KR20150115013A

KR20150115013A - 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리

Info

Publication number: KR20150115013A
Application number: KR1020157024205A
Authority: KR
Inventors: 안야 안 데 스톨페; 하르마 마르티네 페이트스마; 피테르 얀 반 데르 자흐; 레인홀드 빔베르헤르-프리에들; 야코프 마리뉘스 얀 덴 툰데르; 안케 피리크; 프레크 반 헤메르트
Original assignee: 코닌클리케 필립스 엔.브이.
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2015-10-13
Also published as: US20150369772A1; BR112015018674A2; EP2954315A2; WO2014122548A2; CN104969065A; RU2015137824A; RU2661784C2; JP2016508371A; JP6430406B2; WO2014122548A3

Abstract

본 발명은 뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequence)들의 처리를 위한 방법 및 장치(100)에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 장치(100)는 전극들(120a, 120b,...)의 어레이를 포함하고, 여기서 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스(1, 2)의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼(nanoball)(NB)은 그 크기의 단지 하나의 나노볼(NB)이 동시에 부착될 수 있는 전극에 부착된다. 따라서, 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들(1, 2)에 대한 전극들(120a, 120b,...)의 고유한 연관이 성취될 수 있다. 나노볼들(NB)은 바람직하게 회전환 증폭(rolling circle amplification)에 의해 생성된다. 전극들(120a, 120b,...)에 대한 끌어당기고/거나 밀어내는 전위들의 인가는 나노볼들(NB)의 부착을 제어하기 위해 이용될 수 있다. 전극들(120a, 120b,...)의 용량의 변화들의 측정치는 전극에서의 나노볼(NB)에서 복제되는 가닥들로의 상이한 용액들(A, T, G, C)에 의해 순차적으로 제공된 모노-또는 올리고뉴클레오티드들의 합체를 검출하고 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.

Description

뉴클레오티드 시퀀스들의 처리{PROCESSING OF NUCLEOTIDE SEQUENCES}

본 발명은 뉴클레오티드(nucleotide)들의 시퀀스(sequence)들의 처리를 위한 특히, DNA/RNA 뉴클레오티드 순서의 결정을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

WO 2012/042399 A1은 상이한 DNA-프라이머(primer)들로 코팅되는 복수의 전극들을 포함하는 바이오센서 디바이스를 개시한다. 용량들의 변화들을 복제된 DNA-프라이머에 대한 뉴클레오티드들의 부가의 탓으로 돌리도록 허용하는 전극들의 전기 용량이 모니터링된다. 전극들을 순차적으로 모노뉴클레오티드들의 상이한 용액들에 노출시킴으로써, 어떤 뉴클레오티드가 현재 부가되는지가 제어될 수 있다. 하나의 전극에서의 관측된 부가를 하나의 특정한 유형의 프라이머에 할당할 수 있게 하기 위해, 각각의 전극이 단지 하나의 종류의 프라이머로 코팅되는 것이 중요하다. WO 2012/042399 A1에 설명된 절차에서, 이용가능한 전극들 중 단지 약 37%가 이 방식으로, 단일 유형의 프라이머로 코팅될 수 있는 반면에, 나머지 전극들은 전혀 어떠한 프라이머도 포함하지 않거나 동시에 2개 이상의 상이한 프라이머들을 포함하고, 이는 측정 신호들의 어떠한 고유의 해석을 허용하지 않는다.

전극 어레이를 갖는 뉴클레오티드 시퀀스들의 더 효율적인 처리를 허용하는 수단들을 제공하는 것이 이로울 수 있다.

이 관심사는 청구항 제 1 항에 따른 장치, 청구항 제 2 항에 따른 방법, 및 청구항 제 15 항에 따른 이용에 의해 해결된다. 바람직한 실시예들은 종속 청구항들에서 개시된다.

제 1 양태에 따라, 본 발명의 일 실시예는 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치에 관한 것이고, 상기 장치는 다음 구성요소들:

- 전극들의 어레이, 및

- 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼(nanoball)을 포함하고, 상기 나노볼은 그 크기의 많아야 하나의 나노볼이 한번에 부착될 수 있는 전극에 부착된다.

장치에 의해 행해지는 처리는 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들의 임의의 종류의 조작 예를 들면, 시퀀스들의 분할 또는 한 가닥의 뉴클레오티드들의 복제일 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 처리는 상기 시퀀스를 결정하는 목적을 위해 뉴클레오티드들의 공지되지 않은 시퀀스를 가지는 프라이머의 단계적 복제를 포함한다. 이 경우에, 장치는 바이오센서로서 구성된다.

처리된 뉴클레오티드 시퀀스들은 예를 들면: 가공되지 않은(raw) 샘플들(박테리아, 바이러스, 게놈 DNA, 등); 정제된 게놈 DNA 또는 RNA와 같은, 정제된 샘플들; 증폭 반응의 결과물(들); 핵산들 및 관련 화합물들과 같은 생체 분자 화합물들(예로서, DNA들, RNA들, 올리고뉴클레오티드들 또는 그의 아날로그들, PCR 제품들, 게놈 DNA, 박테리아 인공 염색체들 등)을 포함한다(그러나, 이들로 제한되지 않는다).

용어 "어레이"는 복수의 요소들(본 명세서에서 전극들)의 임의의 1차, 2차 또는 3차원 배열을 나타낼 것이다. 전형적으로, 전극 어레이는 2차원이고 바람직하게 또한 평면이며, 전극들은 규칙적인 패턴 예를 들면, 격자 또는 행렬 패턴으로 배열된다.

