KR20150110581A - 동적으로 구성가능한 신경망에 대한 신경돌기 성장의 전기역학적 구속 - Google Patents

동적으로 구성가능한 신경망에 대한 신경돌기 성장의 전기역학적 구속 Download PDF

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티볼트 호네거
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

신경 성장을 변화시키기 위한 시스템 및 방법이 일반적으로 서술된다. 일부 실시예에서, 시스템은 신경돌기를 포함하는 뉴런 및 물리적 유도 신호를 생성할 수 있는 전극을 포함할 수 있다. 물리적 유도 신호는 신경돌기의 성장을 변화시키기 위해 사용될 수 있고, 일시적이고 공간적으로 동적일 수 있어서, 신경돌기 성장은 공간적 및/또는 일시적 방식으로 변화될 수 있다. 신경돌기 성장의 동적 제어는 지향성 뉴런 연결, 교차 및/또는 겹침을 형성하도록 사용될 수 있다. 시스템은 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버; 채널; 채널을 교차하며 전극의 중심 간격이 약 200 마이크론 이하인 적어도 하나의 전극쌍을 포함하며, 이때 이때 상기 채널은 챔버에 연결되고, 채널은 약 20 마이크론 이하의 폭 및/또는 높이를 갖고, 또한 복수의 전극쌍은 채널을 교차한다.

Description

동적으로 구성가능한 신경망에 대한 신경돌기 성장의 전기역학적 구속{ELECTROKINETIC CONFINEMENT OF NEURITE GROWTH FOR DYNAMICALLY CONFIGURABLE NEURAL NETWORKS}
본원은 2013년 1월 14일에 출원된 미국 가출원번호 61/752,183, 발명의 명칭 "동적으로 구성가능한 신경망에 대한 신경돌기 성장의 전기역학적 구속"에 대해 우선권을 주장하며, 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 포함된다.
본 발명은 국립 과학 재단에 의해 수여된 등록번호 DBI-0852654 및 국립 보건원에 의해 부여된 등록번호 RO1-NS066352 하의 정부 지원과 함께 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
신경돌기 성장을 변화시키기 위한 시스템 및 방법이 제공된다.
생체 내(in vivo)에서 신경돌기를 성장시키는 것은 공간적 및 일시적으로 변화하는 유도 신호의 지배를 받는다. 이러한 유도 신호는 뉴런이 기능적 신경망을 형성할 수 있도록 한다. 예를 들어, 제노푸스(Xenupus) 유충에서의 망막 신경절 포로부터의 초기 신경돌기는 시신경교차에서 십자대생(decussate)하여 대축성(contralateral) 연결을 형성하지만, 일부 후기 신경돌기는 고조된 에프린-B 발현에 의해 정중선(midline)으로부터 반발되고, 교차하지 않는다. 이러한 공정을 연구하고 조작하는 것은 신경돌기 성장에 대한 일시적이고 공간적인 통제를 모두 제공할 수 있는 방법 및 시스템을 요구한다. 또한, 단거리에 걸쳐 분포한 소수의 신경돌기들을 포함하는 작은 신경망 및 장거리에 걸쳐 분포한 다수의 신경돌기를 포함하는 큰 신경망을 형성할 수 있는 가변 방법 및 시스템이 필요하다. 현존하는 방법은 신경돌기 성장을 동적으로 변화시키지 못하고/못하거나 손쉽게 가변할 수 없다. 따라서, 개선된 방법 및 시스템이 필요하다.
신경돌기 성장을 변화시키기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 본 발명의 대상은, 일부 경우에서, 상호관련 제품, 특정 문제에 대한 대안 해결책, 및/또는 하나 이상의 시스템 및/또는 물품의 복수의 다양한 용도를 포함한다.
한 실시예의 세트에서, 일련의 방법이 제공된다. 일 실시예에서, 방법은 하나 이상의 신경돌기를 포함하는 뉴런을 제공하는 단계, 교류 전기장을 제공하는 단계, 및 교류 전기장을 사용하여 하나 이상의 신경돌기의 신장을 지향적으로 인도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 방법은 교류 전기장을 사용하여 신경돌기의 신장을 지향적으로 인도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 방법은 두개 이상의 전극에 의해 발생된 장으로 신경돌기의 성장에 영향을 미치는 단계를 포함한다. 전극들 사이에서 중심 간격은 약 200 마이크론 이하이다.
또 다른 실시예에서, 방법은 전기장을 이용하여 다중-방향으로 신경돌기의 성장에 영향을 미치는 단계를 포함한다. 전기장은 신경돌기 부근에서 약 100 V/m 이상의 규모를 갖는다.
또 다른 실시예에서, 방법은 신경돌기를 포함하는 뉴런을 제공하는 단계, 물리적 유도 신호를 제공하는 단계, 및 물리적 유도 신호를 사용하여 신경돌기의 성장을 제어하는 단계를 포함한다. 물리적 유도 신호는 신경돌기의 성장을 반대로 저지할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 방법은 제1 배향으로의 신경돌기의 성장을 허용하는 단계 및 신경돌기의 성장이 제2 배향으로 일어나도록 신경돌기에 영향을 미치도록, 비-기계적으로-작동된 물리적 유도 신호를 신경돌기에 적용하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 방법은 하나 이상의 신경돌기들을 각각 포함하는 하나 이상의 뉴런을 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 방법은 전기장을 제공하는 단계, 다른 신경돌기와 관계없이 신경돌기를 제어하는 단계, 및 하나 이상의 뉴런으로부터 신경망을 형성하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 방법은 유도 신호를 사용하여 제1 신경돌기가 제2 신경돌기와 겹쳐지도록 유도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 방법은 제2 신경돌기가 겹쳐지도록 신경돌기의 성장을 유도하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 방법은 신경돌기의 제1 및 제2 군집 사이에서 전기장을 사용하여 신경망을 형성하기 위하여 3차원 스캐폴드 내에서 제1 신경돌기 및 제2 신경돌기의 신장을 지향적으로 유도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 방법은 전기장을 사용하여 3차원 스캐폴드 내에서 신경돌기 신장을 가속화하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예들의 세트에서, 일련의 물품들이 제공된다. 일 실시예에서, 물품은 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버, 채널, 및 복수의 전극 쌍들을 포함한다. 채널은 챔버에 연결되고, 채널은 약 20 마이크론 이하의 높이 및/또는 폭을 갖는다. 전극 쌍은 중심 간격이 약 200 마이크론 이하인 두 개의 전극들을 포함한다. 복수의 전극 쌍들은 채널을 가로지른다.
또 다른 실시예에서, 물품은 제1 채널에 연결된 제1 챔버, 제1 채널의 적어도 일부와 나란히 배열된 제1 전극 쌍, 제2 채널에 연결된 제2 챔버, 및 제2 채널의 적어도 일부와 나란히 배열된 제2 전극 쌍을 포함한다. 제1 전극 쌍의 일부는 제1 챔버의 적어도 일부와 겹쳐질 수 있고, 제2 전극 쌍의 일부는 제2 챔버의 적어도 일부와 겹쳐질 수 있다. 일부 예에서, 제1 및 제2 채널은 약 10 마이크론 초과의 높이를 갖는 겹쳐진 영역에서 교차한다.
