KR20160000143A - C/ebp를 포함하는 유도성 t 조절세포 분화촉진 또는 안정화 조성물 및 방법 - Google Patents
C/ebp를 포함하는 유도성 t 조절세포 분화촉진 또는 안정화 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화 촉진 또는 유도성 조절 T 세포의 안정화용 조성물 및 방법과 면역질환 치료에의 용도를 개시한다.
본원에 따른 C/EBPβ는 유도성 면역조절 T 세포의 분화 촉진 및/또는 유도성 조절 T 세포를 안정화시켜, 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 C/EBPβ는 유도성 면역조절 T 세포의 분화 촉진 및/또는 유도성 조절 T 세포를 안정화시켜, 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본원은 조절성 T 세포로의 분화 및 조절성 T 세포 안정화와 이를 이용한 면역질환 치료 기술에 관한 것이다.
최근 연구결과에 의하면 CD4+ T 림프구에 속하는 두 종류의 세포인 조절성 T (regulatory T, Treg) 세포와 T 보조 17 (T helper 17, Th17) 세포가 자가면역 질환에서 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 이들 두 종류의 세포는 형질전환성장인자 (Transforming Growth Factor beta 1, TGFß1)라는 사이토카인의 영향아래 같은 전구체 세포 즉 미접촉 CD4+ T 세포로부터 생성되는 것으로 알려져 있다 (Bettelli, E. Nature. 441, 235-238 (2006)). 하지만 Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고, 면역내성에 중요한 역할을 하고, Th17 세포는 인터루킨 17을 생산하는 염증성 T 세포로 염증 반응 신호를 극대화시켜 질병의 진행을 가속화한다.
따라서 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
미국공개특허공보 2013-0071409호는 ICOS (inducible costimulator, CD278)를 이용한 Th17 세포의 조절을 통한 자가면역질환 가능성에 관하여 개시하고 있다.
미국공개특허공보 2013-0035333호는 시나바린산의 면역 반응 조절을 통한 자가면역 질환 치료제로서의 용도에 관한 것으로 아릴 하이드로카본 수용체 활성의 조절을 통한 자가면역질환 치료 방법을 개시하고 있다
하지만 면역발생과정에서 Treg과 Th17의 역할을 고려할 때 CD4+ T 세포 분화과정에서 Treg 세포로의 분화 조절 및 그 안정화를 통한 균형 조절에 기반을 둔 새로운 면역 및 염증성 질환 치료제의 개발이 필요하다.
본원은 유도성 조절 T 세포로의 분화 및 안정화 기술 및 이를 기반으로 한 면역질환 치료방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화 촉진 및/또는 유도성 조절 T 세포의 안정화용 조성물을 제공한다.
본원에서 전구 T 세포는 미접촉 T 세포, 기억 T 세포 및 효과기 T 세포를 포함하는 것이다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 C/EBP는 본원에 따른 효과를 나타내는 천연 또는 합성의 다양한 형태의 C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein)가 사용될 수 있으며, α,ß,δ, 및ε중 하나 이상이 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 ß가 사용된다.
본원에서 유도성 조절 T 세포로의 분화 및 유도성 조절 T 세포의 안정화는 본원에 따른 C/EBP에 의한 Foxp3 (forkhead box P3) 발현 억제를 방지하는 것에 의한 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다. 여기서, 상기 Foxp3 발현 억제는 억제성 사이토카인 또는 TGF-ß의 부재로 인한 것이다.
본원에 따른 C/EBP에 의한 Foxp3 발현 억제 방지는, 상기 C/EBP가 상기 Foxp3 유전자의 프로모터의 TSDR (Treg-Specific Demethylated Region)에 존재하는 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드에의 결합에 의한 것이다.
본원에 따른 조성물은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나 분화 촉진을 위해 TGF-베타를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 조성물은 상기 조성물은 유도성 조절 T 세포의 기능을 필요로 하는 다양한 면역질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 자가면역질환, 염증성 질환, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 반응의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
이런 측면에서 본원은 또한 C/EBP를 과발현하는 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
C/EBP의 과발현에 의해 본원에 따른 미접촉 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 T 세포는 유도성 조절 T 세포로 분화되고, 유도성 조절 T 세포는 그 세포 상태가 안정화되어, 면역질환 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 세포 치료제에 사용되는 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포는 자가세포, 타가세포 또는 이종세포 유래일 수 있다. 본원에 따른 세포 치료제는 예를 들면 대상체로부터 T 세포를 추출한 후, 이에 C/EBP를 도입하여 과발현 세포를 만든 뒤, 이를 다시 대상체에 도입하는 방식으로 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 세포치료제는 질환이 발생한 부위의 세포, 조직 또는 장기에 주사와 같은 방식 또는 이식 같은 방식으로 투여될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 조성물을 사용한 유도성 조절 T 세포로의 분화 또는 안정화 유도 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 도입에 의해 상기 C/EBP 단백질이 과발현되는 것인, 엑스비보, 인비보 및/또는 인비트로에서 유도성 조절 T 세포로의 분화 또는 안정화 유도하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서 본원은 또한 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 TH17 세포로의 분화 억제용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 분화 억제는 상기 C/EBP 단백질이 RORγt과의 상호작용을 통해 이의 IL -17 유전자 CNS2 영역에의 결합을 방해하는 것에 의한 것이다.
C/EBP를 통해 TH17로의 분화 억제가 가능하여 Treg/Th17 균형의 회복은 물론, T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화를 촉진시켜 TH17 세포의 억제가 가능하다.
다른 측면에서 본원은 또한 전구 T 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 TH17 분화를 억제하는 방법을 제공한다.
본원은 또한 전구 T 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하는 단계를 포함하며, 상기 도입에 의해 상기 C/EBP 단백질이 과발현되는 것인, 엑스비보, 인비보 및/또는 인비트로에서 유도성 조절 T 세포 또는 TH17 세포로의 분화 조절 방법을 제공한다.
다른 측면에서 본원은 또한 전구 T 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포에 포함된 내인성 C/EBP 유전자의 단백질로의 발현을 유도하는 단계를 포함하며, 이에 의해 상기 C/EBP 단백질이 과발현되는 것인, 엑스비보, 인비보 및/또는 인비트로에서 유도성 조절 T 세포 또는 TH17 세포로의 분화 조절 방법을 제공한다.
본원에 따른 C/EBPβ를 포함하는 조성물은 유도성 면역조절 T 세포(Treg)로의 분화를 촉진하여 Treg 세포 수의 증폭이 가능할 뿐 아니라, 상기와 같이 증폭 또는 혈액 등에서 분리된 유도성 조절 T 세포가 그 기능 및 특징을 유지할 수 있도록 안정화에도 기여한다.
나아가 본원에 따른 조성물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제한다.
따라서, 본원에 따른 조성물 및 방법은 유도성 조절 T 세포를 이용한 각종 치료 및 또는 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 각종 면역질환 예를 들면 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부 질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 연구 도구로서도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 RA의 다운스트림에서, 억제성 사이토카인의 존재하에서 C/EBP가 작동하는 것을 나타내는 결과로, 1a는 비활성화 또는 도면에 기재된 바와 같은 조건에서 24시간 동안 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 C/EBPβ mRNA를 실시간 qRT-PCR로 분석한 결과이고, 1b는 48시간 배양된 상기 같은 세포의 핵에서 C/EBPβ 단백질을 면역블롯으로 분석한 결과이고, 1c 및 e는 각각 대조군 레트로바이러스 (MigRI)로 전달이입 또는 A-C/EBP 또는 C/EBPζ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 후 48시간 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 세포내 Foxp3의 발현을 보여주는 유세포분석결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트를 나타내고, 1d 및 f는 빈도를 나타낸다.
도 2는 IFN-γ 및 IL-4에 의한 iTreg 생성 억제를 C/EBPβ 가 완전히 방어할 수 있음을 나타내는 결과로, 2a 및 c는 각각 대조군 레트로바이러스 (MigRI)로 전달이입 또는 C/EBPß를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 후 48시간 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 세포내 Foxp3의 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트를 나타내고, 2b 및 d는 3회 독립적인 실험결과에 기반한 빈도를 나타낸다 (평균 및 SEM). 2e는 대조군 레트로바이러스 (MigRI)로 전달이입 또는 C/EBPß를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 후 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서, 48시간 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포로부터 FACS를 이용하여 분리된 GFP+ 및 GFP- 세포의 실시간 정량 역전사 PCR 분석 결과로, 2회 독립적인 실험결과이며, 베타-엑틴에 대하여 노말라이즈하였다 (3중 실험의 평균 및 SEM). 도 2f는 Foxp3EGFP 마우스 유래의 CD4+ 미접촉 T 세포를 대조군 레트로바이러스 (MIN) 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스 (MIN-C/EBPβ)로 전달이입한 후 TGF-β, IL-2, anti-IFN-γ 및 anti-IL-4 항체 존재 중에서 48시간 동안 anti-CD3 및 anti-CD28 로 자극하였다. GFP+(Foxp3+) hNGFR+ T 세포를 고 순도로 분리하고 (0hr), anti-CD3 및 anti-CD28로 3일간 IL-2, anti-IFN-γ, anti-IL-4 및 anti-TGF-β 항체의 존재 중에서 재자극한 후 유세포 분석 결과이다. Foxp3 발현은 GFP 발현을 기초로 평가하였다.