어레이의 전극들은 일반적으로, 모두 개별적으로 설계될 수 있다. 바람직하게, 모든 전극들 또는 모든 전극들의 적어도 하위-그룹들은 그러나, 그 형태, 크기 및/또는 물질이 같거나 유사하다. 전극들은 도전성일 것이거고 그들을 주어진 전위(electrical potential)로 설정하는 것이 가능할 것이다. 가장 바람직하게, 전극들의 하위-그룹들 또는 심지어 단일 전극들은 개별적으로 어드레스가능하다, 즉 그들은 개별적으로 원하는 전위를 공급받을 수 있다.

용어 "나노볼"은 일반적으로 큰 분자 또는 소형의 예를 들면, 전형적으로 약 1nm과 약 1000nm 사이의 범위, 바람직하게 약 50nm과 약 500nm 사이의 범위인 내부 반지름을 갖는 (대략) 구 형상을 가지는 복합체를 나타낸다. 본 명세서에서 및 다음에, 용어 물체의 "내부 반지름"은 상기 물체에 완전하게 새겨질 수 있는 가장 큰 기하학적 구의 반지름으로서 정의될 것이다.

본 명세서에서 문제가 되는 나노볼은 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함할 것이다. 이들 복제들은 전형적으로, 다른 구성들이 또한 가능할지라도 이어지는 선형 가닥의 뉴클레오티드들로 줄지어 정렬된다(예로서, 관심 있는 시퀀스의 복제들 사이의 상이한 구성의 스페이서 요소들을 갖는 분지(branched) 분자들 및/또는 분자들). DNA의 단일-가닥 본질과 함께 이 직렬 반복(tandem repeat) 구조는 나노볼 접힘 구성을 유발한다.

연관된 전극으로의 나노볼의 부착은 임의의 적절한 효과에 의해 성취될 수 있다. 나노볼은 예를 들면, 전극의 표면에 공유결합으로 결속될 수 있고/있거나 상기 표면 상에 제공되는 일부 프라이머에 부착될 수 있고/있거나 소수성 또는 정전기 상호작용들을 통해 비 공유결합으로 결속될 수 있다.

전극 표면은 나노볼들의 부착을 허용하기 위해 화학적으로 수정될 수 있다. 충전된 분자들 또는 중합체를 가지면, 이러한 수정은, 수정이 확산에 의존하지 않고 표면과 빠르게 접촉되도록 적절한 전하들을 전극들에 인가함으로써 선택적으로 지원될 수 있고/있거나 개선될 수 있으며, 동종의 얇은 층에서 적용될 수 있다.

상기 설명된 종류의 장치는, 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스의 많은 복제들이 하나의 전극에 용이하게 연관될 수 있다는 장점을 갖는데, 이는 그것이 단지 단일 나노볼의 부착으로 부가될 수 있기 때문이다. 동시에, 또 다른 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함할 수 있는 어떠한 다른 나노볼도 동일한 전극에 부착할 수 없음이 보장된다. 이것은, 각각의 전극이 단지 관심 있는 하나의 특정한 뉴클레오티드 시퀀스에 전용됨을 자동적으로 보장한다. 시퀀스들과 전극들 사이의 연관의 이 자동적인 고유성(uniqueness)으로 인해, 나노볼을 실질적으로 어레이의 모든 전극에 제공하는 것이 가능하고, 따라서 처리 목적들을 위해 완전한 어레이를 이용한다.

단지 하나의 단일 나노볼이 하나의 전극에 부착되는 장치가 본 발명에 의해 구성될지라도, 각각이 전극들 중 상이한 전극에 부착되는 복수의 나노볼들이 전형적으로 존재할 것이다. 상기 설명된 바와 같이, 나노볼이 어레이의 각각의 전극에 부착되는 것이 가장 바람직하다. 게다가, 복수의 나노볼들 중 (제 1 전극에 부착된) 적어도 하나의 제 1 나노볼이 관심 있는 제 1 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함하고 (제 2 전극에 부착된) 적어도 하나의 제 2 나노볼이 관심 있는 제 2, 상이한 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 연관된 전극들은 관심 있는 상이한 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리에 전용된다. 모든 접착된 나노볼들이 관심 있는 상이한 시퀀스들의 복제들로 구성되면, 전극들의 어레이는, 각각의 전극이 또 다른 시퀀스에 전용될 때 최적으로 이용된다.

제 2 양태에 따라, 본 발명은 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 방법의 일 실시예에 관한 것이고, 여기서 관심 있는 특정한 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼은 그 크기의 단지 하나의 나노볼이 부착될 수 있는 전극들의 어레이의 하나의 전극에 부착된다.

방법 및 장치는 동일한 발명의 개념 즉, 전극들과 복제된 뉴클레오티드 시퀀스들의 나노볼들 사이의 매칭의 상이한 구현들이다. 이들 구현들 중 하나의 구현을 위해 제공된 설명들 및 정의들은 따라서, 다른 구현에 대해 또한 유효하다.

다음에서, 상기 정의된 장치 및 방법 둘 모두에 관한 다양한 바람직한 실시예들이 설명될 것이다.

하나의 바람직한 실시예에서, 나노볼의 내부 반지름은 연관된 전극의 내부 반지름의 약 40%보다 크다. 따라서, 반드시 나노볼이 다른 나노볼들의 부착을 차단하기 위해 전극의 완전한 영역을 커버하는 것은 아니다.