또 다른 실시예에서, 물품은 제1 챔버 및 제2 챔버에 연결된 제1 채널, 및 제1 채널의 적어도 일부와 나란히 배열된 제1 전극 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 제1 전극 쌍의 일부는 제1 챔버의 적어도 일부와 겹쳐지고, 제1 전극 쌍 사이의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하이다.
본 발명의 다른 이점 및 새로운 특징은, 첨부된 도면과 함께 생각할 경우에, 본 발명의 다양한 비-제한 실시예의 하기 구체적인 설명으로부터 자명해질 것이다. 본원 명세서 및 참조로 포함된 문헌이 저촉 및/또는 모순 내용을 포함하는 경우에, 본원 명세서가 우선한다.
본 발명의 비-제한 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 예시로서 설명될 것이며, 이러한 도면들은 개략적이고 척도에 따라 그려진 것이 아니다. 도면들에서, 각각의 동일하거나 거의 동일한 구성은 하나의 숫자에 의해 보통 대표된다. 명확성의 목적으로, 모든 구성들이 모든 도면에서 표시되지 않고, 본 발명의 각 실시예의 모든 구성들은 통상의 기술자가 본 발명을 이해하는데에 필요하지 않은 부분으로 보이면 도면에 표시하지 않았다.
도 1a-e는 일반적으로 신경돌기 성장을 변화시키는 것에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 2a-d는 신경 연결들을 형성에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경망을 도해한다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 전기 시스템을 도해한다.
도 5a-b는 본 발명의 특정 실시예에 따른 신경돌기 성장을 변화시키기 위한 장치를 도해한다.
도 6은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 신경돌기 성장을 도해한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 신경돌기 성장을 도해한다.
도 8a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 장치 구성의 특징을 도해한다.
도 9a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 모델의 특징을 도해한다.
도 10a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 모델의 특징을 도해한다.
도 11a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 모델의 특징을 도해한다.
도 12는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 신경 연결을 형성하기 위한 장치를 도해한다.
도 13은 본 발명의 특정 실시예에 따른 신경돌기의 성장을 도해한다.
도 14a-b는 본 발명의 일 실시예에 따른 활동 전위 레코딩 및 형광 이미지를 도해한다.
도 15a-b는 본 발명의 특정 실시예에 따른 장치 구성의 특징을 도해한다.
도 16a-c는 본 발명의 특정 실시예에 따른 신경돌기 성장을 변화시키기 위한 장치를 도해한다.
도 17a-b는 일반적으로 신경돌기의 배향을 변화시키는 것에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 18a-b는 일반적으로 특정 영역에서 신경돌기 성장을 유도하고, 신경돌기 신장을 가속화하는 것에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 19a-b는 일반적으로 신경돌기 신장을 늦추는 것에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 20a-c는 일반적으로 신경돌기의 배향을 변화시키는 것에 관한 본 발명의 특정 실시예를 도해한다.
도 21a-g는 본 발명의 일 실시예에 따른, 신경돌기를 유도하기 위한 장치를 도해한다.
도 22a-d는 본 발명의 특정 실시예에 따른, 채널을 스캐폴드로 채우는 방법을 도해한다.
도 23a-e는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 전압에 대한 세포 생존능력의 그래프 및 다양한 전압에서 세포의 이미지를 도해한다.
도 24는 본 발명의 특정 실시예에 따른, 전극 쌍들 사이의 영역에서 신경돌기 성장을 도해한다.
본 발명은 하나 이상의 뉴런의 신경 성장과 일반적으로 관련된다. 신경 돌기 성장을 변화시키기 위한 시스템 및 방법은 일반적으로 설명된다. 일부 실시예에서, 시스템(예, 미세유체 시스템)은 신경 돌기(예, 액손)를 포함하는 뉴런 및 물리적 유도 신호(예, 동전기력(electrokinetic force))를 발생시킬 수 있는 구성을 포함할 수 있다. 물리적 유도 신호는 신경 돌기의 성장을 변화시키기 위해 사용될 수 있고, 일시적이고 공간적으로 동적일 수 있어서, 신경돌기 성장은 공간 및/또는 일시적 방식으로 변화될 수 있다. 일부 예에서, 구성들은 전극들일 수 있고, 물리적 유도 신호는 전기장(예, 교류 전기장)에 의해 생성되는 동전기력일 수 있다. 일부 경우에서, 시스템은 하나 이상의 뉴런을 포함할 수 있는데, 이때 각 뉴런은 신경돌기를 포함한다. 일부 이러한 경우에서, 하나 이상의 물리적 유도 신호는 신경돌기들 간에 단일 배향의 연결을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 신경돌기 성장, 신경 신호전달, 및 공학적으로 배향된 신경망의 형성의 정량적 연구에서의 응용에 특히 적절할 수 있지만, 이러한 시스템은 다른 응용에서 사용될 수 있다.
생물에서 신경돌기 성장은 유도 신호를 통해 유도되고, 그의 발현은 공간적으로 그리고 일시적으로 변화하여, 기능적 신경 연결을 형성한다. 신경돌기 성장을 연구 및/또는 기능적 신경 연결을 형성하기 위한 현존하는 시스템 및 방법은 고정된 기하학을 사용하고, 신경돌기 상에 전해진 유도 신호를 동적으로 변화시킬 수 없다. 또한, 많은 이러한 시스템 및 방법은 긴 거리를 가로질러 수많은 신경돌기로부터 신경망을 형성하도록 손쉽게 조정될 수 없다.
본 발명의 특정 실시예의 맥락에서, 신경돌기 성장에 대한 공간적 및 일시적 제어 및 조정가능한 배향된 신경망의 형성이 동적인 물리적 유도 신호(예, 동전기 현상)을 사용하여 달성될 수 있다고 밝혀졌다. 신경돌기 성장의 동적 제어는 발달 생물학(예, 발달 신경과학)으로부터 재생 장치(예, 말초 신경 부상에 관한 재생 장치)에 이르는 범위에서 수 많은 응용을 가능하게 한다.
