KR20150112157A - 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흰색 지방세포의 생성을 억제하고, 갈색 지방세포의 생성을 촉진하는 효과를 가진 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 비만을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여, 흰색 지방세포로의 분화를 억제하는 효능, 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBP의 발현을 억제하는 효능, 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현을 촉진하는 효능을 보유하고 있다.

Description

우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물{A COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF OBESITY COMPRISING THE ARCTIUM LAPPA'S SEEDS}

본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흰색 지방세포의 생성을 억제하고, 갈색 지방세포의 생성을 촉진하는 효과를 가진 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 비만을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여, 흰색 지방세포로의 분화를 억제하는 효능, 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현을 촉진하는 효능을 보유하고 있다.

비만은 살이 쪄서 몸이 뚱뚱한 상태로, 비만이 아니더라도 근육이 많은 사람은 체중이 많이 나갈 수 있기 때문에 체내에 지방조직이 과다한 상태를 비만으로 정의한다.

비만은 최근 선진국을 중심으로 꾸준히 증가하고 있는 건강문제이며, 세계 보건 기구인 WHO에서는 전 세계적으로 비만 인구가 1억 명이 넘을 것으로 추측하고 있다.

또한 비만은 그 자체로도 문제가 되기도 하지만 암, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 대사 증후군과 같은 각종 성인병의 원인이 되므로, 비만을 치료하는 것은 많은 질병을 예방하는 방법이라고 할 수 있다.

앞서 말한 것처럼 비만은 체내의 지방함량과 큰 관련이 있다. 혈장으로부터 유입된 지방산과 포도당이 지방세포에서 에스테르화하여 주로 중성지방 형태로 축적된다. 이러한 중성지방을 축적하는 지방세포는 보통 흰색 지방세포를 가리킨다.

포유류는 크게 2가지 종류의 지방세포를 가지고 있는데, 그것은 흰색 지방세포(white adipocyte)와 갈색 지방세포(brown adipocyte)이다.

이 두 종류의 지방세포는 서로 상반된 역할을 하여, 흰색 지방세포는 에너지의 저장을 담당하고 갈색 지방세포는 에너지의 소모를 담당한다.

흰색 지방세포는 지방이 하나의 덩어리를 이루어 세포질과 핵을 가장자리로 밀어난 형태의 지방세포로, 성인 지방세포의 대부분을 차지하며, 에너지 저장고 역할을 한다.

에너지 저장과 동원은 지방의 생산과 분해의 형태로 이 세포에서 활발하게 일어나고, 과잉 에너지는 트리아실글리세롤(중성지방)의 형태로 지방세포 내에 축적된다. 이러한 반응은 기질의 농도 외에 여러 가지 호르몬에 의해 조절된다.

인슐린은 합성 촉진에 작용하고, 아드레날린, 부신피질자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone; ACTH), 글루카곤, 갑상샘자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone; TSH), 성장 호르몬(growth hormone; GH), 세크레틴, 갑상선 호르몬, 지방동원인자, 옥시토신, 부갑상샘 호르몬 등은 분해촉진(지방동원)에 작용한다 .

흰색 지방세포는 피부 아래에 위치한 피하지방이나 장막, 복막 및 장간막에 위치한 내장지방 등에 성긴 그물 모양의 결합조직 형태로 존재한다.

반면에 갈색 지방세포는 지방이 작은 알갱이 형태로 분산되어 있는 지방세포이다. 갈색 지방세포는 미토콘드리아가 다수 존재하는데, 이 미토콘드리아의 막에 철을 함유한 사이토크롬이 많고 혈액의 공급이 풍부하기 때문에 갈색을 띄게 된다.

흰색 지방세포의 지방은 에너지원으로 사용되나, 갈색 지방세포의 지방은 대부분이 열을 생산하기 위해 소비된다.

