KR20160005731A

KR20160005731A - 위암의 재발을 예측하는 방법

Info

Publication number: KR20160005731A
Application number: KR1020157034350A
Authority: KR
Inventors: 다케오 후카가와; 히로키 사사키; 마사오 후쿠시마; 치하루 마모리
Original assignee: 국립연구개발법인 고쿠리츠간켄큐센터; 스미또모 베이크라이트 가부시키가이샤
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2016-01-15
Also published as: TW201522645A; JP2014236726A; CN105247074A; WO2014181782A1; RU2015151954A

Abstract

본 발명은, 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에서 측정된 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종의 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 마커 유전자의 표지 단편의 양에 관한 측정량의 결과가, 제1 임곗값을 넘었을 때, 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계를 포함한다.

Description

위암의 재발을 예측하는 방법{METHOD FOR PREDICTING RECURRENCE OF STOMACH CANCER}

본 발명은, 위암의 재발을 예측하는 방법, 및 이것에 이용하는 위암 재발 예측용 키트에 관한 것이다.

최근, DNA칩 기술을 이용한, 세포진을 대신하는 재발 예측법이 개발되고 있다.

특허문헌 1에는, TFF1, TFF2, FABP1, CK20, MUC2, CEA, TACSTD1, MASPIN, PRSS4, GW112 및 ACTB의 합계 11종류의 유전자의 발현 레벨의 측정에 근거하여, 위암의 재발 예측을 행하는 것이 기재되어 있다. 특허문헌 1의 기술에 의하면, 대상의 암환자로부터 채취한 시료를 이용하여 대상의 유전자 일부의 영역을 PCR에 의하여 증폭시켜 얻어진 PCR 증폭물과, 합계 11종류의 프로브가 고상 상에 배치되어 있는 어레이를 하이브리다이제이션시켜, 얻어지는 결과로부터, 균일하고 정확한 위암의 재발 예측을 위한 데이터 취득이 가능하게 된다고 되어 있다.

또, 비특허문헌 1에는, CK20, FABP1, TFF1 및 MASPIN에 대한 마이크로어레이 어세이와 면역 세포 화학적인 결과가 매우 일치하였던 것이 기재되어 있다.

일본 공개특허공보 2006-223303호

Annals of Surgical Oncology, 14, 1694-1702, 2007

그러나, 상기 문헌의 기술에서는, 컷오프값을 정하기 위하여, 검사 대상 검체와 동시에 조기 위암 검체를 이용한 측정을 행할 필요가 있었다.

예를 들면, 특허문헌 1의 기술에서는, 조기 위암 증례 39예의 최대 휘도값을 판정값으로 하여 이 판정값을 상회하는 휘도값이 얻어진 유전자에 대하여, "의미가 있는 발현이 있었다"고 판단하고 있다.

또, 비특허문헌 1의 기술에서는, 조기 위암 샘플 39예의 MAX SD(최대 값 플러스 표준 편차; maximum value plus standard deviation) 또는 AVG 2SD(평균 값 플러스 2배 이상의 양성 마커; average value plus twice or more positive markers)를 컷오프값으로서 설정하고, 결과적으로 후자가 유효한 것을 나타내고 있다.

따라서, 상기 문헌의 기술에서는, 40예 가까운 조기 위암의 증례를 검사마다 사용하지 않으면 적확한 위암의 재발 예측을 행하는 것이 곤란하여, 실용적인 방법은 아니라는 점이 있었다.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 검사 대상 검체와 동시에 조기 위암 검체를 이용한 측정을 행하지 않아도, 정확하게 위암의 재발을 예측할 수 있는, 간편하고 또한 실용적인 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 위암 시료(복강 내 세정액) 중에 포함되는 위암 세포에 특이적인 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하여 상기 마커 유전자의 표지 단편을 취득하는 단계와,

상기 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 식물 유래의 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체에, 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 접촉시켜, 상기 마커 유전자 검출용 프로브와 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 하이브리다이즈시키는 단계와,

하이브리다이즈시키는 상기 단계 후에, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 취득하는 단계와,

상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 기준으로 하여, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량이 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계

를 포함하고,

상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 상기 단계에 있어서, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종의 상기 마커 유전자를 이용하여, 상기 위암 시료의 양성을 판정하는 것을 특징으로 하는 위암의 재발을 예측하는 방법이 제공된다.

또, 본 발명에 의하면, 위암 세포에 특이적인 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체를 구비하고,

상기 마커 유전자는, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종이며,

위암 시료 중에 포함되는 상기 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하여, 취득된 상기 마커 유전자의 표지 단편을 상기 마커 유전자 검출용 프로브와 하이브리다이즈시키며, 하이브리다이즈 후에, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 취득하고, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 기준으로 하여, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량이 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정함으로써 위암의 재발을 예측하기 위한 위암 재발 예측용 키트가 제공된다.

이 발명에 의하면, 식물 유래의 음성 컨트롤 프로브를 담체에 고정하고, 마커 유전자 검출용 프로브와 위암 시료의 PCR 산물을 하이브리다이제이션시켜, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에서 측정된 표지 단편의 양과, 음성 컨트롤 프로브의 위치에서 측정된 표지 단편의 양의 대비 결과를 이용하여 위암의 재발을 예측한다. 이로써, 식물 유래의 핵산쇄가 음성 컨트롤이 되어, 백그라운드값을 결정할 수 있기 때문에, 검사 대상 검체와 백그라운드값을 결정하기 위한 조기 위암 검체를 동시에 측정하지 않고, 미리 정한 임곗값에 근거하여, 위암의 재발 예측을 정확하게 행할 수 있다. 따라서, 간편하고 또한 실용적인 위암 재발 예측이 실현 가능하게 된다.

본 발명에 의하면, 검사 대상 검체와 동시에 조기 위암 검체를 이용한 측정을 행하지 않아도, 정확하게 위암의 재발을 예측할 수 있는, 간편하고 또한 실용적인 방법을 제공할 수 있다.

상술한 목적, 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 설명하는 적합한 실시형태, 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의하여 더 명확해진다.
도 1은 실시형태에 관한 위암의 재발을 예측하는 방법을 설명하는 플로 차트이다.
도 2는 실시형태에 관한 위암의 재발을 예측하는 방법을 설명하는 플로 차트이다.
도 3은 실시형태에서 이용하는 DNA 마이크로어레이의 레이아웃의 일례를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 설명한다.

도 1은, 본 실시형태의 위암의 재발을 예측하는 방법을 설명하는 플로 차트이다.

도 1에 나타내는 바와 같이, 본 실시형태에 관한 위암의 재발을 예측하는 방법은, 위암 시료(복강 내 세정액) 중에 포함되는 위암 세포에 특이적인 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하여 마커 유전자의 표지 단편을 취득하는 단계와, 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 식물 유래의 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체에, 마커 유전자의 표지 단편을 접촉시켜, 마커 유전자 검출용 프로브와 마커 유전자의 표지 단편을 하이브리다이즈시키는 단계와, 하이브리다이즈시키는 단계 후에, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 마커 유전자의 표지 단편의 양에 관한 측정량을 취득하는 단계와, 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 표지 단편의 양에 관한 측정량을 기준으로 하여, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 표지 단편의 양에 관한 측정량이 제1 임곗값을 넘었을 때, 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계(도면 중, "수술 후 재발의 판정")를 포함하고 있다. 이 방법에 의하면, 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계에 있어서, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종의 마커 유전자를 이용하여, 위암 시료가 양성인지 여부를 판정하고 있다. 이렇게 함으로써, 상기 배경기술 항에서 상술한 기술과 같이 검사 대상 검체와 동시에 조기 위암 검체를 이용한 측정을 행하지 않아도, 높은 정확도로 위암의 재발을 예측할 수 있는, 간편하고 또한 실용적인 방법을 실현할 수 있다.

이하, 위암의 재발을 예측하기 위하여 본 실시형태에 관한 방법을 이용하는 것이 바람직한 이유를 설명한다.

먼저, 위암이란, 위의 점막에 발생한 악성 종양을 가리킨다. 그리고, 위암은, 진행 상태의 차이에 따라, "조기 위암"과 "진행 위암"의 2종류로 분류할 수 있다. 일반적으로, "조기 위암"이란, 암세포가, 점막층 또는 점막 하층에 존재하고 있는 것을 가리킨다. 이 "조기 위암"은, 침습성이 작은 외과적 절제나 내시경적 절제에 의하여, 그 90% 이상을 근치할 수 있다. 한편, "진행 위암"이란, 암세포가, 고유근층이나, 고유근층보다 깊은 장막하 조직, 장막에 존재하고 있는 것을 가리킨다. 이 진행 위암은, 최종적으로는 위 이외의 림프절, 복막 및 간장 등의 원격 부위에 전이된다.

여기에서, 위암의 전이에 있어서 가장 빈도가 높게 발생하는 것은 복막 전이이다. 그리고, 복막 전이는, 위암의 전이 증례 전체의 60% 정도를 차지한다. 이로 인하여, 개복 시에 또는 치료 전에 행해지는 심사 복강경 시에, 환자의 복강 내를 세정하여 얻어진 복강 세정액을 채취하여, 현미경을 이용하여 복강 내에 흩어진 암세포의 유무를 조사하는 검사가, 일상 진단으로서 행해지고 있다(세포진). 실제로, 세포진으로 양성이라고 판정되는 증례의 상당수는, 육안적으로 또는 CT 검사로 복막에 전이되어 있는 증례가 아닌, 장막 또는 장막하에 머물고 있지만, 일부의 암세포가 침윤하여, 장막을 찢고 복강 내에 미량으로 존재하고 있는 증례이다. 이로 인하여, 현재, 세포진은, 수술 후의 CT 검사나 혈중 종양 마커의 경과 관찰 등과 마찬가지로, 위암의 재발 예지 진단의 하나로서 중요한 역할을 담당하고 있다.

또, 세포진으로 양성이라고 판정된 증례 중, 수술 후의 복막 전이율은, 약 80%로 높고, 5년 생존율은, 20% 이하로 예후 불량이다. 그러나, 세포진으로 음성이라고 판정된 증례인 경우에 있어서도, 수술 후에 전이되는 증례가 많이 있으며, 이러한 증례를, 상술한 세포진으로 전이를 예지할 수 있는 비율은, 30% 정도로 되어 있다. 이로 인하여, 세포진보다 양호한 감도로 복강 내 세정액 중에 암세포가 존재하고 있는지 여부를 정확하게 판단하는 기술이 요구되고 있다.

