KR20150143190A

KR20150143190A - Pdk 억제제의 스크리닝 방법 및 pdk 억제제의 용도

Info

Publication number: KR20150143190A
Application number: KR1020140072395A
Authority: KR
Inventors: 박동호
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2015-12-23
Also published as: KR101749380B1

Abstract

본 발명은 PDK 억제제의 스크리닝 방법 및 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

PDK 억제제의 스크리닝 방법 및 PDK 억제제의 용도{Method for screening PDK inhibitor and use of PDK inhibitor}

눈은 생활에 필요한 대부분의 정보를 받아들이는 중요한 감각기관이다. 눈은 외막, 중막, 내막 및 굴절매질로 구성되는데, 외막은 까만 눈동자를 덮고 있는 앞표면인 각막과 그 뒤에 이어진 공막으로 되어 있고, 중막은 홍채와 섬모체, 그리고 맥락막으로 구성되며, 내막은 망막으로 이루어진다, 수정체와 유리체 및 안방수는 굴절매질에 해당된다. 눈의 기능적 장애 또는 상실은 생활의 질을 떨어뜨리는 큰 요인의 하나기 때문에 눈의 건강을 유지하는 것이 중요해지고 있다. 안과 질환의 예로는 망막 변성 질환 및 녹내장을 포함하는 망막 질환, 백내장, 각결막 상피 장해 또는 각막 상피 창상 등을 들 수 있다.

망막(retina)은, 안구의 가장 안쪽을 덮고 있는 신경조직으로 빛에 대한 정보를 전기적 정보로 전환하여 뇌로 전달하는 역할을 수행하는 기관이다. 망막병증(retinopathy)은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환으로, 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반한다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증에는 당뇨망막병증, 고혈압성 망막병증 및 미숙아 망막병증 등이 있다.

그 중 당뇨망막병증은, 당뇨가 있는 환자에서 특유의 망막의 순환장애가 발생하여 발병하는 질환으로, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 신증과 함께 당뇨병에서 3대 미세혈관합병증 중 하나이다. 당뇨망막병증의 발생은 당뇨병을 앓은 유병기간과 연관이 있는데 제1형에 해당하는 30세 이전에 진단된 당뇨병의 경우 유병기간이 5년 이하일 때 17%, 15년 이상일 때 98%에서 당뇨망막병증이 발생하고, 이 중 더 악화된 증식당뇨망막병증은 10년 이하일 때는 약 1%, 35년 이상에서는 67%에서 발생한다. 제2형 당뇨병에서는 유병기간 5년 이하에서는 29%, 15년 이상에서는 78%이며, 증식당뇨망막병증은 5년 이하에서는 2%, 15년 이상에서는 16%에서 발생한다고 알려져 있다. 당뇨병 환자의 망막에서는 망막모세혈관 기저막의 비후, 혈관주위 세포의 소실, 미세혈관류의 발생 등 모세혈관에서 혈관의 변화가 나타나며, 시간이 경과함에 따라 광범위한 모세혈관 비관류에 이어 망막신생혈관 역시 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 당뇨망막병증은 당뇨 합병증의 일종이기는 하나, 일단 발병하게 되면 혈당 조절 등으로 그 진행을 막기 어려우며, 당뇨망막병증에 특이적인 치료 방법이 요구된다.