사람이 과식을 하거나 추운 환경에 노출되었을 때, 또는 여러 가지 스트레스 상황에 노출되었을 때 교감신경계가 자극을 받으면 이에 따라 갈색 지방세포의 미토콘드리아가 활성화되어 열 발생을 촉진한다.

갈색 지방세포는 골격근의 수축을 수반하지 않은 열 생산에서 중요한 역할을 하며, 탈용역 단백질이 존재하여 ATP 생산을 수반하지 않고 지방산을 산화시켜 열을 내어 다른 지방을 줄여주는 역할을 한다.

즉 에너지 생산 없이 열로 소비되는 에너지가 증가하는 것이다. 이에 따라 이러한 적응 대사에 장애가 있는 것이 비만과 관련이 있다는 설이 강력히 대두되고 있다.

갈색 지방세포는 신생아와 동면하는 동물에게 많으며, 성인의 경우에는 콩팥, 대동맥, 목과 종격(가슴 안쪽) 등에 존재한다.

본래 갈색 지방세포는 태어난 직후에 많이 존재하다가, 성장하면서 점차 사라져 없어진다고 알려져 있었다. 그러나 최근 연구결과를 통해 성인에게도 여전히 갈색 지방세포가 존재하며, 갈색 지방세포의 양을 증가시키면 당 내성, 비만, 대사에 이로운 효과를 내는 것이 입증되었다.

한편, 우방자는 국화과(Asteraceae) 식물인 우엉(Arctium lappa)의 종자이다. 다른 이름으로는 악실(惡實), 서점자(鼠粘子), 대력자(大力子), 방옹채(蒡翁菜), 편견우(便牽牛)가 있다.

맛은 쓰고(苦) 매우며(辛), 성질은 평하다. 폐경, 위경에 작용하며, 풍열을 없애고 해독하고 발진을 순조롭게 한다. 감기로 기침이 나면서 열이 있는 데, 홍역, 인후종통, 곪는 상처, 피부병, 악성종양, 두드러기, 반진, 헌데, 부종, 변비, 이하선염 등에 쓴다. 폐렴, 기관지염에도 쓴다.

동물실험을 통해 오줌내기작용, 항염증작용, 배농작용이 밝혀졌으며, 우방자의 물 추출액은 피부병을 일으키는 여러 가지 사상균에 대한 억균작용이 있음이 밝혀졌다.

최근에는 강심작용이 있는 락톤 화합물이 추출 분리되어 임상에서 쓰이고 있으며, 뇌일혈과 감기에 좋은 효과를 보였다.

우방자에는 리그닌 배당체인 아르크티인, 기름 25-30%(리놀레인 58.5%, 올레인 19.1%), 피토스테롤, 고보스테롤, 비타민 B1, 사포닌, 쿠마린, 펙틴, 레몬산 및 사과산 등이 함유되어 있다.

한편, 우방자 또는 우엉과 관련된 항비만 조성물에 관한 종래기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1298568호에 우엉추출물을 포함하는 항비만용 식품조성물이 개시되어 있다.

위 종래기술은 우엉추출물과 함께 항산화 효과 및 갈변 방지를 위하여 비타민 C를 더 포함하고, 체중감량 효과증대를 위하여 가르시니아캄보지아껍질 추출물과 식이섬유를 더 포함하며, 보존성 향상을 위한 황금 추출물 등을 첨가하여 양산성을 가지는 항비만용 식품조성물에 대한 것이다.

그러나 위 종래기술은 3T3-L1 지방전구세포의 지방과립 생성을 억제하는 효능과 트리글리세리드(중성지방)의 생성을 저해하는 효능만 나타내고 있을 뿐, 비만 예방과 에너지 대사에 관련된 갈색 지방세포에 대한 효능은 알 수 없다는 문제점이 있다.

따라서 비만을 유도하는 흰색 지방세포의 생성은 억제하고, 비만을 억제하는 갈색 지방세포의 생성은 촉진하는 우방자 추출물을 유효성분으로 하는 조성물에 대한 연구가 요구되고 있다.