동적인 물리적 유도 신호를 사용하여 신경돌기(예, 액손, 수상돌기) 성장을 변화시키기 위한 장치의 예는 도 1a에서 보여진다. 도 1a에서 도해로서 보여지는 바와 같이, 장치(10)는 하나 이상의 신경돌기(20)를 포함하고 챔버(25) 내에 위치된 뉴런(15)을 함유할 수 있다. 장치는 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버(25), 신경돌기들이 성장할 수 있는 채널(30), 및 물리적 유도 신호를 발생시킬 수 있는 전극(35)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 챔버 및 채널은 뉴런 세포체(16)가 챔버에 가둬지면서 하나 이상의 신경돌기는 채널들(30) 안으로 성장할 수 있도록 구성될 수 있다. 일 예에서, 채널은 뉴런 세포체의 크기에 비해 작지만, 신경돌기의 평균 크기에 비해 큰 크기(높이, 폭, 단면적)를 가질 수 있다. 채널의 크기는, 또한 일부 예에 있어서, 채널을 점유하는 신경돌기의 수 및 신경돌기의 방향성을 제한할 수 있다. 예를 들어, 채널의 단면은 단일 신경돌기가 채널을 점유하도록 할 수 있다. 다른 예에서, 채널의 단면은 복수의 신경돌기(예, 신경돌기의 군집)가 채널을 점유하도록 할 수 있다. 특정 실시예에서, 채널은 신경돌기 성장을 1차원으로 국한시키는 것에 의해 신경돌기의 방향성을 제한하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 도 1b-1d에서 보는 바와 같이, 챔버(25)를 제2 챔버(25-2)에 연결하는 채널(30)의 폭은 신결돌기가 배향을 바꾸는 것을 방지한다. 그러므로, 채널(30)에 진입하는 성장하는 신경돌기는. 챔버(25-2)를 향해 신장할 것이다. 다른 실시예에서, 채널은 배향 및 수평면의 변화와 같은 다중-차원 성장을 허용할 수 있다. 일부 예에서, 신경돌기 및 뉴런 세포체는 채널(30)에서 성장할 수 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 전극(35)은 채널(30)의 적어도 일부에서 교차할 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 전극은 모든 채널들을 교차할 수 있고, 다른 경우에서, 하나 이상의 전극은 모든 채널을 교차하지 않을 수 있다. 특정 실시예에서, 채널에 대한 전극의 배향(예, 교차각)은 물리적 유도 신호의 존재하에서 신경돌기 성장이 어떻게 변화되는지에 대해 영향을 미친다. 예를 들어, 물리적 유도 신호가 힘인 실시예에서, 전극의 배향은 힘의 방향을 결정할 수 있다. 일 예에서, 도 1a에서 보는 바와 같이, 전극이 채널에 대해 수직인 경우에(즉, 90°교차각), 채널에 평행한 힘은 생성될 수 있다. 전극은 신경돌기 성장에 대한 물리적 장벽을 제기하지 않고 비-접촉(즉, 접촉없는) 물리적 유도 신호를 생성하는데에 사용될 수 있다고 이해되어야 할 것이다.
특정 실시예에서, 하나 이상의 전극은 하나 이상의 채널의 적어도 일부와 나란히 배열되고 겹칠 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 전극의 전체 길이는 채널과 나란히 배열되고 겹쳐질 수 있고, 다른 경우에서, 하나 이상의 전극의 길이의 일부는 채널과 나란히 배열되고/배열되거나 겹쳐지지 않을 수 있다. 특정 실시예에서, 채널에 대한 전극의 배향(예, 평행 배열 및 채널과 하나 이상의 전극의 겹침)은 물리적 유도 신호의 존재하에서 어떻게 신경돌기 성장이 변화되는지에 대해 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 전극의 배향은 신경돌기 성장을 특정 영역, 경로 및/또는 평면에 국한시킬 수 있다.
일부 실시예에서, 전기장(36)(예, 교류 전기장, 직류 전기장)은, 도 1a에서 보는 바와 같이, 두 개의 전극(즉, 전극쌍)들 사이에서 생성된다. 전기장은 신경돌기의 성장을 변화시킬 수 있는 하나 이상의 물리적 유도 신호(예, 계면 동전현상(electrokinetic phenomena), 줄 발열(joule heating)를 발생시킬 수 있다. 특정 실시예에서, 물리적 유도 신호는 특정 부근(예, 전극들 사이, 전극들 인접하여)에 국부화될 수 있다. 예를 들어, 물리적 유도 신호는 특정 규모(예, 100 V/m)을 초과하는 전기장을 요구할 수 있다. 물리적 유도 신호는 전기장 역치 규모 미만의 영역에서 생성되지 않을 수 있다.
장치(10)에서 신경돌기 성장을 변화시키는 예는 도 1b-1d에서 보여진다. 도 1b에서 도해적으로 보는 바와 같이, 장치(10)는 제1 신경돌기(20-1) 및 제2 신경돌기(20-2)를 가지며, 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버(25) 내에 위치된 뉴런(15)을 함유할 수 있다. 전극(35)은 채널(30)의 일부를 교차한다. 도 1b는 성장 기간 이후에 장치(10)에서 신경돌기(20-1 및 20-2)의 성장의 개략적 도해를 보여준다. 성장 기간 동안에, 신경돌기(20-1 및 20-2)는 채널(30-1 및 30-2)안으로 각각 성장하고, 챔버(25-2)를 향해 신장했다. 일부 실시예에서, 전압은, 신경돌기(20-1)의 신장이 전극(35B)을 지나치는 것을 방지하는 물리적 유도 신호를 생성하는 전극(35A 및 35B)을 가로질러 인가된다. 물리적 유도 신호의 부재하에서 신경돌기(20-2)는 도 1b에서 보는 바와 같이, 챔버(25-2)로 신장할 수 있다.
신경돌기 성장을 변화시키는 또 다른 예는 도 1e에 도해된다. 도 1e에서 보는 바와 같이, 장치(100)는 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버(125-1)에 위치된 몇몇 신경돌기(예, 120-1, 120-2, 120-3, 120-4)를 갖는 뉴런(115)을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 장치는 전극을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 전극의 적어도 일부는 채널과 겹쳐질 수 있다. 예를 들어, 도 1e에서 도해된 것과 같이, 두 쌍의 전극들(전극쌍(135) 및 전극쌍(136) 중 일부는 챔버에 겹쳐질 수 있다. 특정 실시예에서, 전극에 의해 생성된 물리적 유도 신호는 뉴런이 전극쌍 사이의 영역 안으로 신장하는 하나 이상의 신경돌기(예, 120-1, 120-2, 120-3)를 향할 수 있다. 일부 예에서, 전극들 중 적어도 일부는 채널(130)의 적어도 일부와 겹쳐지거나 나란히 배열될 수 있다. 예를 들어, 도 1e에 도해된 바와 같이, 전극(135A 및 136A)은 채널(130)의 일부와 나란히 배열되고 겹쳐진다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 전극은 채널의 벽에 실질적으로 평행할 수 있다. 일부 예에서, 전극들 중 일부는 채널의 벽에 실질적으로 평행할 수 있다. 성장 기간 동안에, 신경돌기(120-1, 120-2, 120-3, 및 120-4)는 채널(130) 안으로 성장하고 챔버(125-2)를 향해 신장된다. 일부 실시예에서, 전압은, 전극(135A 및 136A) 사이의 영역 내로 성장(예, 신장)을 국한시키고 채널(130)에 의해 정의된 전체 영역 내에서 신경돌기(120-1, 120-2 및 120-3)의 성장을 방지하는 물리적 유도 신호를 생성하는 전극(135A 및 136A)에 인가된다. 물리적 유도 신호의 부재하에서 신경돌기(120-4)는 전극(135A 및 136A) 사이의 영역의 외부에서 성장할 수 있다.
일부 실시예에서, 전극들 사이에서 국한된 신경돌기는, 전극들 사이에 국한되지 않은 본질적으로 동일한 조건(배양 환경, 온도, 압력, 습도 등) 항에서 신경돌기에 비해 향상된(예, 가속화된) 성장(예, 신장)을 가질 수 있었다. 일부 이러한 실시예에서, 전극 쌍의 적어도 일부(예, 채널과 나란히 배열되고 겹쳐지는 부분)에 평행하게 측정된 신경돌기의 길이는 전극쌍의 외부에 있지만 본질적으로 동일한 조건 하에서 배양된 신경돌기(즉, 전극쌍 내에 국한되지 않음)의 길이에 비해 더 클 수 있다. 이론에 구속됨 없이, 신경돌기 성장은 향상되었는데, 그 이유는 물리적 유도 신호(예, 전기장)에 의해 유발된 힘이 신경돌기의 성장원뿔의 유효 조사 면적을 제한하기 때문인 것으로 생각된다. 면적의 감소는 유효 조사 면적이 제한되지 않은 신경돌기에 비해 환경을 조사하는데 걸리는 총 시간을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 신경돌기 신장은 전기장을 사용하는 3차원 스캐폴드 내에서 가속화될 수 있다. 일부 이런 실시예에서, 장을 생성하는데에 사용된 전극은 스캐폴드 내에 함유되지 않을 수 있다.
