KR20150116309A

KR20150116309A - 신규 숙취개선 및 간보호용 조성물

Info

Publication number: KR20150116309A
Application number: KR1020140041409A
Authority: KR
Inventors: 주성수
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2014-04-07
Publication date: 2015-10-15
Also published as: US9901608B2; KR101591429B1; US20150283192A1

Abstract

본 발명은 숙취개선 및 간보호 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 증포인삼열매 유래 비진세노사이드 추출물을 유효성분으로 하는 숙취개선 및 간보호용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 숙취개선 및 간보호용 조성물{Novel composition for treating and preventing an alcohol hangover and hepatoprotection}

본 발명은 신규 숙취개선 및 간보호용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 증포인삼열매 유래 숙취개선 및 간보호용 조성물에 관한 것이다.

인삼은 다년생 반음지성 식물로 오가피과에 속하는 것으로서 중국, 한국의 다양한 의서에서 그 효능이 널리 알려져 있어 예로부터 많은 분야의 한약재로 사용하고 있다. 인삼에는 다양한 종류의 진세노사이드(Ginsenoside) 성분이 함유되어 있는데, 진세노사이드는 인삼에 함유된 사포닌(Saponin)을 의미한다. 인삼의 진세노사이드는 파낙사디올(Panaxadiol, PD)계, 파낙사트리올(Panaxatriol,PT)계, 올레안(Oleanane)계 등이 있다. 또한 인삼에는 상기 진세노사이드 성분 이외에도 비진세노사이드 물질로서 전분 등의 탄수화물, 폴리아세틸렌의 항산화성방향족 화합물, 간장을 보호하는 고미신(Gomisin N-A), 유사인슐린 작용을 하는 산성 펩티드 등이 있다.

인삼은 보통 재배기간이 4년 이상 소요되며, 또한 최고 품질의 인삼을 얻기 위해서는 6년간 재배하여야 하는데 재배기간이 오래 걸리고, 또한 재배하는 동안 각종 병충해, 자연재해 등 여러 가지 이유로 인해 최초 재배량 보다 수확량이 적게 되어 가격이 비싸며, 인삼을 얻기 까지 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 이러한 단점을 해결하기 위해 6년을 재배하는 6년근 인삼 대신 6년근 인삼과 대비시 커다란 약효의 차이를 보이지 않은 4년근 인삼의 사용이 점차적으로 증가하고 있는 추세이다.

에탄올 대사는 유해한 화합물을 생성하는데, 이러한 유해한 화합물은 간 손상에 기여하고 알코올 숙취의 원인이다. 알코올(에탄올) 섭취 후 일어나는 일련의 알코올 대사과정 중 활성 대사물질인 아세트알데히드의 과도한 축척이 숙취를 일으켜 두통, 복통, 구토, 설사 외 신체적으로 활동하기에 불편한 증세들이 나타난다. 이때 간에서는 섭취된 알코올을 분해 및 대사에 관여하는 효소들이 활성화되어 신속하게 대사물들을 제거하게 된다. 하지만 과도한 알코올이 체내로 들어올 때 적절한 독성 대사물 제거가 이루어지지 않을 경우 심한 숙취 증상이 나타난다. 숙취는 사람마다 개인차가 있으나 일반적으로 알코올의 대사과정에 아세트알데히드 및 활성산소종 등이 생성되어 숙취 뿐 아니라 지방간 등 간조직에 유해한 영향을 끼치게 된다.

따라서 종래의 숙취개선제는 한약성분 및 생약성분의 복합제의 형태로서 그의 약리학적 특성이 확실치 않으며 간의 해독에 도움을 주는 L-cystein 등이 사용되고 있다. 그러나 알코올 대사과정에서 생성되는 유해 활성 대사물질인 아세트알데히드 및 활성산소종 제거가 동시에 이루어지는 새로운 제제의 개발이 요구 된다. 숙취해소와 관련하여 국내외의 선행기술을 살펴보면, 대한민국 특허등록 제1125130호는 인삼열매 추출물, 인삼화병 추출물, 헛개나무 열매 추출물을 포함하는 숙취해소 음료를 개시하고 있고, 일본 공개특허 제2011-219370호는 인삼열매로부터 얻어지는 항TNF-α 작용제 및 간보호작용제를 개시하고 있으며, 중국 등록특허 제001273175호는 인삼열매의 당뇨병 치료용 조성물 제조를 개시하고 있다.

그러나, 상기 선행문헌의 축취해소제는 그 효과가 미미하거나, 제조비용이 높다는 등의 문제점을 가지고 있다. 본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효과적이고 경제적인 숙취개선 및 간보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취 제거용 조성물이 제공된다.