본 발명은 위와 같은 요구에 부응하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없이 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 흰색 지방세포의 분화를 억제하고, 분화와 관련된 인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하여 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현이 증가한 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하여 부작용 및 세포독성이 없이 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은 흰색 지방세포의 분화를 억제하고, 분화와 관련된 인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하여 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명의 목적은 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현이 증가한 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 상기 조성물에 식품학적으로 허용가능한 첨가제 또는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없는효과를 보유하고 있다.

본 발명에 따른 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 흰색 지방세포의 분화를 억제하고, 분화와 관련된 인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효과를 보유하고 있다.

본 발명에 따른 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물은 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현이 증가한 효과를 보유하고 있다.

도 1은 3T3-L1 세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 3T3-L1 세포에서 우방자 추출물의 지방생성 억제 효과를 나타내는 현미경 상의 사진이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서 우방자 추출물의 지방생성 억제 효과 정도를 수치화한 그래프이다.
도 4는 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBPα에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 결과이다.
도 5는 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 Real-Time PCR로 나타낸 결과이다.
도 6은 흰색 지방세포의 분화인자인 C/EBPα에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 Real-Time PCR로 나타낸 결과이다.
도 7은 갈색 지방세포에 대한 우방자 추출물의 독성여부를 나타내는 그래프이다.
도 8은 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 결과이다.
도 9는 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 Real-Time PCR로 나타낸 결과이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사살에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물

1-1. 우방자 추출물의 제조

우방자를 제조 목적에 적합하도록 자르거나, 자른 후 볶거나 하는 등의 수치 가공 과정을 거쳐서 추출 준비를 한다.

우방자를 추출한다.

우방자의 추출에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법, 열수 추출법, 발효 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출법 또는 용매 추출법이 실행될 수 있다. 추출 시간 역시 임의로 조정할 수 있으며, 2가지 이상의 추출방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.

열수 추출법의 경우, 우방자 100 g을 기준으로 물 0.8~1.2 L를 우방자와 함께 2~4시간 동안 가열하여 물 추출물을 얻을 수 있다. 바람직하게는 물 1 L와 함께 3시간 동안 가열하여 물 추출물을 얻을 수 있다.

용매 추출법의 경우, 다양한 용매가 사용될 수 있으며, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 프로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있다. 바람직하게는 70% 에탄올이 이용될 수 있다.

우방자 100 g을 기준으로 70% 에탄올 0.8~1.2 L를 우방자와 함께 2~4시간 동안 가열하여 물 추출물을 얻을 수 있다. 바람직하게는 70% 에탄올 1 L와 함께 3시간 동안 가열하여 에탄올 추출물을 얻을 수 있다.

추출된 물 추출물 또는 에탄올 추출물은 설계 조건에 따라 여과, 건조 및 농축 등의 과정이 더 수행될 수 있으며, 바람직하게는 동결 건조하여 분말 형태로 제조될 수 있다.

1-2. 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 제조

우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.

약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

약학적 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질환의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.

약학적 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.

식품 조성물로 이용되는 경우에는, 식품학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공한다.

건강기능식품의 경우, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.

의약외품 조성물로 이용하는 경우에는, 각 의약외품의 용도에 맞게 본 발명에 따른 조성물을 적용하여 제공할 수 있다.

실험예 1. 3T3-L1 세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석

1-1. 실험 준비

3T3-L1 지방전구세포는 미국세포주은행(ATCC)으로부터 구매하여 실험에 사용하였으며, 10% BCS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하여 사용하였다.

1-2. 실험 과정

① 3T3-L1을 96well에서 배양한다.

② 96well의 바닥이 세포로 가득 차면 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물을 농도별로 처리한다.

③ 약물 처리 후, 48시간 뒤에 각 well에 MTS시약을 10 ul 첨가하고 4시간 동안 배양기에서 배양한다.