특정 실시예에서, 신경 돌기의 성장에 변화는 도 1c-d에 도해한 바와 같이 재구성될 수 있다. 도 1c는 채널(30)에서 성장하는 신경돌기를 가진 복수의 뉴런을 포함하는 장치(10)의 이미지를 보여준다. 전극(35)은 채널(30-3)에서 채널(30)을 교차하고 채널(30-3)에서 물리적 유도 신호를 생성한다. 일부 실시예에서, 채널(30-3)에서 성장한 신경돌기는 개방형 화살표에 의해 지시하는 방향으로 전극(35B)을 지나 챔버(25-2)로 향해 신장하는 것이 방지된다. 전극을 교차하지 않는 채널(30-4)에서 성장하는 신경돌기는, 폐쇄형 화살표에 의해 지시되는 바와 같이 챔버(25-2)를 향해 신장할 수 있다. 일부 실시예에서, 전압을 차단하는 것은 신경돌기 성장에서의 변화를 반전시킬 수 있는 물리적 유도 신호를 없앤다. 도 1d에서 보는 바와 같이, 물리적 유도 신호의 제거 후에, 채널(30-3)에서의 신경돌기는 폐쇄형 화살표에 의해 지시되는 바와 같이 챔버(25-2)를 향해 신장할 수 있다.
여기 설명된 바와 같이, 신경돌기 성장은 물리적 유도 신호를 사용하여 변화될 수 있다. 신경돌기 성장을 변화시키는 것은 신경돌기의 하나 이상의 성장 특징을 변화시키는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, 신경돌기 길이 및 배향 모두 변화될 수 있다. 일부 예에서, 신경돌기 성장의 실질적으로 모든 특징이 변화될 수 있다. 신경돌기 특징의 비-제한 예는 성장률, 신경돌기 길이, 배향(예, 방향), 위치(예, 평면, 치수), 및 성장원뿔 특징(예, 액틴 분극화)를 포함한다. 다른 성장 특징도 가능하다. 일반적으로, 임의의 적절한 성장 특징이 변화될 수 있다.
일부 실시예에서, 용어 신호(cue) 또는 유도 신호(guidance cue)는 통상의 기술자에 의해 일반적으로 알려진 의미를 갖는다. 신호는, 뉴런 세포체 또는 신경돌기에 의해 수신되고 뉴런 세포체 신경돌기에 의해 하나 이상의 성장 특징과 관련된 지시로 번역될 수 있는 신호(화학적, 힘, 등)를 지칭할 수 있다. 유도 신호는, 뉴런 세포체 또는 신경돌기에 의해 하나 이상의 성장 특징에 관한 지시로 번역된 후에, 본질적으로 동일한 조건이지만 신호가 결핍된 조건 하에서 하나 이상의 성장 특징을 성장 특징의 일반적인 통계적 분포로부터 변화시켜서 성장 특징이 변화되거나 제어되도록 하는 신호를 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 신경돌기 성장을 유도하거나 성장에 영향을 미치는 것은 연장된 기간(예, 적어도 약 1시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 4일, 적어도 약 1주)에 걸쳐서 하나 이상의 성장 특징(뜰)의 일반적인 통계적 분포를 변화시키는 것을 수반할 수 있다.
일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 통상의 기술자에게 일반적으로 알려진 의미를 가진다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 비-화학적 신호로, 신경돌기에 의해 수신되고 신경돌기에 의해 하나 이상의 성장 특징에 관한 지시로 번역될 수 있는 비-화학적 신호이다. 물리적 유도 신호의 비-제한 예는 계면 동전현상(예, 유전영동, 전기삼투, 전열 효과), 에너지(예, 열), 기계력(예, 유체 흐름에 의해 발생함, 구조적 장벽과의 상호작용), 비-기계적으로 구동력, 광학 신호, 및 그의 조합을 포함한다. 물리적 유도 신호가 신경돌기에 대한 화학종의 직접적인 적용을 수반할지라도, 물리적 유도 신호가 신경돌기 성장을 변화시키기 위한 화학종을 생성할 수 있고/있거나 화학종을 유발할 수 있다고 이해되어야한다. 일부 실시예에서, 비-기계적 구동력은 하나 이상의 기계적으로 구동된 요소(예, 회전하도록 기계적으로 구동된 입자)로부터 유래되거나 그에 의해 생성되지 않은 비-접촉힘을 지칭할 수 있다. 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 신경돌기에 직접적으로 접촉하지 않고/않거나 신경돌기 성장에 대한 물리적 장벽으로 작용하는 하나 이상의 요소로부터 유래되거나 그로부터 생성될 수 있다.
물리적 유도 신호가 신경돌기 성장을 변화시키는 방식은, 성장 특징에 영향을 미치는 신경돌기 주변의 기하학적 제한(예, 구조적 장벽), 다른 유도 신호의 존재, 물리적 유도 신호의 강도, 물리적 유도 신호의 공간적 및/또는 일시적 성질 등과 같은 다수의 요인에 의존한다. 하나 이상의 신경돌기가 존재하는 실시예들에서, 물리적 유도 신호가 신경돌기 성장을 변화시키는 방식 및/또는 한 신경돌기에 대한 성장 변화의 결과는 다른 신경돌기와 다를 수 있다. 일부 경우에서, 방식 및 결과는 실질적으로 동일할 수 있다. 따라서, 신경돌기 성장 변화의 결과는 실시예에 따라 변화할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 신경돌기 성장을 변화시키는 것은 신경돌기의 성장에 영향을 미치는 것을 수반할 수 있어서, 적어도 하나의 성장 특징은 신경돌기의 본래 성장 특징과 상이하다. 특정 실시예에서, 신경돌기 성장을 변화시키는 것은 하나 이상의 성장 특징(예, 신경돌기 길이, 성장 방향, 성장 속도)을 통제하는 것의 결과일 수 있다. 일 예에서, 물리적 유도 신호는 신경돌기의 성장률을 좌우하고, 성장을 역으로 억제하거나 저지할 수 있다, 예, 도 1a-b 참조. 또 다른 예에서, 도 1e에 도해된 바와 같이, 물리적 유도 신호는 신경돌기의 성장률을 향상(예, 가속화)시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호가 성장률에 미치는 영향은, 물리적 유도 신호의 존재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이를 물리적 유도 신호의 부재하에서 본질적으로 동일한 존재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이에 대해 비교함으로써 정량될 수 있다. 예를 들어, 물리적 유도 신호가 성장을 억제하거나 저지하는 실시예에서, 물리적 유도 신호(예, 비-접촉 물리적 유도 신호)의 존재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이 대(vs) 물리적 유도 신호의 부재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이의 비는 약 1:1 이하, 약 0.8:1 이하, 약 0.6:1 이하, 약 0.5:1 이하, 약 0.4:1 이하, 약 0.2:1 이하, 약 0.1:1 이하이다.