본 실시형태에 관한 위암의 재발을 예측하는 방법은, 상술한 바와 같이, 복강 내 세정액을 시료로서 이용함과 함께, 특정의 5종의 마커 유전자를 이용하여 당해 시료 중에 위암 세포의 유전자 산물 mRNA가 포함되어 있는지 여부를 판정하는 것이다. 이와 같이 본 실시형태에 관한 방법은, 유전자 레벨에서의 해석을 가능하게 하는 것이기 때문에, 복강 내에 미량의 암세포가 존재하고 있는 경우였다고 해도, 그 존재를 검출할 수 있는 것이다.

또, 본 실시형태에 관한 방법은, 복강 내 세정액에 포함되는 세포로부터 추출한 RNA를 주형(鑄型)으로 하여, PCR을 행하여 얻어진 형광 표지된 유전자 시료의 형광을 측정함으로써, 위암의 재발을 예측하는 것이다. 즉, 본 실시형태에 관한 방법에서는, 현미경하의 세포 형태 관찰, 육안에 의한 평가가 아닌, 측정한 수치에 의하여 위암의 재발을 예측하고 있다고 할 수 있다. 이로 인하여, 본 실시형태에 관한 방법에 의하면, 간편하고 또한 실용적인 방법으로, 객관적으로 위암의 재발을 예측할 수 있다.

다음으로, 도 2를 이용하여, 본 실시형태에 관한 위암의 재발을 예측하는 상세한 방법에 대하여 상세하게 설명한다.

도 2는, 본 실시형태의 위암의 재발을 예측하는 방법을 설명하는 플로 차트이다. 본 실시형태는, 위암 시료 중에 포함되는 위암 세포에 특이적인 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 PCR에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하는 단계(S104)와, 마커 유전자의 표지 단편을 취득하는 단계(S105)와, 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체에, 마커 유전자의 표지 단편의 혼합물을 접촉시키는 단계(S107)와, 마커 유전자 검출용 프로브와 마커 유전자의 표지 단편을 하이브리다이즈시키는 단계(S108)와, S108 후에, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 표지 단편의 양을 각각 측정하는 단계(S109)와, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에서 측정된 표지 단편의 양과 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에서 측정된 표지 단편의 양을 대비하여, 대비 결과가 제1 임곗값을 넘었을 때, 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계(S110: (도면 중, "수술 후 재발의 판정"))를 포함한다.

본 실시형태에 있어서, 식물 유래의 음성 컨트롤 프로브로서는, 예를 들면 애기장대, 벼, 밀, 벌노랑이, 담배 등의 고등 식물 유래의 핵산쇄를 이용할 수 있는데, 그 중에서도 애기장대 유래의 핵산쇄가 바람직하다. 또한, 이 프로브는, 모든 인간 유래 핵산쇄와 상보성을 갖지 않거나, 또는 매우 낮은 것이다.

이하, 음성 컨트롤 프로브로서, 애기장대 유래의 DNA쇄(이하, "애기장대 DNA쇄"라고도 함)를 이용하는 예를 들어 각 단계에 대하여 구체적으로 설명한다.

먼저, 본 실시형태의 방법을 실행하기 위한 위암 재발 예측용 키트를 준비한다. 이 키트는, 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 애기장대 유전자 검출용 프로브(이하, "애기장대 프로브"라고도 함)가 소정의 위치에 각각 고정된 담체를 구비하고 있다.

마커 유전자 검출용 프로브는, 바람직하게는, 5종의 종양 마커 유전자에 대하여, 각각 특이적인 배열을 갖는 것이다. 5종의 종양 마커 유전자는, 구체적으로는, CEA(암태아성 항원), TFF1(trefoil factor family 1), FABP1(Fatty acid binding protein 1), CK20(Cytokeratin 20), 및 MUC2(장형(腸型) 뮤신)이다. 이들 5종의 종양 마커 유전자는, 모두 복강 내 세정액 중의 위암 세포의 검출에 유용하고, 활성화 중피를 구별할 수 있는 것이다. 또, 마커 유전자를 검출하기 위한 프로브로서는, 표 1에 나타내는 것을 예시할 수 있다. 구체적으로는, 배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 검출용 프로브와, 배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 검출용 프로브와, 배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 검출용 프로브와, 배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 검출용 프로브와, 배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 검출용 프로브이다. 본 실시형태에 관한 이들 5종의 마커 유전자는, 종래 사용되고 있는 마커 유전자와 비교하여, 감도(진양성률)가 높다.

예를 들면, 종래 사용되고 있는 마커 유전자로서, TACSTD1이 있다. 이 유전자를 검출하기 위한 프로브로서는, 배열 번호 7로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TACSTD1 검출용 프로브가 있다. 이 TACSTD1은, 본 실시형태에 관한 5종의 마커 유전자보다 감도(진양성률)가 떨어진다. 즉, 마커 유전자로서, TACSTD1을 이용한 경우, 재발 예측의 정확도가 저하한다.

이로 인하여, 비록, TACSTD1의 발현량이 높았다고 해도, 본 실시형태에 관한 상기 5종의 마커 유전자의 발현량이 높을 때에 양성이라고 판단하는 것이, 예측 정확도라는 관점에 있어서 우수한 재발 예측을 행할 수 있다.

담체로서는 기판, 비즈, 섬유 등 다양한 담체를 이용할 수 있다. 기판의 형상은 판 형상으로는 한정되지 않고, 예를 들면 필름 형상이나 시트 형상이어도 된다. 또, 기판은, 하나의 부재로 구성되어 있어도 되고, 복수의 부재로 구성되어 있어도 된다. 담체의 재질로서는, 금속, 유리, 플라스틱, 폴리머, 섬유 등을 이용할 수 있다. 고감도이고, 또한 동시에 다항목의 유전자를 검출하는 방법으로서는, 기판에 검출용 프로브를 고정화한 DNA 마이크로어레이를 들 수 있다. 이 DNA 마이크로어레이에는, 기판 상의 일정한 구획 내에 복수의 스폿을 마련해 두고, 각 스폿에 프로브를 각각 고정화해 두어, 마이크로어레이를 형성해 두는 것이 바람직하다.

또, 담체로서는, 고분자 물질로 이루어지는 코팅층을 표면에 포함하는 기판을 이용해도 된다. 고분자 물질로 이루어지는 코팅층을 표면에 포함하는 기판은, 소정 형상으로 가공된 기판의 표면에 고분자 물질을 포함하는 액체를 도포하고, 건조함으로써 얻을 수 있다. 또, 고분자 물질을 포함하는 액체 중에 기판을 침지하여, 건조해도 된다.

담체로서 "고분자 물질로 이루어지는 코팅층을 표면에 포함하는 기판"을 이용하는 경우, 고분자 물질로서는, 예를 들면 "인지질의 친수부를 구성하는 인산 에스터로부터 유도되는 기를 갖는 제1 단위와 카복실산 유도기를 갖는 제2 단위를 포함하는 고분자 물질"을 이용할 수 있다. "인지질의 친수부를 구성하는 인산 에스터로부터 유도되는 기를 갖는 제1 단위와 카복실산 유도기를 갖는 제2 단위를 포함하는 고분자 물질"은, 예를 들면 일본 공개특허공보 2006-187270호의 단락 0033~0066에 기재된 것을 이용할 수 있는데, 그 중에서도, 하기 일반식 (1)로 나타나는, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린(MPC)기를 갖는 제1 단량체와, p-나이트로페닐옥시카보닐폴리에틸렌글라이콜메타크릴레이트(NPMA)기를 갖는 제2 단량체와, n-뷰틸메타크릴레이트(BMA)기를 갖는 제3 단량체와의 공중합체인 폴리(MPC-co-BMA-co-NPMA)(PMBN)가 특히 바람직하다.

단, 상기 화학식 (1)에 있어서, a, b, 및 c는, 각각 독립적으로, 양의 정수이며, a가 5~200, b가 10~500, c가 1~100인 것이 바람직하다. 또, 상기 일반식 (1)에 있어서, 제1~제3 단량체가 블록 공중합하고 있어도 되고, 이들 단량체가 랜덤으로 공중합하고 있어도 된다.

또, "고분자 물질로 이루어지는 코팅층을 표면에 포함하는 기판"을 이용하는 경우, 고분자 물질로 이루어지는 코팅층을 형성시키는 기판으로서는, 플라스틱 기판이, 형상이나 사이즈의 변경에 대한 유연성이 확보되고, 유리 기판인 것에 비하여 저가로 제공할 수 있다는 관점에서 바람직하다. 이와 같은 플라스틱 재료로서는, 표면 처리의 용이성 및 양산성의 관점에서, 열가소성 수지를 이용할 수 있다.

열가소성 수지로서는, 형광 발생량이 적은 것을 이용할 수 있다. 형광 발생량이 적은 수지를 이용함으로써, DNA쇄의 검출 반응에 있어서의 백그라운드를 저하시킬 수 있기 때문에, 검출 감도를 더 향상시킬 수 있다. 형광 발생량이 적은 열가소성 수지로서는, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 직쇄상 폴리올레핀; 환상 폴리올레핀; 함불소 수지; 등을 이용할 수 있다. 상기 수지 중에서도, 포화 환상 폴리올레핀은, 내열성, 내약품성, 저형광성, 투명성 및 성형성이 특히 우수하기 때문에, 광학적인 분석에 적합하고, 기판의 재료로서 바람직하게 이용된다.

여기에서, 포화 환상 폴리올레핀이란, 환상 올레핀 구조를 갖는 중합체 단독 또는 환상 올레핀과 α-올레핀과의 공중합체를 수소 첨가한 포화 중합체를 가리킨다. 전자의 예로서는, 예를 들면 노보넨, 다이사이클로펜타다이엔, 테트라사이클로도데센으로 대표되는 노보넨계 모노머, 및 이들의 알킬 치환체를 개환 중합하여 얻어지는 중합체를 수소 첨가하여 제조되는 포화 중합체이다. 후자의 공중합체는 에틸렌이나 프로필렌, 아이소프로필렌, 1-뷰텐, 3-메틸-1-뷰텐, 1-펜텐, 3-메틸-1-펜텐, 1-헥센, 1-옥텐 등의 α-올레핀과 환상 올레핀계 모노머의 랜덤 공중합체를 수소 첨가함으로써 제조되는 포화 중합체이다. 공중합체에서는, 에틸렌과의 공중합체가 가장 바람직하다. 이들 수지는 단독으로 이용해도 되고, 2종류 또는 그 이상의 공중합체 혹은 혼합물이어도 된다. 또, 환상 올레핀 구조를 갖는 단량체가 개환 중합하여 얻어지는 포화 환상 폴리올레핀뿐만 아니라, 환상 올레핀 구조를 갖는 단량체의 부가 중합에 의하여 얻어지는 포화 환상 폴리올레핀을 이용할 수도 있다.

