curcu- mina foi testada no que diz respeito ao seu potencial para estimular a morte das células de câncer do pâncreas por células NK. Métodos:

[0078] Cultura celular: Células Mia Paca2 (MP2) e de adenocarci noma ductal pancreático de L3.6 (PDAC) foram obtidas a partir de T. Donahue, Cirurgia UCLA e foram propagadas em Meio de Eagle Modi- ficado por Dulbecco (DME) com 10% de soro fetal de vitela. 10.000 células foram semeadas em cada poço de placas de 24 poços e foram crescidas a 37°C e 24 h próximo à confluência antes do teste.

[0079] Células NK: Essas foram isoladas a partir de sangue hu mano por kit de isolamento de células NK (tecnologias de células- tronco, Vancouver, Canadá). Células NK foram ativadas por tratamento com IL-2 ou IL-2/CD16 como descrito por Tseng, HC et al., em "Increased lysis of stem cells but not their differenciated cells by natural killer cells; de-differenciation or reprogramming activates NK cells.” PLOS One 5 (7): el 1590, de 2010. Composição de acordo com a invenção - Smartfish Nutrifriend 2000

[0080] A composição de acordo com a invenção (Nutrifriend 2000) contendo DHA (1000 mg/200 ml) e EPA (1000 mg/200 ml) foi adquirido pela empresa Smartfish AS, Oslo, para utilização em cultura de células, diluiu-se 1:2 com soro fetal de vitelo, submetida ao ultrassom durante 30 segundos e, em seguida, diluída a 1:100 em DMEM com 10% de soro fetal de vitelo.

[0081] Ensaio citocida; cocultura de células ou MP2 L3.6 com célu las NK: células NK foram adicionados às células ou MP2 L3.6 a uma razão de 5 células NK por uma célula MP2. As coculturas foram tratados com Smartfish. A adição de DHA (50 nM) ou resolvina dl (RvDl empresa de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, 50 nM) foram testados como controles. As coculturas foram cultivadas durante 48 horas, colhidas e testadas pelo ensaio de caspase-3. Ensaios de Caspase-3:

[0082] Ensaio enzimático da caspase-3 foi realizado pelo ensaio CaspACE-3 de G-7351 (Promega Corporation, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante.

[0083] Ensaio microscópico de imunofluorescência de caspase-3: As células MP2 foram cultivadas até à confluência parcial em lâminas de câmara de 8 poços (Corning) em DME com 10% de soro fetal de vitela e foram tratados por 24 horas como indicado. Em seguida, elas foram fixadas em 4% de paraformaldeído, permeabilizadas usando 0,25 de Triton, coradas utilizando a técnica indireta com anticorpo de coelho anti-caspase-3 (ativo) (Genetex) a diluição de 1:200 seguido por ALEXA-fluor-burro anti-coelho 568 (Invitrogen) a diluição de 1:200 e FITC-faloidina (Sigma) a diluição de 1:500, montado utilizando um artefato Prolong Gold com DAPI (Invitrogen). Análise Estatística:

[0084] Os dados foram analisados através da comparação da faixa de médias (média +/- 2x erro padrão da média). Quando indicado o valor exato foi calculado pelo teste exato de Fisher.

RESULTADOS: Ensaio Enzimático da caspase-3.

[0085] A Tabela 1 mostra os resultados do tratamento de cocultura de células do câncer do pâncreas (células MP2) e células NK com Smartfish. A adição de DHA e RvDl são mostradas como controles. Tabela 1

[0086] Como mostrado na Tabela 1, as células MP2 sozinhas e células NK sozinhas estimuladas por IL-2, demonstraram muito baixa expressão da caspase-3 (3,8 μM e 2,2 μM, respectivamente), enquanto que na cocultura de células com células NK MP2 a caspase 3 a expressão foi mais elevada (5,5 +/- 0,48 μM), e foi ligeiramente aumentada pela adição de RvDl (6,3 +/- 0,31 μM) ou DHA (6,1 μM +/- 0,48 μM). O tratamento da cocultura de câncer com células NK por Smartfish aumentou a expressão da apoptose de forma significativa (9,6 +/1,1 μM).

[0087] Assim, foi demonstrado que o Smartfish potencializa os efeitos citocidas de células NK sobre células cancerosas. O Smartfish potencializa a apoptose de células cancerosas do pâncreas por células NK.

RESULTADOS Ensaio microscópico de imunofluorescência de caspase-3:

[0088] O experimento foi esboçado tal como foi apresentado na Figura 6. Resumidamente, as células NK foram estimuladas com IL-2 ou uma combinação de células IL-2 e CD 16. Células NK não estimuladas serviram de controle. Os dois grupos de células NK estimuladas foram cocultivadas com a linhagem de células cancerosas pancreáti- cas L3.6. As células de controle NK e as coculturas foram adicionalmente estimuladas com Smartfish. Imunofluorescência:

[0089] As coculturas de células cancerosas L3.6 (células cancero sas de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC)) com células NK foram fixadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo paraformaldeído a 4% (PFA), permeabilizadas por 0,25 Triton X100 (Sigma )/PBS, coradas 30 minutos com uma diluição pré- determinada do anticorpo primário anticaspase 3 (IgG de coelho GTX22302, GeneTex) anti-humano em diluição de 1:200, 30 min com o anticorpo secundário de burro fluorescente anticorpo anti-coelho (ALEXA fluor 568, Invitrogen) (diluição 1:200), 20 min de diluição 1:500 de faloidina fluorescente (488, Sigma), e montadas em meio de montagem aquoso a com DAPI (Prolong Gold antifade; Life Technologies). As fotos foram tiradas por microscópio de fluorescência (Olympus) a 20x e/ou 40x.