물리적 유도 신호가 성장을 강화시키는 실시예에서, 물리적 유도 신호(예, 비-접촉 물리적 유도 신호)의 존재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이 대(vs) 물리적 유도 신호의 부재하에서 성장한 신경돌기의 신장 길이의 비는 약 1:1 이상, 약 1.2:1 이상, 약 1.3:1 이상, 약 1:5 이상, 약 1.8:1 이상, 약 2:1 이상, 약 3:1 이상, 약 4:1 이상, 약 5:1 이상, 약 6:1 이상, 약 7:1 이상, 또는 약 8:1 이상일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 비율은 약 10:1 이하, 약 9:1 이하, 약 8:1 이하, 약 7:1 이하, 약 6:1 이하, 약 5:1 이하, 약 4:1 이하, 또는 약 2:1 이하 일 수 있다. 상기 범위들의 모든 조합들이 가능하다(예, 약 1.2:1 이상 및 약 10:1 이하, 약 1.5:1 이상 및 약 10:1 이하, 약 2:1 이상 및 약 10:1 이하). 신경돌기의 신장 길이는 실시예 12에서 설명되는 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 신경돌기에게 특정 방향성 또는 배향성을 제공하는 것에 의해 성장을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 전기장 영역에서 성장을 억제하는 전기장 영역일 수 있다. 일부 이런 실시예에서, 전기장 영역을 향한 신경돌기 성장(예, 신장)은 전기장 영역을 회피하기 위하여 성장의 방향을 바꿀 수 있고, 그 결과 신경돌기는 전기장 영역을 마주하기 전 및 마주한 후에 성장 각도에 0이 아닌 상대 변화(non-zero relative change)를 갖는다. 예를 들어, 도 17a에서 보는 바와 같이, 신경돌기는 전기장 영역을 마주하기 전에 제1 성장 배향(202A)을 갖고 전기장 영역을 마주한 후에 제2 성장 배향(202B)을 갖는다. 제1 성장 배향과 제2 성장 배향에 의해 형성된 각도는 0이 아닐 수 있다. 일부 실시예에서, 복수의 신경돌기가 전기장 영역을 마주하기 전과 후에 성장 각도에서의 평균 상대적 변화는 0이 아닐 수 있다. 그와 대조적으로, 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호(도 17a의 제어 영역)의 부재하에서 복수의 신경돌기에 대한 성장 각도의 평균 상대적 변화는 0일 수 있고/있거나 물리적 유도 신호를 마주하는 신경돌기에 비해 현저히 낮은 규모를 가질 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호(예, 교류 전기장)를 마주하기 전후에 복수의 신경돌기에 대한 성장각도의 평균 상대적 변화의 규모는 약 10° 이상, 약 15° 이상, 약 25° 이상, 약 30° 이상, 약 45° 이상, 약 60° 이상, 또는 약 75° 이상일 수 있다. 일부 예에서, 물리적 유도 신호(예, 교류 전기장)를 마주하기 전후에 복수의 신경돌기에 대한 성장각도의 평균 상대적 변화의 규모는 약 90° 이하, 약 85° 이하, 약 80° 이하, 약 75° 이하, 약 60° 이하, 또는 약 45° 이하일 수 있다. 상기 범위들의 모든 조합들도 가능하다(예, 30° 이상 및 90° 이하, 45° 이항 및 90° 이하). 일부 실시예에서, 성장각의 평균 상대적 변화의 규모는 특정 규모의 전기장보다 큰 규모에서 현저히 증가할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 성장각의 평균 상대적 변화의 규모는, 전기장의 규모가 신경돌기의 주변에서 약 100 V/m 이상인 경우에 45° 이상일 수 있다.
일부 예에서, 물리적 유도 신호는 1차원, 2차원 또는 3차원 공간에서 특정 경로를 따라 신경돌기 성장을 지향적으로 유도할 수 있다. 일부 예에서, 신경돌기를 지향적으로 유도하는 것은 기결정된 배향으로 신경돌기 성장을 유도하는 것을 수반한다. 예를 들어, 도 20a에 도해된 바와 같이, 물리적 유도 신호(245)는() xy 평면 상에서 제1 배향(250)으로 성장하는 신경돌기에 가해져서, 신경돌기가 제2 배향(255), 예, z 방향(즉, xz 평면 또는 yz 평면)으로 성장하도록 유도할 수 있다.
특정 실시예에서, 물리적 유도 신호는 신경돌기의 다중-방향으로의 성장에 영향을 미칠 수 있어서, 성장이 하나 이상의 배향으로 변화되도록 한다. 일부 예에서, 신경돌기 성장은 한 번이상 변화될 수 있다. 보통, 신경돌기 성장은 임의의 적절한 횟수로 변화될 수 있다. 예를 들어, 장치는 신경돌기 성장에 동일한 방식 또는 다른 방식으로 영향을 미치는 복수의 물리적 유도 신호를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴런 연결을 형성하기 위한 장치는 신경돌기를 국한시키고/국한시키거나 신경돌기를 가속화시키는 물리적 유도 신호를 포함할 뿐만 아니라 신경돌기의 배향을 제1 배향(예, xz 평면)으로부터 제2 배향(예, yz 또는 xz 평면)dmfh 변화시키는 물리적 유도 신호도 포함한다. 일부 실시예에서, 신경돌기 성장에서의 다중 변화는 뉴런 연결을 형성함 없이도 신경돌기의 제1 군집이 신경돌기의 제2 군집에 겹쳐지도록 하는데에 이용될 수 있다.
일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 연속적일 수 있다. 예를 들어, 상기 신호는 적용하는 도처에서 신경돌기의 성장을 연속적으로 변화시킬 수 있다. 연속적 유도는, 성장 변화의 방식 및/또는 결과가 시간 및/또는 공간에 따라 변화할 수 있기 때문에 정지적 유도와 필수적으로 등가물이 아니라고 이해되어야 할 것이다. 특정 실시예에서, 물리적 유도 신호는 불연속적일 수 있어서, 신호가 시간의 흐름 및/또는 공간에서 변한다. 예를 들어, 교류 전기장(예, 교류 비-균질 전기장)은 전극 쌍들 사이에서 전압을 켜고 끄는 것에 의해 신경돌기 성장을 역으로 억제하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 전극 쌍의 배열은, 시간 및 공간에서 변하는 국부적 전기장을 제공하는 것에 의해 신장을 동적으로 유도하는데에 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 물리적 유도 신호는 전기장에 의해 생산될 수 있다. 전기장은 비-균질 교류 전기장과 같은 교류 전기장, 또는 직류 전기장일 수 있다. 보통, 임의의 유형의 전기장이 사용될 수 있다. 그러나, 특정 실시예에서(예, 전극의 근접부가 폐쇄되는 경우, 전압이 높은 경우), 직류 전기장은 뉴런 및/또는 전극에 해로울 수 있는 과량의 줄 발열 및/또는 전기 분해의 위험성 때문에 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 비-균질 교류 전기장은 직류 전기장에서의 문제점을 극복할 수 있는데, 그 이유는 고주파가 해로운 전기화학적 반응을 최소화하고 줄 발열의 정도를 감소시킬 수 있기 때문이다. 일부 실시예에서, 비-균질 교류 전기장은, 예컨대 균질한 교류 전기장 또는 직류 전기장 대신에, 소정의 물리적 신호를 생성하기 위해 필요할 수 있다.
