KR20150137758A

KR20150137758A - 발효된 천연물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20150137758A
Application number: KR1020140066212A
Authority: KR
Inventors: 김선기
Original assignee: 선 바이오 (주)
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2015-12-09
Also published as: KR101590492B1

Abstract

본 발명은 유산균 및 효모 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 혼합물을 알콜 발효시키는 단계; 상기 알콜 발효물을 초산균으로 초산 발효시키는 단계; 및 상기에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법 및 상기 발효물을 유효성분으로 하는 살균소독용 조성물에 관한 것으로, 병원성 미생물에 대한 소독 효과가 뛰어나, 축사, 축제 및 음수 소독 등에 유용한 안전하고 친환경적인 소독제일 뿐만 아니라 악취제거, 유기질 축분비료 생산, 사육 생산성 향상, 축사환경 개선 등 다양한 기능을 가진 천연소독제로서 사용될 것으로 기대된다.

Description

발효된 천연물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물 및 이의 제조방법{Disinfectant composition comprising fermented natural product as effective component and production method thereof}

본 발명은 발효된 천연물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유산균 및 효모 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 혼합물을 알콜 발효시키는 단계; 상기 알콜 발효물을 초산균으로 초산 발효시키는 단계; 및 상기에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 조성물의 제조방법과 이의 조성물에 관한 것이다.

최근 구제역, 조류독감, 신종 플루 등의 바이러스와 리스테리아, 포도상구균, 연쇄상 구균, 폐렴균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균, 방선균 등의 그람양성균 및 대장균, 살모넬라, 이질균, 티푸스균, 콜레라균 등의 그람음성균 등의 미생물이 체내에 침입하여 다양한 질병을 유발하여 소, 돼지, 닭 등 주요 가축 뿐 아니라 어린이, 노인 또는 만성질환자 등의 고위험군에서 이환율 및 사망률의 증가를 초래해 막대한 사회경제적 손실을 일으키고 있다.

이에 따른 다양한 살균 및 소독제가 출시되고 있으나 대부분이 합성화학 물질이며 세균이나 바이러스에 내성을 일으켜서 또 다른 문제를 유발하고 있다. 가축방역의 경우, 다량의 화학소독제를 축사와 그 주변 및 도로 등에 분사하고 있지만 효율성이 낮고 동물이나 인체에 피해 우려 등의 문제점이 많다. 한편, 화학소독제의 가격 경쟁력을 극복하여 활용중인 천연물 소독제는 매우 한정적이고 대량생산의 어려움이 있어 실용화되지 못하는 실정이다. 따라서 높은 살균 및 살바이러스 활성을 가지는, 안전한 친환경 소재의 천연물 소독제를 개발하는 것은 매우 시급하다.

천연물이란 인공을 가하지 않은 자연 그대로의 것을 의미하는데, GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류된 천연물들은 사용량이나 식품에 규제받지 않으며, 국내에서는 천연첨가물로 분류되어 식품첨가물로도 사용이 되고 있는 실정이다. 외국에서는 특별한 제한 없이 사용자의 뜻에 따라 자유롭게 이용할 수 있는 물질로 기능성이 탁월하여 건강식품과 의약품으로도 이용되고 있다.

인류는 오래전부터 천연물을 이용하여 병원균을 항균 및 살균해왔다. 살구, 복숭아, 매실, 마늘, 양파, 키토산, 허브, 등심초 등이 사용되고 있으며, 현재 개발되어 시판 중인 천연물 소독제의 경우 대부분이 인체식품용으로 가축 방역 등에 이용된 예는 많지 않다.

또한, 상기에서 언급한 천연물들은 추출 및 농축 등의 가공을 통해 천연물 소독제로 판매하고 있으나, 발효된 천연물을 이용한 소독제품은 거의 알려진 바가 없다. 발효미생물을 이용하여 발효천연물 소독제를 만들면 친환경적 소독제로서 뿐만 아니라, 악취제거, 유기물 축분비료, 축산 생산성 등 다양한 축산물 가치 향상까지 기대할 수 있다.