현재, 이러한 안과 질환에 대한 치료법은 레이저 치료, 광응고술, 냉동응고술, 그리고 광역학치료 등이 있다. 이러한 치료법은 모두 수술에 의한 치료로, 약품에 의한 치료법은 아직 개발 단계에 머무르고 있다. 수술에 의한 치료는 모든 환자들에게 적용될 수는 없다는 제약이 있으며 성공률이 낮고 그 비용이 매우 커서 사회적, 경제적 부담이 따른다. 수술을 할 수 없는 대부분의 환자는 현재 특별한 치료약이 없는 상태에서 실명에 이르게 된다. 인간의 수명이 연장되면서 이런 안과 질환들이 계속적으로 증가하고 있으므로, 적절한 치료제 개발이 시급한 실정이다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 망막병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제로 스크리닝할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PDK가 ER 스트레스 관련 유전자의 발현 또는 활성화를 유도하여 VEGF 발현을 촉진하여 망막병증의 발생 또는 진행을 유도함을 규명하였고, 이로부터 eIF2α와 같은 ER 스트레스 관련 단백질의 발현 또는 활성을 측정함으로써 PDK 억제제를 스크리닝 하는 방법을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 망막병증 개체로부터 분리된 망막시료, 저산소증이 유발된 망막시료 또는 망막병증 동물 모델에 PDK(pyruvate dehydrogenase kinase) 억제제 후보 물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료 또는 동물 모델에서 ER 스트레스유전자의 발현 또는 발현된 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PDK 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 (a) 망막병증 개체로부터 분리된 망막 시료, 저산소증(hypoxia)이 유발된 망막시료 또는 망막병증 동물 모델에 PDK(pyruvate dehydrogenase kinase) 억제제 후보 물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료 또는 동물 모델에서 ER 스트레스유전자의 발현 또는 발현된 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PDK 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, “PDK(pyruvate dehydrogenase kinase)”는 피루브산 탈수소효소 인산화효소로도 명명되며, 피루브산 탈수소효소를 인산화함으로써 피루브산 탈수소효소의 활성을 억제하는 단백질이다. 본 발명에서는 망막병증을 야기할 수 있는 저산소증 조건에서 증가하는 ER 스트레스 및 이에 따른 VEGF 발현 증가가 PDK에 의해 매개됨을 규명하였다. 특히, PDK가 eIF2α(eukaryotic inhibition factor2 alpha)와 같은 ER 스트레스 관련 인자의 발현 또는 활성을 조절하는 인자임을 규명함으로써 eIF2α와 같은 ER 스트레스 관련 인자의 발현 또는 활성을 측정하여 PDK 억제제를 스크리닝할 수 있는 방법을 개발하였다.

상기 스크리닝 방법에서 (a) 단계는 망막병증 개체로부터 분리된 망막 시료, 저산소증이 유발된 망막시료 또는 망막병증 동물 모델에 망막병증 치료 후보 물질을 처리하는 단계이다.

본 발명에서 용어, "망막병증(retinopathy)"은 눈의 망막에 만성 또는 급성에 의한 손상으로 발병하는 질환이다. 이러한 망막병증은 계속 진행중인 염증 및 혈관 리모델링(vascular remodeling)을 수반할 수 있다. 또한, 망막병증은 당뇨병 또는 고혈압과 같은 전신 질환의 시각적 발현으로 나타나기도 한다. 이러한 망막병증의 종류로는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) 및 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity, ROP) 등이 있다. 이와 같은 망막병증에 있어, VEGF는 혈관신생을 매개하는 역할을 수행하므로, 중요한 치료타겟으로 여겨진다.

여기서, 당뇨망막병증은 전신 질환인 당뇨병에 의한 말초 순환 장애에 따라 장애가 생겨 시력 감소가 발생하는 눈의 합병증을 의미한다. 당뇨망막병증은 초기에는 증상이 없으나, 황반부의 침범이 일어나게 되면서 시력 저하를 나타낸다. 당뇨망막병증은 미세혈관류, 정맥확장, 망막출혈, 망막경색, 황반부종, 신생혈관, 초자체출혈, 견인성 막 등 다양한 병리학적 특징을 수반하여, 이러한 현상이 안저 증상으로 관찰되면 당뇨망막병증으로 진단된다. 당뇨망막병증은 상기와 같은 다양한 증상이 복합적으로 수반되어 발병하는 질환으로, 이 중 하나의 증상을 완화시킬 수 있다고 해서 질환의 치료를 가져올 수 있는지는 불분명한 면이 있다.

또한, 미숙아 망막병증은 미숙아, 특히 저체중 출생아에게서 발생할 수 있는 증식성 망막병증이다. 출생 시 망막의 혈관이 완전히 형성되지 않은 미숙아에게 출생 후 혈관형성 과정에 장애가 발생하면 망막의 혈관형성부위와 혈관무형성 부위의 경계에서 비정상적인 섬유혈관증식이 발생하며, 이에 의해 망막이 박리되면서 최종적으로 실명을 초래할 수 있다.

본 발명에서 용어, "시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 분리된 망막시료는 망막병증 개체로부터 분리된 세포 또는 조직임이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 망막병증 치료 후보 물질과 반응시킬 수 있다.

본 발명에 용어, "망막병증 동물 모델"이란 인간을 제외한 동물로서, 망막병증의 병리학적 상태에 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 상태에 있는 동물을 의미한다.

본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 PDK의 발현 또는 활성을 감소시켜 ER 스트레스 관련 유전자의 발현 또는 활성 수준을 감소시킬 수 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.