보통, 전기장은 다양한 메커니즘에 의해 물리적 유도 신호를 생성할 수 있다. 이론에 구속됨 없이, 동전기 현상은 물리적 유도 신호의 발생에 중요한 역할을 담당할 수 있다고 생각된다. 특정 실시예에서, 동전기 현상은 신경돌기 및/또는 그 주변 환경에 동전기력이 가해지도록 한다. 이러한 힘의 특징(예, 근원, 유형, 규모, 방향)은 물리적 유도 신호가 신경돌기 성장을 변화시키는 방식을 좌우할 수 있다. 예를 들어, 수직적 동전기력은 성장 저지를 초래할 수 있는 반면에, 비-수직적 힘은 신경돌기가 그의 배향을 바꾸도록 유발할 수 있다. 특정 실시예에서, 동전기 현상 및 결과로 초래된 힘은 교류(AC) 전기장 및 직류(DC) 전기장에 있어서 다를 수 있다. 다른 실시예에서, 교류 전기장 및 직류 전기장에 대한 동전기 현상 및 결과로 초래된 힘은 실질적으로 동일할 수 있다.
일부 실시예에서, 전기장의 특정 특성(예, 규모, 빈도)은 물리적 유도 신호의 특성에 영향을 미칠 수 있고, 이에 의해 신경돌기 성장의 변화에 영향을 미친다. 예를 들어, 저빈도의 교류 전기장은 주어진 전압하에서 고빈도의 교류 전기장에 비해 더 높은 신경돌기 성장의 억제를 초래할 수 있다. 특정 실시예에서, 특정 범위의 빈도를 갖는 교류 전기장이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 교류 전기장의 빈도는 약 100Hz 이상, 약 500Hz 이상, 약 1,000Hz 이상, 약 5,000Hz 이상, 약 10,000Hz 이상, 약 50,000Hz 이상, 약 100,000Hz 이상, 약 500,000Hz 이상 일 수 있다. 일부 예에서, 교류 전기장의 빈도는 약 10,000Hz 이하, 약 1,000,000Hz 이하, 약 500,000Hz 이하, 약 100,000Hz 이하, 약 50,000Hz 이하, 약 10,000Hz 이하, 약 5,000Hz 이하, 약 1000Hz 이하, 약 500Hz 이하일 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 100Hz 이상 및 약 1,000,000Hz 이하). 다른 값들도 가능하다.
일부 실시예에서, 전기장의 규모는 물리적 유도 신호의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 일 예에서, 역치값은 물리적 유도 신호의 발생에 대해 존재할 수 있어서, 물리적 유도 신호는 특정 규모 미만에서는 발생 되지 않을 수 있다. 보통, 전기장의 규모는 원하는 만큼 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 전기장의 규모는 약 50 V/m 이상, 약 100 V/m 이상, 약 200 V/m 이상, 약 500 V/m 이상, 약 1,000 V/m 이상, 약 5,000 V/m 이상, 약 10,000 V/m 이상, 약 50,000 V/m 이상, 약 100,000 V/m 이상, 약 500,000 V/m 이상일 수 있다. 일부 예에서, 전기장의 규모는 약 1,000,000 V/m 이하, 약 500,000 V/m 이하, 약 100,000 V/m 이하, 약 50,000 V/m 이하, 약 10,000 V/m 이하, 약 5,000 V/m 이하, 약 1,000 V/m 이하, 약 500 V/m 이하, 약 200 V/m 이하일 수 있다. 전술한 범위들의 조합도 가능하다(예, 약 100 V/m 이상 및 약 1,000,000 V/m 이하). 다른 값들도 가능하다.
특정 실시예에서, 전기장을 생성하는 전극의 근접부는 물리적 유도 신호의 특성에 영향을 미칠 수 있다(예, 근접부로의 국부화; 성장이 변화되는 방식). 예를 들어, 작은 중심 간격(예, 1 마이크론)을 갖는 전극 쌍은 신경돌기의 성장 원뿔로 국부화되는 전기장을 가할 수 있는 반면에, 큰 중심 간격(예, 200 마이크론 초과)을 갖는 전극 쌍은 국부화된 전기장을 가할 수 없다. 보통, 전극 상에서 중심 간격은 소정의 결과를 달성하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 전극 사이의 중심 간격은 200 마이크론 미만, 약 150 마이크론 이하, 약 125 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 75 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하, 약 30 마이크론 이하, 약 10 마이크론 이하, 또는 약 1 마이크론 이하일 수 있다. 일부 예에서, 전극들 상에서 중심 간격은 약 0.1 마이크론 이상, 약 1 마이크론 이상, 약 5 마이크론 이상, 약 15 마이크론 이상, 약 30 마이크론 이상, 약 60 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 140 마이크론 이상, 또는 약 180 마이크론 이상일 수 있다. 전술한 범위들의 조합도 가능하다(예, 약 1 마이크론 이상 및 약 100 마이크론 이하). 다른 값들도 가능하다.
특정 실시예에서, 다른 유도 신호의 존재는 물리적 유도 신호의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 물리적 유도 신호는 또 다른 유도 신호(예, 기계적 유도 신호) 때문에 성장의 장벽을 갖는 경로를 따라 신경돌기를 지향적으로 유도할 수 있다. 일부 실시예에서, 다른 유도 신호의 힘은 물리적 유도 신호에 비례하거나 초과할 수 있어서, 이러한 경로를 따른 신경돌기 성장은 억제되거나 저지된다. 특정 실시예에서, 물리적 유도 신호는 신경돌기의 배향을 원래 배향에 비해 훨씬 효율적인 탐침 영역을 갖는 경로로 바꿀 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 신경돌기 성장(예, 신장)은 물리적 유도 신호의 부재하에서 원래 배향으로 성장하는 신경돌기에 비해 억제되거나 늦춰질 수 있다. 예를 들어, 제1 배향으로 나란히 배열된 섬유(예, 콜라겐 섬유)를 포함하는 3차원 스캐폴드에서 제1 배향으로 성장하는 신경돌기는, 신경돌기 성장을 촉진하는 트랙-라인(track-line) 기계적 유도 신호를 제공할 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 신경돌기는 제1 배향에 비해 제2 배향에서 더 느리게 성장할 수 있다.