상기 숙취 제거용 조성물에 있어서, 상기 인삼열매 비진세노이사이드 추출물은 인삼열매를 증포하는 단계; 증포된 인삼열매를 건조하는 단계; 건조된 증포 인삼열매를 분쇄하는 단계; 분쇄된 증포 인삼열매 분말에 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액을 첨가하여 추출하여 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계; 상기 증포 인삼열매 추출물에 에틸아세테이트와 증류수를 첨가한 후 에틸아세테이트층과 증류수 층으로 분획하는 단계; 및) 상기 에틸에세테이트층을 분리하여 건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 건강기능식품이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 증포 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물이 알코올 제거에 관여하는 효소들의 증가와 활성화를 유도하는 알코올 대사촉진 및 숙취 개선용 조성에 관한 것으로, GFM 추출물을 유효성분으로 하는 조성물은 숙취개선 또는 예방 효과가 있다. 또한 기존의 합성 간보호용 물질과는 달리 천연물질인 증포 인삼열매 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으므로, 부작용 등이 문제되지 않는다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 컬럼 크로마토그래피에 의한 에틸아세테이트 추출로부터 비진세노이드(GFM) 추출물을 도식한 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 GFM의 GC-MS 크로마토그램을 나타낸 그래프다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 GFM의 라디칼 소거활성에 대한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 GMF 분획물에 Cu²⁺/H₂O₂와 함께 BSA 단백질의 PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis) 프로파일이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 HepG2 세포의 세포독성과 DAPI 염색을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 핵 조직형태(Nuclear morphology)를 DAPI 염색으로 분석하고 세포사멸의 경향을 형광 현미경으로 분석한 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 주요 효소 유전자 발현 중 ADH 유전자에 대한 GFM의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 주요 효소 유전자 발현 중 CYP2E1에 대한 GFM의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 주요 효소 유전자 발현 중 CAT 유전자에 대한 GFM의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 주요 효소 유전자 발현 중 ALDH 유전자에 대한 GFM의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따라 지방산(HA, PA 및 LA)에 의해 유도된 alcohol dehydrogenase(ADH)의 mRNA 발현을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따라 지방산(HA, PA 및 LA)에 의해 유도된 aldehyde dehydrogenase(ALDH)의 mRNA 발현을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 주요 효소 유전자인, CYP2E1 mRNA의 발현을 프로파일한 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 주요 효소 유전자인 CAR(catalase) mRNA의 발현을 프로파일한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 주요 효소 유전자인 aldehyde dehydrogenase (ALDH)의 mRNA의 발현을 프로파일한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 BALB/c 마우스에서 혈청 에탄올 및 아세트알데히드를 검출한 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라 BALB/c 마우스에서 혈청 에탄올 및 아세트알데히드를 검출한 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따라 BALB/c 마우스에서 혈청 에탄올 및 아세트알데히드를 검출한 그래프이다.

상기 숙취 제거용 조성물에 있어서, 상기 인삼열매 비진세노이사이드 추출물은 인삼열매를 증포하는 단계; 증포된 인삼열매를 건조하는 단계; 건조된 증포 인삼열매를 분쇄하는 단계; 분쇄된 증포 인삼열매 분말에 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액을 첨가하여 추출하여 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계; 상기 증포 인삼열매 추출물에 에틸아세테이트와 증류수를 첨가한 후 에틸아세테이트층과 증류수 층으로 분획하는 단계; 및) 상기 에틸에세테이트층을 분리하여 건조하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 상기 인삼 열매는 미성숙 인삼 열매일 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다. 상기 간질환은 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 원발담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis)(PBC), 간섬유증(liver fibrosis), 비알코올성 지방간(non alcoholic fatty liver disease), 지방간, 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 급성 지방간, 간경변증, 또는 간암일 수 있다.

상기 C1 내지 C4의 저급알코올은 메탄올, 에탄올 또는 프로판올일 수 있고, 더 바람직하게는 에탄올일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구투여 또는 비경구투여를 통해 투여되는 것이 가능하며, 경구투여가 더욱 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.

아울러, 본 발명의 간질환 치료용 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 간질환 치료용 약학적 조성물은 다양한 제형으로 제형화될 수 있는데, 탕제로 제조되어 레토르트 파우치에 포장되어 제조될 수 있고, 열풍건조, 동결건조 등의 방법에 의해 건조된 후 산제, 환제, 캡슐 등의 제형으로 제형화될 수도 있으며, 젤라틴 등 젤화 성분과 혼합되어 젤리 형태로 제형화될 수도 있다. 약학적 제제의 제조에 통상 사용되는 공지된 제형은 어느 것이라도 사용 가능하다.