도 3은 C/EBPβ-로 전달이입된 iTreg 세포에 의한 대장염 억제 효과를 나타내는 것으로, 3a는 5 x 105 개의 CD4+CD45RBhigh 세포 단독 (원) 또는 대조군 바이러스 MigRI (사각형) 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스 (삼각형) 로 전달이입된 2 x 105 개의 FACS-sorted CD4+GFP+세포로 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서 2일간 배양된 세포를 RAG-2-/-mice에 전달한 후 체중을 나타낸 것이고, 3b는 비장의 크기를 비교한 결과이고, 3c는 마우스 원위 콜론에 대한 H&E 염색결과이다.
도 4는 C/EBPβ 가 Foxp3 TSDR의 메틸-CRE 서열에 결합하여, 메틸화 의존적으로 기능하는 것을 나타내는 결과로, 4a는 Foxp3 유전자의 엑손-인트론 구조 및 Treg-특이적 탈메틸화 영역 (TSDR) (위쪽) 및 TSDR 내의 10개의 CpG 모티브 및 CRE 서열을 도식적으로 나타낸 것이다 (아래). 4b는 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 유래의 FACS-분리된 GFP+ 세포로 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서 2일간 배양된 세포에 대한 바이설파이트 서열분석 결과를 나타낸다. 도 4c는 대조군 벡터 또는 C/EBPβ로 전달이입된 JurkaT 세포의 핵추출물을 TSDR의 잠정적 비메틸- 또는 메틸화-CRE 서열을 커버하는 프로브로 분석한 EMSA 결과이다. 4d는 상술한 바와 같은 조건에서 2일간 배양된 미접촉 CD4+ T세포 ChIP 분석으로, 세포 분해물을 대조군 IgG 또는 anti-C/EBPβ 항체로 면역침전하였고, 결과는 대조군 IgG와 비교하여 면역침전에 의해 농축된 상대 값으로 나타냈다. 결과는 일관성 있는 결과를 나타내는 2회의 독립적 실험결과이다 (4중 실험의 평균 및 SEM). 4e 및 f는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타낸다.
도 5는 RORγt 및 RORα 가 억제성 사이토카인에 대한 C/EBPβ-유도성 저항을 약화시키는 결과를 나타내는 것으로, 5a는 표시된 바와 같은 조건에서 24시간 배양되거나 또는 불활성화(미접촉)된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 C/EBPβ mRNA에 대한 정량 역전사 PCR 분석결과로, 일관성 있는 결과를 나타내는, 3회 독립적인 실험 결과를 나타내고, 결과는 베타-엑틴에 대하여 노말라이즈되었다 (4중 실험의 평균 및 SEM). 5b는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타내며, 3회 독립적인 실험결과이다 (평균 및 SEM). 5c는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 A-C/EBP 또는 C/EBPζ 를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타낸다. 5d는 상술한 조건에서 2일간 배양된, C/EBPβ(MigRI vector : GFP reporter) 및 RORγt (MIN vector : hNGFR reporter)를 발현하는 레트로바이로스로 공동 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP/hNGFR-double positive (위쪽) 및 GFP-single positive (아래)로 게이트된 경우, 숫자는 각 게이트에서 Foxp3+ 세포의 퍼센트를 나타내며, 결과는 일관성 있는 2회 독립적인 실험결과이다. 5e는 상술한 발현 벡터로 전달이입된 293T 세포의 전체 세포 추출물을 이용한 C/EBPβ 및 RORγt 에 대한 면역침전 분석 결과이다.
도 6은 C/EBPβ 에 의한 TH17 분화 억제를 나타내는 것으로, 6a는 상술한 조건에서 2일간 배양되고,PMA/ionomycin로 재자극된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 및 IL-17A 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+세포에 대하여 게이트 되었으며 (왼쪽), IL-17A+세포의 빈도를 나타낸다 (오른쪽). 6b는 혼합된 골수 이식과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 6c는 상술한 조건에서 2일간 배양되고, PMA/ionomycin로 재자극된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 혼합 BM 키메라 유래의 CD4+ Foxp3 sf 미접촉 T 세포내의 IL-17A 및 Foxp3 발현에 대한 유세포 분석 결과이다. 6d는 상술한 조건에서 2일간 배양되고, PMA/ionomycin로 재자극된, C/EBPβ(MigRI vector) 및 RORγt (MIN vector)를 발현하는 레트로바이로스로 공동 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 IL-17A 및 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, GFP/hNGFR-double positive로 게이트되었다. a,c 및 d에서 숫자는 각 4중 실험에서 T세포의 퍼센트를 나타낸다. 6e는 IL-17 promoter-CNS2 루시퍼라제 리포터 벡터를 갖는 대조군 벡터 단독, RORγt 단독, RORγt 플러스 C/EBPβ로 전달이입된 JurkaT 세포에서 IL-17 promoter-CNS2 리포터를 이용한 루시퍼라제 분석결과이다. 결과는 일관성이 있는 2회 (c, d) 및 3회 (e)의 독립적인 실험결과를 나타내고, 6f는 C/EBPβ, RORγt 또는 양자로 전달이입된 JurkaT 세포의 핵추출물에 대한 IL-17 CNS2 영역의 RORE (ROR (Retinoid-related Orphan Receoptor) Response Element)를 커버하는 프로브를 이용한 EMSA 결과를 나타낸다.
도 7은 다양한 C/EBP 아이소 형태의 단백질이 억제성 사이토카인의 억제 효δ과를 극복하고 Fox3p 발현에 미치는 결과를 나타낸 것으로, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPα,β, δ, 또는 ε를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입되고, 항-CD3 및 항-CD28으로 TGF-β의 존재 중에서 2일간 그리고 항-INF-γ 및 항-IL-4 항체, 항-IL-4 항체, 항-INF-γ 항체와 함께 또는 항체 없이 자극된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+ 세포 (왼편) 및 GFP- 세포(오른쪽)에 대하여 게이트 되었으며, 숫자는 Foxp3+의 퍼센트를 나타내고, 7b는 Foxp3+의 빈도를 나타낸다 (3회 독립적인 실험, 평균 및 SEM).
도 8은 C/EBPα,β,δ,ε 또한 TH17 분화를 억제하는 결과로, 8a는 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPα,C/EBPβ, C/EBPδ, C/EBPε를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입되고, TGF-ß, IL-6, anti-IFN-ν, 및 anti IL-4 Ab의 존재 중에서 2일간 배양되고, PMA 및 ionomycin으로 3시간 재자극된, CD4+미접촉 T 세포 내의 Foxp3 및 IL-17A 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+ (윗쪽) 및 GFP- (아래쪽)에 대하여 게이트되었다. 숫자는 각 사분면의 세포 퍼센트이다. 8b는 IL-17A+ 세포의 빈도를 나타낸다.
도 2는 IFN-γ 및 IL-4에 의한 iTreg 생성 억제를 C/EBPβ 가 완전히 방어할 수 있음을 나타내는 결과로, 2a 및 c는 각각 대조군 레트로바이러스 (MigRI)로 전달이입 또는 C/EBPß를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 후 48시간 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 세포내 Foxp3의 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트를 나타내고, 2b 및 d는 3회 독립적인 실험결과에 기반한 빈도를 나타낸다 (평균 및 SEM). 2e는 대조군 레트로바이러스 (MigRI)로 전달이입 또는 C/EBPß를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 후 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서, 48시간 배양된 CD4+ 미접촉 T 세포로부터 FACS를 이용하여 분리된 GFP+ 및 GFP- 세포의 실시간 정량 역전사 PCR 분석 결과로, 2회 독립적인 실험결과이며, 베타-엑틴에 대하여 노말라이즈하였다 (3중 실험의 평균 및 SEM). 도 2f는 Foxp3EGFP 마우스 유래의 CD4+ 미접촉 T 세포를 대조군 레트로바이러스 (MIN) 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스 (MIN-C/EBPβ)로 전달이입한 후 TGF-β, IL-2, anti-IFN-γ 및 anti-IL-4 항체 존재 중에서 48시간 동안 anti-CD3 및 anti-CD28 로 자극하였다. GFP+(Foxp3+) hNGFR+ T 세포를 고 순도로 분리하고 (0hr), anti-CD3 및 anti-CD28로 3일간 IL-2, anti-IFN-γ, anti-IL-4 및 anti-TGF-β 항체의 존재 중에서 재자극한 후 유세포 분석 결과이다. Foxp3 발현은 GFP 발현을 기초로 평가하였다.
도 3은 C/EBPβ-로 전달이입된 iTreg 세포에 의한 대장염 억제 효과를 나타내는 것으로, 3a는 5 x 105 개의 CD4+CD45RBhigh 세포 단독 (원) 또는 대조군 바이러스 MigRI (사각형) 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스 (삼각형) 로 전달이입된 2 x 105 개의 FACS-sorted CD4+GFP+세포로 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서 2일간 배양된 세포를 RAG-2-/-mice에 전달한 후 체중을 나타낸 것이고, 3b는 비장의 크기를 비교한 결과이고, 3c는 마우스 원위 콜론에 대한 H&E 염색결과이다.
