TW202222308A - 葉綠素酯的治療癌症用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提出一種葉綠素酯的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥。本發明另提出一種經由葉綠素酶作用後之植物葉片萃取物的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥，其中經由葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物包含葉綠素酯。

Description

葉綠素酯的治療癌症用途
本發明關於一種葉綠素衍生物用於治療癌症的醫藥用途，且特別攸關一種葉綠素酯用於治療癌症的醫藥用途。
植物為傳統醫藥的來源。多數植物萃取物具備抗癌特性，如：鳳梨釋迦（ Annona muricata L.）、木瓜（ Carica papaya）、大野芋（ Colocasia gigantea）、釋迦（ Annona squamosa Linn）、可因氏月橘（ Murraya koenigii L.）、油橄欖（ Olea europaea L.）、七葉蘭（ Pandanus amaryllifolius Roxb.）、藜麥（ Chenopodium quinoa）、香椿（ Toona sinensis）、肉荳蔻（ Myristica fragrans）、菱葉野決明（Thermopsis rhombifolia）、印度大麻（ Cannabis sativa）。植物的抗癌活性與特定化合物有關，如：葉綠素（chlorophyll）、脫鎂葉綠酸（pheophorbide）、生物鹼（alkaloid）、類萜（terpenoid）、多醣（polysaccharide）、內酯（lactone）、類黃酮（flavonoid）、類胡蘿蔔素（carotenoid）、醣苷（glycoside）、大麻二酚（cannabidiol）。除了抗癌特性外，植物萃取物中的化合物亦具有抗氧化、抗發炎、與減緩化療導致的副作用。此外，植物萃取物中的生物活性因子葉綠素及其衍生物具有治療癌症的可能性。
葉綠素為大自然最豐富的色素，且大量存在於綠色植物、藻類、藍綠藻（cyanobacteria）。葉綠素的降解主要分為兩種途徑；第一種為透過葉綠素酶（chlorophyllase）催化水解葉綠素而產生葉綠素酯（chlorophyllide）與植醇（phytol），而第二種為透過脫鎂葉綠素酶（pheophytinase）降解脫鎂葉綠素（pheophytin）而產生脫鎂葉綠酸與植醇。先前文獻已證實葉綠素能減緩MCF-7乳癌細胞的生長與增殖。先前文獻亦已報導葉綠素能促進細胞分化並誘導HCT116大腸癌細胞的細胞週期停滯與凋亡。另已證實於肝癌細胞中葉綠素a/b與脫鎂葉綠酸a/b能減緩過氧化氫誘導的鏈斷裂與氧化傷害，並降低黃麴毒素B1（aflatoxin B1）-DNA加成物的形成。又已證實於四環黴素誘導型之HBV表現的HepDE19細胞中葉綠素能降低B型肝炎病毒量與病毒基因產物，且不影響細胞存活。於molt 4B淋巴球性白血病細胞中，脫鎂葉綠酸b與植醇能促進細胞凋亡。再者，植醇亦能透過抑制嗜中性顆粒白血球（neutrophil）的遷移來減緩發炎，並降低IL-1β、TNF-α與氧化壓力。於光動力治療中，發現脫鎂葉綠酸a能提高胞質細胞色素c（cytochrome c）含量，並能抗胰臟癌細胞（Panc-1、Capan-1、HA-hpc2）、肝癌細胞（Hep 3B）、子宮肉瘤細胞、子宮癌細胞、Jurkat白血病細胞。此外，亦已發現於Hep3B、Hep G2細胞及MES-SA子宮肉瘤細胞內脫鎂葉綠酸能降低procaspase-3/-9的活性。
文獻研究已延伸至研究半合成之銅耦合的葉綠素水溶性衍生物銅葉綠酸鈉（copper-chlorophyllin sodium）。文獻亦已證實銅葉綠酸鈉能大幅抑制致突變劑誘導的癌細胞生長。體內與試管內的研究已證實銅葉綠酸鈉具有抗存於熟肉內之化合物的抗原毒性，包含：N-亞硝基化合物與真菌毒素（如：黃麴毒素B1、二苯並[d、e、f、p]屈（dibenzo[d,e,f,p]chrysene））。葉綠酸涉及的癌症生長調控可能與訊息傳遞途徑的失活有關，如：NF-κB、Wnt/b-catenin、phosphatidylinositol-3-kinase/Akt、expressed E-cadherin and alkaline phosphatase等。
每年全球降解葉綠素的含量預估超過十億噸，主要源自農業與食品處理廢棄物。除了蔬果食用部位外，多數農業廢棄物的葉綠素能自然降解。因此，自利用農業廢棄物中萃取葉綠素不僅可應用於生物醫學產業，亦可作為醫療保健或醫藥材料製成的高價值營養保健品。