[0090] Os resultados são apresentados na Figura 6, que mostra a indução da apoptose (caspase-3-positivo = vermelho) em culturas de células de adenocarcinoma pancreático imortalizadas L3.6 (= grandes células verdes) cocultivadas durante a noite com células NK (IL-2) ou NK (IL-2/CD16) (= células pequenas verdes ou murchas) em um ensaio de imunofluorescência.

[0091] Células NK cultivadas sozinhas mostraram uma aparência enrugada, enquanto que as células NK cultivadas com Smartfish mostraram um citoplasma verde normal, indicando proteção por Smartfish (Painel A e D da figura 6).

[0092] A cocultura de células NK (estimulada por IL-2) e células cancerosas L3.6 sem ou com estímulo do Smartfish mostrou o seguinte: as células cancerosas L3.6 têm citoplasma verde na maior parte, indicando que elas estão sobrevivendo, enquanto a cocultura estimulada com Smartfish mostraram que apenas algumas células cancerosas sobrevivem e mostram citoplasma amarelo ou laranja, indicando a sua apoptose (Painel B e F da Figura 6).

[0093] A cocultura de células NK (estimulada por CD16 e TL2) e células L3.6 sem ou com Smartfish mostrou o seguinte: as células cancerosas L3.6 têm citoplasma verde na maior parte, indicando que eles estão sobrevivendo, enquanto a cocultura estimulada com Smartfish mostrou que as células cancerosas estão em uma aglutinadas exibindo apoptose (amarelo ou vermelho). (Painel (C) e (E) da figura 6)

[0094] As células NK nas coculturas (painel (B), (C), (E), (F) da figura 6) são apoptóticas, isto é, mostrando ou apenas núcleos ou ci- toplasma vermelho. Assim, as células cancerígenas e as células NK ambas morrem na disputa, porém mais células cancerosas morrem na presença de uma composição de acordo com a invenção. Assim, demonstrou-se que uma composição de acordo com a invenção potencializa os efeitos citocidas de células NK sobre células cancerosas, aumentando assim a apoptose. Indução de interferon-Y

[0095] Foi estudado o efeito sobre a produção de interferon-Y (IFNY) por células NK. As condições experimentais foram conforme descrito acima. O IFNY foi medido usando um ensaio de IFNY disponível comercialmente.

[0096] O ensaio para IFNY mostrou que o IFNY não foi de todo produzido somente pelas células NK, mas foi produzido pelas células NK em cocultura com células MP2 a um nível de 158 pg/ml. A produção de interferon-Y foi diminuída por Smartfish a 119 pg/ml. Os resultados são apresentados na Tabela 2, abaixo. Tabela 2

[0097] Assim, demonstrou-se que a composição de acordo com a invenção é capaz de reduzir a produção de IFNY. Tendo agora descrito a presente invenção em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo com o propósito de clareza do entendimento, será óbvio para um versado na técnica que a mesma pode ser realizada por modificação ou alteração do invento, utilizando uma ampla e equivalente faixa de condições e outros parâmetros dos mesmos, e que tais modificações ou alterações destinam-se a ser englobados dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Claims

1. Uso de uma combinação de óleo de peixe e suco em uma emulsão de óleo-em-água, em que o referido óleo de peixe é selecionado a partir de óleo de peixe com um valor Totox inferior a 20 e teor de ômega-3 superior a 10% em peso com base no peso total do óleo de peixe e em que um emulsionante adequado é usado para estabilizar a emulsão, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição para tratamento e/ou pós-tratamento de um tipo de câncer selecionado do grupo que consiste em câncer do pâncreas, câncer color- retal, câncer neurológico, câncer de mama, câncer da próstata, câncer do pulmão e câncer da pele; em que o referido pós-tratamento do câncer compreende o tratamento da caquexia, a deficiência de vitamina D, fadiga, ou estímulo do sistema imunológico.

2. Uso de acordo com as reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o valor Totox do óleo de peixe é abaixo de 10.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o teor de óleo de peixe é 0,5 a 15% em peso com base no peso total da composição.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o teor do suco é 30 a 95% em peso com base no peso total da composição.

5. Uso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido suco é selecionado a partir de frutos e bagas que apresentam um elevado nível de antioxidantes adequados.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o suco é selecionado a partir do seguinte grupo; romã, damasco, uva, laranja, amora, rosa mosqueta, abacaxi, aronia preta, amora, amora silvestre, acerola, framboesa, melancia, pêssego, uva, cereja, jambolão, maçã, manga, pera, aronia, maracujá e kiwi.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o suco é selecionado a partir do seguinte grupo; beterraba, cenoura, aronia, quava, amora ou verduras como couve, espinafre, aipo, salsa ou pepino.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido emulsionante é selecionado do seguinte grupo: sólidos do leite, de proteínas de soro de leite, de proteína de aveia e proteína de ervilha.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda pectina.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda edulcorantes, agentes aromatizantes, conservantes e antioxidantes.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é administrada a uma dosagem em uma faixa a partir de 600 mg/dia a 5.000 mg/dia de EPA e DHA, preferivelmente 3.000 mg/dia, mais preferivelmente 2.000 mg/dia e mais preferivelmente 1.100 mg/dia.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que está na forma de líquido para beber, ou em uma forma de cápsula ou de pó.