도 4는 C/EBPβ 가 Foxp3 TSDR의 메틸-CRE 서열에 결합하여, 메틸화 의존적으로 기능하는 것을 나타내는 결과로, 4a는 Foxp3 유전자의 엑손-인트론 구조 및 Treg-특이적 탈메틸화 영역 (TSDR) (위쪽) 및 TSDR 내의 10개의 CpG 모티브 및 CRE 서열을 도식적으로 나타낸 것이다 (아래). 4b는 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 유래의 FACS-분리된 GFP+ 세포로 TGF-β 및 기억 상층액의 존재 중에서 2일간 배양된 세포에 대한 바이설파이트 서열분석 결과를 나타낸다. 도 4c는 대조군 벡터 또는 C/EBPβ로 전달이입된 JurkaT 세포의 핵추출물을 TSDR의 잠정적 비메틸- 또는 메틸화-CRE 서열을 커버하는 프로브로 분석한 EMSA 결과이다. 4d는 상술한 바와 같은 조건에서 2일간 배양된 미접촉 CD4+ T세포 ChIP 분석으로, 세포 분해물을 대조군 IgG 또는 anti-C/EBPβ 항체로 면역침전하였고, 결과는 대조군 IgG와 비교하여 면역침전에 의해 농축된 상대 값으로 나타냈다. 결과는 일관성 있는 결과를 나타내는 2회의 독립적 실험결과이다 (4중 실험의 평균 및 SEM). 4e 및 f는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타낸다.
도 5는 RORγt 및 RORα 가 억제성 사이토카인에 대한 C/EBPβ-유도성 저항을 약화시키는 결과를 나타내는 것으로, 5a는 표시된 바와 같은 조건에서 24시간 배양되거나 또는 불활성화(미접촉)된 CD4+ 미접촉 T 세포에서 C/EBPβ mRNA에 대한 정량 역전사 PCR 분석결과로, 일관성 있는 결과를 나타내는, 3회 독립적인 실험 결과를 나타내고, 결과는 베타-엑틴에 대하여 노말라이즈되었다 (4중 실험의 평균 및 SEM). 5b는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타내며, 3회 독립적인 실험결과이다 (평균 및 SEM). 5c는 상술한 조건에서 2일간 배양된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 A-C/EBP 또는 C/EBPζ 를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP+ 로 게이트된 경우, Foxp3+ 세포의 퍼센트(왼쪽) 및 빈도(오른쪽)를 나타낸다. 5d는 상술한 조건에서 2일간 배양된, C/EBPβ(MigRI vector : GFP reporter) 및 RORγt (MIN vector : hNGFR reporter)를 발현하는 레트로바이로스로 공동 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, 숫자는 GFP/hNGFR-double positive (위쪽) 및 GFP-single positive (아래)로 게이트된 경우, 숫자는 각 게이트에서 Foxp3+ 세포의 퍼센트를 나타내며, 결과는 일관성 있는 2회 독립적인 실험결과이다. 5e는 상술한 발현 벡터로 전달이입된 293T 세포의 전체 세포 추출물을 이용한 C/EBPβ 및 RORγt 에 대한 면역침전 분석 결과이다.
도 6은 C/EBPβ 에 의한 TH17 분화 억제를 나타내는 것으로, 6a는 상술한 조건에서 2일간 배양되고,PMA/ionomycin로 재자극된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 및 IL-17A 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+세포에 대하여 게이트 되었으며 (왼쪽), IL-17A+세포의 빈도를 나타낸다 (오른쪽). 6b는 혼합된 골수 이식과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 6c는 상술한 조건에서 2일간 배양되고, PMA/ionomycin로 재자극된, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPβ를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입된 혼합 BM 키메라 유래의 CD4+ Foxp3 sf 미접촉 T 세포내의 IL-17A 및 Foxp3 발현에 대한 유세포 분석 결과이다. 6d는 상술한 조건에서 2일간 배양되고, PMA/ionomycin로 재자극된, C/EBPβ(MigRI vector) 및 RORγt (MIN vector)를 발현하는 레트로바이로스로 공동 전달이입된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 IL-17A 및 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로, GFP/hNGFR-double positive로 게이트되었다. a,c 및 d에서 숫자는 각 4중 실험에서 T세포의 퍼센트를 나타낸다. 6e는 IL-17 promoter-CNS2 루시퍼라제 리포터 벡터를 갖는 대조군 벡터 단독, RORγt 단독, RORγt 플러스 C/EBPβ로 전달이입된 JurkaT 세포에서 IL-17 promoter-CNS2 리포터를 이용한 루시퍼라제 분석결과이다. 결과는 일관성이 있는 2회 (c, d) 및 3회 (e)의 독립적인 실험결과를 나타내고, 6f는 C/EBPβ, RORγt 또는 양자로 전달이입된 JurkaT 세포의 핵추출물에 대한 IL-17 CNS2 영역의 RORE (ROR (Retinoid-related Orphan Receoptor) Response Element)를 커버하는 프로브를 이용한 EMSA 결과를 나타낸다.
도 7은 다양한 C/EBP 아이소 형태의 단백질이 억제성 사이토카인의 억제 효δ과를 극복하고 Fox3p 발현에 미치는 결과를 나타낸 것으로, 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPα,β, δ, 또는 ε를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입되고, 항-CD3 및 항-CD28으로 TGF-β의 존재 중에서 2일간 그리고 항-INF-γ 및 항-IL-4 항체, 항-IL-4 항체, 항-INF-γ 항체와 함께 또는 항체 없이 자극된 CD4+ 미접촉 T 세포 내의 Foxp3 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+ 세포 (왼편) 및 GFP- 세포(오른쪽)에 대하여 게이트 되었으며, 숫자는 Foxp3+의 퍼센트를 나타내고, 7b는 Foxp3+의 빈도를 나타낸다 (3회 독립적인 실험, 평균 및 SEM).
도 8은 C/EBPα,β,δ,ε 또한 TH17 분화를 억제하는 결과로, 8a는 대조군 바이러스 MigRI 또는 C/EBPα,C/EBPβ, C/EBPδ, C/EBPε를 발현하는 레트로바이러스로 전달이입되고, TGF-ß, IL-6, anti-IFN-ν, 및 anti IL-4 Ab의 존재 중에서 2일간 배양되고, PMA 및 ionomycin으로 3시간 재자극된, CD4+미접촉 T 세포 내의 Foxp3 및 IL-17A 발현을 보여주는 유세포분석 결과로 GFP+ (윗쪽) 및 GFP- (아래쪽)에 대하여 게이트되었다. 숫자는 각 사분면의 세포 퍼센트이다. 8b는 IL-17A+ 세포의 빈도를 나타낸다.
본원은 C/EBPβ의 조절성 T 세포의 분화 및 안정성을 향상시키고, TH17 세포 분화는 억제하는 새로운 기능 규명에 기반한 것이다.
한 양태에서 본원은 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화 촉진 및/또는 유도성 조절 T 세포의 안정화용 조성물에 관한 것이다.
본원에 따른 조성물에 의한 유도성 조절 T 세포로의 분화와 안정화는 연관되어 사용되거나 또는 독립적일 수 있다. 예를 들면 전구 T 세포의 분화를 촉진한 후, 상기 분화된 유도성 조절 T 세포의 안정화에 사용될 수 있다. 다른 측면에서 분화와 안정화는 서로 독립적인 것이다. 예를 들면 분화 촉진은 미접촉 T 세포를 수득한 후 이에 TGF-베타를 추가하여 수행될 수 있다. 후자의 경우에는 Fox3P+유도성 조절 T 세포를 분리한 후, 이에 C/EBP를 도입하여 유도성 조절 T 세포가 안정적으로 기능하게 할 수 있다.
본원에서 분화란 후술하는 전구 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화를 의미한다.
본원에서, 유도성 조절 T 세포의 “안정화”란, 분화된 유도성 조절 T 세포 및/또는 분리된 유도성 조절 T 세포가 그 기능 및 특징을 유지하게 하는 것을 말한다. 유도성 조절 T 세포의 기능 및 특징 여부는 마커의 발현 여부 등으로 파악할 수 있으며, 유도성 조절 T 세포는 후술하는 FoxP3를 특이적으로 발현한다.
본원에 따른 C/EBP (CCAAT/enhancer Binding Protein)는 염기성 영역인 루신 지퍼 (bZIP) 영역을 포함하는 전사인자로서 6개의 아이소형태, C/EBPα, β, γ, δ, ε 및 ζ를 포함한다. 일구현예에서는 아이소형태로α,ß,δ, 및ε를 포함한다. 이러한 모든 C/EBP 아이소형태는 bZIP을 포함하는 C-말단에서 상당한 상동성을 가진다 (Tsukada, J. et al., Cytokine 54, 6-19 (2011)). 에너지 대사, 조혈기능, 지방생성, 파골세포 형성 등에서의 다양한 기능이 알려져 있으나, 이의 T 세포 분화 조절과 관련되서는 알려진 바 없다.
본원에는 본원에 따른 효과를 나타내는 한 공지된 다양한 유래 또는 아이소형태의 C/EBP 패밀리에 속하는 자연적으로 분리되거나 합성된 단백질 또는 그 유전자 또는 그 기능적 동등물이 사용될 수 있다. 예를 들면 인간 C/EBP 알파 서열은 GenBank ID NC_000019.9 (cDNA), NP_004355.2 (단백질); 베타서열은 NC_000020.10 (cDNA) 및 NP_005185.2 (단백질)로 공지되어 있으며, 마우스는 NC_000068 (cDNA), NP_034013 (단백질)로 공지되어 있다.