상기 스크리닝 방법에서 (b) 단계는 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료 또는 동물 모델에서 ER 스트레스 관련 유전자, 구체적으로는 eIF2α의 mRNA, 이의 단백질 수준; 또는 이의 활성을 측정하는 단계이다. 이 단계에서 ER 스트레스 유전자 또는 발현된 단백질의 검출은 노던 블롯(Northern blot), 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining), 인 시추 혼성화 방법(in situ hybridization), 역전사효소 중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 정량적 RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 이 단계에서 eIF2α의 인산화 정도를 측정하여 eIF2α의 활성 수준을 측정할 수 있다. 이는 웨스턴 블롯, 면역조직화학적 염색 등으로 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은, 추가로 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ER 스트레스 유전자의 발현 또는 발현된 단백질의 활성 수준이 후보 물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 PDK 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 비처리 시료값과 비교하여, eIF2α의 인산화 수준이 비처리군에 비하여 낮으면 PDK 억제제로 판단하는 단계일 수 있다.

본 발명에서, ER은 소포체(endoplasmic reticulum)로서, 리보솜에서 만들어진 폴리펩티드에 디설피드 본드, 징크 핑거 등의 여러가지 결합을 통해 폴리펩티드가 접히도록 한다. 이러한 단백질을 만드는 과정이 과도해지거나, 노화 등으로 인해 단백질 접힘의 에러가 빈발해지는 경우 및 저산소증에 의해 ER이 스트레스를 받기도 하며, 이로부터 ER 기능에 장애가 발생되기도 한다.

ER 스트레스가 발생하면, 세포는 생존하기 위해 방어기작을 시작하며, IRE1/XBP-1 및 ATF6(Activating Transcription Factor 6) 유전자의 전사를 활성화하여 샤페론의 발현을 증가시키거나, eIF2α인자를 인산화시켜 단백질로 번역되는 과정을 감소시킨다. 본 발명 일 실시예에서는 ER 스트레스 관련 인자로서 eIF2α인자의 인산화가 PDK 억제제 처리시 감소하는 것을 확인하였으며, ER 스트레스에 의해 발현하는 유전자 중 하나인 VEGF의 발현이 PDK 억제제 처리시 감소하는 것을 확인하였다.

본 발명에서 용어, “Phospho-eIF2α(phophorylated-eukaryotic inhibition factor2 alpha)”는 eIF2는 알파, 베타 및 감마 단량체로 이루어진 이종삼합체(heterotrimer)로서, eIF2α는 잠재적인 RNA-결합 사이트를 가지고 있으며, 51번째 위치의 세린(serine)이 인산화된다. 저산소증에 의한 ER 스트레스의 신호전달에 Phospho-eIF2α가 관여하며, 본 발명에서는 PDK 억제제를 처리할 경우, Phospho-eIF2α의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 PDK의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 PDK 및 망막병증에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질"은 PDK 유전자 또는 단백질에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식을 통해 PDK의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 단백질로 번역 후 분해를 촉진시키는 방식으로 발현을 저해하는 물질, 또는 그 활성을 방해함으로써 PDK의 활성을 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다.

상기 PDK의 발현을 저해하는 물질은 PDK를 표적으로 하여 PDK의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 상기 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질의 예로, 바람직하게는 PDK의 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드, PDK 단백질의 활성을 억제하는 항체, 앱타머 또는 화합물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “올리고 뉴클레오티드”는 수 개 내지 수십 개의 뉴클레오티드가 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)으로 중합되어 형성된 중합체를 의미한다. 상기 PDK mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드로의 예로, 바람직하게는 PDK의 핵산에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 앱타머, 또는 siRNA(small interfering RNA) 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명에서 PDK mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드는 상기 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 유도체로서, 상기 mRNA에 결합하여 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 등을 방해하거나 또는 mRNA의 그 밖의 다른 모든 생물학적 기능 또는 활성을 저해할 수 있다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 특별히 제한되지 아니하나, 구체적으로는 6 내지 100 염기일 수 있고, 더욱 구체적으로는 8 내지 60 염기일 수 있으며, 가장 구체적으로는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 당해 기술 분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라 생체 내(in vivo) 에서 합성되거나, 시험관 내(in vitro)에서 합성되어 생체 내로 투여될 수 있다. 생체 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 다중 클로닝 부위 (Multi-cloning site; MCS)의 기원(origin)이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 방법을 들 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 RNA를 합성하는 방법의 비제한적인 예로 RNA 중합효소 I를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 PDK의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 PDK의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 PDK, Phospho-eIF2α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 대하여 적절하게 선택되어 사용될 수 있다. 본 발명의 PDK, Phospho-eIF2α 및 VEGF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 mRNA의 발현을 억제하는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"는 RNA 간섭(interference) 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다. 이중 가닥의 RNA가 다이서(dicer)에 의해 절단되어 생성될 수 있는 상기 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 해당 mRNA의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 siRNA는 PDK의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 상기 siRNA를 제작하는 방법의 비제한적인 예로는 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 전사를 이용하여 siRNA를 합성하는 방법, 시험관 내 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 다이서를 이용해 절단하여 제작하는 방법, shRNA 발현 플라스미드 또는 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 또는 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통하여 발현시키는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중사슬(heavy chain) 및 두 개의 경사슬(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중사슬 및 경사슬은 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위 (Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위 (Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.