담체에 대한 애기장대 프로브, λDNA 프로브 및 마커 유전자 검출용 프로브(이하, 간단히 "프로브 DNA"라고도 함)의 고정화 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 담체로서, PMBN의 코팅층을 표면에 포함하는 기판을 이용하는 경우, 예를 들면 PMBN에 포함되는 p-나이트로페닐옥시카보닐기와 프로브 DNA를 반응시켜 공유결합을 형성시킴으로써, 기판 표면에서 프로브 DNA를 고정화할 수 있다.

프로브 DNA를 기판 상에 고정화할 때에는, 프로브 DNA를 용해 또는 분산한 액체를 점착하는 방법이 바람직하다. 이 프로브 DNA를 용해 또는 분산한 액체는, 예를 들면 중성으로부터 알칼리성, 예를 들면 pH를 7.6 이상으로 할 수 있다.

또, 점착 후, 기판 표면에 고정화되지 않았던 프로브 DNA를 제거하기 위하여, 순수나 완충액으로 세정해도 된다. 세정 후에는 프로브 DNA를 고정화한 이외의 기판 표면의 p-나이트로페닐옥시카보닐기의 불활성화 처리를 알칼리 화합물, 혹은 1급 아미노기를 갖는 화합물로 행해도 된다.

또, 기판에 고정화하는 프로브 DNA에는, p-나이트로페닐옥시카보닐기와의 반응성을 높이기 위하여, 아미노기를 도입해 두는 것이 바람직하다. 아미노기는 p-나이트로페닐옥시카보닐기와의 반응성이 우수하기 때문에, 아미노기가 도입된 프로브 DNA를 이용함으로써, 효율적이고 또한 강고하게 기판의 표면 상에 프로브 DNA를 고정화할 수 있다. 아미노기의 도입 위치는 프로브 DNA의 분자쇄 말단 혹은 측쇄여도 되지만, 분자쇄 말단에 도입되고 있는 것이, 상보적인 주형 DNA 단편과의 어닐링을 보다 더 효율적으로 행할 수 있다는 관점에서는, 바람직하다.

이상에 의하여, 기판의 표면 상에 표 1에 나타내는 프로브가 고정화된 DNA 마이크로어레이를 얻을 수 있다.

DNA 마이크로어레이에 의한 발현 해석을 행하는 경우에는, 보다 정확도가 높은 판정을 행하기 위하여, 내부 컨트롤이나 외부 컨트롤을 이용하는 것이 바람직하다. 본 실시형태에서는, 내부 컨트롤로서, ACTB(베타 액틴)를 이용할 수 있다. 또, 외부 컨트롤로서는, 음성 컨트롤이나 양성 컨트롤을 이용할 수 있고, 상술과 같이 본 실시형태에서는, 음성 컨트롤로서 애기장대 DNA쇄를 이용할 수 있으며, 양성 컨트롤로서 λDNA쇄를 이용할 수 있다. ACTB를 내부 컨트롤로서 이용하는 경우에는, 배열 번호 8로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 ACTB 검출용 프로브를 내부 컨트롤 프로브로서 담체에 고정시킬 수 있다. ACTB 검출용 프로브의 고정화도 애기장대 프로브나 마커 유전자 검출용 프로브의 고정화와 동일하게 행할 수 있다.

위암 재발 예측용 키트에는, 마커 유전자의 일부의 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 구비하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써, 심사 복강경 시의 세정액 혹은 개복 시 복강 내 세정액으로부터 추출한 총 RNA가 적은 경우이더라도, 증폭시켜 유효한 판정이 가능하게 된다. 표 1로 나타내는 프로브에 의하여 검출되는 각 마커 유전자의 프라이머 염기 배열을 표 2에 나타낸다. 구체적으로는, 배열 번호 10, 11로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 증폭용 프라이머 세트, 배열 번호 12, 13으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 증폭용 프라이머 세트, 배열 번호 14, 15로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 증폭용 프라이머 세트, 배열 번호 16, 17로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 증폭용 프라이머 세트, 및 배열 번호 18, 19로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 증폭용 프라이머 세트를 들 수 있다. 본 실시형태에서는, 이러한 프라이머 세트를 이용하여 위암 시료 중에 포함되는 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 PCR에 의하여 증폭시키는 것이 바람직하다. 또, 내부 컨트롤로서 ACTB를 이용하는 경우에는, 배열 번호 22, 23으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프라이머 세트에 의하여, ACTB의 일부의 영역을 증폭시켜도 된다. 또한, 표 2에는, 표 1에 나타내는 프라이머에 의하여 증폭되는 PCR 산물의 염기 길이도 함께 나타낸다.

또, 표 2에는 상기에 있어서 종래 사용되고 있는 마커 유전자로서 예시한 TACSTD1의 일부의 영역을 증폭시키기 위한, 배열 번호 20, 21로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TACSTD1 증폭용 프라이머 세트에 대해서도 함께 나타낸다.

이와 같이 하여 얻어지는 위암 재발 예측용 키트를 준비한 후, 도 2에 나타내는 바와 같이, 연구 사용 목적에 대한 인폼드·컨센트(informed consent)가 얻어진 위암 환자로부터 복강 내 세정액을 회수하고(S101), 이것을 원심하여 부유 성분인 유리 세포를 펠릿 형상으로 침전시킨 후, 그 펠릿으로부터 총 RNA를 추출한다(S102). 총 RNA의 추출 방법은 각종 방법이 고안되어, 많은 제조사에 의하여 키트화되어 있으며, 본 실시형태에 있어서는 어느 키트도 사용 가능하다.

다음으로, 위암 시료 중에 포함되는 총 RNA를 증폭시키기 위하여, RT-PCR을 행한다. 구체적으로는, 먼저, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응(Reverse Transcription, RT)에 의하여, 추출한 총 RNA를 주형으로 하여, 예를 들면 랜덤 헥사머나 올리고 dT 프라이머 등의 프라이머의 존재하에서 데옥시뉴클레오타이드 3인산(dNTP)을 기질로 하고, 추출한 총 RNA에 상보적인 cDNA를 5'3'방향으로 합성한다(S103).

그 후, 얻어진 cDNA를 이용하여 PCR 증폭 반응을 행한다(S104). 구체적으로는, 합성한 cDNA, 배열 번호 10~25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프라이머, DNA 폴리머라제 및 dNTP와, DNA 폴리머라제가 작용하는 지적(至適) 염농도 환경을 만들기 위한 버퍼 용액을 혼합하여, 시판 중인 PCR 장치에 세트한다. 사용하는 DNA 폴리머라제는, 내열성을 갖는 것이면 된다.

그 후, (1) cDNA의 열변성(94~96℃), (2) 배열 번호 10~25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프라이머의 어닐링(55~60℃), (3) DNA 폴리머라제에 의한 상보쇄의 합성(72~74℃)의 3단계의 온도 변화를, 예를 들면 20~30 사이클 반복하여, cDNA를 증폭시킨다.

여기에서, PCR 증폭 반응은, dNTP와 함께, 라벨화한 뉴클레오타이드 모노머를 이용하여 실행한다. 이렇게 함으로써, 형광 표지된 마커 유전자의 표지 단편을 취득할 수 있다. 라벨 방법은, 형광체, 광흡수체, 방사성 핵종(P³²), 효소 표지 등의 방법을 들 수 있다.

예를 들면, 형광 라벨화 뉴클레오타이드 모노머로서는, dTTP의 염기의 3위치를 형광 라벨한 Cy3-dUTP를 들 수 있다. Cy3-dUTP를 이용한 경우, 주형 DNA 단편의 아데닌 (A)에 대응하는 신장(프라이머)측의 위치에 Cy3-dUTP가 삽입된 PCR 산물을 얻을 수 있다.

또, 방사성 핵종에 의한 라벨화 뉴클레오타이드 모노머로서는, P³²-ATP, P³²-dATP를 들 수 있다.

또, 아미노알릴 dUTP를 이용하여 PCR 증폭 반응을 행하고, 반응 후에, 아미노알릴 dUTP를 포함하는 PCR 산물에 대하여, Cy3 형광 색소나 아미노기 염색 시약(NHS-시약)을 이용하여 발색시켜도 된다.

효소 표지의 방법에 있어서는, 비오틴(biotin)화 또는 다이곡시제닌(DIG: 스테로이드계 천연물)을 결합한 핵산(예를 들면, 비오틴-dUTP, DIG-dUTP)을 사용하여 증폭시킨 후, 얻어지는 PCR 산물에 알칼리포스파타제 처리하여 나이트로블루테트라졸륨(NBT)과 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 인산(BCIP)액 중에서 수시간 반응시켜 발색시킬 수도 있다.

또한, S104에서는, 역전사 반응으로 얻어진 cDNA와 함께, 양성 컨트롤 핵산쇄를 버퍼 용액에 혼합하여, 증폭 반응을 행해도 된다. 양성 컨트롤 핵산쇄로서는, 미생물 유래의 핵산쇄를 이용할 수 있고, 구체적으로는 박테리오파지 등의 바이러스 유래의 것을 들 수 있다. 양성 컨트롤 핵산쇄로서 λDNA쇄를 이용하는 경우, 양성 컨트롤 핵산쇄 증폭용 프라이머 세트로서, 표 2로 나타내는 배열 번호 24 및 25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프라이머를 이용하여 λDNA쇄의 적어도 일부의 영역을 증폭시킬 수 있다. 이렇게 함으로써, 양성 컨트롤 핵산쇄의 표지 단편을 취득할 수 있다. 이 경우, λDNA쇄를 검출하기 위하여, 양성 컨트롤 프로브로서, 표 1로 나타내는 배열 번호 9로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 λDNA 검출용 프로브를 미리 담체에 고정해 둔다. 이 λDNA 검출용 프로브는, 배열 번호 24 및 25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 프라이머에 의하여 증폭되는 λDNA쇄의 단편과 상보적으로 결합할 수 있도록 설계되어 있다.