아울러, 본 발명의 약학적 조성물을 제조하는데 있어서 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 사용될 수 있는데, 이러한 담체로는 통상적인 각종 유기 또는 무체 담체, 예를 들어, 고형제제에서는 부형제, 윤활제, 결합제 및 붕해제, 액체제제에서는 용매, 가용화제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 및 무통화제(soothing agent)가 있다. 또한, 필요한 경우, 통상적인 보존제, 산화방지제, 착색제, 감미제, 흡착제, 습윤제 등과 같은 첨가제가 적절량으로 적절하게 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 적합한 다양한 제형, 예컨대, 탕제, 드링크제, 산제, 환제, 캡슐, 정제(코팅정, 당의정, 설하정 등), 젤리 등의 제형이 사용될 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 "비진세노사이드 추출물(GFM)"은 진세노사이드가 실질적으로 제거된 증포 인삼열매 추출물을 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 인삼열매 추출

본 발명에서 신선한 인삼열매(Panax ginseng C.A. Meyer berries)는 ㈜한국 지네틱 팜(Korea Genetic Pharm Co. Ltd. 한국 경기)으로부터 구입하였다. 본 발명에서 사용한 미성숙 인삼열매(unripened berries)는 최소 4년생으로 모았고, 전체 인삼 열매는 2시간 동안 100℃에서 증포(增布)한 후 50℃에서 24시간 동안 건조하였다. 이러한 증포와 건조 과정을 4회 내지 7회 반복하여 인산열매를 모았고, 마지막으로 7일 동안 건조하여 준비하였다. 도 1은 증포 인삼 미성숙 열매로부터 비진세노이드(GFM) 추출물의 추출과정을 도식화한 개요도이다. 도 1에 나타난 바와 같이 최종 증포된 100 g의 인삼 열매를 실온에서 80% 에탄올 1L 안에 반복적으로 24시간씩 3회에 거쳐 3일 동안 담가두었다. 이후 에탄올 추출물을 혼합하고, 여과지(Whatman International Ltd., 영국)로 여과한 후 증발시켰다. 에탄올 추출물을 1:1 비율의 에틸아세테이트와 증류수 혼합물을 사용하여 분획하였고 그후 에틸아세테이트층을 증발시켜 GFM을 수득하였다(도 1). 에틸아세테이트 추출물의 수율은 건조된 파우더 100g 당 수득된 추출물의 그램으로 나타내었는데, 건조중량 기준으로 에탄올 추출물(27.5 g)에서 대략 50%의 GFM(13.7 g)이 수득되었다.

실시예 2:　Gas chromatogtaphy-mass spectrometry(GC-MS)

본 발명에서 모든 시료들은 에탄올에 녹인 뒤 CTC CombiPAL autosampler system이 부착된 analytical Agilent Technologies 5975C GC/MS 기구를 이용하여 분석하였다. 크로마토그래피 분리는 헬륨 캐리어 가스와 HP-5 column (250 μm 0.25 μm 30 m, Agilent Technologies, USA)을 이용하여 수행하였다. 각 시료들은 10 μL씩 5:1의 분할비율을 이용한 분할 모드(split mode)로 분할 인젝터에 주입되었으며, 분할유속 및 칼럼유속은 각각 5mL/min, 1 mL/min로 설정하였다. 인젝터의 온도는 250℃, 트랜스퍼라인(transfer line)은 250℃로 설정하였으며, GC 오븐은 50℃에서 3분 동안 유지 후 50℃에서 280℃까지 2 ℃/min씩 증가시키고, 3분간 유지시켰다(혈청내 에탄올은 3분간 50℃에서 유지 후, 150℃까지 10℃/min으로 증가시킨 다음, 3분간 유지후 측정하였다). 이온소스(Ion source) 온도는 250℃로 설정하였으며, 이온화 에너지는 -70 V로 고정하여 진행하였다. 데이터는 1059 V 하에서 4분 간 지연 후, 35~250 m/z의 범위에서 수집되었다. 분리된 성분들은 머무름 시간(retention time)과 질량 스펙트럼(mass spectra)을 바탕으로 Wiley 7N library data와 비교하여 분석하였다. 도 2는 GFM의 GC-MS 크로마토그램을 나타낸 그래프인데, 도 2를 보면 GFM는 50여 가지 이상 다양한 요소를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 또한 도 2의 GFM의 GC-MS 크로마토그램 피크(1-4)를 GC-MS 라이브러리에 기초하여 비교하여 표 1의 목록에 나타냈다. GFM은 팔미트산(palitic acid, 이하, 'PA'로 약칭함') 30.00%, 메틸 리놀레산(methyl linoleate, 이하, 'MLA'라 약칭함) 34.10 %, 및 리놀레산(linoleic acid, 이하, 'LA'로 약칭함) 34.66%와 같이 생물학적 활성 분자로 이루어졌고 GFM에서 PA, MLA, 및 LA은 대략 98.76%에 해당한다.

GFM^a의 GC-MS 라이브러리

피크	RT(min)	분자	질(%)	%면적
1	52.482	Palmitic acid(PA)	99	30.00
2	55.286	Heptadecanoic acid(HA)	99	0.11
3	56.337	Methyl linoleate(MLA)	99	34.10
4	57.667	Linoleic acid(LA)	97	34.66

^a:GC-MS 시스템의 와일리 7N 라이브러리 정보를 사용하여 상대 체류 시간 및 질량 스펙트럼의 비교에 기초하여 성분을 확인하였음; RT; 머무름 시간(분).