본원에서 “기능적 동등물”이란, 야생형 아미노산 또는 핵산 서열에서 부가, 치환 또는 결실이 있으나 야생형과 실질적으로 동질의 활성을 가진 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 번호로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 일 구현예에서 아미노산의 치환은 다음과 같은 유사한 특징을 갖는 다른 아미노산으로의 보존적 치환일 수 있으며, 예를 들면 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe,Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys,Met) 내에서의 치환을 포함한다. 아미노산의 결실은 바람직하게는 본원에 따른 C/EBP의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 C/EBP 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 및/또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.
또한 본원에 따른 C/EBP 단백질은 당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터에 클로닝 한 후, 상기 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킨 후, 통상적 분리 및 정제 기술, 예를 들어 한외여과, 투석법, 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본원에 따른 C/EBP는 단백질 자체, 또는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 C/EBP를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 또는 변형된 것일 수 있으며, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 기능, 특히 본원에 따른 효과와 관련하여 유의한 변화를 유발하지 않아야 한다.
본원에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로는 당업계에 공지된 것이 사용될 수 있으며, 숙주세포 또는 발현량, 조절성 여부에 따라 결정될 수 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 벡터는 단백질 발현을 위해 숙주 유전체와 별도로 존재하여 자가 복제하거나 숙주 유전체 DNA에 통합될 수 있다. 벡터에는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 상시 발현은 물론 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 일 구현예에서 본원에 따른 단백질을 발현하는 발현벡터는 바이러스성벡터, 예를 들어, 복제 불능 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스-연관 바이러스 등이 포함된다.
상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 전달이입(transfection), 마이크로인젝션, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개 전달이입, DEAE 덱스트란-매개 전달이입, 폴리브렌-매개 전달이입, 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 기타 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992).
T 세포는 흉선에서 성숙되는 항원특이적 적응성 면역반응과 관련된 림프구로 일반적으로, 아직 항원을 만나지 못한 미접촉 T세포 (naive T cells)와, 항원을 만나 성숙한 효과 T 세포 (effector T cells) 그리고 기억 T 세포 (memory T cells)로 분류될 수 있으며, 효과 T 세포는 특정 면역반응을 수행할 수 있는 다양한 T 세포 분화될 수 있는 세포를 일컫는 것으로, 도움 T 세포 (Helper T cells), 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells) 및 자연살상 T 세포 (Natural Killer T cells)가 포함된다.
본원의 전구 T 세포는 본원의 조성물의 처리에 의해 유도성 조절 T 세포로 분화될 수 있는 세포를 포함한다. 예를 들면 상술한 미접촉 T 세포 (Navie T cells), 기억 T 세포 (memory T cells), 및 효과 T 세포 (effector T cells)를 포함한다.
본원에서 미접촉 T 세포는 항원과 접촉되지 않은 T 세포를 일컫는 것으로, 또는 많은 분열을 거친 기타 흉선 유래의 세포를 포함하는, 다양한 표현형 갖는 세포를 포함할 수 있다. 전형적으로, T세포 중에서 CD62LhighCD44low, CD45RA+CD62L+, CD45RA+CD27+, CD45RA+CCR7+ 세포를 포함한다.
기억 T 세포는 항원을 인지한 T 세포가 분화 및 선별 과정을 거친 뒤 장기간 생존하고 있다가 나중에 항원이 재차 침입하였을 때 빠르게 활성화되어 효과 T세포의 기능을 할 수 있는 잠재적 능력을 가진 세포를 말한다.
세포독성 T 세포는 그 표면에 CD8+을 발현하며, MHC class I 분자와 회합된 항원에 결합하여 바이러스로 감염된 세포와 같은 표적세포를 인지하여 제거하는 기능을 하며, 장기이식 거부반응에도 관여한다.
도움 또는 보조 T 세포는 B 세포의 플라즈마 세포, 기억 B 세포로의 성숙, 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화와 같은, 면역과정에서 다른 백혈구를 보조하는 기능을 하는 세포로서, 표면에 CD4+를 발현한다. TH1, TH2, TH3, TH17, TH9, or TFH,서브타입을 포함한다.
자연살상 T 세포는 CD1d 분자에 의해 제시되는 글리코리피드 항원을 인식하며, 도움 T 세포 및 세포독성 T 세포의 기능을 수행할 수 있다.
조절 T 세포는 천연 T 세포 (Natural regulatory T, nTreg)와 유도성 조절 T 세포 (Induced regulatory T cell, iTreg)를 포함한다. 전자는 면역 억제 기능이 있으며, Foxp3 (foxhead box P3)를 발현하며 IL-10을 생산하는 흉선에서 생산되는 CD4+ CD25+ T 세포로, 정상개체의 말초 CD4+ T 세포 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 유도성 조절 T 세포는 특정 환경 하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받아 Foxp3를 발현하여 말초에서 분화되는 면역억제효과를 나타내는 세포로, 점막표면에서의 면역억제에 중요한 역할을 한다. 일 구현예에서 본원의 조절 T 세포는 유도성 조절 T 세포이다. FoxP3는 Treg 특이적 전자인자로 다수의 중요한 T 세포 특징을 조절하며, Treg 순도를 평가하는 마커로 작용할 수 있다.
전구 T 세포에서 조절 T 세포로 분화된 후, 안정성이 현저히 향상되어, 상술한 바와 같은 유도성 조절 T 세포의 기능이 장기간 유지되어 후술하는 바와 같은 면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자에 의한 미접촉 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화 및 안정화는 억제성 사이토카인에 의한 Foxp3의 발현 억제 방지에 의한 것이다. Foxp3는 흉선 및 말초에서 분화되는 조절성 T 세포의 분화에 중요한 기능을 하는 전사인자이다 (Fontenot et al., Nature immunology 4, 330-336, 2003. Chen, W. et al., The Journal of experimental medicine 198, 1875-1886, 2003.)
본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 본원에 따른 C/EBP 단백질은 본원의 실시예에서 나타난 바와 같이 Foxp3 유전자의 프로모터의 TSDR에 존재하는 메틸화 CpG 에의 결합을 통해, 억제성 사이토카인 예를 들면 IFN-γ 및 IL-4에 의한 Foxp3 발현 억제를 방해하여, 궁극적으로 Foxp3 안정적 발현을 통해 유도성 조절 T 세포로의 분화를 촉진한다.
따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 본원에 따른 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 조성물은 면역질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있으며, 이런 관점에서 본원은 자가면역질환을 포함하는 면역질환, 염증성 질환, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 반응의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어,“면역질환”은 면역시스템의 부전에 의한 질환으로, 다양한 방식으로 분류될 수 있으며, 면역 시스템에 관여하는 성분에 따른 분류, 또는 반응성에 따라, 과민성 또는 저반응성으로 분류하거나, 또는 선천적인지 획득한 것인지 여부 등에 따라 다양한 분류가 존재한다. 일 구현예에서, 면역질환은 포유류 면역계를 구성하는 성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 면역결핍증, 알러지, 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환을 포함할 수 있다.
염증성 질환이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6,프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환의 종류로는 담즙 간경변, 만성 류마티스성 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 궤양성 대장염, 크론병, 다발성 경화증, 자가면역성 심근염, 피부경화증, 중증근육무력증, 다발성 근육염/피부 근육염, 하시모토병, 만성특발성혈소판감소성자반증, 혈구감소증, 쇼그렌 증후군, 혈관염 증후군 및 전신홍반루푸스를 포함할 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 “치료”란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병이 갖는 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며 예를 들면 면역질환의 진행을 저지하거나, 면역질환의 확산을 방지, 면역질환의 경감, 면역질환의 재발 방지 및/또는 면역질환의 증상을 완화를 포함하는 것이다.
본원에 따른 조성물은 약학 조성물의 형태로서, 치료적으로 유효한 양의 C/EBP 및/또는 이를 코딩하는 유전자를 단독으로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 활성성분의 투여의 용이성, 흡수, 보전성의 개선 등을 위해 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본원에서 “치료적으로 유효한 양”이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 유효한 양은 약 0.1 ~ 100 mg/day/체중kg, 특히 0.5 ~ 10mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 면역질환 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 당업자라면 공지된 정보를 이용하여 정확한 투여량을 결정할 수 있을 것이며, 예를 들면 Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins을 참조할 수 있다.
아울러 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본원에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
본원에 따른 조성물은 유도성 T 세포로의 분화를 촉진하여, 세포 수의 증폭이 가능할 뿐아니라, 증폭된 유도성 T 세포가 그 기능 및 특징을 유지할 수 있도록 안정화에도 기여하여, 유도성 조절 T 세포를 이용한 각종 치료 및 또는 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 C/EBP를 과발현하는 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다.
본원에서 “세포치료제” 란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 기타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 방법을 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 줄기세포치료제를 포함하는 것이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서 본원에 따른 세포치료제는 대상체에서 세포를 분리하여, 이를 생체외에서 본원에 따른 조성물로 처리하여, 유도성 조절 T 세포로 분화 한 후 이를 다시 대상체에게 이식하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 엑스 비보 세포 치료법에 사용될 수 있다.