한국등록특허 제1322851호에는 '한약재 추출물을 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 또는 조류독감 바이러스의 증식 억제용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1130691호에는 '천연물질 추출물을 포함하는 항균활성 증강용 손소독제 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 발효된 천연물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물 및 이의 제조방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 인동등, 황금, 갈근 및 생지황의 천연물소재를 활용하여 유산균, 효모에 의한 알콜 발효 및 초산균에 의한 초산 발효과정을 거치면서 대장균, 살모넬라, 리스테리아 및 포도상구균 등의 병원성 미생물 성장을 효과적으로 억제함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유산균 및 효모 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 혼합물을 알콜 발효시키는 단계; 상기 알콜 발효물을 초산균으로 초산 발효시키는 단계; 및 상기 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 살균소독용 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발효물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 천연물 소독제는 인동등, 황금, 갈근 및 생지황의 혼합물을 유산균, 효모에 의한 알콜 발효 및 초산균에 의한 초산 발효 과정을 거치면서 시너지 효과를 낼 수 있는 대사산물을 생성하여 미생물에 대한 소독 효과가 뛰어나, 축사, 축제 및 음수 소독 등에 유용한 안전하고 친환경적인 소독제 뿐만 아니라 악취제거, 유기질 축분비료 생산, 사육 생산성 향상, 축사환경 개선 등 다양한 기능을 가진 천연물 소독제로서 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 발효미생물(Lactic acid bacteria;유산균, Bacillus;바실러스, Yeast;효모)에 따른 천연물 추출물의 발효패턴 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 천연물 추출액, 혼합액 및 발효추출물 혼합액의 병원성 미생물에 대한 항균력 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 사용된 천연물 소재(인동등, 황금, 갈근 및 생지황) 및 이의 발효 배지의 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 각 천연물을 사용한 배지에서의 발효미생물(Lactic acid bacteria;유산균, Bacillus;바실러스, Yeast;효모)의 발효능을 알아보기 위해 생균수(A, C, E) 및 pH 변화(B, D, F)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 유산균 발효 추출 농축액의 대장균(E. coli) K88 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) KCCM40253에 대한 항균력 조사 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 천연물 배지 조성의 차이에 따라 실온에서 30일간 숙성시킨 후 유산균 또는 효모의 생균수를 측정한 결과를 나타낸 것이다(유산균;LAB, 효모;YEAST, 포도당;Glu).
도 7은 알콜 함량(0, 1, 3, 5, 7%(v/v))에 따른 초산균주 ATCC23746 및 ATCC15973의 생균수(A) 및 초산 생산량(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 천연물 배지 조성의 차이에 따른 2차 초산발효시 초산 생성량을 나타낸 것이다(유산균;LAB, 효모;YEAST, 포도당;Glu).
도 9는 천연물 배지 조성의 차이에 따른 1차 저온발효 후 초산균 접종 배양 유무에 따른 천연물의 병원성 미생물에 대한 항균력 조사를 나타낸 것이다(유산균;LAB 또는 L, 효모;YEAST 또는 Y).
도 10은 유산균 및 효모에 의한 천연물 배지에서의 1차 발효에 의한 알콜 생성량(A) 및 2차 발효에 의한 초산 생성량(B)의 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 천연물 배지에 첨가된 포도당(0, 1, 3, 5, 10, 20%(w/v))에 따른 장기 숙성시 초산 생성량 변화를 나타낸 것이다(Y;효모, L;유산균, G;포도당).
도 12는 장기 숙성시 온도 차이에 따른 초산 생성량 변화(A) 및 병원성 미생물에 대한 항균력 조사(B)를 나타낸 것이다.
도 13은 천연물 배지 조성의 차이에 따른 병원성 미생물에 대한 항균력 조사를 나타낸 것이다.
도 14는 천연물 발효 공정도 및 시제품을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) 유산균 및 효모 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 혼합물을 알콜 발효시키는 단계;

(2) 상기 단계 (1)에서 발효시킨 알콜 발효물을 초산균으로 초산 발효시키는 단계; 및

(3) 상기 단계 (2)에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법을 제공한다.