상기 항체는 전장항체 또는 항체 단편의 형태를 모두 포함하며, 또한, 다클론 항체, 단일클론 항체 등을 모두 포함할 수 있다. 또한 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

또한, PDK 활성을 저해하는 물질은 화합물의 형태일 수 있으며, 그 예로 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은, IUPAC 에 따르면 디클로로아세트산(Dichloroacetic acid)로 명명되며, 디클로로아세테이트(Dichloroacetate)로도 불린다.

본 발명에서 사용되는 용어 “예방”이란, 본 발명의 조성물을 투여에 의해 망막병증의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 “치료”란, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 망막병증의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물은 약학으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.

본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 망막증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 방식으로 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비톨(Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 망막병증에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 개체의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

또 다른 일구현예로서, 본 발명은 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공한다.

상기 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 상기 건강 기능 식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또 다른 일구현예로, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 망막병증 의심 개체 내에 투여하는 단계를 포함하는, 망막병증 치료 방법을 제공한다. 상기 약학적 조성물, 망막병증 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 망막병증이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약학적 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

특정 동물에 대한 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.

본 발명의 예방 또는 치료 방법에 있어서 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며 목적하는 해당 부위에 PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, PDK의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.

본 발명은 PDK 억제제의 스크리닝 방법을 제공하여, PDK 억제제로 사용될수 있는 후보물질을 발굴하여, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 활용될 수 있도록 할 수 있다.

도 1은 대조군, 페닐부티레이트(PBA) 처리군, 탑시가르긴(TG) 처리군, 데프록사민(DFO) 처리군, 데프록사민(DFO)과 페닐부티레이트(PBA) 동시처리군 및 데프록사민(DFO)과 디클로로아세테이트(DCA) 동시처리군에서의 HIF1α, PDK1 및 Phospho-eIF2α 단백질의 발현수준을 웨스턴블랏을 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 대조군, 페닐부티레이트(PBA) 처리군, 탑시가르긴(TG) 처리군, 데프록사민(DFO) 처리군, 데프록사민(DFO)과 페닐부티레이트(PBA) 동시처리군 및 데프록사민(DFO)과 디클로로아세테이트(DCA) 동시처리군에서의 HIF1α, PDK1 및 Phospho-eIF2α 단백질의 발현수준에 있어서 대조군을 기준으로 한 증가 또는 감소정도를 나타낸 것이다.
도 3은 대조군, 페닐부티레이트(PBA) 처리군, 디클로로아세테이트(DCA) 처리군, GSK 처리군, 탑시가르긴(TG) 처리군, 데프록사민(DFO) 처리군, 데프록사민(DFO)과 페닐부티레이트(PBA) 동시처리군 및 데프록사민(DFO)과 디클로로아세테이트(DCA) 동시처리군, 및 데프록사민(DFO)과 GSK 동시처리군에서의 VEGF의 mRNA 발현을 측정하여 나타낸 것이다.
도 4는 저산소증에 의한 ER 스트레스에 의해 증가하는 VEGF 신호전달에 있어서, PDK의 관련 가능성을 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 망막색소체상피세포(ARPTE-19)의 배양

인간 망막색소체상피세포인 ARPE-19 세포(ATCC CRL-2302)를 100mm 플레이트(plate)에 약 1X10⁶ 개의 세포를 분주하여 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM/F-12 배지에서 3일에 1번 간격으로 계대 배양하였다. 실험을 위해 60mm 플레이트에 약 3X10⁵ 개의 세포를 분주하고, 다음날 약제를 처리하였다.