실험예1:　라디칼 소거활성 및 단백질 보호분석법

1-1:　라디칼 소거활성(Radical scavenging)

진한 보라색을 띠는 DPPH 라디칼은 안정화된 유기 질소 라디칼(organic nitrogen radicals)들 중 하나이며 일반적으로 다양한 항산화 물질(antioxidant substances)의 자유라디칼 소거활성을 평가하는 시약으로 주로 사용되었다. 또한 DPPH는 안정된 자유라디칼이고, DPPH는 안정한 반자성 분자(diamagnetic molecule)가 되기 위해서 전자나 수소라디칼(hydrogen redical)을 받아줌으로 DPPH 라디칼은 GFM의 항산화 효능을 초기에 평가하기 위하여 라디칼소거활성 분석에 주로 사용되었다. 따라서 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 분획물을 DPPH 용액으로 반응시켰다(Espin JC et al., J. Agric. Food Chem., 48:648-656, 2000). 각 동결건조한 분획물은 스톡 용액(100 mg/mL)으로서 DMSO(dimethyl sulfoxide, 시그마알드리치, 미국)로 용해하였고, 각 분획물은 메탄올에 0.3 mM 로 반응하였다. 다양한 농도(0.01-100 μg/mL)의 GFM을 실온에서 20분 동안 DPPH 라디칼 용액에서 반응시킨 후 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 자유 라디칼소거활성(%)은 하기의 식을 이용하여 계산하였다. 이때 Ac는 대조군 DPPH 용액의 시료 흡광도를 나타내고, A는 DPPH 용액에서의 시료의 흡광도를 나타내며, As는 시료 자체의 흡광도를 나타낸다:

DPPH 라디칼소거활성(%) = [Ac - (A - As)]/Ac x 100.

양성대조군으로는 0.1 mM 아스코르브산일 사용하였고 10% DMSO는 음성대조군(vehicle control)으로 사용하였다.

도 3에서 나타난 바와 같이 DPPH 분석에서 GFM은 1 ug/mL에서 라디칼 소거활성을 나타남을 보여주고, 100 ug/mL에서 최대 활성에 도달하였는데, 이는 양성대조군인 아스코르브산의 활성에 상응하는 것이다.

1-2: 단백질 보호분석(protein protection assays)

본 발명에서 단백질 보호분석을 위해 종래에 보고된 방법에 약간의 변형을 가하여 금속-촉매 반응을 이용한 수산기 라디칼-매개 산화 실험을 수행하였다(Mayo JC et al., Biochim. Biophys. Acta., 1620:139-150, 2003). 구체적으로, 표적 단백질인 BSA(bovine serum albumin)는 최종 농도가 0.5 mg/mL이 되기까지 150 mL의 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.3)에 용해시켰다. 상기 BSA 용액을 각 0- 100 μg/mL의 각기 다른 농도의 GFM 및 아스코르브산염 시료의 존재 하에 100 μM의 Cu²⁺ 및 2.5 mM의 H₂O₂의 존재 또는 부존재시 배양 하였다. 이때 PBS에 용해된 0.1 mM의 아스코르브산염(Asc)을 대조 항산화제(control antioxidant)로 사용하였다. 상대적으로 0.1 mM의 아스크로브산은 양성 대조군으로 10% DMSO는 음성대조군(vehicle control)으로 사용하였다. 이때 반응은 37 ℃가 유지되는 진탕항온수조(shaking water bath)에서 뚜껑이 없는 튜브에 넣어 수행하였다. BSA를 포함하여 모든 반응물은 2시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 후에, 각각의 혼합물은 10% SDS-PAGE 전기영동으로 분리한 후, 0.1% 쿠마시 블루 용액(Coomassie Blue solution)으로 염색하여 단백질을 시각화하였다(도 4). 그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이, 10 μg/ml의 GFM은 Cu²⁺ 및 H₂O₂에 의해 생성되는 수산기 자유 라디칼에 의한 공격으로부터 BAS 단백질의 분해를 완벽하게 보호하는 단백질 수준의 항산화 활성을 나타냈다. 따라서 도 3 및 도 4에 나타난 결과를 통애 알 수 있듯이 GFM는 효과적으로 DPPH 라디칼 및 수산기 자유 라디칼과 같은 자유 라디칼을 소거시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 GFM는 항산화 효과를 통해 다기능 에탄올 해독 활성을 갖고 있음을 뒷받침하였다.