인동등(Lonicera japonica Thunberg)은 예로부터 우리나라 전국 각지의 산야지에서 자생하는 인동과의 반상록 덩굴성 관목 식물인 인동의 잎과 줄기로서, 약재로 널리 사용된 무독한 한방 생약이다. 인동등에 함유된 유효성분으로는 아피게닌(Apigenin), 로니세린(Lonicerin), 루테오린(Luteolin) 등의 플라보노이드(Flavonoid)가 있으며, 이들 플라보노이드에 의해 항염증 효과 및 항암 효과 등을 갖는 것으로 알려져 있다.

황금은 꿀풀과의 다년생 초본으로 플라보노이드를 포함하는 것으로 알려져 있다. 황금에 함유된 유효성분으로는 비칼린(Bicalin), 오록실린A(Oroxylin A), 비칼레인(Bicalein) 등이 있으며, 이들 성분이 항균, 항바이러스 작용, 소염, 항알레르기 작용 및 해열 작용을 갖는다.

갈근은 콩과에 속하는 칡(Pueraria thunbergiana BENTHAM)의 뿌리를 적당히 썰어서 건조한 것으로, 예로부터 생즙을 내서 먹거나 건조시켜 차로 마시기도 하고 전분을 내어 식품 등에 이용하기도 하였다. 주요성분으로는 다이드자인(daidzein), 다이드진(daidzin), 게니스테인(genistein), 파라쿠마릭산, 푸에라린, 케르세틴, 등이 있으며 예로부터 해독제, 구토방지제, 진경제, 강심제, 진통제, 정화제, 발한제, 해열제, 유즙분비제, 혈당강하제, 혈압강하제 등으로 쓰이기도 하였다.

생지황은 지황(Rehmannia glutinosa) 뿌리의 날것을 의미하며, 성질이 차서 해열 작용이 뛰어나며, 허약 체질, 토혈, 코피, 자궁 출혈, 생리불순 및 변비의 치료에 사용한다.

본 발명에서 인동등, 황금, 갈근 및 생지황은 자체 또는 추출물을 사용할 수 있다. 바람직하게는 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 자체를 분쇄하여 사용할 수 있다. 또한, 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중 어느 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상을 혼합하여 혼합물 형태로 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 인동등, 황금, 갈근 및 생지황이 모두 포함된 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명은, 상기 단계 (1)에서 혼합물 100 중량부를 기준으로, 1 내지 50 중량부의 인동등, 1 내지 50 중량부의 황금, 1 내지 50 중량부의 갈근 및 1 내지 50 중량부의 생지황 중에서 선택된 하나 이상을 이용하여 알콜 발효를 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 (1)의 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 중에서 선택된 2종 이상의 유산균을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 L. acidophilus PF-01, L. fermentum NLRI201, L. plantarum NLRI112를 사용할 수 있다.

상기 단계 (1)의 효모는 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 S. cerevisiae KCTC 7919를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (1)에서 알콜 발효는 14 내지 60일 동안 20 내지 35℃의 온도로 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 40일 동안 20-25℃의 온도로 발효시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (1)에서 추가로 1 내지 20 %(w/v), 바람직하게는 5-10%(w/v)의 당, 더 바람직하게는 5-10%(w/v)의 포도당을 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산균은 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Acetobacter aceti ATCC15973 또는 Acetobacter aceti ATCC23746을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산 발효 직전의 알콜 발효물의 알콜 함량을 4 내지 6 부피%, 바람직하게는 5 부피%로 조절한 후, 초산균을 접종하여 발효할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산 발효는 15 내지 300일 동안 20 내지 35℃의 온도로 발효시킬 수 있으며, 바람직하게는 90 내지 300일 동안 20-25℃의 온도로 발효시킬 수 있다.