本發明乃基於多種不同植物葉片萃取物經葉綠素酶（chlorophyllase）作用後具有抑制癌細胞存活活性所完成的，其中活性成份至少含有葉綠素酯。
本發明乃基於多種不同植物葉片萃取物經葉綠素酶作用後與多柔比星（doxorubicin）對抑制癌細胞存活活性具協同現象（synergistic effect）所完成的，其中活性成份至少含有葉綠素酯。
於是，本發明一實施方式提出一種葉綠素酯的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥。
較佳地，所述癌症為乳癌、肝癌、結腸腺癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、或膀胱癌。
較佳地，所述癌症為抗藥性癌症。
較佳地，所述癌症為抗蒽環類藥物的癌症。
較佳地，所述蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素（daunorubicin）、阿柔比星（arubicin）、表柔比星（epirubicin）、伊達比星（idarubicin）、戊柔比星（valrubicin）、或米托蒽醌（mitoxantrone）。
較佳地，所述癌症為三陰性乳癌。
本發明另一實施方式提出一種葉綠素酶作用後之植物葉片萃取物的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥，其中葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物包含葉綠素酯。
較佳地，所述之葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物為以下步驟所取得：提供植物葉片；利用一溶劑萃取植物葉片以取得一粗萃物；以及利用葉綠素酶與粗萃物反應以取得葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物。
較佳地，所述溶劑為乙醇或己烷。
較佳地，所述癌症為乳癌、肝癌、結腸腺癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、或膀胱癌。
較佳地，所述癌症為抗藥性癌症。
較佳地，所述癌症為抗蒽環類藥物的癌症。
較佳地，所述蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素、阿柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星、或米托蒽醌。
較佳地，所述癌症為三陰性乳癌。
本發明又一實施方式提出一種醫藥組合物，其包含：葉綠素酯以及蒽環類藥物。
較佳地，所述蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素、阿柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星、或米托蒽醌。
本發明再一實施方式提出一種醫藥組合物，其包含：葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物以及蒽環類藥物，其中葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物包含葉綠素酯。
較佳地，所述蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素、阿柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星、或米托蒽醌。
較佳地，所述之葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物為以下步驟所取得：提供植物葉片；利用一溶劑萃取植物葉片以取得一粗萃物；以及利用葉綠素酶與粗萃物反應以取得葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物。
較佳地，所述溶劑為乙醇或己烷。
本發明又一實施方式提出一種上述任一醫藥組合物的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥。
較佳地，所述葉綠素酯的有效濃度為12.5至100μg/mL，而蒽環類藥物的有效濃度為0.625至20μg/mL。
較佳地，所述癌症為乳癌、肝癌、結腸腺癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、或膀胱癌。
較佳地，所述癌症為抗藥性癌症。
較佳地，所述癌症為抗蒽環類藥物的癌症。