이와 같이 하여, 표지한 PCR 산물(표지 DNA 단편)을 취득한 후(S105), 얻어진 표지 DNA 단편과 DNA 프로브를 접촉시켜 하이브리다이제이션을 행한다. 하이브리다이제이션 버퍼는, 공지의 것을 이용할 수 있는데, 예를 들면 SSC 또는 SSPE와, SDS와, 폼아마이드와의 혼합액을 이용할 수 있다.

다음으로, 혼합한 표지 DNA 단편 및 애기장대 DNA쇄를, 하이브리다이제이션 버퍼, 및 프로브 DNA가 고정화된 DNA 마이크로어레이와 함께 하이브리다이제이션 장치에 세트하고(S107), 예를 들면 45℃~60℃에서 3~24시간, 바람직하게는 3~5시간, 하이브리다이제이션한다(S108).

그 후, 마이크로어레이의 세정 후에, 시판 중인 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 표지 단편의 양을 측정한다(S109). S104에 있어서, 미생물 유래의 DNA쇄, 특히, λDNA쇄를 이용하여 마커 유전자와 함께 PCR 증폭시킨 경우에는, S109에 있어서 λDNA쇄의 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여 각 마커 유전자의 표지 단편의 양을 측정해도 된다. 구체적으로는, λDNA 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 표지 단편의 측정량이 소정의 범위가 되도록 검출 감도를 제어한다. 이렇게 함으로써, 어세이 간의 편차를 보정할 수 있다. 또, 형광 표지된 마커 유전자의 표지 단편에 대해서는, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치의 형광 강도를 각각 측정하는 것이 바람직하다.

또, 얻어진 표지 단편의 양의 실측값에 여러가지 보정을 가하여, 보정된 실측값을 실제 측정값으로 해도 된다. 예를 들면, 프로브 DNA가 고정화되어 있지 않은 담체 표면의 표지 단편의 측정량을 백그라운드로 하여 측정 결과로부터 차감하여, 측정값으로 해도 된다.

그 후, 얻어진 측정값에 근거하여 위암 시료의 수술 후 위암 재발의 예측을 행한다(S110). DNA 마이크로어레이에 의한 발현 해석을 행하는 경우에는, 각 프로브, 판정 대상이 되는 총 RNA마다 알맞는 규격화를 행하고, 각 샘플 간에서 비교 가능하게 되는 조정을 행함으로써, 보다 정확도가 높은 판정을 행할 수 있다.

구체적으로는, 각 유전자의 발현량(발현 레벨)의 컷오프값을 설정하고, 컷오프값을 상회한 유전자 수를 카운트하여, 정한 수를 상회하는지 하회하는지에 따라 판정을 행하는 방법이 유효하다. 따라서, 본 실시형태에서는, 애기장대 DNA쇄를 음성 컨트롤로 하고, 이를 기준으로 하여, 컷오프값(임곗값)을 도출한다.

임곗값을 도출하는 방법은, 의료 기관에 있어서 실제의 검체를 이용한 해석에 의하여, 경험적으로, 마커 유전자마다, 소정의 임곗값(제1 임곗값)을 정한다. 구체적으로는, 임상의 소견이나 그 외의 측정값을 맞추어 제1 임곗값이 정해진다. 그리고, 애기장대 검출용 프로브가 고정된 기판의 위치에 있어서의 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 각 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값을 산출한다. 각 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값의 산출법으로서는, 애기장대 검출용 프로브가 고정된 기판의 위치에 있어서의 표지 단편의 측정량을 1로 하여, 각 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값을 산출하는 방법이나, 애기장대 검출용 프로브가 고정된 기판의 위치에 있어서의 표지 단편의 양을 0으로 하여, 각 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값을 산출하는 방법을 들 수 있다. 또, 상댓값으로서, 자연 대수를 이용할 수도 있다. 그리고, 1개 이상의 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값을 넘은 경우에, 결과를 양성, 즉 예후 불량(재발함, 또는 재발의 가능성이 큼)이라고 예측한다. 한편, 모든 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값이 임곗값 이하인 경우에는, 결과를 음성, 즉 예후 양호(재발하지 않음, 또는 재발의 가능성이 작음)라고 판정할 수 있다. 또한, 본 실시형태에 관한 판정 수단으로서는, 이에 한정되지 않고, 설정된 임곗값을 넘은 마커 유전자가 2개 이상의 소정 수 존재한 경우에 양성이라고 판정하며, 설정된 임곗값을 넘은 마커 유전자가 이 소정 수에 미치지 않은 경우를 음성이라고 판정해도 되고, 어느 특정 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값을 넘은 경우에 양성이라고 판정하며, 이 특정의 마커 유전자의 표지 단편의 양의 상댓값이 임곗값 이하였던 경우에 음성이라고 판정해도 된다.

구체적으로 재발의 예측 방법으로서, 예를 들면 이하의 (i), (ii) 혹은 (iii)의 방법을 이용할 수 있다.

(i)의 방법은, 위암의 재발 예측을, 양성 및 음성의 2단계로 판정하는 것이다. 구체적으로는, (i)의 방법은, 애기장대 DNA의 발현량을 나타내는 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여 산출된, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2 중 어느 1개 이상의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값을 넘었을 때, 양성이라고 판단하는 방법이다. CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2는, TACSTD1과 비교하여 감도(진양성률)가 높다. 따라서, 이렇게 함으로써, 보다 정확한 위암 재발의 예측이 가능하게 된다. 한편, TACSTD1은, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2의 마커 유전자에 비하여 감도(진양성률)가 떨어진다. 따라서, TACSTD1의 발현량이 높은 경우이더라도, 1개 이상의 다른 마커 유전자의 발현량이 높을 때에 양성이라고 판단하는 것이, 예측 정확도의 관점에서 바람직하다.

(ii)의 방법은, 위암의 재발 예측을, 양성, 준양성 및 음성의 3단계로 판정하는 것이다. 구체적으로는, (ii)의 방법은, 애기장대 DNA의 발현량을 나타내는 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여 산출된, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2 중 어느 1개 이상의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값을 넘었을 때, 위암 시료가 양성이라고 판정하며, 제1 임곗값보다 낮은 제2 임곗값을 넘고, 또한 제1 임곗값보다 낮은 값일 때, 위암 시료가 준양성이라고 판정하는 방법이다. 이러한 (ii)의 방법은, 상기 (i)의 2단계 평가 방법과, 음성, 준양성 및 양성의 3단계 평가를 채용하고 있다는 점에서 상이하다. 이와 같이 3단계 판정법을 채용하고 있기 때문에, 보다 더 판정 정확도를 향상시킴과 함께, 정확한 예후 재발의 판정이 가능하게 된다. 또, (ii)의 방법에 의하면, 준양성이라는 평가 기준을 설정함으로써, 측정 기기나 측정 조건 등의 판정 조건의 차이에 따라 판정 결과가 변동되었던 임곗값 정도의 값을 나타내는 환자에 대하여, 적절한 치료를 실시하는 것이 가능해진다.

(iii)의 방법은, 상기 (ii)의 방법과 마찬가지로 3단계로 판정하는 것이지만, 양성, 준양성 및 음성의 판정 기준이 상기 (ii)의 방법과는 상이한 것이다. 그러므로, 후술에서는, 상기 (ii)의 방법에 따른 판정 결과와 구별하기 위하여, 이하에 설명하는 (iii)의 방법에 따른 판정 결과를, 양성, 약양성 및 음성의 3단계로 나타내기로 한다.

구체적으로는, (iii)의 방법은, 애기장대 DNA의 발현량을 나타내는 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여 산출된, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2 중 어느 1개 이상의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값을 넘은 경우, 또는 CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2 중 어느 2개 이상의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값보다 낮은 제2 임곗값을 넘고, 또한 제1 임곗값보다 낮은 값인 경우, 위암 시료가 양성이라고 판정하며, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2 중 어느 1개의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제1 임곗값보다 낮은 제2 임곗값을 넘고, 또한 제1 임곗값보다 낮은 값이며, 그 외의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 표지 단편의 양의 상댓값이 제2 임곗값보다 낮은 값인 경우, 위암 시료가 약양성이라고 판정하는 방법이다. 이러한 (iii)의 방법은, 상기 (ii)의 방법과 비교하여, 3단계 평가를 채용하고 있다는 점에서는 공통되지만, 보다 정확하게 위암의 재발 예측을 행한다는 관점에서, 그 판정 기준이 상이하다. 이와 같이, (iii)의 방법에서는, (ii)의 방법과 비교하여 상세하게 설정한 것이기 때문에, 측정 기기나 측정 조건 등의 판정 조건의 차이에 따라 판정 결과가 변동되었던 임곗값 정도의 값을 나타내는 환자에 대하여, 보다 정확하게 재발의 가능성을 판별할 수 있게 된다.

또, S104에 있어서, 내부 컨트롤(ACTB)이나 양성 컨트롤(λDNA)을 이용하여 PCR 증폭을 실행한 경우에는, ACTB나 λDNA의 측정 결과도 함께 고찰함으로써, S102의 추출, 또는 S108의 하이브리다이제이션이 각각 양호하게 진행되었는지 여부를 판별할 수 있다. 구체적으로는, ACTB의 결과가 음성이고, 또한 λDNA의 결과가 음성인 경우에는, S102의 추출, 및 S108의 하이브리다이제이션 모두가 불량이었던 것을 알 수 있다. 또, ACTB의 결과가 양성인 한편, λDNA의 결과가 음성이었던 경우에는, S102의 추출은 양호하게 진행되었지만, S108의 하이브리다이제이션의 진행이 불량이었던 것을 알 수 있다. ACTB의 결과가 음성이고, 또한 λDNA의 결과가 양성인 경우에는, S104의 PCR은 양호하게 진행되었지만, S102의 추출의 진행이 불량이었던 것을 알 수 있다.

또한, 본 실시형태의 판정 방법과 함께, 통상 외과적 절제 치료 증례, 심사 복강경 증례에 있어서 필수로 되어 있는 세포진의 결과에 더하여, 림프절 전이의 유무, 각종 암 마커 등의 수치를 참조하고, 상황에 따라서는 판정 방법을 구별하여 사용하는 등, 종합적으로 위암 세포의 유무를 판단하면 보다 효과적인 예측이 가능하다.