상기 단계 (2)에서 제조된 초산 발효물의 초산 함량은 3 내지 10 부피%일 수 있으며, 바람직하게는 초산 함량이 5 내지 10 부피%일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 상기 단계 (2)에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 초산 발효물의 정제는 초산 발효물을 여과하여 불순물을 제거하고 농축하거나 여과 없이 농축할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 발효물은 병원성 미생물에 대한 항균력을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 병원성 미생물은 대장균, 살모넬라, 리스테리아 및 포도상구균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella typhimurium), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

상기 조성물은 병원성 미생물에 대한 항균력을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 병원성 미생물은 대장균, 살모넬라, 리스테리아 및 포도상구균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli), 살모넬라(Salmonella typhimurium), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

본 발명의 살균소독용 조성물은 적용 대상 및 형태에 따라 축산음료, 사료, 식품, 의약품, 또는 화장품 등 어느 하나의 형태의 것일 수 있다. 상기 조성물에 함유된 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 혼합물의 함량은 적용 형태에 따라 적절히 조절 가능하여 특별히 제한하지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 천연물 추출 및 천연물 소재의 항균력 조사

천연물 소재(인동등, 황금, 갈근, 생지황)를 천연물 라이브러리(library)로 선발한 후 천연물 발효를 위한 배지 배합비(표 1)를 작성하고 각각의 미생물 균주(락토바실러스, 바실러스, 효모)를 스타터로 1% 첨가하고, 수분 45%에서 48시간 배양하면서 각 미생물의 발효 변화를 조사하였다(도 1). 각 배지 배합비에 따른 미생물의 발효경향은 도 1과 같으며, 3개 균주(유산균, 효모, 바실러스) 발효 결과, 배지 A가 B, C에 비해 다소 높게 나타나 포도당이나, 효모추출물 등을 첨가할 필요는 없는 것으로 나타났다. 유산균의 경우, 3일 배양 이후에 발효가 이루어지는 것으로 나타났으며, 바실러스와 효모의 경우 2일 배양 시 최고 피크를 보였다. 미생물을 첨가하지 않은 대조구의 경우 발효가 일어나지 않은 것으로 나타났으며, 발효 후반에 곰팡이에 의한 부패를 확인할 수 있었다.

인동등, 황금, 갈근 및 생지황의 천연물 추출액과 상기 발효조건으로부터 얻은 발효추출액의 항균력을 확인하기 위해 발효가 끝난 고상배지를 70% 에탄올로 40℃에서 12시간 추출하고 감압농축기(Evaporator;EYELA CCA-1111, 일본)로 농축하였다. 상기 추출 및 농축과정이 끝난 천연물 및 발효된 천연물 추출액을 disc paper diffusion 방법을 사용하여 표 2의 대장균(Escherichia coli) K88, 살모넬라(Salmonella typhimurium) KCCM 40253, 리스테리아(L. monocytogenes) ATCC 19114 및 포도상구균(Staphylococcus aureus) KFRI 00188 등에 대한 항균력과 유산균(L. acidophilus) PF-01, 바실러스(B. subtilis) KCTC 3239 및 효모(S. cerevisiae) KCTC 7919에 대한 억제 정도를 조사하였다(표 3 및 도 2). 그 결과 표 3 및 도 2에서 보이는 바와 같이 인동등을 비롯한 천연물 및 발효된 천연물 추출액에서의 뚜렷한 항균력은 확인할 수 없었다.

따라서, 상기 결과로부터 천연물 추출물 및 단순 발효된 천연물은 낮은 항균 효과를 보여준다는 것을 알 수 있었다.

항균력 검증을 위해 사용한 균주

A	L. acidophilus PF-01	B	S. cerevisiae KCTC 7919
C	B. subtilis KCTC 3239	D	Escherichia coli K88
E	Salmonella typhimurium KCCM 40253	F	Staphylococcus aureus KFRI 00188
G	L. monocytogenes ATCC 19114

* 단위 cm는 억제대의 직경을 나타낸다.