較佳地，所述蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素、阿柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星、或米托蒽醌。
較佳地，所述癌症為三陰性乳癌。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：
＜實施例1：製備粗萃物與萃取葉綠素＞
取用番石榴、番薯、香蕉、香椿、龍眼、蓮霧、芒果、黃金果、及可可等植物葉片。將濕重10克的上述物葉片清洗、乾燥、與用研缽及研棒搗碎成粉末後，以液態氮冷凍粉末並保存於-80℃冷凍櫃內，以備後續實驗。之後，將粉末浸於HPLC等級的乙醇溶劑（或己烷溶劑）中。以轉速1500g離心乙醇粗萃物（或己烷粗萃物）5分鐘，再存放於-20℃中以備後續實驗。為測量葉綠素a/b濃度，將粗萃物以0.22μm過濾器進行過濾後，並於對應葉綠素a之吸收峰的波長665nm光與對應葉綠素b之吸收峰的波長649nm光下測量吸光值。粗萃物的葉綠素a/b預估濃度依以下公式計算：
Figure 02_image001
；
Figure 02_image003
。 所計算的葉綠素a/b濃度乘上溶劑體積可得到樣本的葉綠素相對含量。於已知植物乾重與濕重的前提下，葉綠素a/b或粗萃物相對於乾植物的含量可計算並表示為mg/gDW。
＜實施例2：製備葉綠素酶作用後的粗萃物＞
萊茵衣藻（ Chlamydomonas reinhardtii）葉綠素酶依文獻（Molecules. 2015 Feb 24;20(3):3744-57；Biotechnol Appl Biochem. 2016 May;63(3):371-7）製備。經表現、純化與凍乾重組葉綠素酶後，製備反應混合物，其含有0.5mg重組葉綠素酶、650μL反應緩衝液（100mM磷酸鈉，pH7.4、及0.24% Triton X-100）及0.1mL粗萃物（葉綠素濃度100mM）。於水浴槽內以37℃作用反應混合物30分鐘。添加4mL乙醇、6mL己烷、1mL氫氧化鉀（10mM）終止反應。劇烈搖晃反應混合物後，以轉速4000rpm離心10分鐘以分離成二層，上層含有未反應的葉綠素a/b，下層為反應後的粗萃物，其含有葉綠素酯a/b。之後，濃縮含有葉綠素酯a/b混合物的反應後粗萃物，並於減壓與40℃下利用旋轉蒸發器蒸發減壓濃縮以去除溶劑。冷凍乾燥減壓濃縮後的粗萃物後，秤重並存放於-80℃中以備後續實驗。
葉綠素萃取自以下九種植物葉片：番石榴、番薯、香蕉、香椿、龍眼、蓮霧、芒果、黃金果、及可可。以葉綠素酶處理乙醇粗萃物以產生葉綠素酯後，冷凍乾燥來測量粗萃物重量。重量如表1所列，香椿（9.8mg/gDW）含最多葉綠素酯a，其次為芒果（8.407mg/gDW），最少為香蕉（2.921mg/gDW）與番薯（3.481mg/gDW）；最多的葉綠素酯b存在於香椿（5.419mg/gDW），其次為可可（4.485mg/gDW）與芒果（2.599mg/gDW），最少為番薯（0.996mg/gDW）、香蕉（1.031mg/gDW）、與黃金果（1.493mg/gDW）。於此些植物中，可可（412.65mg/gDW）與黃金果（397.62mg/gDW）葉片含有最多乙醇粗萃物，而番薯（43.175mg/gDW）、香蕉（4776mg/gDW）與蓮霧（94.29mg/gDW）含有最少乙醇粗萃物。 表1、粗萃物的葉綠素酯含量
植物 品種 葉綠素酯a （mg/gDW） 葉綠素酯b （mg/gDW） 作用後的粗萃物 （mg/gDW）
番薯 Ipomoea batatas 3.481 0.996 43.17
蓮霧 Syzygium samarangense 5.423 1.955 94.29
番石榴 Psidium guajava 5.219 1.493 124.39
香蕉 Musa paradisiaca 2.921 1.031 47.76
香椿 Toona sinensis 9.800 5.419 148.19
龍眼 Dimocarpus longan 7.044 1.903 183.15
芒果 Mangifera indica 8.407 2.599 291.77
黃金果 Pouteria Caimito 5.218 1.493 397.62
可可 Theobroma cacao 6.718 4.485 412.65
＜實施例3：HPLC分析葉綠素代謝產物＞
為分析粗萃物中的葉綠素與葉綠素酯，依文獻所述使用HPLC分析葉綠素酶作用後的粗萃物。利用波長667nm的光檢測葉綠素與葉綠素酯並透過吸收光譜、峰比例以與可靠標準的共遷移確認。
使用HPLC分析系統決定粗萃物中的葉綠素a/b與葉綠素酯a/b含量。使用市售標準品葉綠素a/b與葉綠素酯a/b鑑定出HPLC的特定峰。使用乙酸乙酯/甲醇/過氧化氫（44：50：6）為HPLC系統所使用的流動相，並比較標準品的滯留時間與UV圖譜，以鑑定樣品中的成分與含量。請參照圖1（A）至1（C），於波長667nm的光下，依流速1mL/min可於30分鐘內鑑定出葉綠素，可於10分鐘內鑑定出葉綠素酯。