④ 배양 후, 흡광도를 측정하여 각 농도별에서의 세포 생존율을 비교한다.

1-3. 3T3-L1 세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석 결과

도 1은 3T3-L1 세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

실험 결과, 우방자 물 추출물(WAL)은 10 ug/ml에서 1000 ug/ml의 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

우방자 70% 에탄올 추출물(ETAL)은 10 ug/ml에서 100 ug/ml의 농도에서는 세포 독성이 나타나지 않았지만, 1000 ug/ml의 농도에서는 세포 생존율이 감소하는 것을 볼 수 있었다.

따라서 이 후 실험예에서는 세포 독성을 나타내지 않는 10 ug/ml 내지 100 ug/ml 농도에서 실험을 진행하였다.

실험예 2. 흰색 지방세포 분화에 대한 우방자 추출물의 억제효과 분석

2-1. 실험 준비

1) 3T3-L1 세포에서 흰색 지방세포 분화 유도

① 3T3-L1을 6 well에서 세포가 dish바닥에 가득 찰 때까지 배양한다. cell이 가득 찬 후 1 ~ 2일 정도 더 유지시키고, MDI시약을 각 well에 처리한다.

② MDI시약 처리 48시간 후에 약물처리를 한다. 약물처리를 하는 동시에 각 well에 인슐린(insuin)을 1 uM로 처리한다.

Blank군은 아무것도 처리를 하지 않으며, control군은 분화시약과 인슐린만을 처리하며 약물군은 추가로 독성이 없는 농도의 우방자 추출물을 처리한다.(물 추출물과 에탄올 추출물 각각 10 ug/ml, 100 ug/ml로 처리) 또한 troglitazone을 이 실험의 음성 대조군으로 사용하여 실험과정에 문제가 없음을 보였다.

③ 약물처리 후 48시간 뒤에 배양액을 모두 버리고 인슐린이 1 uM로 첨가된 배양액을 첨가하여 48시간을 더 유지시키는데, blank군은 인슐린도 처리하지 않는다.

④ 배양액은 blank군은 10% carf serum(CS)이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였으며 나머지 군은 10% fetal bovine serum(FBS)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하였다. 배양 조건은 5% CO₂, 37℃이다.

2-2. 실험 과정

오일레드(oil red) O 염색법은 중성지방 성분을 염색하는 기법이다. 실험 방법은 다음과 같다.

① 위 실험 준비에서 분화가 끝난 6 well을 가지고 실험을 한다. 배양액을 모두 제거한 뒤 세포를 10% formaldehyde로 상온에서 2시간 이상 고정한다.

② 고정 후, formaldehyde를 모두 제거하고 2 ml의 60% iso-propanol로 washing해 준다.

③ iso-proanol을 모두 제거하여 완전히 마르게 한 뒤, Oil Red O 시약을 각 well에 1 ml씩 넣고 10~30분 정도를 상온에 둔다.

④ Oil Red O 시약을 모두 제거한 뒤, D.W 3 ml정도로 3~4회 각 well을 washing해 준다.

⑤ washing이 끝나면 현미경을 통해 cell의 염색 정도를 사진으로 찍고, 그 후 각 well에 100% iso-propanol 2 ml씩 첨가하여 염색된 Oil Red O 시약을 녹여 흡광도로 분화 정도를 측정한다.

2-3. 흰색 지방세포 분화에 대한 우방자 추출물의 억제효과 분석 결과

3T3-L1 세포는 지방세포의 대사과정 연구에 널리 이용되는 세포주로서, 상기 세포의 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방 축적이 활발하여 비만을 유도하게 된다.

따라서 항비만 효과를 가질 것으로 생각되는 물질을 상기 세포에 처리하였을 때, 세포의 분화가 적을수록 항비만 효과가 큰 물질인 것으로 볼 수 있다.