실험예 2: 세포독성 및 세포보호(Cytotoxicity and cytoprotection )

2-1: 세포배양

본 발명에서 인간 간암 HepG2 세포(한국세포주은행, 한국)는 10% 우태아혈청, 100 U/mL 페니실린, 및 100 ug/mL 스트렙토마이신(인비트로젠, 미국)을 포함한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 조직 세포배양 플라스크에서 5% CO_2,37℃ 조건에서 배양하였다. 이때, 세포 배양 20 계대를 넘지 않았다. 배지는 2-3일 마다 교체하였다. 각 실험을 위하여, 세포는 90% 정도가 포화될 때까지 배양한 후, 세포를 수집하였고, poly-L-lysine이 코팅된 35 mm 또는 60 mm 플레이트에 5 x 10⁵또는 1.5 x 10⁶의 조건으로 세포를 분주하였다. 24 시간 동안 배양 후에, 무혈청 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium) 배지로 대체하였고, 인산완충용액(PBS, phosphate buffered saline)으로 1회 세척하였고, GFM 또는 PA(palmitic acid), HA(heptadecanoic acid), LA(linoleic acid, 시그마-알드리치, 미국) 및 헛개나무(Hovenia dulcis), 글루타티온(glutathione), 타우린(taurine) 및 다른 자연 허브 추출물의 과일 추출물을 포함하는 상업적으로 이용 가능한 숙취제거제를 양성 대조군(CDT)으로 처리하였다. 상기 CDT는 시판중인 C사의 숙취제거제를 약국에서 구매하였다.

2-2: 세포독성

본 발명에서 GFM의 세포독성은 HepG 세포로부터 방출되는 LDH(lactate dehydrogenase) 함량 측정하여 조사하였다. 즉, HepG2 세포에 의해 유도된 세포독성은 각기 다른 농도(1-1000 μg/mL)의 GFM에서 LDH 방출을 측정함으로서 정량하였다. 세포독성은 실험 시료에서 %LDH 방출로 결정되었고, 또한 3회의 세포배양의 결과는 평균ㅁ표준편차로 나타냈다. 먼저, HepG2 세포는 96웰 마이크로플레이트에 세포를 깔아준 후 각기 다른 GFM의 농도(1??1000 μg/mL)에서 24시간동안 배양하였다. 배양 상등액으로 방출된 %LDH로 측정된 농도-의존적인 세포독성은 비처리대조군-세포(Ctrl)와 비교하였다. 또한 양성대조군으로 H₂O₂(1 mM)처리-대조군을 사용하였고, 200 mM의 에탄올 처리군도 함께 비교하였다. 이때 LDH 분석 키트인 CytoTox 96^ㄾ(Promega, 미국)을 사용하였는데, 이는 빨간색의 포르마잔 생성물 쪽으로 테트라졸리움 염의 확산으로 인해 결합된 효소반응을 기반으로 하였다. 이때 세포배양 상등액에서 생성된 포르마잔 양의 증가는 직접 용균 세포의 수의 증가와 관련이 있음을 보여준다. 포르마잔은 490 nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도 방법적으로 Spectra Max 340 기기(Molecular Devices, 미국)에서 정량하였다(도 5). 그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, GFM으로 HepG2 세포를 24시간 배양한 경우에서 대략 10 ug/mL 이하에서 세포독성을 나타내지 않았고, 세포 독성효과는 100 및 1000 ug/mL의 GFM 처리에서 관찰되었다. 또한 200 mM의 에탄올 역시 세포독성을 나타내지 않았다.

2-3: 세포보호(cytoprotection)

GFM에 의한 세포보호효과를 관찰하기 위하여, 핵 조직형태(Nuclear morphology)를 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate) 염색으로 분석하였고 세포사멸의 경향을 형광 현미경으로 분석하였다. 먼저HepG2 세포(1 x 10⁴)를 4웰 챔버슬라이드에 뿌려준 후 한 시간 동안 10 또는 25 ㎍/㎖의 GFM으로 전처리를 하고 추가로 0.5 M 에탄올을 처리한 후 30분 동안 공동 배양한 후에 DAPI(Sigma-Aldrich, 미국)로 염색하였다. 슬라이드는 실온 암실에서 10분 동안 DAPI(1:500 PBS에 희석)에 염색하였고, PBS에 4% 파라포름알데히드에 고정하고 600배 확대하여 역상-형광현미경 시스템(Eclipse Ti-S; Nikon, 일본)으로 관찰하였다. 그 결과 도 6에서 보여주는 바와 같이 < 25 μg/mL의 GFM을 전처리하였을 때 에탄올 단독처리한 경우와 비교하여 성공적으로 0.5 M의 높은 농도 에탄올로부터 HepG2 간암 세포를 보호하였다. 이러한 결과는 GFM은 에탄올 대사과정에서 아세트알데히드 및 ROS와 같은 반응의 대사산물(reactive metabolites)을 감소하고 제거함으로서 간손상을 최소화함을 나타낸다.