＜實施例4：細胞培養、化學物質處理與型態觀察＞
使用以下細胞株於體外測試細胞毒性：纖維母細胞（NIH/3T3）、乳癌細胞（MCF7與MDA-MB-231）、肝癌細胞（Hep G2）、結腸腺癌細胞（Caco2）、與神經膠母細胞瘤細胞（U-118 MG），此些細胞分別培養於含10% FBS的DME/F-12培養液、含10% FBS的DME/F-12培養液、含10% FBS的L-15培養液、含10% FBS的DME/F-12培養液、含20% FBS的MEM/EBSS培養液、與含10% FBS的DME/F-12培養液。除了MDA-MB-231外，所有細胞均培養於5%二氧化碳的濕氣氛圍與37℃下。以不同濃度樣品處理細胞後，繼續於培養器內以37℃培養48小時，並觀察細胞狀態。
＜實施例5：細胞存活率MTT分析＞
利用細胞內粒腺體酵素琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase）代謝四氮唑鹽類MTT的效率分析細胞存活率。以5x10 4個/每孔的細胞數培養細胞後，以不同濃度樣品處理細胞，並於培養24小時後，先去除培養液，再添加1mg/mL MTT溶液反應4小時。之後，去除MTT溶液後，再添加二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液並使用多孔分光光度計以595nm波長測定吸光值。半抑制劑量（IC 50）定義為抑制50%細胞存活活性所須的濃度，其透過非直線回歸分析取得。計算選擇性指數（selectivity index，SI）可評估癌細胞與正常細胞的毒性，其為正常細胞NIH-3T3的IC 50值相對於癌細胞的IC 50值。於SI值超過2時，可視為粗萃物具高選擇性。葉綠素酯含量與毒性間的相關係數以皮爾森相關係數（Pearson's correlation coefficient）公式計算，其值介於+1至-1間。相關係數值介於0.7至0.99間定為高相關性，介於0.4至0.69間定為高適度相關性，介於0.1至0.39間定為低適度相關性，介於0.01至0.09間定為低相關性。
請參照圖2（A）至2（C），利用MTT法分析葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物（濃度為50至200μg/mL）對NIH/3T3、MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、Caco2與U-118 MG等細胞的毒性影響。以番薯而言，葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物可誘導測試細胞（包含NIH/3T3）產生濃度依賴型的毒性效應，且最低IC 50值介於6.42至11.02μg/mL。以蓮霧而言，葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物對MCF7、MDA-MB-231、與U-118 MG均有顯著的劑量依賴型毒性且IC 50值分別為5.28、6.98、與7.13μg/mL。以番石榴而言，葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物可誘導U-118 MG與Caco2死亡，IC 50值分別為5.6與6.98μg/mL。以香蕉而言，葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物對MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、與U-118 MG呈現適度的毒性。來自香椿之葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物具有與番薯相似的細胞毒性，除了對Hep G2具有稍高IC 50值外。對龍眼而言，葉綠素酶作用後的乙醇粗萃物對U-118 MG具有最強毒性。於NIH/3T3中，芒果、黃金果與可可之作用後的乙醇粗萃物未出現明顯細胞毒性。然而，芒果、黃金果與可可等植物之作用後的乙醇粗萃物對MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、與U-118 MG僅有些微差異，且IC 50值＞20μg/mL。