원칙적으로, 전극(들)에 대해 나노볼의 크기에 관한 어떠한 상한도 존재하지 않는다. 따라서, 나노볼은 또한, 전극보다 클 수 있다. 그것은 특히, 각각이 그 다음, 동일한 신호를 제공할 다수의(예로서, 4개) 전극들을 커버할 수 있다.

일반적으로, 장치의 전극들은 환경에 노출될 수 있거나 일부 매체에 침지(immerse)될 수 있는 외부 표면 상에 배열될 수 있다. 바람직한 일 실시예에 따라, 장치는 관심 있는 매체로 채워질 수 있고 전극들이 위치되는(전형적으로, 반응실의 하부 표면 상에) 반응실(reaction chamber)을 갖는 컨테이너(container)를 포함한다.

상기 언급된 컨테이너는 바람직하게, 적어도 2개의 상이한 피펫용 리져버(reagent reservoir)들이 선택적으로 결합될 수 있는 주입구를 포함할 수 있다. 따라서, 전극들에 인접한 매체는 제어적으로 변경될 수 있다. 예를 들면, 중합효소(polymerase)에 의한 복제된 가닥으로의 뉴클레오티드들의 합체(incorporation)가 관측될 것이면("합성에 의한 시퀀싱"), 피펫용 리져버들은 순수한 모노뉴클레오티드들의 용액들을 포함할 수 있다. 리가아제(ligase)에 의한 복제된 가닥으로의 올리고뉴클레오티드들의 합체가 관측될 것이면("리게이션에 의한 시퀀싱"), 피펫용 리져버들은 순수한 올리고뉴클레오티드들의 용액들을 포함할 수 있다. 아데노신 뉴클레오티드들을 갖는 시약 공급부가 예를 들면, 주입구에 결합될 때, 컨테이너는 전극들에 인접한 이들 뉴클레오티드들을 갖는 매체를 제공할 것이고, 이는 전극들에서 아데노신 뉴클레오티드들의 합체의 관측을 허용한다. 이 접근법에 관한 더 상세들은 참조로서 본 텍스트에 통합되는, WO 2012/042399 A1에서 발견될 수 있다.

바람직하게, 상기 언급된 피펫용 리져버들은 전극들에 의해 감지될 수 있는 상이한 절연체 특성들(예로서, 버퍼들, 버퍼 구성요소들)을 갖는 매체들을 포함할 수 있다. 따라서, 전극들이 현재 노출되는 매체가 추론될 수 있다.

장치의 전극들은 특히, 전극들의 용량의 측정을 허용하는 처리 회로에 결합될 수 있다. 전극의 용량은, 새로운 뉴클레오티드들이 전극에 부착된 나노볼로 통합되면 변경되기 때문에, 이 통합 단계는 용량성 측정치들에 의해 모니터링될 수 있다. (주위의 매체에 대한) 전극들의 용량은 예를 들면, (바람직하게, 고 주파수) 부하에 대한 그들의 응답(진폭, 위상)을 통해 측정될 수 있다. 또 다른 절차는 전극들에 대한 상이한 전압들의 반복적 적용을 포함할 수 있고, 여기서 이 방식으로 전송되는 전하의 총 량이 결정된다. 전극들의 용량을 측정하기 위한 가능한 절차의 또 다른 상세들은 WO 2012/042399 A1에서 발견될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 어레이의 전극들은 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들의 복제들을 포함하는 복수의 나노볼들에 노출되고, 상기 나노볼들은, 그들 중 단지 하나가 한번에 하나의 전극에 부착될 수 있도록 하는 크기들을 갖는다. 나노볼들 각각은 전형적으로, 관심 있는 단지 하나의 단일 뉴클레오티드 시퀀스에 고유하게 연관될 그 시퀀스의 복제들을 포함한다. 게다가, 복수의 나노볼들의 상이한 나노볼들은 바람직하게, 관심 있는 상이한 뉴클레오티드 시퀀스들의 복제들을 포함할 수 있다(즉, 제 1 나노볼은 관심 있는 제 1 시퀀스를 포함하고, 제 2 나노볼은 관심 있는 제 2, 상이한 시퀀스를 포함하고, 등이다). 이러한 한 칵테일(cocktail)의 나노볼들에 전극들의 어레이를 노출시키는 것은, 각각의 전극이 결국 관심 있는 (기껏해야) 하나의 특정한 뉴클레오티드 시퀀스에 연관될 것을 자동적으로 보장하고, 이는 측정 결과들의 고유한 해석을 허용한다.

방법의 또 다른 실시예에서, 어레이의 전극들은 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들의 복제들을 포함하는 복수의 나노볼들에 노출되고, 여기서 상기 전극들은 개별적으로 또는 상층 용액(supernatant solution)으로부터 상기 나노볼들을 구체적으로 끌어당기기 위한 앙상블(ensemble)들로서 어드레싱(addressing)될 수 있다. 따라서, 전극들에 대한 나노볼들의 부착은 제어된 방식으로 행해질 수 있다.