도 2는 3T3-L1 세포에서 우방자 추출물의 지방생성 억제 효과를 나타내는 현미경 상의 사진이며, 도 3은 그 정도를 수치화한 그래프이다.

실험 결과, 분화를 유도하지 않은 Blank군에서는 오일 레드로 염색되어 붉게 보이는 부분이 없으며, 흰색 지방세포로 분화를 유도한 Control군은 지방이 염색되어 붉게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

또한 지방세포의 분화를 촉진하는 트로글리타존(Troglitazone)를 처리하였을 시, 염색되는 지방이 많은 것으로 보아 지방세포로의 분화가 정상적으로 이루어지고 있음을 확인할 수 있다.

우방자 물 추출물(WAL)을 처리하였을 시, 10 ug/ml과 100 ug/ml에서 각각 염색되는 부분이 감소하는 것을 볼 수 있으며, 농도의존적으로 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

우방자 에탄올 추출물(ETAL) 역시, 10 ug/ml과 100 ug/ml에서 각각 염색되는 부분이 감소하는 것을 볼 수 있으며, 농도의존적으로 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

즉, 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물은 모두 흰색 지방세포로의 분화를 억제하며 농도의존적으로 억제 효과를 보이는 것을 알 수 있다.

실험예 3. 흰색 지방세포 분화인자에 대한 우방자 추출물의 억제효과 분석

3-1. 실험 준비

2-1의 실험 준비와 동일한 과정으로 수행되었다.

3-2. 실험 과정

1) 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용한 단백질 발현량 확인

① 분화된 세포를 scraper를 사용하여 모은 후, lysis buffer (Santa Cruz, CA, USA)로 용해시켰다.

② 여기에 5X sample buffer(62.5 nM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol)를 첨가하여 95℃에서 5분간 가열하였다.

③ 단백질을 7.5% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하고, nitrocellulose membrane에 옮긴 후, 0.05% TBST 용액에 5% BSA가 함유된 buffer로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다.

④ 1차 항체로 PPARγ, C/EBPα 항체를 넣고 반응시킨 후, 0.05% TBST 용액으로 3번 씻어내었다.

⑤ 2차 항체를 넣고 1 시간 동안 반응시킨 후, ECL detection 용액을 사용하여 밴드를 확인하였다. 이 실험에서 loading control로 GAPDH를 사용하였다.

2) RT(Real time)-PCR을 통한 각 유전자의 mRNA 발현량 확인

① 분화유도가 끝난 6 well을 가지고 실험을 하였다.

② 먼저 RNA extract kit(QIAzen, 79306 )를 사용하여 RNA를 추출하였다.

③ 추출 후 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, 4368577)를 사용하여 mRNA 발현량을 비교하였다. 이때 각 primer의 sequence는 다음과 같다.

GAPDH(F) : AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG

GAPDH(R) : GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT

PPARγ2(F) : TTT TCA AGG GTG CCA GTT TC

PPARγ2(R) : TTA TTC ATC AGG GAG GCC AG

C/EBPα(F) : GCC GAG ATA AAG CCA AAC AA

C/EBPα(R) : CCT TGA CCA AGG AGC TCT CA

3-3. 흰색 지방세포의 분화인자에 대한 우방자 추출물의 억제효과 분석 결과

3T3-L1 지방전구세포가 성숙한 지방세포로 분화하는 과정에는 IGF-1, 인슐린 및 당질코르티코이드와 같은 호르몬, 지방산, FGF(Fibroblast growth factor), 사이토카인(cytokine) 및 C/EBP와 PPAR같은 전사인자 등 다양한 신호에 의해 지방세포의 분화가 진행된다.

그 중 C/EBP(CCAAT/enhancer-binding protein)와 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)은 가장 대표적인 지방세포 분화인자로, C/EBPα는 지방세포 특이 유전자의 전사조절부위를 활성화한다.