依劑量反應曲線，計算出各葉綠素酶作用後之乙醇粗萃物的IC 50值，結果如表2、3所示。MCF7對蓮霧與香蕉之作用後的乙醇粗萃物較敏感，且IC 50值為6.98與10.82μg/mL。MDA-MB-231對番薯、蓮霧、與香椿等植物之作用後的乙醇粗萃物最為敏感，IC 50值各為8.6、7.31與8.14μg/mL。於Hep G2，番薯之作用後的乙醇粗萃物具最低的IC 50值9.0μg/mL，而於其他植物的IC 50值均大於15μg/mL。於Caco2，番薯的IC 50值為8.75μg/mL。U-118 MG為所有細胞中最為敏感的，且對蓮霧、番石榴、番薯、龍眼、香蕉、香椿與芒果的IC 50值分別為5.28、5.60、6.45、10.88、11.10、13.62、與15.51μg/mL。
SI值定義為作用後的乙醇粗萃物對癌細胞與正常細胞NIH/3T3的IC 50值比值。SI值超過2時，視為具高選擇性。故SI值可評估粗萃物中之葉綠素酯的治療可能性。香蕉於MCF7、U-118 MG、MDA-MB-231與Hep G2具有最高的SI值，分別為3.66、3.57、2.66及2.5。番石榴的最大SI值出現於U-118 MG為2.37。於所有植物中，番薯於U-118 MG、Hep G2、Caco2、MDA-MB-231中具最低IC 50值（6.45至11.02μg/mL），因而展現最有潛力的細胞毒性。 表2、作用後的乙醇粗萃物對不同細胞的IC 50值與SI值
植物 MCF7 MDA-MB-231 Hep G2 Caco2 U-118 MG NIH/3T3
IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50
番薯 122.29 0.67 82.90 0.99 63.73 1.29 80.73 1.02 43.17 1.915 82.68
蓮霧 88.87 1.63 97.83 1.48 ＞200 0.57 ＞200 0.66 52.64 2.75 144.90
番石榴 ＞200 1.03 ＞200 1.10 ＞200 0.72 ＞200 1.41 133.55 2.37 ＞200
香蕉 104.41 4.60 186.99 2.57 192.07 2.50 N/A 1.00 119.59 4.02 ＞200
香椿 ＞200 1.02 107.24 2.12 ＞200 0.74 154.63 1.47 206.01 1.10 ＞200
龍眼 ＞200 0.72 ＞200 0.56 ＞200 N/A ＞200 0.99 ＞200 1.28 ＞200
芒果 ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200
黃金果 ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200
可可 ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200 N/A ＞200
表3、作用後之乙醇粗萃物中的葉綠素酯對不同細胞的IC 50值與SI值
植物 MCF7 MDA-MB-231 Hep G2 Caco2 U-118 MG NIH/3T3
IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50 SI IC 50
番薯 11.02 0.75 8.60 0.96 9.00 0.92 8.75 0.94 6.45 1.28 8.26
蓮霧 6.98 1.38 7.13 1.36 15.43 0.63 11.95 0.81 5.28 1.83 9.66
番石榴 12.87 1.03 12.01 1.10 18.44 0.72 9.39 1.41 5.60 2.37 13.26
香蕉 10.82 3.66 14.90 2.66 15.86 2.50 ＞20 1.00 11.10 3.57 ＞20
香椿 14.67 1.02 8.14 1.84 20.32 0.74 10.36 1.45 13.62 1.10 15.02
龍眼 19.19 0.72 ＞20 0.56 ＞20 N/A 13.51 1.03 10.88 1.28 13.87
芒果 ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20 N/A 15.51 N/A ＞20
黃金果 ＞20 N/A 15.13 N/A ＞20 N/A 16.74 N/A ＞20 N/A ＞20
可可 ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20 N/A ＞20
依皮爾森相關係數計算相關係數於圖3及表4，其說明著葉綠素/葉綠素酯含量與細胞毒性之間呈現負相關係數。於不同植物間葉綠素/葉綠素酯含量與細胞毒性的相關性為不同，因此依據相關係數可將植物分成四類：第一類為高相關類，相關係數介於0.7至0.99，番薯與蓮霧屬於此類；第二類為高適度相關類，相關係數介於0.4至0.69，番石榴、香蕉與香椿屬於此類；第三類為低適度相關類，相關係數介於0.1至0.39，龍眼與芒果屬於此類；第四類為低相關類，相關係數介於0.01至0.09，黃金果與可可屬於此類。 表4、作用後之乙醇粗萃物對不同細胞的相關係數