본원의 세포치료제에 사용되는 세포는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 또는 이종 (xenogenic) 세포이며, 특히 자가 세포이다.
본원의 세포치료제에 포함되는 전구 T 세포는 미접촉 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
본원에 따른 세포치료제에 사용되는 T 세포는 말초 혈액의 단핵구세포로부터, 공지된 방법을 이용하여 분리 및 배양될 수 있으며, 예를 들면 Raulf-Heimsoth, Methods in Molecular Medicine, Volume: 138, pp17-30, 2007; Current Protocols in Immunology, 최근 판, Wiley 에 기재된 것을 참조할 수 있다.
또한 유세포 분석기 (flow cytometer) 또는 시중에서 구입할 수 있는 공지된 키트를 사용하여 분리할 수 있으며, 예를 들면 미접촉 T 세포, 기억 T 세포, 는 말초 혈액으로부터 Miltenyi Biotec 사의 분리 키트를 이용할 수 있다.
상기 과정에서 이용되는 배지로는, T 세포의 배양 및/또는 증식에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N.et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지(Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항생제 또는 항진균제(예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신) 및 글루타민 등이 포함될 수 있다.
본원에 따른 세포치료제에 사용되는 분리된 세포는 유세포 분석을 통하여 분리 및/또는 확인될 수 있다. 이러한 유세포 분석은, T 세포 특이적 표면 마커를 이용하여 실시된다. 예컨대, 유도성 조절 T 세포는 CD4+CD25+CD127Low 등과 같은 마커의 검출을 통해 확인 할 수 있다.
본원에 따른 세포치료제는 C/EBP 단백질을 과발현한다. 세포에서 단백질을 과발현하는 방법은 공지되어 있다. C/EBP 유전자를 적절한 진핵세포 발현벡터 예를 들면 파아지, 바이러스 또는 레트로바이러스 유래의 벡터 또는 플라즈미드에 발현 프로모터에 작동가능하도록 연결되도록 클로닝 하여, 발현 벡터를 구축한 후, 이를 본원에 따른 세포에 도입할 수 있다. 발현벡터 및 도입방법은 앞서 설명한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 세포치료제 또는 세포를 포함하는 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여될수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 따른 치료제 또는 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 세포치료용 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. 용어 ‘치료적으로 유효한 양’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 세포치료제는 면역질환의 치료가 필요한 부위 (세포, 조직 또는 장기)에 투여될 수 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본원의 세포치료제의 투여량은 유효성분인 유도성 조절 T 세포를 기준으로 1.0× 107 내지 1.0× 108 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0× 105 내지 1.0× 108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
본원에 따른 조성물 또는 세포치료제는 일 구현예에서 대상체에서 세포를 분리하여, 이를 생체외에서 본원에 따른 조성물로 처리하여, 유도성 조절 T 세포로 분화 한 후 이를 다시 대상체에게 이식하는 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 엑스 비보 세포 치료법에 사용될 수 있다.
이러한 측면에서 또다른 양태에서 본원은 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 처리하는 단계를 포함하는 인비트로에서 유도성 조절 T 세포로의 분화 또는 안정화 유도하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 대상체의 치료는 물론 분화된 세포는 각종 연구의 도구로서 유용하게 사용될 수 있다.
본원의 방법에 사용되는 세포의 종류, 단백질, 유전자, 벡터 등은 앞서 설명한 바를 참조할 수 있다.
또다른 양태에서 본원은 또한 C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 TH17 세포로의 분화 억제용 조성물에 관한 것이다.
전구 T 세포의 분화 과정에서 T 세포는 Treg 세포 이외에, Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 생성되나 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 요구되고 IL-17을 분비한다. Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 극대화하여 질병의 진행을 가속화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, Th17 세포의 분화 억제는 면역질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본원에 따른 C/EBP에 의한 TH17 세포로의 분화 억제는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만 본 실시예에 개시된 바와 같이 C/EBP 단백질이 RORγt과의 상호작용을 통해 이의 IL-17 유전자 CNS2 (conserved noncoding sequence 2) 영역에의 결합을 방해를 통한 것이다.
이런 측면에서 본원은 또한 전구 T 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 처리하여 상기 단백질을 과발현하는 단계를 포함하는 인비보, 엑스비보 및/또는 인비트로에서 TH17 분화를 억제하는 방법에 관한 것이다. 본원에 방법에 사용되는 전구 T 세포는 앞서 기술한 바를 참조할 수 있으며, 전구 T 세포는 자가, 타가 또는 이종 유래일 수 있다. 본원에 따른 방법은 상술한 바와 같이 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 인비보 및/또는 엑스비보 세포 치료법에 사용될 수 있다.
또다른 양태에서 본원은 또한 전구 T 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 처리하여 상기 단백질을 과발현하는 단계를 포함하는 인비보, 엑스비보 및/또는 인비트로에서 유도성 조절 T 세포 및 TH17 세포 분화 조절 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서 본원의 방법에 따른 분화조절에 의해 유도성 조절 T 세포로의 분화촉진 및/또는 안정화를 유도하고, TH17 세포의 분화를 억제한다. 이러한 조절을 통해 상술한 바와 같이 면역질환의 예방 또는 치료를 위한 인비보 및/또는 엑스비보 세포 치료법에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 포유류에서 유도성 조절 T 세포의 안정화 및/또는 분화촉진 및/또는 TH17 세포 분화 억제를 포함하는 면역질환의 치료가 필요한 대상체에게 치료적으로 유효한 양의 본원에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 면역질환 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에서 채용된 실험방법은 다음과 같다.
마우스. 모든 마우스는 서울대학교의 무병균의 병균 차단 장치를 갖춘 시설에서 사육되었으며, 동물실험은 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care & Use Committees (IACUC))의 규정에 따라 진행되었다. C57BL/6 및 Scurfy 마우스는 Jackson Laboratory (USA)에서 구입하였다. Foxp3EGFP마우스는 T. A. Chatila (University of California at Los Angeles)에서 수득하였다.
항체 및 시약. 다음의 항체 CD3ε (2C11), CD28 (37.51), PE-conjugated IL-17A (TC11-18H10), PE-conjugated CD-25 (PC61) 및 biotin-conjugated human CD271 는 BD Pharmingen 유래이고; PE-Cy7-conjugated CD4 (GK1.5), APC-conjugated Foxp3 (FJK-16s), APC-eFluor780-conjugated CD45.1 (A20), biotin-conjugated CD44 (IM7), FITC-conjugated CD44 (IM7), IL-4 (11B11) 및 IFN-γ (XMG1.2)는 eBiosciences 유래이고; TGF-β1,2,3 (1D11)는 R&D Systems 유래; C/EBPβ (C-19), RORγ (H-190)는 Santa Cruz 유래이다. 재조합 인간 TGF-β1 eBiosciences에서 구입하였다. IL-6, IFN-γ, IL-4는 Peprotech에서 수득하였으며, all-trans retinoic acid(RA, 레티노산) 및 5-azacytidine (아자사이티딘)는 Sigma사 유래이다.
인비트로 T 세포 분화. 모든 T 세포 배양에는 10% FBS, 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 및 55 μM 2-mercaptoethanol를 포함하는 PMI-1640 배지를 사용하였다. CD4+ T세포는 각 해당도면에 기재된 항체 및 사이토카인과 함께 플레이트에 결합된 anti-CD3 (3 μg/ml) 및 가용성 anti-CD28 (0.5 μg/ml) 항체로 자극되었으며, 농도는 다음과 같다: 0.5 ng/ml TGF-β, 10 U/ml IL-2, 10 ng/ml IFN-γ, 1 ng/ml IL-4, 20 ng/ml IL-6, 5 μg/ml anti-IFN-γ, 5 μg/ml anti-IL-4, 10 ng/ml anti-TGF-β, 1 μM 5-aza, 100 nM ATRA. For analysis of IL-17A 발현 분석의 경우, 재자극은 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 10 ng/ml, Sigma-Aldrich), ionomycin (0.5 μg/ml, Sigma-Aldrich) 및 Brefeldin A (eBiosciences) (추가 3시간 동안)을 이용하여 수행되었다. 기억 상층액은 플레이트 결합된 anti-CD3 (3 μg/ml) 및 anti-CD28 (3 μg/ml) 항체로 활성화된 기억 CD4+ T세포를 48시간 동안 배양한 후 수집한 것이다.
레트로바이러스 전달이입 (Retroviral transduction). 미접촉 CD4+ T세포를 플레이트 결합된 anti-CD3 (3 μg/ml) 및 용해성anti-CD28 (1 μg/ml) 항체 및 용해성 anti-IFN-γ (5 μg/ml), anti-IL-4 (5 μg/ml) 및 anti-TGF-β (10 ng/ml) 항체로 24시간 자극하였다. 이어 레트로바이러스 발현 플라스미드로 전달이입된 Phoenix 패키징 세포 유래의 6 μg/ml polybrene을 포함하는 레트로바이러스 상층액을 이용하여 1시간 동안 스핀-감염되었다. 이어 37 ℃에서 anti-IFN-γ, anti-IL-4 및 anti-TGF-β 항체와 20시간 배양한 후, 바이러스 상층액을 해당하는 적절한 사이토카인 및 항체를 포함하는 T 세포 배지로 교체하였다.