PPAR는 지방 특이적 유전자에 직접 작용하여 주인 조절자(master regulator)로 모든 지방생성과정의 프로그램을 관장한다. 이런 PPAR은 C/EBPα와 상호 상승적인 작용을 하여 지방세포 분화를 더욱 촉진한다.

본 실험예에서는 PPARγ와 C/EBPα의 발현 정도를 측정함으로써, 우방자 추출물의 흰색 지방세포의 분화 억제효능을 관찰하였다.

도 4는 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBPα에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 결과이다.

실험결과, 분화를 유도하지 않은 Blank군에 비해, 지방세포로 분화를 유도한 Control군에서 PPARγ 및 C/EBPα의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

우방자 물 추출물(WAL)과 에탄올 추출물을(ETAL) 각각 처리한 군에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현량이 감소한 것을 확인하였으며, 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 5 및 도 6은 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBPα에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 Real-Time PCR로 나타낸 결과이다.

웨스턴 블롯의 결과와 마찬가지로, 분화를 유도하지 않은 Blank군에 비해 지방세포로 분화를 유도한 Control군에서 PPARγ 및 C/EBPα의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 우방자 물 추출물(WAL)과 에탄올 추출물을(ETAL) 각각 처리한 군에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현량이 감소한 것을 확인하였으며, 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물이 흰색 지방세포로 분화를 유도하는 인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 감소시키며, 이를 통해 흰색 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 알 수 있다.

실험예 4. 갈색 지방세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석

4-1. 실험 준비

갈색 지방세포는 갓 태어난 상태에서 가장 많이 보이기 때문에 FVB mouse를 직접 교배하여 갓 태어난 새끼 FVB mouse에서 채취하였다.

① 새끼 mouse의 머리를 단두한 뒤 견갑골 쪽에서 갈색 지방만을 분리한다.

② 분리한 후 잘게 잘라 BSA와 collagenase를 처리한 뒤 37℃에서 1시간 동안 shaking해준다.

③ 그 후 200 um filter로 여과하고 200 g의 회전수에서 10분간 원심분리한다.

④ 이렇게 얻어진 갈색 지방세포는 20% fetal bovine serum(FBS)가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양한다.

4-2. 실험 과정

① 갈색 지방세포를 96 well에서 배양한다.

② 96well의 바닥이 세포로 가득 차면 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물을 농도별로 처리한다.

③ 약물 처리 후, 48시간 뒤에 각 well에 MTS시약을 10 ul 첨가하고 4시간 동안 배양기에서 배양한다.

④ 배양 후, 흡광도를 측정하여 각 농도별에서의 세포 생존율을 비교한다.

4-3. 갈색 지방세포에 대한 우방자 추출물의 세포독성 분석 결과

도 7은 갈색 지방세포에 대한 우방자 추출물의 독성여부를 나타내는 그래프이다.

실험 결과, 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물은 각각 0.1, 1, 10 ug/ml에서 모두 세포 독성을 나타내지 않았다.

실험예 5. 갈색 지방세포 분화에 대한 우방자 추출물의 촉진효과 분석

5-1. 실험 준비

1) 갈색 지방세포에서 지방분화 유도

① 갈색 지방세포를 6 well에서 cell이 dish바닥에 가득 찰 때까지 배양한다. cell이 가득 찬 후 1 ~ 2일 정도 더 유지시킨다.

② 분화유도 시약을 각 well에 처리한다. 이때부터는 갈색 지방세포를 10% FBSDMEM 배양액에서 유지시킨다.

③ 분화유도 처리 48시간 후에 약물처리를 한다. 약물처리를 하는 동시에 각 well에 인슐린과 T3를 처리한다.

Blank군은 아무것도 처리를 하지 않으며, 약물군은 독성이 없는 농도의 우방자 추출물을 처리한다.(물 추출물과 에탄올 추출물 각각 0.1 ug/ml, 1 ug/ml로 처리).