어레이의 전극(들)에 부착되는 나노볼(들)은 바람직하게 회전환 증폭(rolling circle amplification; RCA)에 의해 생성될 수 있다. RCA는 링으로서 형성되는 뉴클레오티드 시퀀스가, 시퀀스의 이어지는 가닥의 복제들이 생성되는 템플릿의 역할을 하는 공지된 절차이다. 이 절차의 상세들은 문헌(예로서, Lizardi 등에 의한, "등온 회전환 증폭을 이용하는 돌연변이 검출 및 단일 분자 카운팅(Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification)", 네이처 제네틱스 19, 225-232(1998); Asiello 등에 의한, "소형화된 등온 핵산 증폭, 리뷰(Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review)", 랩 칩, 2011, 11, 1420-1430(2011); Zhao 등에 의한, "회전환 증폭: 기능적 핵산들을 이용한 나노기술 및 바이오검출에서의 적용들(Rolling Circle Amplification: Applications in Nanotechnology and Biodetection with Functional Nucleic Acids)", 안게반테 케미 국제판 ISSN: 1433-7851, Vol: 47 (34) 2008, 페이지: 6330-6337(2008))에서 발견될 수 있다. RCA에 의한 하나의 종류의 나노볼(또는 복수의 상이한 나노볼들)의 생성은 전극들에 인접한 볼륨에서 또는 별개의 베셀(vessel)에서 선택적으로 발생할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 전위들은 나노볼들 및/또는 인접 매체의 다른 구성요소들을 끌어당기고/거나 밀어내기 위해 어레이의 전극들에 선택적으로 인가될 수 있다. 코팅되지 않은 전극들의 어레이가 예를 들면, 처음으로 나노볼들을 포함하는 매체에 노출될 때, 적절한 전위들은, 나노볼들이 전극들의 원하는 하위-그룹에 단지 부착할 것임을 보장하기 위해 전극들에 인가될 수 있다. 다른 전극들은 예를 들면, 참조의 목적들을 위해 또는 또 다른 매체가 제공될 수 있는 다른 나노볼들(예로서, 참조 뉴클레오티드 시퀀스들을 갖는)의 나중의 부착을 위해 자유롭게 유지될 수 있다. 이론적으로, 따라서, 특정 매체로부터의 나노볼을 각각의 단일 전극에 선택적으로 제공하는 것이 가능하다.

설명된 장치 및 방법의 전형적인 적용에서, 부착된 나노볼을 갖는 전극들의 전기 용량은 측정되고 바람직하게 시간에 따라 모니터링된다. 용량의 변화들은 그 다음, 전극들에서 및/또는 부착된 나노볼들에서 발생하는 처리들에 관한 정보, 특히 상기 나노볼들에서 현재 복제되는 가닥들로의 뉴클레오티드들 및/또는 올리고뉴클레오티드들의 합체에 관한 정보를 제공할 것이다. 게다가, 용량의 변화들은 전극에 대한 나노볼의 결속을 나타낼 수 있다.

이미 상기 표시된 바와 같이, 전극들의 어레이는 모노뉴클레오티드들 및/또는 올리고뉴클레오티드들의 상이한 용액들에 순차적으로 노출될 수 있다. 전극들에서 관측되는 반응들은 따라서, 각각의 순간에서 전극에 인접한 용액에 있는 모노뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 고유하게 기인할 수 있다.

본 발명은 추가로 핵산들, 분자 진단, 생물 샘플 분석, 화학 샘플 분석, 음식 분석, 및/또는 포렌식 분석(forensic analysis)을 시퀀싱하기 위한 상기 설명된 장치의 이용에 관한 것이다.

본 발명의 이들 및 다른 양태들은 이하에 설명된 실시예들로부터 분명하게 될 것이고 상기 실시예들을 참조하여 더 자세히 설명될 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 바이오센서 장치의 일 실시예를 개략적으로 도시한 도면.

핵산 시퀀싱 기술은 빠르게 개선되고 있고, 따라서 유전학, 병리학 및 종양학에서의 분자 진단을 위한 선택의 미래의 방법일 것이다. 그러나, 현재의 이용가능한 기술들 중 어느것도 비용, 충실도 및 이용의 용이성 면에서 일상의 진단적 이용을 위한 요구조건들을 충족시키지 못한다. 많은 합성에 의한 시퀀싱 기술들은 비싸며 화학적으로 정상의 DNA 중합효소들에 잘 알려지지 않은 형광성으로 라벨링된, 되돌릴 수 있는 종결된 뉴클레오티드들을 이용한다. 뉴클레오티드 그 자체보다 새로운 뉴클레오티드의 합체 반응을 측정하는 기술들은, 정상의 중합효소 및 정상의, 라벨링되지 않은 뉴클레오티드들이 이용될 수 있는 장점을 갖고, 이는 비용을 강력하게 감소시키며 충실도를 개선한다. 이것의 하나의 예는 "454 시퀀싱"(로체(Roche))이고, 뉴클레오티드의 합체에서 릴리싱되는 피로인산 분자는 가시광을 생성하는 효소 반응에 의해 검출되지만, 이 효소 반응은 부가적인 단계들을 요구하며 비싸다. 또 다른 예는 용량의 변화들을 전극들에 대해 복제된 DNA-프라이머에 대한 뉴클레오티드들의 부가의 탓으로 돌리도록 허용하는 전극들의 전기 용량이 모니터링되는 기술이다(WO 2012/042399 A1). 이 방법의 단점은 전극들의 대부분이, 프라이머와 전극 사이의 고유한 연관이 보장될 경우에 이용될 수 없다는 것이다.