실험예 3: 정량적인 실시간-qPCR 분석을 통한 GFM 및 주요 효소 프로파일

3-1: 정량적인 실시간 중합 효소 연쇄 반응법(qPCR) 분석

본 발명의 정량적인 실시간 중합 효소 연쇄 반응법(qPCR)을 하기의 방법을 통해 수행하였다. 먼저 HepG2 세포 또는 관류시킨 간 조직에서 트리졸(Invitrogen, 미국) 방법을 사용하여 총 RNA를 추출하였으며, 총 RNA가 1 ㎍이 되게 정량을 한 뒤 Improm-Ⅱ 역전사 시스템(Promega, 미국)와 oligo dT 프라이머를 이용하여 역전사를 실행하였다. qPCR은 real-time PCR master mix에는 2x enzyme Master mix 10 ㎕, RNase-free water 7 ㎕, 각각 primer 1 ㎕(각각 10 pM), 그리고 cDNA 1 ㎕로 넣어 총 부피 20 ㎕에 SYBR Green Master Mix(Qiagen, 미국)를 사용하여 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, 호주)로 qPCR을 진행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 먼저 95℃에서 10분간 변성시킨 후에, 95℃에서 15초, 52℃에서 15초, 그리고 72℃에서 10초간 반응을 45주기 반복하였다. 본 발명의 qPCR에 사용된 프라이머는 Gene Bank에 등록되어있는 정보를 바탕으로 제작하였다(표 2). PCR 생성물의 형성을 확인하기 위하여 용융 곡선 분석(melting point analysis)을 사용하고, 정확한 길이를 확인하기위해 1.2%의 아가로스겔 전기영동으로 별도로 수행하였다. 인터-런 교정장치(inter-run calibrator)를 사용하고, PCR효율을 얻기 위해 표준곡선은 각 유전자를 위해 만들었다. 그 후 Rotor-Gene 6000 series software 1.7을 사용하여 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 기준으로 하여 유전자의 발현량을 알아보았다. 각각 3회 수행한 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. *P < 0.05, **P < 0.01, *** P < 0.001. Ctrl은 대조군을 의미하며, EtOH은 에탄올을 나타낸다.

반응에 사용된 프라이머

프라이머명	종	유전자명	핵산서열	크기 (bp)	GenBank 등록번호	서열 번호
hADH1B F	Humamn	ADH1B	5'-GTGGATGAGAATGCAGTGGC-3'	278	NM_000668	1
hADH1B R			5'-CATTCAGTGGCACCCAACTC-3'			2
hALDH1A1 F		ALDH1A1	5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'	203	NM_000689	3
hALDH1A1 R			5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'			4
hCatalase F		Catalase	5'-CAGCTGACACAGTTCGGGAC-3'	276	NM_001752	5
hCatalase R			5'-GATGTCCATCTGGAATCCCC-3'			6
hCYP2E1 F		CYP2E1	5'-CATGAAGCAACCCGAGACAC-3'	277	NM_000773	7
hCYP2E1 R			5'-CTGCAAAATGGCACACAACA-3'			8
hGAPDH F		GAPDH	5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3'	203	AK_026525	9
hGAPDH R			5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'			10
mADH1B F	Mouse	ADH1B	5'-ATTTCATGGGCGTCAGTTCA-3'	209	NM_011996	11
mADH1B R			5'-AAGACCTACACACCCCAGGC-3'			12
mALDH1A1 F		ALDH1A1	5'-GTGGACAAAGTGGCGTTCAC-3'	200	NM_009656	13
mALDH1A1 R			5'-ACTGGCCCTGGTTGAAGAAC-3'			14
mCatalase F		Catalase	5'-CAGCGACCAGATGAAGCAGT-3'	197	NM_009804	15
mCatalase R			5'-CTGCATGGCTACAAGGCTGT-3'			16
mCYP2E1 F		CYP2E1	5'-CAGCGACCAGATGAAGCAGT-3'	162	NM_021282	17
mCYP2E1 R			5'-ACTTAGGGAAAACCTCCGCA-3'			18
mGAPDH F		GAPDH	5'-TACAGCTTCACCACCACAGC-3'	187	NM_007393	19
mGAPDH R			5'-AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3'			20

3-2: 에탄올 대사와 관련하여 GFM의 역할

본 발명에서 에탄올 대사와 관련하여 GFM의 역할 확인을 위하여 GFM 처리 후 에탄올 제거와 연관된 주요 효소(ADH, ALDH, CYP2E1, 및 catalase) 유전자의 mRNA 발현을 조사하였고, ADH(도 7), CYP2E1(도 8), CAT(도 9) 및 ALDH(도 10) 유전자에 대한 GFM의 효과를 나타낸 그래프이다. 먼저 HepG2 세포(1 x 10⁶/웰)를 12웰 세포배양 플레이트에 뿌려 준 후, 0.2 mM의 에탄올 또는 10 ug/mL의 GFM을 처리하여 1, 2, 4 및 24시간 후에 세포를 수집하였다. 그런다음 상기 일실시예에 나타난 방법에 따라 실시간-PCR을 사용하여 ADH, CYP2E1, CAT, 및 ALDH mRNAs 정량하였다. 그 결과 도 7 내지 도 9에 도시 된 바와 같이, 상기 일실시예에 따라 증포된 인삼열매(steam-dried ginseng berries)로부터 준비된 GFM은 시험관 내에서 에탄올의 산화적인 대사에 기여하는 ADH 및 ALDH를 자극하고 CYP2E1 및 CAT 발현을 증가시켰다. 이때 GFM는 에탄올처럼 GFM 처리 2시간 후에 상기 유전자를 자극하였고 이러한 자극은 4시간째까지 계속되었다. 게다가 도 10에 나타난 바와 같이, GFM은 미토콘드리아에서 아세트알데히드의 주요한 대사 유전자(metabolizer)인 ALDH 유전자를 유의하게 자극하여 아세테이트 및 NADH로 대사시켰다.