  番石榴 番薯 香蕉 香椿 龍眼 蓮霧 芒果 黃金果 可可
NIH/3T3 -0.902 -0.945 -0.774 -0.983 -0.831 -0.976 -0.175 -0.057 -0.519
MCF7 -0.954 -0.975 -0.955 -0.983 -0.712 -0.967 -0.932 0.014 -0.302
MDA-MB-231 -0.971 -0.933 -0.986 -0.959 -0.584 -0.976 -0.768 -0.709 -0.797
Hep G2 -0.666 -0.770 -0.859 -0.572 -0.497 -0.878 -0.922 -0.497 -0.789
Caco2 -0.961 -0.876 -0.634 -0.995 -0.701 -0.937 -0.758 -0.676 -0.975
U-118 MG -0.886 -0.839 -0.982 -0.982 -0.685 -0.870 -0.964 -0.507 -0.713
為確認作用後之乙醇粗萃物中的葉綠素酯對細胞毒性的影響，利用MTT分析比較葉綠素酶作用前後的番薯乙醇粗萃物及銅葉綠酸鈉對MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、Caco2與U-118 MG等細胞的細胞毒性。如圖4所示，作用後的番薯乙醇粗萃物對MCF7、MDA-MB-231、Hep G2、Caco2與U-118 MG展現顯著的細胞毒性，IC 50值各為116.53、84.95、66.73、80.37及45.65μg/mL。相對地，未作用的番薯乙醇粗萃物僅對MCF7展現出適度細胞毒性，IC 50值為197.31μg/mL；銅葉綠酸鈉對MCF7具有低活性，IC 50值為218.34μg/mL。以上結果與先前結果呼應，證實基於最低IC 50值，MDA-MB-231、Hep G2、Caco2與U-118 MG等細胞對葉綠素酶作用後的番薯乙醇粗萃物敏感。
＜實施例6：自由基清除分析＞
使用DPPH分析評估葉綠素酶作用後之粗萃物的自由基清除活性。利用乙醇製備0.1mM DPPH溶液。接著，取等量DPPH溶液與樣品混合，並於暗處室溫下反應30分鐘後，以波長517nm的光測量吸光值。DPPH清除率依以下公式計算：
Figure 02_image005
。 ，Ac為空白控制組的吸光值，Ai表示為樣品存在下的吸光值，Aj表示為樣品單獨存在下的吸光值。使用維生素B2作為參考標準品。EC 50為抑制50%DPPH自由基活性所須的濃度，其透過回歸分析的外插法所取得。
利用DPPH分析比較葉綠素酶作用前後之番薯乙醇粗萃物及銅葉綠酸鈉的抗氧化活性。如圖5所示，葉綠素、銅葉綠酸鈉及正控制組維生素B2的清除率依劑量增加而增加。於濃度100、200與400μg/mL下，銅葉綠酸鈉各具25.68%、30.58%、45.34%清除率。葉綠素酶作用後之番薯乙醇粗萃物（濃度200μg/mL）的清除率為26.92%與濃度100μg/mL維生素B2的清除率28.05%於相近；葉綠素酶作用後之番薯乙醇粗萃物（濃度400μg/mL）的清除率維持不變。經計算後，葉綠素酯與維生素B2的EC 50值超過400μg/mL，葉綠素則為62.14μg/mL。
＜實施例7：多柔比星抗藥性分析＞
本實施例參照上述的細胞存活率MTT分析進行。如圖6（A）所示，僅於0.625μg/mL多柔比星存在下，對MCF7與MDA-MB-231等細胞無明顯毒性；又如圖6（B）所示，僅於葉綠素酶作用後且含100μg/mL葉綠素酯的番薯己烷粗萃物存在下，對MCF7與MDA-MB-231等細胞無明顯毒性。
因此，進一步以0.625μg/mL多柔比星搭配葉綠素酶作用後且含不同濃度之葉綠素酯的番薯己烷粗萃物進行細胞存活率MTT分析。如圖6（C）所示，於多柔比星濃度固定為0.625μg/mL下，隨著葉綠素酯濃度增加，可降低多柔比星與葉綠素酶作用後之番薯己烷粗萃物的組合物對細胞的存活性。表示說，多柔比星與葉綠素酶作用後之番薯己烷粗萃物的組合物對細胞的毒性相對於僅多柔比星對細胞的毒性以及僅葉綠素酶作用後之番薯己烷粗萃物的組合物對細胞的毒性具有協同效應。
又進一步以葉綠素酶作用後且含100μg/mL葉綠素酯的番薯己烷粗萃物搭配不同濃度多柔比星進行細胞存活率MTT分析。如圖6（D）所示，於葉綠素酯濃度固定為100μg/mL下，隨著多柔比星濃度增加，並無法降低多柔比星與葉綠素酶作用後之番薯己烷粗萃物的組合物對細胞的存活性。表示說，多柔比星與葉綠素酶作用後之番薯己烷粗萃物的組合物對細胞毒性造成的協同效應並非多柔比星所致的，而為葉綠素酯所致的。