본원에서 설명한 바와 같이, 하나 이상의 물리적 유도 신호는 하나 이상의 뉴런으로부터 신경돌기의 성장을 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 각각이 적어도 하나의 신경돌기를 갖는 하나 이상의 뉴런이 존재하는 실시예에서, 재구성가능한 물리적 유도 신호는 액손 다이오드(axon diodes), 신경 회로, 및 신경망과 같은 방향성 신경 연결을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 재구성가능한 물리적 유도 신호를 사용하여 방향성 신경 연결을 형성하기 위한 장치(40)의 예는 도 2a에서 보여진다. 일부 실시예에서, 장치(40)는 장치(10)과 유사할 수 있다. 도 2a에서 도해된 바와 같이, 단면으로 보여지는 장치(40)는 챔버(25)내에 위치된 제1 신경돌기(20-1)을 구비한 뉴런(15) 및 챔버(25-2)내에 위치된 제2 신경돌기(20-2)를 구비한 제2 뉴런(15-2)를 함유할 수 있다. 장치는, 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 복수의 챔버(예, 25 및 25-2), 두 개의 챔버를 연결하고 각 뉴런으로부터의 신경돌기가 성장할 수 있는 적어도 하나의 채널(예, 30A), 및 물리적 유도 신호를 발생할 수 있는 전극(35)을 포함한다. 전극(35)은 쌍으로 배열될 수 있다. 예를 들어, 세 개의 전극은 두 개의 전극 쌍을 형성하도록 배열될 수 있고 각각의 전극은 하나 이상의 물리적 유도 신호를 발생시키는 전기장(36)을 생성할 수 있다. 특정 실시예에서, 각 전극 쌍은 자물쇠가 있는 게이트와 같은 기능을 할 수 있다. 게이트는 전압이 전극을 가로질러 가해지는 경우에 폐쇄될 수 있고(즉, 잠기고), 전압의 부재 하에서 개방될 수 있다. 일부 예에서, 도 2a에서 도해한 바와 같이, 전극 쌍은 챔버에 인접한 채널을 교차한다. 다른 예에서, 채널을 갖는 전극의 교차점은 변할 수 있을 뿐만 아니라, 다수의 전극 쌍이 존재한다. 예를 들어, 두개 이상의 전극 쌍은 그의 길이를 따라 임의의 지점에서 채널을 교차할 수 있다. 보통, 전극 쌍의 위치는 원하는 만큼 선택될 수 있다. 또한, 챔버와 채널은 뉴런 세포체가 챔버에 국한되면서 신경돌기가 각각의 채널 안으로 성장할 수 있도록 구성될 수 있다.
하나 이상의 재구성가능한 물리적 유도 신호를 사용하는 지향적으로의 신경 연결의 형성의 예는 도 2b-c에서 보여준다. 도 2b에서 도해한 바와 같이, 평면도로 보인 장치(40)는 제1 챔버(25-1), 제2 챔버(25-2), 및 제3 챔버(25-3) 각각에 보유된 제1 뉴런(15-1), 제2 뉴런(15-2), 및 제3 뉴런(15-3)을 함유한다. 장치는 제1 채널(30-1B), 제2 채널(30-2B), 및 제3 채널(30-3B)를 포함할 수 있고, 그 안에서 각각의 신경돌기는 성장할 수 있다. 일부 실시예에서, 도 2b에서 보인바와 같이, 장치는 각각의 챔버가 단일 채널에 의해 다른 챔버에 연결되어 각각의 챔버가 두 개의 채널에 연결되도록 구성된다. 다른 경우에서, 각각의 챔버는 하나 이상의 채널에 의해 또 다른 챔버에 연결될 수 있다. 도 2b에서 보는 바와 같이, 세 개의 전극(예, 두 개의 게이트)은 챔버에 인접해서 각각의 채널을 교차할 수 있다.
실시예들의 한 세트에 따른, 장치(40)을 사용하여 채널에서 한 방향의 신경 연결을 형성하기 위한 방법은 도 2c-d에서 보여진다. 도 2c는 도 2d의 액손 다이오드 시스템의 이미지 각각에 대해 전기장의 존재("x"로 표시함) 또는 부재("-"로 표시함)를 보여준다. 도 2ci 및 2di에서 보는 바와 같이, 액손 다이오드 형성은 신경돌기가 채널(예, 30-1B)의 각 말단(31 및 32)을 진입하는 경우에 시작된다. 두 개의 전극 쌍(즉, 세 개의 전극)은 각 말단에 인접하여 위치되고 게이트로서 역할을 한다. 단방향 연결을 형성하기 위해서, 전압은 각 말단에서 게이트에 인가되어 게이트를 잠글 수 있다. 일부 실시예에서, 신경 연결의 방향성은 게이트가 먼저 개방되도록(즉, 전압의 제거) 정의된다. 예를 들어, 도 2cii 및 2dii에서 보는 바와 같이, 전압은 전극 인접 말단(32)에 인가된다. 일부 경우에서, 전기장은 신경 과성장을 역으로 저지하거나 억제하는 전극 쌍의 근접하여 물리적 유도 신호를 발생한다. 전압은 전극 인접 말단(31)에 인가되지 않아서, 뉴런은 채널을 통해 성장할 수 있다. 뉴런의 성장 원뿔은 백색 화살표로 표시된다. 신경돌기의 성장 원뿔이 게이트 인접(31)을 모두 지나치고 게이트 인접(32)에 도달하면, 도 2ciii 및 2diii에 보는 바와 같이, 게이트 인접 말단(32)은 개방되고 게이트 인접 말단(31)은 잠긴다. 일부 실시예에서, 게이트 인접 말단(31)은 다른 신경돌기가 채널에서 성장하는 것을 방지하기 위해 잠긴다. 또한, 게이트 인접 말단(32)은 신경돌기가 연결되도록 개방된다. 특정 실시예에서, 액손 다이오드 형성 후에, 모든 게이트는 다른 신경돌기들이 채널에 진입하는 것을 방지하도록 잠긴다. 일부 실시예에서, 이런 개방 및 폐쇄 게이트의 방법은 추가적인 신경 연결을 형성하도록 반복될 수 있다.
하나 이상의 재구성가능한 물리적 유도 신호를 사용하여 방향성 신경망을 형성하는 예는 도 3에서 보여진다. 일부 실시예에서, 장치(40)는 신경망을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 신경망을 형성하기 위해서, 게이트는 전술한 예에서와 같이 개방되고 폐쇄되어, 신경 연결이 챔버(25-1 및 25-2) 및 챔버(25-2 및 25-3) 사이에서 형성된다. 연결은 도 3에서 "X"와 함께 화살표에 의해 표시된 챔버(25-1) 및 챔버(25-3) 사이에서 형성되지 않는다. 특정 실시예에서, 연결은 도 3에서 보는 바와 같이 단일-방향성일 수 있다. 연결의 방향은 화살표로 표시되고 반대 방향으로의 방향성 연결의 결핍은 "X"와 함께 화살표로 표시된다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 유도 신호(예, 물리적 및 비접촉 유도 신호)는 2차원 및/또는 3차원으로 신경돌기 성장을 유도하여 복잡한 신경망을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나 이상의 유도 신호는 제1 신경돌기 또는 신경돌기들의 군집이 예컨대 유도 신호(예, 물리적 및 비접촉 유도신호)를 사용하여 제2 신경돌기 또는 신경돌기들의 군집에 겹쳐지도록 하는데에 사용될 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 하나 이상의 유도 신호의 사용은, 겹침 영역에서 상대적으로 적은 신경 연결을 형성하거나 신경 연결을 형성함 없이 신경돌기들이 겹쳐지도록 한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 겹침 영역에서 제2 군집 중에 신경돌기들과 연결을 형성하는 제1 군집 중에 신경돌기들의 퍼센트는 약 10% 이하, 약 8% 이하, 약 5% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.75% 이항, 약 0.5% 이하, 약 0.25% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.01% 이하, 또는 약 0.001% 이하일 수 있다.