또, 본 실시형태의 판정 방법에 의하여 양성이라고 판정된 경우, 대응하는 위암 환자에 대하여, 방사선 치료, 화학 요법, 또는 이들을 조합한 추가적인 치료를 추가해도 된다. 본 실시형태의 판정 방법에서는, 양호한 정확도로 위암의 예후 재발을 예측할 수 있기 때문에, 재발의 우려가 있는 환자에게만 재발을 방지하기 위한 효과적인 치료를 추가할 수 있고, 또한 재발의 우려가 적은 환자에 대해서는, 과잉 치료를 추가하는 것을 방지할 수 있다.

다음으로, 본 실시형태의 작용 효과에 대하여 설명한다. 본 실시형태에 의하면, 식물 유래의 음성 컨트롤 핵산쇄의 적어도 일부의 영역에 상보적으로 결합하는 음성 컨트롤 프로브를 담체에 고정하고, 마커 유전자 검출용 프로브와 위암 시료의 PCR 산물을 하이브리다이제이션시킴과 함께, 음성 컨트롤 프로브와 음성 컨트롤 핵산쇄를 하이브리다이제이션시켜, 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에서 측정된 표지 단편의 양과 음성 컨트롤 프로브의 위치에서 측정된 표지 단편의 양의 대비 결과를 이용하여 위암의 재발을 예측한다. 이로써, 식물 유래의 핵산쇄가 음성 컨트롤이 되기 때문에, 검사 대상 검체와 조기 위암 검체를 동시에 측정하지 않고, 미리 정한 임곗값에 근거하여, 위암의 재발의 예측을 정확하게 행할 수 있다. 따라서, 간편하고 또한 실용적인 위암의 예후 예측이 실현 가능하게 된다.

종래, 위암의 재발의 예측에 있어서는, 대상 검체와 동시에, 음성 컨트롤로서 복강 내에 암세포가 존재하지 않는 것이라고 생각되는 Ia기의 조기 암 검체를 이용한 측정을 행하여, 조기 암 검체의 결과로부터 컷오프값을 도출하는 방법이 채용되고 있었다. 그러나, 검사마다 조기 암 검체를 복수, 예를 들면 비특허문헌 1에서는 40예 가까이, 준비하지 않으면 안되어, 실용성이나 윤리면에서 문제가 있었다.

한편, 본 실시형태에서는, 식물 유래의 DNA쇄를 음성 컨트롤로서 이용하여, 양호한 정확도로 위암의 재발을 예측할 수 있다. 따라서, 검사마다 조기 암 검체를 준비할 필요가 없어져, 실용적이다. 특히 애기장대 DNA쇄를 음성 컨트롤로서 이용함으로써, 마커 유전자와의 반응을 무시할 수 있는 레벨로 할 수 있어, 보다 양호한 정확도로 위암의 재발을 예측할 수 있다. 또한, 애기장대 유전자는, 교차 반응성이 낮은 것이 확인되고 있다. 또, 애기장대 DNA쇄는, 입수가 용이한 점에서도 메리트가 있다.

실시예

이하, 구체적인 실시예를 나타내, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.

<실시예 1>

(1) 플라스틱 기판의 제조

포화 환상 폴리올레핀 수지(5-메틸-2-노보넨의 개환 중합체의 수소 첨가물(MFR(용융 지수; Melt flow rate): 21g/10분, 수소 첨가율: 실질적으로 100%, 열변형 온도 123℃))를 이용하고, 사출 성형에 의하여 슬라이드 유리 형상의 기판을 얻었다. 얻어진 기판을 상기 화학식 (1)로 나타나는 PMBN 폴리머(MPC기:BMA기:NPMA기=23:74:3(몰비))의 0.3중량% 에탄올 용액에 침지함으로써, 기판 표면에 포스포릴콜린기와 활성 에스터기를 갖는 고분자 물질을 도입하여, 플라스틱 기판을 얻었다. 또한, MFR은, JIS K 7210: 1999법에 기재된 조건에 준하여 측정한 것이다.

(2) 프로브 DNA

5' 말단이 아미노기로 수식된, 위암 재발에 관한 마커 유전자 6종류의 특이 배열을 갖는 올리고 DNA쇄, 및 컨트롤 유전자 3종류를 준비했다. 준비한 프로브는 표 1에 기재한 9종류의 유전자에 대응한 프로브이다. 각 유전자에 대응한 프로브의 배열 번호는, CEA 검출용으로서 배열 번호 2, TFF1 검출용으로서 배열 번호 3, FABP1 검출용으로서 배열 번호 4, CK20 검출용으로서 배열 번호 5, MUC2 검출용으로서 배열 번호 6이다. 또, 내부 컨트롤로서 배열 번호 8(ACTB쇄 검출용), 음성 컨트롤로서 배열 번호 1(애기장대 DNA쇄 검출용), 양성 컨트롤로서 배열 번호 9(λDNA쇄 검출용)이다.

(3) 기판에 대한 프로브 DNA 고정

스포팅 버퍼(제품명: ×2 스포팅액, 스미토모 베이크라이트사제)를 이용하여, 본 실시예의 (2)에서 준비한 프로브 DNA를 용해하여, 10μM의 프로브 DNA 용액을 조제했다. 이 용액을 스포터(히타치 소프트웨어 엔지니어링사제 MARKS-I)를 이용하여, 300μm 직경 스폿핀으로, 본 실시예의 (1)에서 제작한 플라스틱 기판(세로 75mm x 가로 25mm)의 표면 상에 스폿했다. 스폿은, 각 프로브에 대하여, N=5로 스폿했다. 프로브 DNA를 스폿한 기판을, 80℃에서 1시간 가열하여, 프로브 DNA를 고정화시켰다. 이로써 플라스틱 기판의 폴리머 표면에 단일쇄 DNA가 고정된 DNA 마이크로어레이를 얻었다. 스폿의 레이아웃을 도 3에 나타낸다.

(4) 총 RNA의 회수

연구 사용 목적에 대한 인폼드·컨센트가 얻어진 위암 수술 중 환자에 대하여, 통상 행해지는 수술 방식에 따라 50~100mL의 생리 식염수를 이용하여 복강 내 세정을 행하고, 세정액을 회수했다. 회수된 복강 내 세정액 중 병리부에 검사 검체 20~60mL로서 제출하는 데 필요한 분량을 빼낸 잉여 검체를 검사 대상 검체로 하여, 1500rpm으로 10분간 원심하고, 상청을 제거함으로써 펠릿 형상이 된 침전 성분을 복강 내 부유 세포로서 회수했다. 회수한 세포를 배양하여, 얻어진 세포를 닛폰진사제 시약 이소젠(Isogen)에 더하여 호모지나이즈하고, 소량의 클로로폼을 넣어, 12k×g로 15분간 원심 분리시켜, 상청을 채취했다. 또한 채취량과 등량의 아이소프로판올을 더하여, 10분 이상 인큐베이트한 후, 12k×g로 10분간 원심하여, 펠릿을 회수하고, 에탄올 침전(70%)에 의하여 총 RNA를 얻었다. 이 총 RNA를 189증례분 준비하여, 진행암 샘플로 했다.

(5) 역전사 반응

역전사 반응을 행함으로써 상기 추출한 총 RNA로부터 cDNA를 제작했다.

상기 추출한 총 RNA를 0.1 또는 1μg/μL로 농도 조제하고, 조제한 총 RNA 1 또는 10μL와, 20μM의 랜덤헥사머(제품명: 랜덤 프라이머(Random primer), 다카라바이오사제) 1μL와, 10mM의 dNTP(GE 헬스케어사제) 1μL와, 정제수 9μL, 역전사 효소(인비트로젠(Invitrogen)사제, 슈퍼스크립트(SuperScript)II) 1μL, 및 RNase 억제제(로슈(Roche)사제) 1μL를 첨가하며, 42℃에서 50분 가열 유지하고 또한 72℃에서 15분 가열 유지시켜, 단일쇄 cDNA를 얻었다.

(6) 멀티플렉스 PCR 반응

복강 내 세정액으로부터 얻은 단일쇄 cDNA를 주형으로 검사 대상이 되는 마커 유전자의 cDNA를 증폭시키기 위한 PCR을 행했다. 동일 반응 중에 복수의 프라이머를 이용하는 멀티플렉스 PCR법에 의하여 cDNA의 증폭을 행했다. 동일한 cDNA에 대하여, 프라이머로서 표 2에 나타내는 배열 번호 10~25의 염기 배열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용했다.

cDNA 용액 1μL, 표 2에 나타내는 배열 번호 10~25의 염기 배열로 이루어지는 프라이머를 DEPC-처리수 중에 각각 농도 10μM로 포함하는 프라이머 용액을 0.5μL, DNA 폴리머라제(인비트로젠사제 아큐프라임(AcuuPrime)) 0.5μL, 및 λDNA쇄(다카라바이오사제)를 PCR 버퍼(인비트로젠사제 아큐프라임의 키트 내에 포함됨) 중에 용해시키고 20μL의 반응액을 조제했다. 또, PCR 산물의 표지를 위하여, 아미노알릴 dUTP(앰비온(Ambion)사제) 0.1μL를 기질로 하여, PCR의 반응 용액에 첨가했다.

조제된 반응액에 대하여, 시판 중인 서멀 사이클러(제품명: GeneAmp(등록상표) PCR 시스템 9700, 어플라이드 바이오시스템(Applied biosystem)사제)를 이용하여, (i) 열변성 95℃ 15초, (ii) 어닐링 60℃ 45초, (iii) DNA쇄의 신장 반응 72℃ 3분의 히트 사이클로, 25사이클 행하여, 아미노알릴 표지 PCR 산물을 얻었다.

정제는, 칩마다 DNA 정제 키트(퀴아젠사제 퀴아 퀵(QIA quick))를 사용하여 상기 PCR 산물의 정제를 행했다.

(7) Cy3 표지

얻어진 아미노알릴 표지 PCR 산물에 대하여, Cy3 표지를 행했다. 구체적으로는, 본 실시예의 (6)에서 얻어진 조제가 완료된 아미노알릴 표지 PCR 산물을 형광 라벨화 시약(GE 헬스케어사제 Cy3 모노-반응성 염료 팩(Cy3 Mono-reactive Dye Pack))을 사용하여 Cy3 형광 라벨화하고, 또한 DNA 정제 키트(퀴아젠사제 퀴아 퀵)를 사용하여 정제를 행하여, Cy3 형광 라벨화 PCR 산물을 얻었다.

(8) 하이브리다이제이션

Cy3 형광 라벨화 PCR 산물 45μL에 대하여, 버퍼 85μL를 첨가하여, 하이브리다이제이션 용액을 얻었다. 얻어진 하이브리다이제이션 용액의 조성은, 이하와 같다.