언급된 이슈들을 해결하기 위해, 본 명세서에서 평평한 (나노-) 전극 표면 상에 판독될 분자들의 증폭된 클론(clone)들을 위치시킴으로써 그리고 이들 클론들 상에 구축된 새로운 뉴클레오티드들의 용량성 변화를 검출함으로써, 시퀀싱하기 위한 용량성 (바이오-) 센서를 이용하는 것이 제안된다. 이 방법에서, 여분의 뉴클레오티드 부가의 용량성 변화는, 신호 측정치가 더 긴 기간을 통해 통합될 수 있도록 영구적인 변화이고 따라서, 아마도 강건한(robust) 신호를 제공한다. 게다가, 전극 당 단지 하나의 나노볼의 부착을 허용하는 크기를 갖는 관심 있는 복제된 뉴클레오티드 시퀀스들의 나노볼들이 이용된다.

도 1은 상기 일반적인 원리의 일 실시예에 따라 설계되는 장치 또는 바이오센서(100) 및 이러한 바이오센서로 실행될 수 있는 방법을 개략적으로 도시한다.

도시된 실시예에서, 바이오센서(100)는 처리될 매체(유체)로 채워질 수 있는 반응실(111)을 갖는 컨테이너(110)를 포함한다. 이 목적을 위해, 컨테이너(110)에는 매체가 공급될 수 있는 주입구(112) 및 매체가 반응실로부터 제거될 수 있는 배출구(113)가 제공된다.

게다가, 몇몇 개별적인 피펫용 리져버들(141, 142, 143, 144)을 갖는 시약 공급부(140)가 제공되고, 여기서 이들 리져버들 각각은 반응실(111)로 연관된 시약을 도입하기 위한 주입구(112)에 선택적으로 결합될 수 있다. 이것은 상이한 시약들을 차례로 공급하고 그 사이의 버퍼들을 세정하기 위한 마이크로유체 접속부들에 의해 성취된다.

바이오센서(100)는 반응실(111)의 하부 상의 2차원 어레이(단지 x-방향으로의 확장이 보이는)에 위치되는 복수의 전극들(120a, 120b,...120e)을 추가로 포함한다. 전극들의 표면은 바람직하게 평면이어야 하고 DNA 분자들이 부착될 수 있는 기판을 생성하기 위해 수정 또는 코팅을 허용해야 한다. 전극들의 수는 전형적으로 약 100개보다 크고, 바람직하게 약 1000개보다 크다. 전극들은 상이한 전위들을 개별적으로 전극들에 인가할 수 있는 처리 회로(130)에 개별적으로 결합된다. 게다가, 처리 회로(130)는 (주위의 매체에 대한) 전극들의 용량을 개별적으로 측정할 수 있을 것이다. 이것은 예를 들면, WO 2012/042399 A1에서 설명된 바와 같은 방법으로 성취될 수 있다.

바이오센서(100)는 다음 방식으로 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들의 시퀀싱을 위해 준비되고 이용될 수 있다:

제 1 단계(①)에서, 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들의 복제들을 포함하는 나노볼들(NB)이 생성된다. 이 생성은 별개의 컨테이너 또는 튜브(101)(도시되지 않음)에서 또는 반응실(111)에서 발생할 수 있다. 나노볼들은 특히 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들(1, 2)의 링-형상의 템플릿들로부터 시작하는 회전환 증폭("RCA")에 의해 생성될 수 있다(전형적으로, 어레이에 전극들의 수의 순서로 복수의 상이한 템플릿들이 존재할 것이다). RCA는, 전형적으로 하나의 분자에 관심 있는 시퀀스의 100 내지 10000 카피들로 구성되는 큰 단일-가닥의 DNA 분자들을 야기하는, 관심 있는 시퀀스의 순차 중복들을 생성하는 클론 증폭 방법이다. 이 처리의 결과로서, 내부 반지름들(d)을 갖는 나노볼들(NB)이 생성되고, 그들 각각은 관심 있는 특정한 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함한다. 이 맥락에서, 나노볼의 "내부 반지름"은 나노볼에 완전하게 새겨질 수 있는 가장 큰 구의 반지름(하나의 나노볼에 대해 도 1에서 회색 그림자로 표시된)으로서 정의된다. 도시된 나노볼들(NB)의 내부 반지름(d)은 전형적으로 약 100nm과 500nm 사이의 범위이다.

준비 절차의 제 2 단계에서, 반응실(111)에서의 전극들의 어레이는 생성된 칵테일의 나노볼들(NB)에 노출된다. 이것은 전극 어레이의 전극들(120a 및 120b)에서 ②로 도시된다. 이 단계 동안, 전극들은 나노볼들을 끌어당기거나(본 명세서에서 양의 전위들에 대해 가정됨) 나노볼들을 밀어내는(본 명세서에서 음의 전위들에 대해 가정됨) 상이한 양 또는 음(또는 중성)의 전위들로 선택적으로 놓여질 수 있다. 따라서, 전극들의 선택된 하위그룹들에 대한 나노볼들의 부착이 제어될 수 있다. 게다가, 전극들의 용량의 변화는 나노볼의 부착을 검출하기 위한 이 단계 동안 선택적으로 모니터링될 수 있어서, 시퀀싱 반응 동안 "채워진" 전극들을 계속 파악하는 것을 가능하게 한다.

나노볼들이 일반적으로 모두 동일한 부호(전형적으로, 음)의 일부 전하를 운반할 것이기 때문에, 그들은 서로 밀어낼 것이고(버퍼에 의존하여), 이는 추가로 전극들 위로 나노볼들을 이격시키는데 도움을 준다.