3-3: 에탄올 대사와 관련하여 GFM의 요소

GFM 내의 어떤 인자가 일차적인 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, GFM에서 동정된 3가지 주요한 분자(HA, PA 및 LA)를 동일한 조건에서 조사하였다. 먼저 HepG2 세포(1 x 10⁶/웰)를 12웰 세포배양 플레이트에 분주한 후, 0.2 mM의 에탄올을 처리하거나 10 μM의 HA, PA, 및 LA를 1시간 또는 2시간 동안 처리하였다. 그런다음 ADH 및 ALDH mRNAs 발현은 상기 일실시예에 나타난 방법에 따라 실시간-PCR을 사용하여 정량 확인하였다(도 11 및 12). 이 때, 상기 ADH 및 ALDH의 mRNA 발현 정도는 GAPDH mRNA를 표준으로 정규화하였다. 그 결과, 도 11 및 12에서 나타난 바와 같이, GFM의 효과는 불포화 지방산인 LA에 의한 것임을 확인할 수 있었. 즉, LA는 다른 지방산(PA 및 HA)와 비교하여 현저하게 ADH, CYP2E1, 및 ALDH 유전자 발현을 증가시켰다. 상기 결과는 GFM가 효과적으로 에탄올로부터 HepG2 세포를 보호하기 때문에, LA가 DNA 손상 및 세포 사멸을 억제하는 것임을 시사하는 것이다(Lundquist F et al., In: Bergmeier HU (ed) Methods of enzymatic analysis. 2nd edn. Weinheim/New York and London, 230-2571, 1974).

실험예 4: 생체 내 조건에서의 숙취 제거능 분석

4-1: 주요 효소 유전자(CYP2E1, CAT 및 ALDH)의 프로파일

본 발명에서 웅성 BALSB/c 마우스(7주령)은 샘타코(오산, 한국)으로 구매하였고, 1주일 동안 온도는 20ㅁ2℃, 상대습도는 50%, 명암주기는 12시간 조건에 두어 안정화시켰다. 안정화된 마우스를 비처리-대조군(Ctrl), 양성-대조군(+CDT), 에탄올 단독처리군(EtOH), 그리고 에탄올-GFM 처리군(+GFM) 4그룹으로 무작위적으로 나누었다(각 n=5). 이때 10 ml/kg의 20% 에탄올을 처리, 0.5 mL/mouse의 CDT 처리 또는 25 mg/kg의 GFM을 처리하고 1시간 지난 BALB/c 마우스에서 간 조직을 분리한 후 균질화한 후 TRIZOL 방법으로 RNA를 추출하였다. 그런 다음 에탄올 대사와 관련된 주요 유전자인 CYP2E1, CAT 및 ALDH mRNA의 발현을 상기 일실시예에 나타난 방법에 따라 실시간-PCR을 수행함으로써 분석하였다. 그 결과, 도 13 내지 도 15에 나타난 바와 같이, 에탄올(EtOH)이 처리된 BALB/c 마우스에 비해 양성대조군인 CDT, 그리고 GFM이 처리된 BALB/c 마우스에서 에탄올 대사에 연관된 주요 유전자(CYP2E1, CAT 및 ALDH)의 간 조직에서의 발현이 유의하게 증가하였다. 특히 에탄올의 일차 산화 대사에 기여하는 CYP2E1 및 CAT mRNA은 매우 현저하게 발현되었는데(P<0.001), 이는 신속한 에탄올 제거를 시사하는 것이다. 또한 미토콘드리아에서 알데히드를 독성이 없는 초산으로 변환하는 ALDH mRNA 역시 GFM에 의해 증가되었다(도 15).