세포내 염색. Foxp3 및 IL-17A 발현 분석을 위해, CD4+T세포를 anti-CD4-PE-cy7 mAb로 염색한 후 고정하고, 이어 cytofix/permeabilization solution (BD Pharmingen)으로 투과성있게 만들었다. 이어 세포를 anti-Foxp3-APC 및 anti-IL-17A-PE mAb로 각각 염색한 후 FACS Canto II (BD biosciences)를 제조자의 방법대로 이용하여 분석하였다.
DNA 구축물. 전장 마우스 C/EBPα, β 및 δ cDNA는 유전체 DNA로부터 증폭하였다. C/EBPε, ζ 및 RORγt cDNA는 각각 마우스 골수세포 및 인비트로 생성된 TH17 세포의 총 RNA를 이용하여 역전사 PCR로 증폭한 하였다. 증폭된 산물은 서열분석된 후 레트로바이러스 벡터 (MCSV-IRES-GFP (MigRI) 및 MSCV-IRES-hNGFR (MIN) vector) 및 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터로 도입되었다. MigRI 및 MIN 벡터는 W. S. Pear (University of Pennsylvania)에서 수득하였다. Dominant-negative C/EBP (A-C/EBP)는 C. Vinson (National Institutes of Health)에서 수득하였으며 MigRI 벡터로 도입되었다. IL-17A 프로모터 및 IL-17 CNS2 영역은 PCR을 이용하여 마우스 유전체로부터 증폭한 후 pGL3-Basic 벡터(Promega)의 XhoI/HindIII 및 NheI/XhoI 부위에 도입되었다.
세포 분류 (Cell sorting). 말초 CD4+T세포는 8- 내지 12- 주령의 C57BL/6 마우스 비장 및 림프절에서 수득하였다. 미접촉 CD4+T세포 (CD4+CD25-CD44-)및 기억CD4+T세포 (CD4+CD25-CD44+)는 FACSAriaII(BD)를 이용하여 분리되었다. Foxp3EGFP-reporter 마우스 유래의 미접촉 CD4+T세포 (CD4+CD44-Foxp3-)도 FACSAriaII를 이용하여 분리되었다. 미접촉 및 기억 CD4+T세포의 순도는 각각 98% 및 95%를 상회하였다.
미접촉 CD4 + Foxp3 sf T 세포 수득을 위한 골수이식. CD45.2+Foxp3sf mice 마우스 유래 T cell-결핍된 골수 세포를 B6.SJL 마우스 (CD45.1+)유래의 골수 세포와 1:1의 비로 혼합하였다. 이를 B6.SJL 마우스에 정맥주사하였고, 이식 하루 전에 500 rad γ-선을 조사하였다.
실시간 RT-PCR을 이용한 정량. CD4+T세포 유래의 총 RNA는 TRIzol (Invitrogen)을 제조자의 방법대로 사용하여 분리하고, DNase I (Invitrogen)로 처리하였다. 이어 cDNA는 SuperScript III (Invitrogen)를 이용하여 합성한 후, 정량 실시간 PCR은 SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems)를 이용하여 ABI StepOnePlus real-time PCR system 상에서 분석하였다. 결과는 베타-엑틴에 대하여 노말라이즈되었다. 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다: C/EBPβ forward, 5’-AGCGGCTGCAGAAGAAGGT-3’; C/EBPβ reverse, 5’-GGCAGCTGCTTGAACAAGTTC-3’; Foxp3 forward, 5’-GGACAGACCACACTTCATGCA-3’; Foxp3 reverse, 5’-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3’; β-actin forward, 5’-CAACGAGCGGTTCCGATG-3’; β-actin reverse, 5’-GCCACAGGATTCCATACCCA-3‘.
크로마틴 면역침전 분석. ChIP 분석은 제조자 (Upstate/Millopore)의 방법대로 수행하였다. 요약하면, 세포 (2-3x106)를 1% 포름알데하이드로 고정한 후 초음파처리한 후 ProteinA/salmon sperm DNA(Upstate/Millipore)로 처리하였다. 이어 항체 (normal rabbit IgG, Millipore; anti-C/EBPβ, Santa Cruz)를 이용하여 하룻밤 면역침전을 수행한 후 1시간 동안 ProteinA/salmonspermDNA(Upstate/Millipore)로 처리하였다. 침전물을 탈고정화 한 후 DNA를 분리하였다. 침전된 DNA에 대하여 실시간 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다: Foxp3 CNS2 forward, 5’-CCTCCTTGTTGCCGATGAA-3’; Foxp3 CNS2 reverse, 5’-CACAACCTGAACTTGGCCAGAT-3’.
바이설파이트 서열분석. LaboPass™ tissue Mini Kit (Cosmo genetech)을 제조자의 방법대로 사용하여 수컷 마우스에서 분리한 CD4+T세포에서 유전체 DNA를 분리 정제하였다. 메틸화 분석은 Methyl Detector kit (Active Motif)를 제조자의 방법대로 이용하여 분석하였다. PCR은 PfuTurbo Cx hotstart DNA polymerase (Stratagene) 와 프라이머 세트 (Foxp3 CNS2 forward, 5’-TTTTGGGTTTTTTTGGTATTTAAGA-3’; Foxp3 CNS2 reverse, 5’-TTAACCAAATTTTTCTACCATTAAC-3’)를 이용하여 수행하였다. PCR 산물은 pGEM-T easy vector (Promega)로 도입되었고, 재조합 플라스미드를 포함하는 박테리아를 선별하고, 이에 포함된 플라스미드에 대하여 서열분석을 수행하였다.
대장염 동물 모델. RAG-2-/- 마우스에 CD4+CD45RBhigh세포 (5x105) 단독 또는 대조군 레트로바이러스 (MigRI) 또는 C/EBPβ-발현 레트로바이러스로 감염된 후 TGF-β 및 기억 상층액에서 2일간 배양된, FACS-sorted CD4+GFP+세포 (2x105)를 함께 정맥주사였다. 마우스를 매일 관찰하고 매주 체중을 측정하였다. 세포 전달 후 8주 째, 마우스를 희생하여 조직학적 분석을 수행하였다. 대장의 원위부에서 조직을 추출하여 10% 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 포매한 후 6 μm 절편을 만든 후 헤마톡실린&에오신 염색을 수행하였다.
세포주. Jurkat 세포주는 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin 및 55 μM 2-mercaptoethanol로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다.
핵추출물 및 면역블롯팅. 핵 추출물은 종전 (Xiao, S. et al. J Immunol 181, 2277-2284 (2008).)에 기술된 바와 같이 추출되었다. 단백질은 로딩 완충액에 녹인 후 SDS-PAGE (10-12.5% gels) 분석을 수행한 후 Immunobilon-P membrane (Millipore)으로 전달하였다. 이어 막을 anti-C/EBPβ 항체와 결합시킨 후 ECL system (Pierce)을 이용하여 가시화하였다.
면역침전. 293T 세포를 해당 도면의 설명에 기재된 바와 같이 전달이입하였다. 이어 세포를 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 및 1% Triton X-100)에서 융해하였다. 상층액을 RIPA 완충액 중에서 protein G-Sepharose 4 fast flow (GE Healthcare)로 한 번 처리 한 후, 상층액을 Anti-Myc 항체와 4℃에서 4시간 배양하였고 protein G-Sepharose와 1.5 시간 배양하였다. 결합된 항체/항원 복합체를 RIPA 완충액으로 3회 세척하였다. 세척된 면역 복합체에 대하여 면역블롯팅을 수행하였다.
EMSA ( Electrophoretic mobility shift assay ). 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 T4 polynucleotide kinase를 사용하여 [γ-32P]ATP로 말단을 표지한 후 MicroSpin™G-25column(AmershamBiosciences)을 이용하여 정제하였다. 이어 10 mM HEPES (pH 7.9), 80 mM KCl, 0.05 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 1mM dithiothreitol, 및 6% 글리세롤을 포함하는 결합 완충액 중에서 핵 추출물(3μg), 말단 표지된 프로브 및 2 μg of poly(dI-dC)를 포함하는 총 20μl 부피의 반응액에서 15 분간 실온에서 DNA 결합반응을 수행하였다. 특정 실험의 경우 초이동(supershifting)을 위해 항체(1 μl)를 반응액에 추가하였다. DNA-단백질 복합체는 0.5X TBE 완충액에서 비변성 5% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동 하였다. 젤을 건조한 후 방사선을 검출하였다. 하기의 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하였다: Foxp3 CNS2 methyl-CRE forward, 5'-CCGGCCGCCATGA m CGTCAATGGCAGAAA-3'; Foxp3 CNS2 methyl-CRE reverse, 5'-TTTCTGCCATTGA m CGTCATGGCGGCCGG-3';Foxp3CNS2unmethyl-CREforward,5'-CCGGCCGCCATGACGTCAATGGCAGAAA-3';Foxp3CNS2unmethyl-CREreverse,5'-TTTCTGCCATTGACGTCATGGCGGCCGG-3';RORelement(RORE)inIL17CNS2forward,5'-GAAAGTTTTCTGACCCACTTTAAATCAATTT-3';RORelement(RORE)inIL17CNS2reverse,5'-AAATTGATTTAAAGTGGGTCAGAAAACTTTC-3'
루시퍼라제 분석. 루시퍼라제 분석은 JurkaT 세포에서 수행되었다. 전달이입은 Transfection was performed using the Gene Pulser-II electroporator (Bio-Rad)를 이용하여 수행되었고, 루시퍼라제 분석은 Luciferase Assay System, Cat# E1501 (Promega, USA)를 제조자의 방법(Promega, Madison, WI)대로 이용하였다. RSV-LacZ 플라스미드 (Addgene)를 함께 전달이입하였으며, β-갈락토시다제 활성은 전달이입 효율의 노말라이즈하기 위해 측정되었다.