실시예 2. 천연물 함량 증가에 따른 유산균 및 바실러스의 발효능 조사

표 4와 도 3에 개시한 바와 같이 인동등, 황금, 갈근, 생지황을 대두박과 동량으로 혼합한 배합비를 작성하고, 증류수 150ml를 첨가하여 수분 35%로 조절하였으며, 90℃에서 1시간 열처리 후 30℃로 냉각한 다음 각각의 천연물 고상 배지에 유산균(L. fermentum NLRI201 및 L. plantarum NLRI112), 바실러스(B. subtilis) KCTC 3239 및 효모(S. cerevisiae) KCTC 7919를 각각 10% 접종하고, 30℃에서 3일간 발효하면서 미생물 생장 및 pH 변화를 측정하였다(도 4).

천연물 배합비

구분	대두박 처리구	인동등 처리구	황금 처리구	갈근 처리구	생지황 처리구
대두박	500	250	250	250	250
인동등		250
황금			250
갈근				250
생지황					250
	500	500	500	500	500

상기 유산균의 경우에 천연물소재가 첨가되지 않은 대조구(대두박 처리구)보다 천연물 소재가 첨가된 처리구가 발효능이 좋은 것으로 나타났으며 24시간 발효시 10⁹-10¹⁰cfu/g 수준으로 대체적으로 높은 수준을 보였으며, 인동등, 갈근, 황금, 생지황 순으로 발효능력에 차이를 보였으나, 처리구 간에 유의성은 없었다(도 4A). 다음으로, 천연물과 유산균를 배양한 경우, pH 5.0에서 시작하여 4.0 수준으로 감소했으며 인동등이 가장 낮은 pH 3.88을 보였다(도 4B).

바실러스 경우도 유산균와 비슷한 발효 패턴(10⁸-10⁹cfu/g 수준)을 보였으며, 48시간에 최고 피크를 보였다. 바실러스로 배양하는 경우, pH 5.0에서 시작하여 6.0 수준을 보이다 약간 낮아졌으며 pH 5.0-5.5 수준을 유지하였다.

실시예 3. 유산균 및 바실러스로 고상배양한 천연물 소재 발효물의 유기용매 추출 및 농축

유산균 및 바실러스로 배양한 천연물 소재 발효물 100g에 70% 에탄올 250ml를 가해 30℃에서 24시간 추출하였다. Whatman No.2 여과지로 여과 후 회전 감압농축기(rotary evaporator, Eyela N-1100S-W, 일본)를 사용하여 45℃ 항온수조에서 감압 농축하였다. 농축액의 양이 추출액의 1/10이 되면 농축을 멈추고 농축액을 회수하였다. 유산균 발효 추출 농축액의 항균력은 종이 디스크(paper disc;ø 8mm)를 이용한 한천배지 확산법(Disc Diffusion Assay)으로 실험하였다.

TSB(Tryptic Soy Broth) 배지 100ml에 대장균(E. coli) K88 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) KCCM40253를 각각 접종하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 100배 희석하였다. TSA(Trytic Soy Agar) 배지에 희석한 병원성 균액을 멸균 면봉으로 도말하고 실린지 필터로 제균시킨 농축액 80㎕, 60㎕, 30㎕를 종이 디스크에 흡수시킨 후 배지에 밀착시켰다. 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 디스크 주위에 억제대(inhibition zone; mm)의 직경을 측정하였다. 유산균 발효 추출 농축액의 항균력을 조사한 결과는 항균력이 미약한 것으로 나타났다(도 5).

실시예 4. 천연물의 저온 장기 숙성 중 유산균 및 효모의 변화

기존에 발효시킨 천연물을 혼합하여 천연물 100g에 증류수 400ml를 혼합하여 90℃에서 2시간 용출시킨 다음 냉각하였다. 각각의 처리구에 포도당을 5%(25ml) 접종한 다음, 실온(20~25℃)에서 30일간 숙성시키며 생균수를 측정하였다(*처리구 ; 유산균(LAB) 처리구, 효모(Yeast) 처리구, 유산균+효모 처리구, 유산균+5% 포도당 처리구, Yeast+5% 포도당 처리구, LAB+Yeast+5% 포도당 처리구). 유산균 또는 효모의 저온 장기 숙성 결과는 특히 유산균+효모+5% 포도당 처리구에서 log6.7과 7.7 cfu/g으로서 제일 높게 나타났으며, 대부분의 처리구에서 10⁵cfu/g 이상을 유지하였다(도 6).