④ 약물처리 후 48시간 뒤에 배양액을 모두 버리고 인슐린과 T3이 첨가된 배양액으로 48시간을 더 유지시키는데 blank군은 아무것도 처리하지 않는다. 배양 조건은 5% CO₂, 37℃이다.

5-2. 실험 과정

실험 과정은 3-2와 동일한 과정으로 수행되었으나, 이때 사용된 각 primer의 sequence는 다음과 같다.

GAPDH(F) : AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG

GAPDH(R) : GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT

UCP1(F) : AAC TGT ACA GCG GTC TGC CT

UCP1(R) : TAA GCC GGC TGA GAT CTT GT

PGC1α(F) : AAT GCA GCG GTC TTA GCA CT

PGC1α(R) : TGT TGA CAA ATG CTC TTC GC

5-3. 갈색 지방세포 분화에 대한 우방자 추출물의 촉진효과 분석 결과

인체의 세포 내에서는 보통 산화적 인산화 과정에서 발생된 수소 이온(H+)을TP 합성효소에 의해서 ATP를 합성하는 데 사용한다.

그러나 미토콘드리아막에 존재하는 UCP1(Uncoupling protein-1)은 이 수소이온을 ATP를 합성하는 데 사용되지 못하게 하고, 열을 생산하는 데 이용되도록 하여 에너지를 열로 낭비되게 하는 물질이다.

동물에서는 갈색 지방세포에서 발현되며, 체온을 유지시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. UCP의 열 생산은 자연적으로 에너지 소비를 촉진한다.

PGC1(Peroxisome proliferator-activated receptor γ co-activator 1-alpha)은 골격근 내부에 존재하는 단백질로, 활성화되면 근육 세포의 외막에서 이리신(irisin)이라는 호르몬의 분비를 촉진하여 흰색 지방세포가 갈색 지방세포로 바뀌는 데 도움을 주며 그에 따라 에너지 소비량이 늘어나게 한다.

본 실험예에서는 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현되는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현량을 측정함으로써, 우방자 추출물이 갈색 지방세포의 분화에 미치는 영향을 조사하였다.

도 8은 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 UCP1과 PGC1α에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 웨스턴 블롯으로 나타낸 결과이다.

실험 결과, 분화를 유도하지 않은 Blank군에 비해 갈색 지방세포의 분화를 유도한 Control군에서 UCP1과 PGC1α의 발현이 증가한 것을 확인할 수 있다.

또한 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물을 처리하였을 시, UCP1과 PGC1α의 발현이 더욱 증가하여 Control군에 비해 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있다.

도 9는 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 UCP1과 PGC1α에 대한 우방자 추출물의 억제효과를 Real-Time PCR로 나타낸 결과이다.

Real-Time PCR 결과, 분화를 유도하지 않은 Blank군에서는 거의 검출되지 않았던 UCP1과 PGC1α가 분화를 유도한 후 밴드가 나타난 것을 확인할 수 있다.

우방자 물 추출물과 에탄올 추출물을 처리하였을 시에는 UCP1의 발현량이 Control군에 비해 증가한 것을 확인할 수 있으며, 농도가 높이질 수록 발현량도 증가하는 것을 알 수 있다.

PGC1α 역시, 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물을 처리하였을 시에 발현이 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

즉, 우방자 물 추출물과 에탄올 추출물이 갈색 지방세포의 분화과정에서 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현을 증가시키며, 이를 통해 갈색 지방세포로의 분화를 촉진하는 것을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 우방자 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 우방자 추출물의 추출용매는 물 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은 세포 독성이 없는 효능, 흰색 지방세포의 분화를 억제하는 효능, 흰색 지방세포의 분화인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능 및 갈색 지방세포의 분화과정 중에 발현하는 인자인 UCP1과 PGC1α의 발현이 증가한 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물.
   
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
   
5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선을 위한 의약외품 조성물.

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