[하이브리다이제이션 용액］

·3 × SSPE

·10% 폼아마이드

·0.05% SDS

(3)에서 제작한 DNA 마이크로어레이를 하이브리다이제이션 장치(제노믹 솔루션스(Genomic Solutions)사제 Hyb4)에 세트하고, 상기 조성의 하이브리다이제이션 용액을 이용하여 하이브리다이제이션을 행했다. 구체적으로는, 95℃에서 5분 열변성시킨 하이브리다이제이션 용액을 실시예 1에서 제작한 DNA 마이크로어레이 상에 분주(分注)하고, 55℃에서 4시간 반응을 행했다. 하이브리다이제이션 반응 종료 후, 0.1% SDS를 포함한 2 × SSC 용액, 2 × SSC, 0.1 × SSC의 순서로 마이크로어레이의 표면을 세정하여, 하이브리다이제이션 반응을 종료했다.

(9) 측정

본 실시예 (8)에서 행한 하이브리다이제이션 반응 종료 후, 스핀 드라이한 DNA 마이크로어레이에 대하여, DNA 마이크로어레이용 스캐너(액손(Axon)사제 GenePix 4000B)를 이용하여, 프로브가 스폿된 위치마다 형광 강도를 측정했다. 측정할 때의 수광 감도(PMT)는, λDNA가 고정된 스폿에 있어서의 형광 강도가 900에서 1100이 되도록 조정했다. 형광 강도의 산출 시에는, 프로브마다 5개의 측정값이 얻어지는데, 최곳값 및 최젓값을 제외한 중간의 3개의 측정값을 평균화하고, 프로브마다 평균값을 산출하여, 이것을 형광 강도로 했다. 진행암 샘플 전체 189증례에 대하여 형광 강도를 측정했다.

(10) 상댓값을 이용한 위암의 재발 예측

얻어진 189증례의 형광 강도에 대하여, 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 백그라운드값으로 하여, 각 프로브가 고정된 위치에 있어서의 형광 강도로부터 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 차감하고, 이것을 자연 대수로 나타낸 결과를 표 3~6에 나타낸다. 또, 각 마커 유전자의 형광 강도의 상댓값(자연 대수)에 각각 임곗값을 설정하고, 그 임곗값을 넘은 경우에는, 양성으로 하고, 하회하는 경우에는, 음성으로 했다. 이 임곗값은, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 일반적인 DNA 마이크로어레이의 컷오프값의 설정이 통상 백그라운드의 3배인 것에 근거하여 CEA의 임곗값을 설정하고, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2에 대해서는, CEA의 임곗값의 약 절반으로 설정했다. 그리고, 임곗값을 넘은 경우에는, 양성으로 하고, 하회하는 경우에는, 음성으로 했다. 구체적으로는, 진행암 샘플의 마커 유전자의 임곗값은, 하기와 같이 설정했다.

CEA: 2.11

TFF1: 1.85

FABP1: 1.85

CK20: 1.85

MUC2: 1.85

진행암 샘플 전체 189증례에 대하여 양성이라고 판단된 마커 유전자의 수를 표 3~6에 함께 나타낸다. 또, 표 3~6에는, 이하에 설명하는 방법으로 얻어진 세포진의 결과, 림프절 전이의 판정 결과, 및 수술 후 경과에 대해서도 함께 나타낸다.

<세포진>

위암의 수술 중 복강 내 세정 세포진 가이드라인(일본 임상세포학회 잡지 44(1); 93-97.2001)에 근거하여, 진행암 샘플 189증례에 대하여, 세포진에 의하여 판정을 행했다. 각 증례에 대하여 회수한 복강 내 부유 세포를 슬라이드 유리 상에 올리고, 스프레더 유리를 이용하여 도말(塗抹) 표본을 제작했다. 신속하게 도말 표본을 바람 건조시켜, 그 후, 메탄올에 의하여 3분간 고정시켰다. 김자액과 순수를 1:2의 비율로 혼합시키고, 혼합액을 이용하여 표본의 염색을 행했다. 30분간 염색시킨 후, 순수로 세정하고, 건조시켜 봉하여, 표본을 완성시켰다. 광학 현미경에 의한 표본 관찰로 염색된 암세포를 찾음으로써, 세포진의 판정을 행했다. 세포진에서는, 클래스 분류를 행하여, "1"은 양성(재발함)으로 하고, "0"은 음성(재발하지 않음)으로 했다. 결과를 표 3~6에 나타낸다.

<림프절 전이>

진행암 샘플 전체 189증례에 대하여, 위암부와 함께 외과적으로 절제한 주변 림프절의 병리 진단에 의하여, 림프절 전이의 유무의 진단을 행했다. 결과를 표 3~6에 나타낸다. 또한, 표 3 및 이후의 표 중, 림프절 전이의 유무의 진단에 있어서, "0"은, 주변 림프절에 림프절 전이가 확인되지 않는 것이다. "1"은, 주변 림프절에 1개 이상 2개 이하의 림프절 전이가 확인된 것, "2"는, 주변 림프절에 3개 이상 6개 이하의 림프절 전이가 확인된 것, "3"은, 주변 림프절에 7개 이상의 림프절 전이가 확인된 것, "LN+"는, 전이 수는 불명확하지만, 주변 림프절에 림프절 전이가 확인된 것이다. 표 3 및 이후의 표 중, "0"은 음성(-, 재발하지 않음), "1", "2", "3" 및 "LN+"는 양성(+, 재발함)이다.

또, 진행암 샘플 전체 189증례의 위암 환자의 수술 후 경과에 대해서는 3년 이상, 평균 4.5년에 걸쳐 추적 조사되어, 재발 및 사망 여부의 정보를 얻었다. 표 3~6에서는, 생사의 결과도 함께 나타낸다. "alive"는 재발하지 않고 생존, "alive but recurrent"는 재발하지만 생존, "death"는 재발에 의한 사망을 나타낸다.

실시예 1의 189증례에 대하여, 후술하는 판정에 의하여 양성 또는 음성을 판정한 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7에서는, 재발한 증례와 사망한 증례 수와, 양성 혹은 음성이라고 판정된 진행암 샘플 중의 재발 및 사망 증례 수의 비율(백분율)을 대응지어 나타낸다.

표 7의 실시예의 란에는, 실시예 1의 189증례 중, 양성 마커 유전자가 1개 이상 검출된 것을 양성(+)으로서 판정하고, 양성 마커 유전자가 전혀 검출되지 않았던 것을 음성(-)으로서 판정한 결과를 나타낸다.

표 7에서는, 진행암 샘플 189증례 중, 림프절 전이가 양성인 132증례에 있어서, 세포진에 의하여 검출할 수 없었던 98증례 중, 양성이라고 판단된 20증례의 재발률은 90.0%, 사망률은 80.0%이고, 음성이었던 78증례와 비교하여, 모두 높아 예후가 나빴다. 이것은 후술하는 비교예 1의 데이터와 비교하여, 재발률이 23.3포인트, 사망률이 25.5포인트 높았다. 따라서, CEA, TFF1, FABP1, CK20 및 MUC2 중 어느 1개 이상의 마커 유전자가 양성인지 여부를 판정함으로써, 보다 정확도가 높은 예후 판정이 가능하게 되는 것이 명확해졌다.

<실시예 2>

실시예 1의 (1)~(8)의 조작을 행했다.

(8)의 하이브리다이제이션 반응 종료 후, 실시예 1의 (9)로 나타내는 바와 같이, 프로브가 스폿된 위치마다 형광 강도를 측정했다. 얻어진 189증례의 형광 강도에 대하여, 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 백그라운드값으로 하여, 각 프로브가 고정된 위치에 있어서의 형광 강도로부터 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 차감하고, 이것을 자연 대수로 나타낸 결과를 표 8~11에 나타낸다. 또, 각 마커 유전자의 형광 강도의 상댓값(자연 대수)에 각각 2개의 임곗값(제1 임곗값과 제2 임곗값)을 설정하고, 높은 쪽의 임곗값(제1 임곗값)을 넘은 경우에는, 양성으로 하고, 2개의 임곗값의 사이의 값을 나타내는 경우에는, 준양성으로 했다. 이 임곗값은, 컷오프값 부근에 값을 갖는 샘플의 측정 오차가 있는 것에 근거하여, 컷오프값의 전후 15%의 범위를 중으로 하고, 그 이상이면 고로 설정하는 것이다. 또, 이 임곗값은, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 일반적인 DNA 마이크로어레이의 컷오프값의 설정이 통상 백그라운드의 3배인 것에 근거하여 CEA의 임곗값을 설정하고, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2에 대해서는, CEA의 임곗값의 약 절반으로 설정했다. 구체적으로는, 진행암 샘플의 마커 유전자의 임곗값은, 하기와 같이 설정했다.

(제2 임곗값; 준양성)

CEA: 1.79

TFF1: 1.57

FABP1: 1.57

CK20: 1.57

MUC2: 1.57

(제1 임곗값; 양성)

CEA: 2.43

TFF1: 2.13

FABP1: 2.13

CK20: 2.13

MUC2: 2.13

진행암 샘플 전체 189증례에 대하여 준양성 또는 양성이라고 판단된 마커 유전자의 수를 표 8~11에 함께 나타낸다. 또, 표 8~11에는, 상기에서 설명한 방법으로 얻어진 세포진의 결과, 림프절 전이의 판정 결과, 및 수술 후 경과에 대해서도 함께 나타냈다.

실시예 2의 189증례 중, 상기 판정에 의하여 음성, 준양성 또는 양성을 판정한 결과를 표 12에 나타낸다. 표 12에서는, 재발한 증례와 사망한 증례 수와, 음성, 준양성 또는 양성이라고 판정된 진행암 샘플 중의 재발 및 사망 증례 수의 비율(백분율)을 대응지어 나타낸다.

표 12에서는, 진행암 샘플 189증례 중, 림프절 전이 및 세포진이 모두 음성인 57증례에 있어서, 양성이라고 판단된 3증례의 재발률은 66.7%, 사망률은 33.3%이고, 후술하는 비교예 1의 림프절 전이 및 세포진이 모두 음성인 57증례에 있어서, 양성을 나타낸 데이터와 비교하여, 재발률이 16.7포인트, 사망률이 8.3포인트 높았다. 따라서, 종래의 방법으로 재발의 가능성이 낮다고 판정되었지만 재발하게 된 증례에 대하여, 3단계 평가를 행함으로써, 보다 더 정확도가 높은 예후 판정이 가능하게 되는 것이 명확해졌다.