실시예 5. 초산 발효를 위한 초산균의 선발

유전자은행을 통해 2개의 초산균주(Acetobacter aceti ATCC15973, Acetobacter aceti ATCC23746)를 구입하여 실험에 사용하였다. 활성화된 균주를 YPD 액상배지(Yeast extract 5g/L, peptone 3g/L, glucose 10g/L) 100ml에 접종한 후 30℃, 180rpm의 조건으로 24시간 동안 진탕배양 후 종균으로 사용하였으며, 알콜 함량에 따른 생균수 및 초산 생성 차이를 확인하기 위해 알콜 0~7% 첨가된 YPD 액상배지를 만들고 30℃, 180rpm에서 6일간 배양하며 초산 함량을 측정하였다.

총산도는 시료 1ml를 취하여 1% 페놀프탈레인 용액을 2~3방울 넣은 후 0.1N-NaOH로 적정하여 소요된 NaOH용액의 양을 초산(acetic acid)로 환산하여 총산도 분석하였다.

V: 0.1N-NaOH 용액의 적정 소요량(ml), D: 희석배수

A: 0.1N-NaOH 용액 1ml에 상당하는 초산의 양(0.006g), S:시료채취량(ml)

YPD 배지에서 초산균의 생장은 48시간에 10⁸ cfu/ml 정도 생장하였으며, 0~7%의 알콜 함량에서 생장에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 7A). 그러나, 각 초산균주 ATCC23746 및 ATCC15973을 알콜 함량 0, 1, 3, 5, 7%(v/v)로 조성하여 배양한 결과에서 초산균주 ATCC15973은 알콜 함량 7%에서 초산 함량을 1.62%로 가장 높게 생성하였으며, 상기 초산균주가 상대적으로 초산 생성량이 많은 것으로 나타났다(도 7B).

실시예 6. 초산균을 활용한 초산 발효

실시예 4에서 저온발효시킨 천연물에 초산균을 2% 접종시킨 후 30℃, 180rpm에서 11일간 배양하면서 0, 7, 11일의 초산 함량을 측정하였다. 유산균과 포도당이 함유된 배지에서 배양한 후 초산균 배양한 경우가 초산 함량을 1.44%로 가장 높게 생성하고, 나머지 조건하에서는 0.8~1.2%의 초산을 생성함을 나타났다(도 8).

실시예 7. 알콜 발효 및 초산 발효된 천연물의 항균력 조사

1차 알콜 저온발효 및 2차 초산균 접종 배양에 의해 제조된 발효물의 항균력 조사를 위해 한천 홈 확산법(Agar-well diffusion assay)을 이용하였다. 병원성 균주 대장균(Escherichia coli) K88, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) KCCM40253, 스타필로코쿠우스 아우레우스(Staphylococuus aureus) KFRI00188, 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) ATCC19114를 각각 TSB 배지 100ml에 접종한 후 32℃, 160rpm에서 24시간 배양했다.

항균력 실험용 NA 고체 플레이트(1000ml 증류수, 8g NB, 15g 한천)을 준비했다. 병원성 균주 수만큼 100ml의 TSB 배지를 준비하고 한천을 0.75% 넣어 멸균한 후 TSB 소프트 한천이 적당한 온도로 식으면 각각의 TSA 배지에 병원성 균주를 600㎕ 넣어 미리 굳혀놓은 NA 배지에 적당량 부었다. 완전히 굳으면 직경 1cm 크기로 배지 층에 구멍을 뚫어 원기둥 모양의 홈을 만들었다. 미리 만들어 놓은 배지의 홈에 병원성 균주를 75~150㎕씩 분주한 후 4℃에서 3시간 방치한 후 32℃ 배양기에서 24시간 배양했다.

대부분의 처리구에서 초산균 접종 전보다 접종 후에 병원성 미생물에 대한 억제효과가 분명하게 관찰되었다(도 9 및 표 5). 특히 유산균+효모 처리구의 경우 초산균 접종 전에는 4개의 병원균에 대한 억제력이 전혀 없다가 접종 후에 억제력이 생성된 것은 앞으로 그 원인에 대해 연구할 가치가 있다고 판단된다.