실시예 2. ER ( endoplasmic reticulum ) 스트레스 마커 단백질의 웨스턴블랏( western blot)을 통한 발현 확인

상기 실시예 1에서 배양한 ARPE-19 세포에 각각 페닐부티레이트(Phenylbutyrate, PBA), 탑시가르긴(Thapsigargin, TG), 데프록사민(defroxamine, DFO), 데프록사민(DFO)과 페닐부티레이트(PBA)의 동시처리 및 데프록사민(DFO)과 디클로로아세테이트(Dichloroacetate, DCA)를 동시처리하고, 6시간 후 회수하였다. 세포 용해물(cell lysate)를 정량하여 SDS-PAGE 젤에 로딩하고 PVDE 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 5% skim milk로 블로킹한 후, 항- HIF-α, PDK1, Phospho-eIF2α 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 대조군으로 β-actin을 사용하였으며, 각 단백질의 양은 Image J software를 이용하여 수치화하였다.

데프록사민(DFO)의 처리는 망막세포 중 하나인 ARPE 세포에서의 저산소증과 ER 스트레스를 유발하는 것으로 알려져있으며, 상기 웨스턴블랏을 통해 데프록사민 단독 처리시, HIF1α 단백질과 ER 스트레스 마커 단백질인 Phospho-eIF2α의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 그러나, 데프록사민과 함께 PDK 억제제인 디클로로아세테이트를 처리하면, PDK1이 감소함과 더불어, Phospho-eIF2α 역시 감소함을 확인하였는바, PDK 억제제가 ER 스트레스의 감소와 관련이 있음을 알 수 있었다(도 1 및 도 2).

실시예 3. ER ( endoplasmic reticulum ) 스트레스에 따른 VEGF( Vascular endothelial growth factor )의 mRNA 발현 확인

상기 실시예 1에서 배양한 ARPE-19 세포에 각각 페닐부티레이트, 디클로로아세테이트, GSK, 탑시가르긴, 데프록사민, 데프록사민과 페닐부티레이트의 동시처리, 데프록사민과 디클로로아세테이트의 동시처리 및 데프록사민과 GSK를 동시처리하고, 6시간 후 회수하였다. Qiazol solution(Qiagen, 79306)을 사용하여 RNA를 분리하고, cDNA를 합성하고, VEGF 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

VEGF forward primer: 5’-CGAAACCATGAACTTTCTGC-3’(서열번호 1)

VEGF reverse primer: 5’-CCTCAGTGGGCACACACTCC-3’(서열번호 2)

PCR 반응은 cDNA 200ng을 주형으로 하여, 95 ℃에서 10분, 95 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 30초를 하나의 사이클(cycle)로하여 총 35 사이클(cycle)을 진행한 후, 72 ℃에서 5분동안 1 사이클(cycle) 진행하였다.

이후, PCR 생성물을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 발현양을 확인하였다. 대조군으로 β-actin을 사용하였으며, 각 밴드는 Image J software를 이용하여 수치화하였다.

ARPE-19 세포에 데프록사민 단독 처리시, VEGF의 mRNA의 발현이 대조군에 비해 4배 이상 증가하였으며, 디클로로아세테이트를 함께 처리할 경우 VEGF가 감소되는 것을 확인하였다(도 3). 이를 통해 PDK 억제제가 ER 스트레스에 의해 VEGF가 증가되는 신호전달에 있어서, PDK 억제제가 관련이 있음을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과를 종합한 내용을 도 4에 모식도로 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for screening PDK inhibitor and use of PDK inhibitor <130> KPA140228KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF forward primer <400> 1 cgaaaccatg aactttctgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF reverse primer <400> 2 cctcagtggg cacacactcc 20

Claims

(a) 망막병증 개체로부터 분리된 망막 시료, 저산소증(hypoxia)이 유발된 망막시료 또는 망막병증 동물 모델에 PDK(pyruvate dehydrogenase kinase) 억제제 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 물질이 처리된 망막 시료 또는 동물 모델에서 ER 스트레스유전자의 발현 또는 발현된 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, PDK 억제제의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 ER 스트레스 유전자의 발현 또는 발현된 단백질의 활성 수준이 후보물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 PDK 억제제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 후보 물질은 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 화합물의 형태인 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 체외(in vitro)에서 사용되는 PDK 억제제를 스크리닝 하고자 하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 ER 스트레스 단백질은 Phospho-eIF2α(phophorylated-eukaryotic inhibition factor2 alpha)인, 방법.
PDK(pyruvate dehydrogenase kinase)의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 망막병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.