또, 표 12에서는, 림프절 전이가 양성인 132증례에 있어서, 세포진에 의하여 검출할 수 없었던 98증례 중, 준양성이라고 판정된 13증례의 재발률은 61.5%, 사망률은 53.8%이고, 양성이라고 판정된 13증례의 재발률은 84.6%, 사망률은 76.9%였다. 이것은, 후술하는 비교예 1에 있어서 98증례 중, 양성이라고 판정된 33증례의 재발률, 사망률과 비교하여, 포인트가 각각 향상했다. 따라서, 실시예 2의 방법에 의하면, 보다 더 정확도가 높은 예후 판정이 가능하게 되는 것이 명확해졌다.

<실시예 3>

실시예 1의 (1)~(8)의 조작을 행했다.

(8)의 하이브리다이제이션 반응 종료 후, 실시예 1의 (9)로 나타내는 바와 같이, 프로브가 스폿된 위치마다 형광 강도를 측정했다. 얻어진 189증례의 형광 강도에 대하여, 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 백그라운드값으로 하여, 각 프로브가 고정된 위치에 있어서의 형광 강도로부터 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브가 스폿된 위치의 형광 강도를 차감하고, 이것을 자연 대수로 나타낸 결과를 표 13~16에 나타낸다. 또, 각 마커 유전자의 형광 강도의 상댓값(자연 대수)에 각각 2개의 임곗값(제1 임곗값과 제2 임곗값)을 설정하고, 적어도 하나 측정 결과의 값이 높은 쪽의 임곗값(제1 임곗값)을 넘은 경우, 또는 높은 쪽의 임곗값(제1 임곗값)을 넘은 것은 없지만, 적어도 2개 이상의 측정 결과의 값이 2개의 임곗값의 사이의 값을 나타내는 경우에는, 양성으로 했다. 또, 측정 결과의 값이 높은 쪽의 임곗값(제1 임곗값)을 넘는 것은 없고, 5개의 마커 중, 1개의 마커에 대하여 측정하여 얻어진 측정 결과의 값이 2개의 임곗값의 사이의 값을 나타냄과 함께, 그 외의 마커에 대하여 측정하여 얻어진 측정 결과의 값은 낮은 쪽의 임곗값을 하회하고 있는 경우, 약양성으로 했다. 이 임곗값은, 컷오프값 부근에 값을 갖는 샘플의 측정 오차가 있는 것에 근거하여, 컷오프값의 전후 15%의 범위를 중으로 하고, 그 이상이면 고로 설정하는 것이다. 또, 이 임곗값은, 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 일반적인 DNA 마이크로어레이의 컷오프값의 설정이 통상 백그라운드의 3배인 것에 근거하여 CEA의 임곗값을 설정하고, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2에 대해서는, CEA의 임곗값의 약 절반으로 설정했다. 구체적으로는, 진행암 샘플의 마커 유전자의 임곗값은, 하기와 같이 설정했다.

(제2 임곗값)

CEA: 1.79

TFF1: 1.57

FABP1: 1.57

CK20: 1.57

MUC2: 1.57

(제1 임곗값)

CEA: 2.43

TFF1: 2.13

FABP1: 2.13

CK20: 2.13

MUC2: 2.13

진행암 샘플 전체 189증례에 대하여 약양성 또는 양성이라고 판단된 마커 유전자의 수를 표 13~16에 함께 나타낸다. 또, 표 13~16에는, 상기에서 설명한 방법으로 얻어진 세포진의 결과, 림프절 전이의 판정 결과, 및 수술 후 경과에 대해서도 함께 나타냈다.

실시예 3의 189증례 중, 상기 판정에 의하여 음성, 약양성 또는 양성을 판정한 결과를 표 17에 나타낸다. 표 17에서는, 재발한 증례와 사망한 증례 수와, 음성, 약양성 또는 양성이라고 판정된 진행암 샘플 중의 재발 및 사망 증례 수의 비율(백분율)을 대응지어 나타낸다.

표 17에서는, 진행암 샘플 189증례 중, 림프절 전이 및 세포진이 모두 음성인 57증례에 있어서, 양성이라고 판단된 5증례의 재발률은 60.0%, 사망률은 40.0%이고, 후술하는 비교예 1의 림프절 전이 및 세포진이 모두 음성인 57증례에 있어서, 양성을 나타낸 데이터와 비교하여, 재발률이 10.0포인트, 사망률이 15.0포인트 높았다. 따라서, 종래의 방법으로 재발의 가능성이 낮다고 판정되었지만 재발하게 된 증례에 대하여, 실시예 2의 방법으로부터 판정 기준을 변경한 3단계 평가를 행함으로써, 정확도가 더 높은 예후 판정이 가능하게 되는 것이 명확해졌다.

또, 표 17에서는, 림프절 전이가 양성인 132증례에 있어서, 세포진에 의하여 검출할 수 없었던 98증례 중, 약양성이라고 판정된 11증례의 재발률은 54.5%, 사망률은 45.5%이며, 양성이라고 판정된 15증례의 재발률은 86.7%, 사망률은 80.0%였다. 이것은, 비교예 1에 있어서 98증례 중, 양성이라고 판정된 33증례의 재발률, 사망률과 비교하여, 포인트가 각각 향상했다. 따라서, 실시예 3의 방법에 의하면, 매우 정확도가 높은 예후 판정이 가능하게 되는 것이 명확해졌다.

<비교예 1>

(1) DNA 마이크로어레이의 제작

실시예 1의 (1)~(3)의 조작에 따라, DNA 마이크로어레이를 제작했다. 단, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 애기장대 DNA쇄 검출용 프로브는 DNA 마이크로어레이에 고정하지 않았다.

(2) 진행암 샘플과 DNA 마이크로어레이와의 하이브리다이제이션

실시예 1의 (4)~(7)의 조작을 행하고, 얻어진 진행암 샘플 189증례의 Cy3 형광 라벨화 PCR 산물을 본 비교예 1의 (1)에서 제작한 DNA 마이크로어레이에 각각 하이브리다이즈했다. 하이브리다이제이션의 조건 및 조작은, 실시예 1의 (8)에 따랐다. 단, Cy3 형광 라벨화 PCR 산물에 애기장대 DNA쇄는 더하지 않았다.

(3) 조기 암 샘플과 DNA 마이크로어레이와의 하이브리다이제이션

세포진에 의하여 조기 암이라고 판정된 조기 암세포 25증례에 대하여, 실시예 1의 (4)~(7)로 나타내는 방법과 동일한 조작을 행하여 Cy3 형광 라벨화 PCR 산물을 준비하여, 비교예 1의 (1)에서 제작한 DNA 마이크로어레이에 하이브리다이즈했다. 이 경우에도, 하이브리다이제이션의 조건 및 조작은, 실시예 1의 (8)에 따라, Cy3 형광 라벨화 PCR 산물에 애기장대 DNA쇄는 더하지 않았다.

(4) 측정

하이브리다이제이션 반응 종료 후, 스핀 드라이한 DNA 마이크로어레이에 대하여, DNA 마이크로어레이용 스캐너(액손사제 GenePix 4000B)를 이용하여, 프로브가 스폿된 위치마다 형광 강도를 측정했다. 측정할 때의 수광 감도(PMT)는, λDNA가 고정된 스폿에 있어서의 형광 강도가 100에서 600이 되도록 조정했다. 형광 강도의 산출 시에는, 프로브마다 5개의 측정값이 얻어지지만, 최곳값 및 최젓값을 제외한 중간의 3개의 측정값을 평균화하고, 프로브마다 평균값을 산출하여, 이것을 형광 강도로 했다. 전체 189증례, 및 조기 암 샘플 25증례에 대하여 형광 강도를 각각 측정했다.

(5) 위암의 재발 예측

조기 암 샘플을 하이브리다이즈한 DNA 마이크로어레이의 측정 결과 25증례를 이용하여, 각 마커에 대하여, 평균값+그 표준 편차×2를 컷오프값으로 했다. 구체적인 컷오프값을 이하에 나타낸다.

CEA: 56.9

TFF1: 54.0

FABP1: 55.3

CK20: 53.1

MUC2: 49.8

TACSTD1: 85.1

진행암 샘플 189증례에 대하여, 컷오프값을 넘은 마커 유전자를 양성이라고 판단하고, 컷오프값 이하의 마커 유전자는 음성으로 했다. 형광 강도의 결과를 표 18~21에 나타낸다. 또, 표 18~21에는, 상기에서 설명한 방법으로 얻어진 세포진의 결과, 림프절 전이의 판정 결과, 및 수술 후 경과에 대해서도 함께 나타냈다.

표 22는 비교예 1의 결과이다. 표 22에서는 재발한 증례와 사망한 증례 수, 및 양성 혹은 음성이라고 판정된 진행암 샘플 중의 재발 및 사망 증례 수의 비율(백분율)을 각 비교예의 결과와 대응지어 나타낸다. 표 22에서는, 각 비교예에서 양성 마커 유전자가 1개 이상 검출된 것을 +로 나타내고, 전혀 검출되지 않았던 것을 -로 나타낸다.

표 22로 나타내는 바와 같이, 진행암 샘플 189증례 중, 림프절 전이가 양성인 132증례에 있어서, 세포진에 의하여 검출할 수 없었던 98증례 중, 비교예 1에 있어서 양성이라고 판단된 33증례의 재발률, 사망률은, 음성이었던 65증례와 비교하여, 모두 높아 예후가 나빴다.

이상으로부터, 실시예 1~3에 기재된 방법을 이용함으로써, 조기 암환자의 증례를 동시에 이용한 종래의 검사법(비교예 1)보다, 더 양호한 정확도로 위암의 재발 예측을 행할 수 있는 것이 명확해졌다. 림프절 전이 음성의 57증례에 대해서도, 증례 수는 적지만 마이크로어레이로 양성으로 판별된 증례의 재발률, 사망률은, 음성으로 판별된 증례에 비하여 높았다.