예를 들면, 그들의 내부 반지름(d)으로 표현된 나노볼들(NB)의 전형적인 크기는 전극들(120a 내지 120f)의 크기와 비교하여 선택되고, 여기서 후자의 크기는 예를 들면, 전극들(도 1에서 원형 전극들에 대해 도시된)의 내부 반지름(w)에 의해 측정될 수 있다. 이 관계는 나노볼(들)의 크기가, 하나보다 많은 나노볼이 동시에 단일 전극에 부착될 수 있음을 근본적으로 불가능하게 하는 것이다(다수의 결속들이 확실성을 갖고 거의 배제되지 않을 수 있을 때, "근본적으로"는 95% 이상, 바람직하게 99% 이상의 가능성을 갖는 것을 의미한다). 전극들의 내부 반지름(w)에 대한 전형적인 값들은 약 100nm과 약 200nm 사이의 범위이다. 전극들 사이의 피치(p)는 전형적으로 약 400nm 내지 약 800nm의 범위에 있다. 일반적으로, 피치(p)는 나노볼들의 반지름(d)보다 커야한다.

언급된 크기 관계는 나노볼들의 크기를 전극들의 주어진 크기에 적응시킴으로써(예로서, 적절한 시점에서 RCA를 중단시킴으로써), 나노볼들의 미리 결정된 크기에 맞는 크기로 전극들을 제조함으로써, 또는 접근법들 둘 모두의 조합(전극 및 나노볼 크기들 둘 모두를 조정하는)으로써 실현될 수 있다. 제 1 옵션에 관해, 다음 추정이 행해질 수 있다: 약 10 내지 1000nt(뉴클레오티드들)의 템플릿들의 100배 내지 10000배 증폭은 약 50000 내지 약 500000 뉴클레오티드들의 나노볼들을 야기한다. 공지된 속도 예를 들면, 약 1 내지 100 nt/초를 갖는 중합효소를 이용하는 것은 나노볼-크기를 바람직한 값으로 조정하기 위한 옵션을 제공한다.

전극(120c)에서 ③으로 도시된, 절차의 선택적인 제 3 단계에서, 전극들에서의 인력 전위는 선택된 전극 표면에서 부착된 나노볼들을 추가로 결속시키고 평평하게 하기 위해 이용될 수 있고, 따라서 이들 전극들에 의해 생성된 용량성 신호를 개선한다. 결국, 전극에서의 인력 전위는 이전 단계와 비교하여 선택적으로 증가될 수 있다.

전극(120d)에서 ④로 도시된, 절차의 선택적인 제 4 단계에서, 밀어내는 전위는 전극들로부터 결속되지 않은 교란 구성요소들(X)("가비지(garbage)", 예로서, 뉴클레오티드들 또는 프라이머들)을 제거하기 위해 전극들에 인가될 수 있다. 따라서, 관심 있는 나노볼로의 뉴클레오티드들의 합체에 관련되지 않은 반응들로부터의 잡음이 감소될 수 있다.

이후에, 바이오센서(100)의 준비가 달성되고 실제 측정들은 즉, 전극들 상의 상이한 나노볼들(NB)에 의해 다수의 카피들로 포함되는 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들(1, 2)의 시퀀싱을 시작할 수 있다. 이것은 전극(120e)에서 ⑤로 도시된다.

시퀀싱 절차 동안, 반응실(111)은 피펫용 리져버들(141 내지 144)로부터 시약 매체들로 순차적으로 채워진다. 이들 리져버들 각각은 상이한 시약 예를 들면, 모노뉴클레오티드들(A, T, G, 및 C) 중 상이한 것을 포함한다(대안적으로, 올리고뉴클레오티드들의 용액들이 이용될 수 있다). 특정한 모노뉴클레오티드를 갖는 용액 즉 아데노신 A가 반응실(111)을 채울 때, 특정한 전극에서 관측되는 용량의 임의의 변화는 고유하게, 전극 상의 연관된 나노볼(NB)에서 복제되는 가닥으로의 그 모노뉴클레오티드 A의 합체의 탓으로 돌릴 수 있다.

새로운 시약 용액이 반응실(111)에 도입되기 전에, 밀어내는 전위는 시퀀싱 반응 동안 통합되지 않은 느슨한 뉴클레오티드들을 밀어내기 위해 (제 4 단계에서 상기 도시된 바와 같이) 전극들에 인가될 수 있다.

단일 분자에 대한 하나의 단일 뉴클레오티드의 부가는 하나의 전극에서 검출가능한 용량 변화를 거의 제공하지 않는다. 강건성을 위해, 구축된 뉴클레오티드 당 검출가능한 신호를 얻기 위해, 동일한 뉴클레오티드가 부가되는 동일한 분자들의 클론들을 필요로한다. 이들 클론들은 예를 들면, 회전환 증폭으로 생성된 나노볼들에 의해 설명된 방식으로 제공된다. RCA는 예를 들면, 별개의 튜브에서 용액의 증폭 반응을 수행하기 위해 생화학 설계의 큰 자유도를 제공한다. 후속적으로, DNA의 이들 나노볼들은 바이오센서 표면 상에 증착될 수 있고 표면과의 특정 또는 비특정 상호작용들에 의해 부착된 채로 유지될 수 있다. 대안적으로, 제 1 프라이머는 표면에 직접적으로 부착될 수 있고 증폭은 그 다음에 수행될 수 있다.