＜實施例8：差異表達基因分析＞
採用次世代定序（next generation sequencing，NGS）分析乳癌細胞MCF7與MDA-MB-231於葉綠素酯處理後的基因表達差異。
如圖7所示，比較葉綠素酯處理之乳癌細胞MCF7與未處理對照細胞MCF7的差異表達基因後，可知經葉綠素酯處理後，乳癌細胞MCF7可鑑別出124個差異表達基因，其中43個為正向調控基因，81個為反向調控基因；另比較葉綠素酯處理之乳癌細胞MDA-MB-231與未處理對照細胞MDA-MB-231的差異表達基因，可知經葉綠素酯處理後，乳癌細胞MDA-MB-231可鑑別出77個差異表達基因，其中56個為正向調控基因，21個為反向調控基因。
針對上述差異表達基因進行gene ontology（GO）註解分析。基於序列同源性，自圖8（A）可知乳癌細胞MCF7經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因於「分子功能」主類別主要落於「結合」子類別，於「細胞組成」主類別主要落於「細胞」子類別，於「生物過程」主類別主要落於「代謝過程」子類別；自圖8（B）可知乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因於「分子功能」主類別主要落於「催化活性」子類別，於「細胞組成」主類別主要落於「細胞解剖實體」子類別，於「生物過程」主類別主要落於「代謝過程」子類別。由此可知，「代謝過程」為乳癌細胞MCF7與乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因中最具代表性。
再針對上述差異表達基因進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，乳癌細胞MCF7與乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因具備顯著相似性，並分配於不同的KEGG途徑，主要有六大主分類：「代謝」、「遺傳訊息處理」、「環境訊息處理」、「細胞過程」、「生物系統」、及「人類疾病」。如圖9（A）所示，乳癌細胞MCF7經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因主要分布於「人類疾病（最多）」與「生物系統（次多）」等主分類，但未分布於「細胞過程」。詳言之，這些歸類於人類疾病的差異表達基因主要與「病毒感染疾病（17個差異表達基因）」、「物質依賴性（4個差異表達基因）」、與「心血管疾病（4個差異表達基因）」等子分類有關，而這些歸類於生物系統的差異表達基因則主要與「內分泌系統（10個差異表達基因）」、「免疫系統（2個差異表達基因）」、「消化系統（2個差異表達基因）」、與「感官系統（2個差異表達基因）」等子分類有關。又如圖9（B）所示，乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因主要分布於「人類疾病」主分類。詳言之，這些歸類於人類疾病的差異表達基因主要與「寄生蟲感染疾病（2個差異表達基因）」子分類有關；此外，就乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因而言，與「生物系統」主分類中的「神經系統」子分類最為有關。
如圖10所示，自乳癌細胞MCF7經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因與乳癌細胞MDA-MB-231經葉綠素酯處理鑑別出的差異表達基因中選出50個候選基因。接著，自此50個候選基因挑選CCR1、STIM2、ETNK1、RAP2B與TOP2A等基因作為即時聚合酶鏈鎖反應（RT-PCR）的分析標的基因，其分析結果如表5所列。 表5、分析標的基因的RT-PCR表達量
基因 Log 2倍率差異 經葉綠素酯處理過 的MCF7 經葉綠素酯處理過 的MDA-MB-231
CCR1 5.954 6.798 10.079
STIM2 2.783 6.125 3.5088
ETNK1 2.181 1.98727 5.954
RAP2B 2.375 0.58816 3.694
MAGI1 (2.307) 3.12595 1.3977
NLRC5 (5.824) 0.68403 5.527
SLC7A7 (22.208) 0.31069 1.159
PKN1 (2.520) 1.16696 0.5819
TOP2A (2.230) 1.57446 11.01549