이 출원은, 2013년 5월 7일에 출원된 일본 특허출원 2013-097736호를 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전체를 여기에 원용한다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL CANCER CENTER SUMITOMO BAKELITE CO., LTD <120> Method for predicting recurrence of stomach cancer <130> SB-70865 <160> 25 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for arabidopsis <400> 1 agttcaagct tcattctggc gagagagcag tgaaacgtgc aatgttcaac tattcggt 58 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for CEA <400> 2 gatatagcag ccctggtgta gtttcttcat ttcaggaaga ctgacagttg ttttgcttct 60 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for TFF1 <400> 3 ttcgacgaca ccgttcgtgg ggtcccctgg tgcttctatc ctaataccat cgac 54 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for FABP1 <400> 4 cattctgcac gatttccgac acccccttga tatccttccc cttctggatg agctcttccg 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for CK20 <400> 5 tctggaggcc caactgatgc agattcggag taacatggaa cgccagaaca acgaatacca 60 <210> 6 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for MUC2 <400> 6 cggaggtttc gtacgccggc tgcaccaaga ccgtcctcat gaatcattgc tc 52 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for TACSTD1 <400> 7 gcagggtcta aaagctggtg ttattgctgt tattgtggtt gtggtgatag cagttgttgc 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for ACTB <400> 8 cctgtggcat ccacgaaact accttcaact ccatcatgaa gtgtgacgtg gacatccgca 60 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sequence for LambdaDNA <400> 9 aattcatgga aaaggtctgc gtcaaatccc cagtcgtcat gcattgcc 48 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of CEA <400> 10 tgcatctgga acttctcctg gtctc 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of CEA <400> 11 tcacgatgtt ggctaggatg gtct 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of TFF1 <400> 12 cctttggagc agagaggagg caat 24 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of TFF1 <400> 13 tcagagcagt caatctgtgt tgtgagc 27 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of FABP1 <400> 14 tcatgaaggc aatcggtctg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of FABP1 <400> 15 caatgtcacc caatgtcatg g 21 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of CK20 <400> 16 acacggtgaa ctatgggagc gatct 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of CK20 <400> 17 cttccagaag gcggcggtaa gtag 24 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of MUC2 <400> 18 ccggggagtg ctgtaagaag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of MUC2 <400> 19 ctcctctttg cagcaggagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of TACSTD1 <400> 20 tgctggggtc agaagaacag 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of TACSTD1 <400> 21 ttgagttccc tatgcatctc a 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of ACTB <400> 22 tcatcaccat tggcaatgag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of ACTB <400> 23 cactgtgttg gcgtacaggt 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of LambdaDNA <400> 24 acggacttcg ttgctttcca gtt 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence as PCR primer for a part of LambdaDNA <400> 25 gaattacagc gcaacacagc aata 24

Claims

위암 시료 중에 포함되는 위암 세포에 특이적인 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하여 상기 마커 유전자의 표지 단편을 취득하는 단계와,
상기 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 식물 유래의 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체에, 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 접촉시켜, 상기 마커 유전자 검출용 프로브와 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 하이브리다이즈시키는 단계와,
하이브리다이즈시키는 상기 단계 후에, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 취득하는 단계와,
상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 기준으로 하여, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량이 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 단계
를 포함하고,
상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 상기 단계에 있어서, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종의 상기 마커 유전자를 이용하여, 상기 위암 시료의 양성을 판정하는 것을 특징으로 하는 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 음성 컨트롤 프로브가 애기장대 유래의 DNA쇄이고,
상기 음성 컨트롤 프로브가, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 애기장대 유전자 검출용 프로브인, 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 담체에는,
배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 검출용 프로브와,
배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 검출용 프로브와,
배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 검출용 프로브와,
배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 검출용 프로브와,
배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 검출용 프로브
가 상기 마커 유전자 검출용 프로브로서 각각 소정의 위치에 고정되어 있고,
상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 취득하는 상기 단계에 있어서,
배열 번호 10 및 11로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 증폭용 프라이머와,
배열 번호 12 및 13으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 증폭용 프라이머와,
배열 번호 14 및 15로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 증폭용 프라이머와,
배열 번호 16 및 17로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 증폭용 프라이머와,
배열 번호 18 및 19로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 증폭용 프라이머
를 이용하여 상기 위암 시료 중에 포함되는 상기 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 의하여 증폭시키는, 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 상기 단계에 있어서, 상기 CEA 검출용 프로브, 상기 TFF1 검출용 프로브, 상기 FABP1 검출용 프로브, 상기 CK20 검출용 프로브, 및 상기 MUC2 검출용 프로브가 각각 고정화된 위치에서 측정된, 각각의 상기 표지 단편의 측정량의 결과 중, 적어도 하나의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 것을 포함하며,
상기 적어도 하나의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료는 양성이라고 판정하고, 또한 상기 제1 임곗값보다 낮은 제2 임곗값을 넘고, 또한 상기 제1 임곗값보다 낮을 때, 상기 위암 시료는 준양성이라고 판정하는 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 3 또는 청구항 4에 있어서,
상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 상기 단계에 있어서, 상기 CEA 검출용 프로브, 상기 TFF1 검출용 프로브, 상기 FABP1 검출용 프로브, 상기 CK20 검출용 프로브, 및 상기 MUC2 검출용 프로브가 각각 고정화된 위치에서 측정된, 각각의 상기 표지 단편의 측정량의 결과 중, 적어도 하나의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정하는 것을 포함하며,
상기 적어도 하나의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제1 임곗값을 넘은 경우, 또는 적어도 2개의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제1 임곗값보다 낮은 제2 임곗값을 넘고, 또한 상기 제1 임곗값보다 낮은 경우, 상기 위암 시료는 양성이라고 판정하며,
1개의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 제2 임곗값을 넘고, 또한 그 외의 위치에 있어서의 상기 표지 단편의 측정량이, 상기 제2 임곗값보다 낮은 경우, 상기 위암 시료는 약양성이라고 판정하는 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 취득하는 상기 단계에 있어서, 상기 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 증폭시키면서, 미생물 유래의 양성 컨트롤 핵산쇄의 적어도 일부의 영역을 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 의하여 증폭시켜, 상기 마커 유전자의 표지 단편과 함께 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 표지 단편을 취득하고,
하이브리다이즈시키는 상기 단계에 있어서, 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 상기 표지 단편과 상보적으로 결합하는 양성 컨트롤 프로브가 추가로 고정된 상기 담체에, 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 상기 표지 단편을 추가로 포함하는 혼합물을 접촉시켜, 상기 양성 컨트롤 프로브와 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 상기 표지 단편을 하이브리다이즈하며,
상기 표지 단편의 양을 측정하는 상기 단계는, 상기 양성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 표지 단편의 측정량을 기준으로 하여, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치의 상기 표지 단편의 양을 각각 측정하는, 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 6에 있어서,
상기 양성 컨트롤 핵산쇄가 λDNA쇄이고,
상기 양성 컨트롤 프로브가, 배열 번호 9로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 λDNA쇄 검출용 프로브이며,
상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 취득하는 상기 단계에 있어서, 상기 마커 유전자의 적어도 일부의 영역과 함께, 배열 번호 24 및 25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 λDNA 증폭용 프라이머를 이용하여 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 적어도 일부의 영역을 상기 폴리머라제 연쇄 반응에 의하여 증폭시키는, 위암의 재발을 예측하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 취득하는 상기 단계에 있어서, 형광 표지된 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편을 취득하고,
상기 표지 단편의 양을 측정하는 단계에 있어서, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치의 형광 강도를 각각 측정하는, 위암의 재발을 예측하는 방법.
위암 세포에 특이적인 마커 유전자를 검출하는 적어도 하나의 마커 유전자 검출용 프로브와, 음성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 각각 고정된 담체를 구비하고,
상기 마커 유전자는, CEA, TFF1, FABP1, CK20, 및 MUC2로 이루어지는 5종이며,
위암 시료 중에 포함되는 상기 마커 유전자의 적어도 일부의 영역을 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의하여 증폭시킴과 함께 표지하여, 취득된 상기 마커 유전자의 표지 단편을 상기 마커 유전자 검출용 프로브와 하이브리다이즈시키며, 하이브리다이즈 후에, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치, 및 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 취득하고, 상기 음성 컨트롤 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량을 기준으로 하여, 상기 마커 유전자 검출용 프로브가 고정된 위치에 있어서의 상기 마커 유전자의 상기 표지 단편의 양에 관한 측정량이 제1 임곗값을 넘었을 때, 상기 위암 시료가 양성이라고 판정함으로써 위암의 재발을 예측하기 위한 위암 재발 예측용 키트.
청구항 9에 있어서,
상기 음성 컨트롤 프로브가 애기장대 유래의 DNA쇄이고,
상기 음성 컨트롤 프로브가, 배열 번호 1로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 애기장대 유전자 검출용 프로브인, 위암 재발 예측용 키트.
청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
상기 담체에는,
배열 번호 2로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 검출용 프로브와,
배열 번호 3으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 검출용 프로브와,
배열 번호 4로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 검출용 프로브와,
배열 번호 5로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 검출용 프로브와,
배열 번호 6으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 검출용 프로브
가 상기 마커 유전자 검출용 프로브로서 각각 소정의 위치에 고정되어 있고,
상기 마커 유전자의 일부의 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 세트로서,
배열 번호 10 및 11로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CEA 증폭용 프라이머 세트와,
배열 번호 12 및 13으로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 TFF1 증폭용 프라이머 세트와,
배열 번호 14 및 15로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 FABP1 증폭용 프라이머 세트와,
배열 번호 16 및 17로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 CK20 증폭용 프라이머 세트와,
배열 번호 18 및 19로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 MUC2 증폭용 프라이머 세트
를 구비하는, 위암 재발 예측용 키트.
청구항 11에 있어서,
미생물 유래의 유전자 배열로 이루어지는 양성 컨트롤 핵산쇄와,
상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 적어도 일부의 영역을 증폭시키는 양성 컨트롤 핵산쇄 증폭용 프라이머 세트
를 추가로 구비하고,
상기 담체에는, 양성 컨트롤 프로브가 소정의 위치에 고정되어 있으며,
상기 양성 컨트롤 프로브는, 상기 양성 컨트롤 핵산쇄 증폭용 프라이머 세트에 의하여 증폭되는 상기 양성 컨트롤 핵산쇄의 적어도 일부의 영역에 상보적으로 결합하는, 위암 재발 예측용 키트.
청구항 12에 있어서,
상기 양성 컨트롤 핵산쇄가 λDNA쇄이고,
상기 양성 컨트롤 프로브가 배열 번호 9로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 λDNA쇄 검출용 프로브이며,
상기 양성 컨트롤 핵산쇄 증폭용 프라이머 세트가, 배열 번호 24 및 25로 나타나는 염기 배열로 이루어지는 λDNA쇄 증폭용 프라이머인, 위암 재발 예측용 키트.