회전환 증폭을 위한 템플릿의 역할을 하는 원형 DNA는 상이한 방식들로 생성될 수 있다. 하나의 예에서, DNA의 랜덤 단편(random fragment)들의 끝들은 원을 형성하기 위해 함께 묶어진다. 회전환 증폭(RCA)의 이용은 부가적으로 타겟된 시퀀싱을 이용한 적용들을 허용한다. RCA는, 단지 특정 시퀀스들이 증폭되도록 특정 프라이머들(선택자 기술)에 기초할 수 있다. 또는, 전장 유전체 RCA 클론들은, 단지 특정 클론들이 시퀀싱되도록 분리를 위해 자성 입자(magnetic bead)들 상의 또는 바이오센서 표면 상의 직접적으로 시퀀스-특정 프로브(probe)들로 교배될 수 있다. 또한, 다수의 단편들은 하나의 원을 형성하기 위해 함께 묶여질 수 있다. 또 다른 예에서, 원형 바이러스 게놈들은 템플릿으로서 직접적으로 이용될 수 있다. RCA 분자들은 센서 표면에 결속하기 위한 결속 사이트들을 생성하기 위해 사후-증폭 동안 구체적으로 수정될 수 있다.

RCA로 생성된 모든 클론 카피들이 하나의 분자에 있을 때, 클론들은 조작될 수 있다. 바이오센서에 관해, 전극들 상에 양 또는 음 전압을 둠으로써 나노볼들을 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. 나노볼들이 전극들과 유사한 크기(전형적으로, 100 내지 300nm)를 갖도록 조정될 수 있기 때문에, 매우 효율적인 표면 충진이 얻어질 수 있어서, 모든 전극들을 가상적으로 채우지만, 그들 중 어느 것도 그들의 크기 때문에 하나보다 많은 나노볼을 갖지 못한다. 이것은, 평균적으로 전극들의 단지 1/3이 이용중인 이전에 설명된 방법들과 비교하여 커다란 개선이다. 설명된 방법으로, 광학 시퀀싱에 대해 가능한 것보다 25배의 전위 밀도가 얻어질 수 있고, 이는 단일 구동으로 동시에 판독될 수 있는 시퀀스들의 수에 관련된다. 부가적으로, 나노볼들은 용량 측정이 가능한 활성 높이에 맞는, 표면 상의 평평한 형태로 끌어당겨질 수 있다. 산출들은, 충분한 속도에서의 나노볼들의 전기 전좌(electrical translocation)가 개방된 전극 표면에서의 전기분해를 야기하지 않는 전압들(최대 1V)로 가능함을 보여준다. 특히, 전형적인 크기(200nm) 및 전하(10⁵ 전자 전하들에 대응하는 10⁵nt)를 갖는 나노볼에 대해, 1V 및 -1V가 전극들에 인가될 때, 약 0.2m/s의 전좌 속도가 성취되고, 이는 순차(order) 50μm의 반응실 높이들에 대해 충분하다.

특정 전극들 또는 전극들의 행들에 전압을 인가함으로써, 나노볼들을 특정 장소들로 지향시킬 수 있다. 이와 같이, 예를 들면, 선험 정보를 유지하고 그것을 시퀀싱 분석에서 이용하는 것을 가능하게 하는 센서에 대한 공간 순위를 생성할 수 있다. 예를 들면, 제어 시퀀스들의 특정 위치들을 가질 수 있고, 상이한 샘플들을 동시에 측정할 수 있거나, 제어 신호를 제공하기 위해 특정 전극들을 빈 상태로 유지할 수 있다. 밀어내는 전압들을 이용하는 것은 시퀀싱 반응 동안 통합되지 않은 느슨한 뉴클레오티드들을 밀어내는 것에 도움을 줄 수 있고, 그에 의해 세정을 개선한다.

설명된 절차들에서, 시약 유체들은 예를 들면, 플러그 흐름 방식(즉, 개별적인 시약들이 이어지는 흐름으로 순차적으로 공급될 때, 그들의 화학 속성들에 의해 또는 마이크로유체 시스템의 설계 및 크기에 의해 분리되는)으로 센서 표면 위로 순차적으로 날라간다. 구별가능한 특성들(예로서, 절연체 속성들)을 상이한 유체들에 제공함으로써, 시퀀싱 처리의 모든 단계들의 판독에 따를 수 있고 하나의 뉴클레오티드 부가 신호 프로파일을 정확하게 정의할 수 있다.

요약하면, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 방법 및 장치에 관한 본 발명의 일 실시예가 설명되었다. 장치는 전극들의 어레이를 포함하고, 여기서 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼은 그 크기의 단지 하나의 나노볼이 동시에 부착될 수 있는 전극에 부착된다. 따라서, 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들에 대한 전극들의 고유 연관이 성취될 수 있다. 나노볼들은 바람직하게 회전환 증폭에 의해 생성된다. 전극들에 대한 당기고/기거나 밀어내는 전위들의 적용은 나노볼들의 부착을 제어하기 위해 이용될 수 있다. 전극들의 용량에서의 변화의 측정치는 전극에서의 나노볼에서 복제되는 가닥들로의 상이한 용액들에 의해 순차적으로 제공된 모노뉴클레오티드들의 합체를 검출하고 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 본 발명은 예로서, 건강관리, 병리학, 및 종양학의 분야들에서의 진단에 대한 핵산 변화들의 검출을 위해 예를 들면, 적용될 수 있다.