如圖11（A）所示，就乳癌細胞MCF7而言，CCR1、STIM1與MAGI1利用RT-PCR測得的表達量明顯地較利用次世代定序之RNA-seq測得的表達量上調，而NLRC5與SLC7A7利用RT-PCR測得的表達量明顯地較利用次世代定序之RNA-seq測得的表達量下降。又如圖11（B）所示，就乳癌細胞MDA-MB-231而言，CCR1、ETNK1、RAP2B、NLRC5與TOP2A利用RT-PCR測得的表達量明顯地較利用次世代定序之RNA-seq測得的表達量上調，而SLC7A7利用RT-PCR測得的表達量明顯地較利用次世代定序之RNA-seq測得的表達量下降。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
圖1（A）至1（C）為HPLC結果圖，說明不同植物之乙醇粗萃物於葉綠素酶處理前後的葉綠素a/b與葉綠素酯a/b。 圖2（A）至2（C）為MTT結果圖，說明不同植物之乙醇粗萃物於葉綠素酶處理後對不同細胞的毒性。 圖3為皮爾森相關係數計算結果圖，說明不同植物之乙醇粗萃物於葉綠素酶處理後的含量對不同細胞之毒性的關聯。 圖4為IC 50值比較圖，說明番薯乙醇粗萃物於葉綠素酶處理前後及銅葉綠酸鈉對不同細胞毒性的IC 50值。 圖5為DPPH結果圖，說明番薯乙醇粗萃物於葉綠素酶處理前後及銅葉綠酸鈉的自由基清除率。 圖6（A）為MTT結果圖，說明多柔比星的不同濃度對細胞毒性的關聯。 圖6（B）為MTT結果圖，說明番薯己烷粗萃物於葉綠素酶處理後之葉綠素酯的不同濃度對細胞毒性的關聯。 圖6（C）為MTT結果圖，說明於多柔比星濃度為0.625μg/mL條件下，番薯己烷粗萃物於葉綠素酶處理後的不同葉綠素酯濃度對細胞毒性的關聯。 圖6（D）為MTT結果圖，說明於番薯己烷粗萃物於葉綠素酶處理後之葉綠素酯濃度為100μg/mL條件下，多柔比星的不同濃度對細胞毒性的關聯。 圖7為NGS結果圖，呈現乳癌細胞MCF7與MDA-MB-231於葉綠素酯處理後的差異表達基因數量。 圖8（A）為GO註解分析結果圖，呈現乳癌細胞MCF7於葉綠素酯處理後之差異表達基因於GO資料庫的分類。 圖8（B）為GO註解分析結果圖，呈現乳癌細胞MDA-MB-231於葉綠素酯處理後之差異表達基因於GO資料庫的分類。 圖9（A）為KEGG富集分析結果圖，呈現乳癌細胞MCF7於葉綠素酯處理後之差異表達基因於KEGG數據庫的子分類。 圖9（B）為KEGG富集分析結果圖，呈現乳癌細胞MDA-MB-231於葉綠素酯處理後之差異表達基因於KEGG數據庫的子分類。 圖10為NGS結果圖，呈現乳癌細胞MCF7與MDA-MB-231於葉綠素酯處理後之差異表達基因的基因表達量。 圖11（A）為長條圖，比較乳癌細胞MCF7於葉綠素酯處理後之例示差異表達基因利用NGS定量與RT-PCR定量的結果。 圖11（B）為長條圖，比較乳癌細胞MDA-MB-231於葉綠素酯處理後之例示差異表達基因利用NGS定量與RT-PCR定量的結果。

Claims (10)

  1. 一種葉綠素酯的用途，係用於製備治療癌症的醫藥。
  2. 一種葉綠素酶作用後之植物葉片萃取物的用途，係用於製備治療癌症的醫藥，其中該葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物包含葉綠素酯。
  3. 如請求項1或2所述之用途，其中該癌症為乳癌、肝癌、結腸腺癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、或膀胱癌。
  4. 如請求項2所述之用途，其中該葉綠素酶作用後之植物葉片萃取物的製備方法包括： 提供植物葉片； 利用一溶劑萃取該植物葉片以取得一粗萃物；以及 利用葉綠素酶與該粗萃物反應以取得該葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物。
  5. 如請求項4所述之用途，其中該溶劑為乙醇或己烷。
  6. 一種醫藥組合物，係包括：葉綠素酯；以及蒽環類藥物。
  7. 一種醫藥組合物，係包括：葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物；以及蒽環類藥物，其中該葉綠素酶作用後的植物葉片萃取物包含葉綠素酯。
  8. 如請求項6或7所述之醫藥組合物，其中該蒽環類藥物為多柔比星、柔紅黴素、阿柔比星、表柔比星、伊達比星、戊柔比星、或米托蒽醌。
  9. 一種如請求項6或7所述之醫藥組合物的用途，其為用於製備治療癌症的醫藥，其中該癌症為乳癌、肝癌、結腸腺癌、神經膠母細胞瘤、肺癌、頰癌、胃癌、結腸癌、鼻咽癌、皮膚癌、腎癌、腦癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、腸癌、或膀胱癌。
  10. 如請求項9所述之用途，其中該葉綠素酯的有效濃度為12.5至100μg/mL，而該蒽環類藥物的有效濃度為0.625至20μg/mL。
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