통계 분석. Two-tailed paired t-tests를 Prism software (GraphPad.com)을 이용하여 수행하였다. 0.05 초과하는 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 유의성은 다음과 같이 나타낸다: *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
실시예 1 RA에 의한 C/EBPβ 발현 상향 조절
TGFß-유도된 Foxp3+Treg분화 과정에서 미접촉 CD4+T세포에서의 C/EBPß 발현에 미치는 레티노산의 영향을 조사하였다. 그 결과 TGF-β-유도된 Foxp3+Treg 분화과정에서 CD4+T세포에서 C/EBPß 발현이 RA에 의해 증가되는 것으로 나타났다. C57BL/6 마우스 유래의 정제된 CD4+CD25-CD44-미접촉 T 세포를 iTreg-polarizing 조건의 인비트로에서 24시간 동안 ATRA (all-trans retinoic acid)의 존재 또는 부재하에서 억제성 사이토카인, IFN-γ 및 IL-4와 함께 또는 없이 배양한 결과, Treatment of TGF-베타와 ATRA의 처리로 인해 C/EBPβ의 발현이 TGF-베타 단독처리와 비교하여 mRNA 및 단백질 수준에서 모두 증가하였다 (도 1a 및 1b). 그러나 IFN-γ 및 IL-4 의 추가는 C/EBPβ 발현에 미치는 영향이 미미하였다.
실시예 2 RA의 하류에서 억제성 사이토카인의 존재하에 작용하는 C/EBP
iTreg분화에서의 C/EBP 기능 분석을 위해 미접촉 CD4+T세포에서 dominant-negative C/EBP (A-C/EBP) 및 C/EBPζ를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 발현한 후 상기 세포를 iTreg 폴라라이징 조건에서 ATRA와 함께 또는 없이, anti-CD3 및 anti-CD28로 자극된 CD4+CD25-CD44+ 기억 T세포 유래의 상층액 (이하 기억 상층액으로 칭함) 존재 중에서 배양하였다. 기억 상층액은 억제성 사이토카인 IFN-γ 및 IL-4을 포함하고 있어, Foxp3 유도를 억제한다. A-C/EBP 는 C/EBP 패밀리 멤버의 DNA 결합을 특이적으로 방해하며, C/EBPζ 도 C/EBP의 dominant-negative 억제제이다. A-C/EBP 또는 C/EBPζ의 발현으로 인해 기억 상층액의 존재 중에서 iTreg 분화가 약간 감소되었다. 하지만 기억 상층액에 ATRA를 추가한 결과 벡터만으로 전달이입된 대조군 세포와 비교하여, A-C/EBP 또는 C/EBPζ-전달이입된 세포에서 iTreg 분화가 상당히 감소된 것으로 나타났다 (도 1c 및 1d). IFN-γ 및 IL-4 성능을 중화시키는 항체의 존재 중에서 기억 상층액의 존재 중에서 A-C/EBP 또는 C/EBPζ의 발현에 의한 Foxp3 발현의 하향조절은 ATRA에 상관없이 관찰되지 않았다 (도 1c, d). 이러한 결과는 C/EBP가 IFN-γ 및 IL-4와 같은 억제성 사이토카인의 존재 중에서 특히 iTreg 분화 동안 RA의 하류에서 작용하는 것을 나타낸다. iTreg분화에서의 C/EBP의 기능은 기억 상층액을 IFN-γ, IL-4, 및 IL-2를 포함하는 새 배지로 교환하는 실험에서도 확인되었다 (도 1e, f). GFP음성 세포에서 이러한 효과는 나타나지 않았으며, 이는 세포에 내제적인 조절임을 나타내는 것이다.
실시예 3 C/EBPß에 의한 iT
reg
생성과정에서 억제성 사이토카인에 대한 완벽한 저항성 부여
C/EBPß의 외인성 발현으로 인해 기억 상층액에 의한 Foxp3 발현의 억제에 대한 완벽한 저항성이 초래되는 것으로 나타났다 (도 2a, b). 이러한 효과는 IFN-γ, IL-4 중 하나 이상이 기억 상층액에 존재하는 한에서 관찰되었으며, 외부에서 추가한 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다 (도 2c, d). C/EBPβ 전달이입된 세포에서의 Foxp3 발현 증가는 TGF-ß 및 기억 상층액을 포함하는 세포배양 배지 유래의 FACS-sorted GFP+ 및 GFP-세포에 대한 정량 역전사 PCR (qRT-PCR) 결과에서도 확인되었다 (도 2e).
이러한 결과는 C/EBPβ Foxp3 발현을 mRNA 수준에서 상향 조절한다는 것을 나타낸다. C/EBP 아이소형태가 중복적 방식으로 수 개의 생리적 현상을 조절하는 것으로 알려졌기 때문에, 4 종류의 멤버 즉 C/EBPa, β, δ, 및 ε가 Foxp3 발현을 조절하는지 조사하였다. 그 결과 C/EBPa는 C/EBPβ 만큼 효과적으로 억제성 사이토카인에 대한 저항성을 부여한 반면, C/EBPδ 및 C/EBPε의 효과는 이에 미치지 못하였다 (도 7a, b). C/EBPβ 단독으로 TGF-β의 부재 중에서 Foxp3 발현을 증가시킬 수 있는 지 여부를 확인하였다. 3% 의 C/EBPβ-도입된 CD4+ T세포가 Foxp3+ 인 것으로 나타났는데, 이는 Foxp3 발현 유도에 TGF-β가 필요한 것임을 나타낸다. TGF-β-유도된 Foxp3+ iTreg 세포는 TGF-β가 없는 경우, 재자극시 빠르게 Foxp3 발현이 사라진다 (Polansky, J. K. et al. European journal of immunology 38, 1654-1663 (2008)). 본원에 따른 C/EBPβ 발현으로 인해 Foxp3 발현 감소가 상당히 억제되는 것으로 나타났다 (도 2f).
실시예 4 실험동물에서 C/EBPβ-전달이입된 iT
reg
세포에 의한 대장염의 예방
C/EBPβ의 발현에 의해 유도된 억제성 사이토카인에 대한 저항성을 나타내는 Foxp3+CD4+T세포의 생체내에서 억제능을 분석하였다. 이를 위해 면역결핍된 마우스에서 대장염을 유발하는 CD45RBhighCD4+T세포를 이용하여 adoptive-transfer 실험을 수행하였다. 마우스에게 CD45RBhighCD4+T세포 단독을 투여한 경우, 점차적으로 체중이 감소(도 3a), 비장비대 (도 3b) 및 심각한 대장염 (도 3c)의 소모성 질환이 발생하였다. TGF-β 및 기억 상층액의 존재하에 배양된 대조군 벡터로 전달이입된 CD4+T세포를 함께 마우스에 투여한 경우 질환 발생을 방지하는 효과가 거의 나타나지 않았다. 하지만, 동일한 조건에서 배양된 C/EBPβ-transduced CD4+T세포를 함께 전달한 경우, 질환 발생이 상당히 감소되었으며, 이는 C/EBPβ의 CD45RBhighCD4+T세포의 병원성 활성에 대한 억제효과를 나타내는 것이다.
이러한 결과는 C/EBPβ가 새로운 Foxp3+iTreg세포의 생산에는 관여하지 않지만, Foxp3+iTreg분화 과정에서 특히 ATRA 하류에서 IFN-γ 및 IL-4에 의한 억제 효과에 대한 저항성을 부여하여, Foxp3의 안정적 발현을 유도하는 것을 나타낸다.