4-2: 혈청시료의 아세트알데히드 및 에탄올 검출

상기 실험예 4-1에서와 동일하게 에탄올, CDT 및 GFM을 처리한 마우스에 대하여 에탄올 처리하고 1시간 후에 혈액 시료를 수집하였다. 본 발명에서 혈청시료는 레트로-오비탈 사이너스 천공(retro-orbital sinus puncture)을 통해 혈액 시료를 수집하였고, 혈청분리를 위한 Microtainer^® 튜브(Becton Dickinson, 미국)에 옮겨 준비하였다. 그런 다음 4℃에서 30분 동안 1200 ㅧ g 조건에서 원심분리하여 혈청을 수득하였으며, 혈청 내의 아세트알데히드 및 에탄올 농도를 효소분석 또는 GC 분석을 사용하여 측정하였다(도 16). 이때 혈중 에탄올은 BALB/c 마우스에 20% 에탄올을 처리하거나, 에탄올과 함께 0.5 mL/mouse의 CDT 또는 25 mg/kg의 GFM을 처리하고 1시간 후에 가스크로마토그래피(GC)를 통해 조사하였다. 아세트알데히드는 상용 테스트-키트(acetaldehyde UV-method, R-BIOPHARM, 독일)로 사용가능한 종래에 보고된 Lundquist의 방법(Lundquist F et al., Biochem. J., 68:172??177, 1958; Lundquist F et al., In: Bergmeier HU (ed) Methods of enzymatic analysis. 2 ^nd ed. Weinheim/New York and London, 230-257, 1974)에 따라 ALDH를 이용하여 효소분석을 수행함으로써 측정하였다. 알코올에 대한 효소분석은 코엔자임 NAD 및 ADH를 이용하여 수행하였다. 형성된 NADH의 양은 아세트알데히드의 양에 대해 화학량론적(stoichiometric)이다. NADH는 365 nm의 파장에서의 흡광도로 측정하였다. 그 후 결과분석은 SPSS ver. 13 software(SPSS, Inc., 미국)를 이용하여 통계 처리하였다. 각 실험군간 비교는 one way ANOVA로 분석하였으며, 사후검정은 Dunnet's post-hoc test로 유의수준 P＜0.05를 검증하였다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. 그 결과, 도 16 및 17에서 나타난 바와 같이, 에탄올 투여군(EtOH)에서 1시간 내에 급성-투여된 에탄올이 12.2%의 농도로 높게 GC에 의해 검출되었다. 반면, 양성 대조군(+CDT) 및 GFM 처리군(+GFM)에서는 에탄올의 수준이 확연히 감소함을 알 수 있었다. 특히, GFM 투여군의 경우 혈청 내에서 에탄올이 거의 검출되지 않았다. 이는 양성 대조군인 CDT와 비교하여도 현저한 효과임을 알 수 있다. 아울러, 숙취의 직접적인 원인물질인 아세트알데히드에 대한 분석결과, 도 18에 나타난 바와 같이, GFM 처리군에서는 확연히 ADH에 의해 변환된 혈청 아세트알데히드가 감소함을 확인할 수 있었다. 마찬가지로, 양성대조군인 CDT 보다 혈중 아세트알데히드 감소 정도가 유의하게 높아, 본발명의 일 실시예에 따른 GFM이 숙취제거에 매우 효과적일 수 있음을 입증하는 것이다.

본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Novel composition for treating and preventing an alcohol hangover and hepatoprotection <130> PD13-1007 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hADH1B F <400> 1 gtggatgaga atgcagtggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hADH1B R <400> 2 cattcagtgg cacccaactc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hALDH1A1 F <400> 3 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hALDH1A1 R <400> 4 gtgatggcat ggactgtggt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCatalase F <400> 5 cagctgacac agttcgggac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCatalase R <400> 6 gatgtccatc tggaatcccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCYP2E1 F <400> 7 catgaagcaa cccgagacac 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCYP2E1 R <400> 8 ctgcaaaatg gcacacaac 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH F <400> 9 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH R <400> 10 gtgatggcat ggactgtggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mADH1B F <400> 11 atttcatggg cgtcagttca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mADH1B R <400> 12 aagacctaca caccccaggc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mALDH1A1 F <400> 13 gtggacaaag tggcgttcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mALDH1A1 R <400> 14 actggccctg gttgaagaac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCatalase F <400> 15 cagcgaccag atgaagcagt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCatalase R <400> 16 caggaatccg ctctctgtca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCYP2E1 F <400> 17 ctgcatggct acaaggctgt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCYP2E1 R <400> 18 acttagggaa aacctccgca 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH F <400> 19 tacagcttca ccaccacagc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH R <400> 20 aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims

인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 숙취 제거용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물은
ⅰ) 인삼열매를 증포하는 단계;
ⅱ) 증포된 인삼열매를 건조하는 단계;
ⅲ) 건조된 증포 인삼열매를 분쇄하는 단계;
ⅳ) 분쇄된 증포 인삼열매 분말에 물, C1 내지 C4의 저급알코올 또는 상기 저급알코올의 수용액을 첨가하여 추출하여 증포 인삼열매 추출물을 제조하는 단계;
ⅴ) 상기 증포 인삼열매 추출물에 에틸아세테이트와 증류수를 첨가한 후 에틸아세테이트층과 증류수 층으로 분획하는 단계; 및
ⅵ) 상기 에틸아세테이트층을 분리하여 건조하는 단계를 통해 제조되는, 숙취 제거용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매인, 숙추 제거용 조성물.
인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매인, 간질환 치료용 약학적 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 간질환은 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 원발담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis)(PBC), 간섬유증(liver fibrosis), 비알코올성 지방간(non alcoholic fatty liver disease), 지방간, 알코올성 지방간, 알코올성 간염, 급성 지방간, 간경변증, 또는 간암인, 간질환 치료용 약학적 조성물.
인삼열매의 비진세노사이드(GFM) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 건강기능식품.
제7항에 있어서,
상기 인삼열매는 미성숙 인삼열매인, 간기능 개선용 건강기능식품.