단위; 억제대 직경(cm)

실시예 8. 1차 및 2차 발효균주의 알콜 생성과 초산 생성량 조사

효모 및 유산균 균주에 의한 천연물 배지에서 1차 발효에 의한 알콜 생성량은 2주 경과 후 3%를 피크로 이후 휘발성 물질로서 알콜 함량이 줄어든 것으로 보였다(도 10A). 초산균에 의한 2차 초산발효는 21일 배양 후 2.5%를 기록하였다(도 10B). 1, 2차 발효 모두 예상했던 목표치를 얻지 못하였지만, 90일과 300일 배양 시 효모+유산균+10% 포도당 배지에서 초산 함량 각각 4.5%와 6.0%를 얻어 목표치에 근접하였다(도 11B 및 11C). 또한 상기 발효물이 4개 병원균에 대한 억제효과가 가장 좋은 것으로 나타났다(도 13 및 표 6). 1, 2차 발효시간은 도 10 및 11에 표기된 시간이며, 온도는 실온(20-25℃)에서 실시하였다.

단위; 억제대 직경(cm)

또한, 장기 숙성의 기간을 단축하고자 초산 발효온도 30℃에서 배양을 하였으나, 실온에서 배양한 것이 초산 함량 5.2%로 30℃ 배양 시 3.9%보다 초산 함량이 높게 나타났다(도 12).

실시예 9. 천연물의 발효 공정도 및 시제품

본 연구에서 최종적으로 인동등, 황금, 갈근, 생지황 등을 천연물로 선발하였다. 증류수와 섞은 후 유산균, 효모 균주로 1달 이상 발효시키면서 알콜 함량이 5% 이상 될 때까지 1차 알콜 발효를 하였다. Whatman No.2 여과지로 여과한다. 여과액의 알콜 함량을 5%로 조정 후 초산균 2% 접종하여 20~25℃에서 3달 이상 초산함량이 5% 이상 되도록 초산 발효를 한 후 정제공정을 거쳐 완제품으로 제조했다(도 14).

Claims

(1) 유산균 및 효모 중에서 선택된 하나 이상의 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 혼합물을 알콜 발효시키는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 발효시킨 알콜 발효물을 초산균으로 초산 발효시키는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 혼합물 100 중량부를 기준으로, 1 내지 50 중량부의 인동등, 1 내지 50 중량부의 황금, 1 내지 50 중량부의 갈근 및 1 내지 50 중량부의 생지황 중에서 선택된 둘 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)의 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum) 및 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 중에서 선택된 2종 이상의 유산균인 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)의 효모는 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 알콜 발효는 20 내지 40일 동안 20 내지 25℃의 온도로 발효시키는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 추가로 5 내지 10%(w/v)의 당을 첨가하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산균은 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)인 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산 발효 직전의 알콜 발효물의 알콜 함량을 4 내지 6 부피%로 조절하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (2)의 초산 발효는 90 내지 300일 동안 20 내지 25℃의 온도로 발효시키는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항에 있어서,
(1) 유산균 및 효모의 혼합 균주를 이용하여 인동등, 황금, 갈근 및 생지황을 포함하는 혼합물을 20 내지 40일 동안 20 내지 25℃의 온도로 알콜 발효시키는 단계;
(2) 상기 단계 (1)에서 발효시킨 알콜 발효물의 알콜 함량을 4 내지 6 부피%로 조절한 후, 초산균으로 90 내지 300일 동안 20 내지 25℃의 온도로 초산 발효시키는 단계; 및
(3) 상기 단계 (2)에서 발효시킨 초산 발효물을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살균소독용 발효물의 제조방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 살균소독용 발효물.
제11항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 살균소독용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 병원성 미생물에 대한 항균력을 가지는 것을 특징으로 살균소독용 조성물.
제13항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 대장균, 살모넬라, 리스테리아, 포도상구균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 살균소독용 조성물.