실시예 5. C/EBPβ의
Foxp3
TSDR에서 메틸-CRE에의 결합에 의한 메틸화 의존적 활성
TGF-β-유도로 인한 Foxp3+Treg세포 생성과정에서 억제성 사이토카인에 대한 C/EBPβ의 저항 기전을 규명하였다. 최근 Foxp3 좌위에서 TSDR (Treg-specific demethylated region)의 메틸화 상태가 Foxp3 발현에 중요한 것으로 알려져 있다 (ibid). TSDR은 iTreg세포와 비교하여 nTreg세포에서 탈메틸화 되어 있으며, iTreg세포가 nTreg세포와 비교하여 덜 안정적이다. 그러나 바이설파이트 염기서열 분석에 의하면, C/EBPβ 발현은 TSDR의 메틸화 상태에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 4a, b). CREB는 TCR 경로의 하류에서 작용하며 탈메틸화된 경우에 TSDR (Treg-specific demethylated region) 내의 CpG 아일랜드에 결합한다 (Kim, H. P. et al., The Journal of experimental medicine 204, 1543-1551,(2007)). CRE 서열 (TGAmCGTCA)의 CpG에서의 메틸화로 인해, C/EBP 결합부위가 생성된다. TSDR 내의 메틸화된 CRE 서열에 대한 C/EBPβ의 DNA 결합 활성을 EMSA를 이용하여 분석한 결과 (도 4c), C/EBPβ로 전달이입된 JurkaT 세포에서 methyl-CRE 서열에 강한 결합능을 나타냈으며, 이러한 결합능은 anti-C/EBPβ 항체 처리시 사라졌다. 또한 C/EBPβ 결합에 대한 ChIP 분석 결과, 결합위치는 TGF-β-자극된 CD4+T세포에서TSDR인 것으로 나타났다 (도 4d). 부가하여, TSDR에 대한 C/EBPβ 결합은 TGF-β와 ATRA-자극된 CD4+T세포에서 증가하였다. 나아가 유전체의 CpG 다이뉴클레오티드를 메틸화될 수 없는 5-azacytidine (5-aza)를 이용하여 탈메틸화시킨 결과, TSDR에 대한 C/EBPβ 결합은이 사라졌다. 이는 CRE 서열에서 CpG 메틸화가 TSDR에 대한 C/EBPβ의 선별적 결합을 촉진시키는 것을 나타내는 것으로, 실험결과 DNA 메틸화가 C/EBPβ-에 의해 유도된 억제성 사이토카인에 대한 저항성에도 중요한 것으로 나타났다. 구체적으로 iTreg 생성과정에서 ATRA를 포함하는 기억 상층액에 5-aza를 추가한 경우 A-C/EBP 또는 C/EBPζ에 의한 Foxp3 발현이 사라지는 것으로 나타났으며, 이는 TSDR 중의 메틸-CRE 서열이 C/EBP에 의한 Foxp3 발현에 있어 중요한 것을 나타낸다 (도 4e). DNA 메틸화의 중요성은 또한 기억 상층액을 IFN-γ, IL-4, 및 IL-2을 포함하는 새로운 배지로 교환한 실험에서도 입증되었다 (도 4f).
실시예 6. RORγt 및 RORα 에 의한 C/EBPβ 유도된 억제성 사이토카인에 대한 저항성 약화
IL-6은 TGF-β-유도된 Foxp3 발현을 억제하며, 그 결과 Foxp3-매개된 RORγt 억제효과를 제거하고 이로 인해 TH17 분화가 촉진된다 (Zhou, L. et al. Nature 453, 236-240 (2008)). C/EBPβ는 IL-6의 하류 표적인 것으로 알려져 있다. TGF-β 단독으로 처리된 CD4+T 세포와 비교하여 TGF-β와 IL-6로 처리된 CD4+T세포에서 C/EBPβ 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 5a). C/EBPβ에 의해 IL-6-매개된 Foxp3 발현 억제가 극복될 수 있는 여부를 실험한 결과, C/EBPβ는 IL-6-매개된 Foxp3 발현 억제를 극복할 수 없는 것으로 나타났다 (도 5b). 부가하여 TGF-β 및 IL-6 플러스 ATRA의 존재 중에서 A-C/EBP 또는 C/EBPζ의 발현은 Foxp3 발현 감소에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 5c). 이러한 결과는 IL-6 신호전달 경로가 C/EBPß의 Foxp3 발현 억제 방지 기능을 방해할 수 있음을 나타낸다. RORα는 지방세포 분화 과정에서 물리적 상호작용을 통해 C/EBPb의 전사활성을 억제하기 때문에 RORγt 및 RORα가 C/EBPß-유도된 Foxp3 발현 억제 극복 효과에 미치는 영향을 조사하였다. C/EBPß에 의한 iTreg 분화 과정에서 IFN-γ 및 IL-4에 의한 Foxp3 발현 억제에 대한 저항성이 RORγt 및 RORa 발현에 의해 상당히 억제되었다 (도 5d). 또한 C/EBPß 및 RORγt는 서로 물리적으로 상호작용하는 것으로 나타났다 (도 5e).
실시예 7. RORγt의 DNA 결합 활성 방해에 의한 C/EBPβ의 T
H
17분화 억제
RA는 IL-6에 의한 TH17 세포 유도를 억제한다. TH17 분화에 대한 C/EBPß의 길항 작용을 조사하였다. 그 결과 C/EBPß 발현은 TH17분화를 상당히 억제시키는 것으로 나타났다 (도 6a). C/EBPα 및 ß는 IL-17A 생산을 억제하나, C/EBPδ 및 C/EBPε은 그 정도가 다소 약한 것으로 나타났다 (도 8a, b). TH17 분화에 미치는 C/EBPß의 억제효과가 불완전한 IL-6-매개된 Foxp3 억제로 인한 것임을 배제하기 위하여, Foxp3의 forkhead binding 영역이 결여된 scurfy mutant (Foxp3 sf ) 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다. Scurfy bone marrow (CD45.2+ Foxp3 sf ) 및 congenic WT bone marrow (CD45.1+ Foxp3 WT )를 사용한 혼합된 골수 키메라를 이용하여 미접촉 CD4+ Foxp3 sf T 세포를 수득하였다 (도 6b). 미접촉 CD4+FoxpsfT세포에서 C/EBPß의 발현으로 인해 IL-17A 생산이 상당히 감소하였으며, 이는 약간의 Foxp3 증가가 C/EBPß-매개된 TH17 분화 억제의 주 원인이 아님을 나타내는 것이고, C/EBPß는 Foxp3-와 독립적으로 TH17 분화를 억제하는 것을 나타낸다 (도 6c).
도 6a에 기술된 GFP+ 및 GFP-세포를 이용하여 TH17-관련된 유전자 발현 프로파일을 qRT-PCR로 분석한 결과, 대조군 벡터로 전달이입된 세포와 비교하여, C/EBPß의 발현으로 인해 IL-17A 및 IL-17F mRNA의 농도가 상당히 감소하였으며, 반면 RORγt 및 RORa mRNA 농도는 동일한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 근거로 C/EBPß에 대한 RORγt-매개된 IL-17A 생산을 분석한 결과, RORγt-매개된 IL-17A 생산이 급격히 감소한 것으로 나타났다 (도 6d). 이러한 결과는 C/EBPß가 RORγt와의 상호작용을 통해 이의 기능을 억제하는 것을 나타낸다. 이는 루시퍼라제 리포터 분석을 통해 C/EBPβ의 발현에 의한 RORγt (RAR-related orphan receptor gamma 2 또는 t, 핵내 수용체 전사인자의 일원)에 의해 활성화되는 IL-17 promoter-CNS2 리포터 활성의 억제에서도 나타난다 (도 6e).
나아가 잠정적 RORγt 결합부위에 해당하는 프로브를 이용한 EMSA를 이용한 실험결과 C/EBPβ가 RORγt의 IL-17 CNS2 영역에의 결합을 조절하며, C/EBPß의 발현에 의해 RORγt의 이의 결합 영역에 대한 결합능이 완전히 사라졌다 (도 6f). 따라서 이러한 결과는 C/EBPb가 RORγt의 DNA 결합을 억제하여 TH17분화를 억제하는 것을 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
Claims (15)
- C/EBP 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 전구 T 세포의 유도성 조절 T 세포로의 분화 촉진 또는 유도성 조절 T 세포의 안정화용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 전구 T 세포는 미접촉 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 T 세포인, 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 C/EBP는 α,ß,δ, 및 ε중 하나 이상인 것인, 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 유도성 조절 T 세포로의 분화 및 유도성 조절 T 세포의 안정화는 상기 C/EBP에 의한 Foxp3 발현 억제 방지에 의한 것인, 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 Foxp3 발현 억제는 억제성 사이토카인 또는 TGF-ß의 부재로 인한 것인, 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 Foxp3 발현 억제 방지는, 상기 C/EBP가 상기 Foxp3 유전자의 프로모터의 TSDR (Treg-specific demethylated region)에 존재하는 메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드에의 결합을 통한 것인, 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 TGF-베타를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 면역질환의 치료 또는 예방에 사용되는 것인 조성물.
- 제 8 항에 있어서,
상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성 질환, 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 반응을 포함하는 것인, 조성물.
- C/EBP를 과발현하는 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포를 유효성분으로 포함하는, 면역질환 치료용 세포치료제.
- 제 10 항에 있어서,
상기 전구 T 세포는 미접촉 T 세포, 기억 T 세포, 또는 효과기 T 세포인, 면역질환 치료용 세포치료제.
- 제 10 항에 있어서,
상기 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포는 자가세포, 타가세포 또는 이종세포 유래인, 면역질환 치료용 세포치료제.
- 제 10 항에 있어서,
상기 세포치료제는 질환이 발생한 부위에 투여되는 것인, 면역질환 치료용 세포치료제.
- 제 1 항에 따른 조성물을 사용한 유도성 조절 T 세포로의 분화 또는 안정화 유도 방법.
- 전구 T 세포 또는 유도성 조절 T 세포를 제공하는 단계; 및
상기 세포에 C/EBP 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 도입하는 단계 또는 대안적으로 상기 세포의 내인성 C/EBP 유전자의 단백질로의 발현을 유도하는 단계를 포함하며, 상기 단계에 의해 상기 C/EBP 단백질이 과발현되는 것인, 인비트로에서 유도성 조절 T 세포로의 분화 또는 안정화 유도하는 방법.
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