본 발명이 도면들 및 상기 설명에서 상세하게 도시되었고 설명되었을지라도, 이러한 도시 및 설명은 제한적이 아닌 도시적이거나 예시적인 것으로 고려되어야 한다; 본 발명은 개시된 실시예들로 제한되지 않는다. 개시된 실시예들에 대한 다른 변형들은 도면들, 본 개시, 및 첨부된 청구항들의 연구로부터, 청구된 발명의 실행 시에 당업자들에 의해 이해될 수 있고 영향을 받을 수 있다. 청구항들에서, 단어 "포함하는"은 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않고, 부정 관사("a" 또는 "an")는 복수를 배제하지 않는다. 단일 처리기 또는 다른 유닛은 청구항들에 나열된 몇몇 항목들의 기능들을 수행할 수 있다. 단지, 특정 조치들이 서로 상이한 종속 청구항들에서 나열된다는 사실은, 이들 조치들의 조합이 이롭게 하기 위해 이용될 수 없음을 나타내지 않는다. 컴퓨터 프로그램은 다른 하드웨어의 부분과 함께 또는 부분으로서 공급된 광학 저장 매체 또는 고체-상태 매체와 같은, 적합한 매체 상에 저장되고/분배될 수 있거나, 예를 들면, 인터넷 또는 다른 유선 또는 무선 통신 시스템들을 통해 다른 형태들로 또한 분배될 수 있다. 청구항들에서의 임의의 참조 부호들은 범위를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.

100: 바이오센서 101: 튜브
110: 컨테이너 111: 반응실
112: 주입구 113: 배출구
140: 시약 공급부
141, 142, 143, 144: 피펫용 리져버
120a, 120b, 120c, 120d, 120e: 전극 130: 처리 회로

Claims

뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequence)들의 처리를 위한 장치(100)에 있어서:
- 전극들(120a, 120b,...)의 어레이; 및
- 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스(1, 2)의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼(nanoball)(NB)을 포함하고,
상기 나노볼(NB)은 전극에 부착되고, 상기 전극에는 전극 크기의 많아야 하나의 나노볼(NB)이 부착될 수 있는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치.
뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 방법에 있어서:
관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스(1, 2)의 복제들을 포함하는 적어도 하나의 나노볼(NB)은 전극들(120a, 120b,...)의 어레이 중 하나의 전극에 부착되고, 상기 전극에는 전극 크기의 많아야 하나의 나노볼(NB)이 부착될 수 있는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 나노볼(NB)의 내부 반지름(d)은 상기 연관된 전극(120a, 120b,...)의 내부 반지름(w)의 약 40%보다 큰 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 전극들(120a, 120b,...)의 어레이가 위치되는 반응실(111)을 갖는 컨테이너(110)로서, 적어도 2개의 상이한 피펫용 리져버(reagent reservoir)들(141, 142, 143, 144)이 선택적으로 결합될 수 있는 주입구(112)를 갖는, 상기 컨테이너(110)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치.
제 4 항에 있어서,
상기 피펫용 리져버들(141, 142, 143, 144)은 상이한 절연체 특성들을 갖는 용액들(A, T, G, C)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치.
제 1 항에 있어서,
상기 전극들(120a, 120b,...)에 대한 전위들의 선택적 인가를 허용하는 처리 회로(130)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 어레이의 전극들(120a, 120b,...)은 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들(1, 2)의 복제들을 포함하는 복수의 나노볼들(NB)에 노출되고, 상기 나노볼들(NB)은, 상기 나노볼들(NB) 중 단지 하나가 동시에 하나의 전극에 부착될 수 있도록 하는 크기들을 갖는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 어레이의 전극들(120a, 120b,...)은 관심 있는 뉴클레오티드 시퀀스들(1, 2)의 복제들을 포함하는 복수의 나노볼들(NB)에 노출되고, 상기 전극들은 개별적으로 또는 상층 용액(supernatant solution)으로부터 상기 나노볼들을 구체적으로 끌어당기기 위한 앙상블(ensemble)들로서 어드레싱(addressing)될 수 있는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 나노볼(NB)은 회전환 증폭(rolling circle amplification)에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
전위들은 나노볼들(NB) 및/또는 다른 구성요소들(X)을 끌어당기고/거나 밀어내기 위해 상기 어레이의 전극들(120a, 120b,...)에 선택적으로 인가되는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 전극들(120a, 120b,...)의 용량은 측정되거나 측정될 수 있는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 11 항에 있어서,
전극(120a, 120b,...)에 대한 나노볼(NB)의 결속은 상기 전극에서의 용량의 연관된 변화를 통해 검출되거나 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 11 항에 있어서,
전극(120a, 120b,...)에 부착된 나노볼(NB)에 대한 뉴클레오티드들 및/또는 올리고뉴클레오티드들의 부가들은 상기 전극에서의 용량의 연관된 변화를 통해 검출되거나 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 전극들(120a, 120b,...)의 어레이는 모노-또는 올리고뉴클레오티드들의 상이한 용액들(A, T, G, C)에 순차적으로 노출되는 것을 특징으로 하는, 뉴클레오티드 시퀀스들의 처리를 위한 장치 또는 방법.
핵산들, 분자 진단, 생물 샘플 분석, 화학 샘플 분석, 음식 분석, 및/또는 포렌식 분석(forensic analysis)을 시퀀싱하기 위한, 제 1 항의 장치(100)의 이용.