특정 실시예에서, 신경돌기들의 제1 군집은 신경돌기들의 제2 군빚과 3차원 스캐폴드 내에서 겹쳐질 수 있다. 일부 이러한 경우에서, 유도 신호는 비-접촉 물리적 유도 신호(예, 전기장)일 수 있다. 일부 실시예에서, 유도 신호를 생성하는데 사용된 물건은 3차원 스캐폴드 내에 함유되지 않을 수 있다. 예를 들어, 유도 신호가 전기장인 실시예에서, 전기장을 생성하는데에 사용된 전극은 스캐폴드 내에 함유되지 않을 수 있다. 다른 실시예에서, 전기장을 생성하기 위해 사용된 전극은 스캐폴드 내에 함유될 수 있다.
두 개 이상의 신경돌기들이 겹쳐지는 영역을 형성하기 위한 장치는 도 21f에서 보여진다. 일부 실시예에서, 장치는 하나 이상의 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진하도록 구성되고 배열되며 제1 채널(305)에 연결되는 제1 챔버(300)를 함유할 수 있다. 장치는 제1 채널의 적어도 일부와 나란히 배열된 제1 전극 쌍(310)을 함유할 수 있고, 여기서 제1 전극 쌍의 일부는 제1 챔버의 적어도 일부와 겹쳐진다. 특정 경우에서, 제1 전극 쌍에서 적어도 하나의 전극(예, 전극들 각각)은 도 1e에 도해된 바와 같이 적어도 제1 챔버의 일부와도 겹쳐지는 또 다른 전극과 쌍을 형성할 수 있다. 장치는 하나 이상의 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진하도록 구성되고 배열되며 제2 채널(325)에 연결되는 제2 챔버(320)도 함유한다. 일부 예에서, 장치는 적어도 제2 채널의 일부와 나란히 배열된 제2 전극 쌍(330)을 함유한다. 적어도 제2 전극 쌍의 일부는 적어도 제2 챔버의 일부와 겹쳐진다. 특정 경우에서, 제2 전극 쌍 중에 적어도 하나의 전극(예, 전극들 각각)은 도 1e에 도해된 바와 같이 적어도 제1 챔버의 일부와도 겹쳐지는 또 다른 전극과 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시예에서, 겹침 영역에서 채널의 높이는 하기 더 구체적으로 설명하는 바와 같이 3차원에서 신경돌기 성장이 이루어지도록 충분히 높을 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 채널은 약 20 마이크론 이상 및 약 1000 마이크론 이하(예, 약 20 마이크론 이상 및 약 500 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이상 및 약 1000 마이크론 이하, 약 20 마이크론 이상 및 약 50 마이크론 이하)의 높이를 갖는 겹침 영역에서 교차할 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 제1 및 제2 채널의 일부는 하기 더 구체적으로 설명되는 바와 같이 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있다. 일부 예에서, 전체 제1 및 제2 채널은 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있다.
일부 실시예에서, 도 21f에서 도해되는 바와 같이, 제2 전극 쌍은 제1 채널과 겹쳐지는 제2 채널의 일부에서 불연속적일 수 있다. 일부 이러한 경우에서, 제2 전극 쌍은, 제1 전극 쌍이 제2 쌍의 전극들 중 적어도 하나에서 교차하거나 겹쳐지는 것과 동시에 채널이 교차하는 영역을 가로지를 수 있도록 하는 갭(335)을 가질 수 있다.
특정 실시예에서, 장치는 신경 연결을 형성함 없이 신경돌기가 겹쳐지도록 하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 뉴런(예, 뉴런의 제1 군집)은 제1 챔버에 도입되고, 하나 이상의 뉴런(예, 제2 군집)은 제2 챔버에 도입된다. 채널은 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있으며, 그 결과 채널 내에서의 신경돌기 신장은 스캐폴드 내에서 발생한다. 일부 실시예에서, 제1 챔버와 겹쳐지는 전극들 중 일부는 신경돌기가 제1 채널을 향해 신장하여 전극 쌍 사이의 영역 안으로 유도될 수 있다. 일부 예에서, 전극들 사이의 스캐폴드 영역 안으로 신장하는 신경돌기는 전극 쌍에서 하나 이상의 전극을 가로지르는 것이 제한될 수 있다. 이론에 구속됨 없이, 전극의 모서리 주변에서의 전기장은 신경돌기가 전극 쌍의 외부 영역에서 신장하는 것을 억제하고 방지한다. 일부 이러한 경우에서, 신경돌기는 전극들 사이의 스캐폴드 영역 내에서 신장하도록 구속되고, 일부 예에서, 하나 이상의 전극에 실질적으로 평행한 방향으로 신장하도록 구속된다. 일부 실시예에서, 제1 전극 쌍은 적어도 신경돌기의 일부를 제1 챔버로부터 제1 전극 쌍의 말단(예, 위치(340))을 향하도록 지향적으로 유도하는 역할을 한다. 전극은 3차원 스캐폴드 내에 있지 않을 수 있고, 전극들 사이의 영역은 전극 사이에 있지만 전극에 물리적으로 접촉할 필요가 없는 3차원 공간을 지칭할 수 있다.
제2 챔버와 겹쳐지는 전극의 일부는 신경돌기가 제2 채널을 향해 신장하여 전극 쌍 사이의 영역 안으로 신장하도록 유도하고, 신경돌기의 성장을 전극들 사이의 영역으로 구속할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 채널에서의 신경돌기는 겹침 영역으로 신장하여, 제1 전극 쌍으로부터의 전기장(예, 교류 전기장)과 마주할 수 있다. 제1 전극 쌍에 의해 생성된 전기장은 고 전기장 영역(예, 제1 전극으로부터의 전기장의 규모가 약 100 V/m 이상)에서 신경돌기 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시예에서, 제2 채널에서의 신경돌기는 제1 전극 쌍에 의해 생성된 고 전기장 영역을 피하도록 배향을 바꿀 수 있다. 예를 들어, 신경돌기는 그의 배향 중 z-축 성분을 도 20a에서 도해한 바와 같이 고 전기장을 피하도록 바꿀 수 있다. 이론에 구속됨 없이, z-축 변화는 제1 채널에서의 신경돌기와 제2 채널에서의 신경돌기 사이의 접촉을 방지하여, 신경 연결의 형성을 방지하는 것으로 생각된다. 특정 실시예에서, 제2 전극 쌍의 일부는 제1 전극 쌍 위로의 신경돌기의 신장 방향의 x-축 및 y-축 성분에 지속적으로 영향을 미칠 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 신경돌기가 제1 전극 쌍을 지나 연장한 후, 신경돌기는 제2 전극 쌍의 사이의 영역에서 지속적으로 신장 및/또는 다시 이동된다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 유도 신호는 신경돌기의 제1 및 제2 군집의 지향적 유도 신장을 위해 사용되어, 유도 신호(예, 물리적 유도 신호)를 사용하여 신경돌기의 제1 및 제2 군집 사이에서 신경망을 형성한다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 유도 신호는 신경돌기의 제1 및 제2 군집의 3차원 스패폴드 내에서 신경돌기 신장을 지향적 유도하기 위해 사용되어, 신경망을 형성할 수 있다. 일부 이러한 경우에서, 유도 신호는 비-접촉 물리적 유도 신호(예, 전기장)일 수 있다. 일부 실시예에서, 유도 신호를 생성하는데 사용된 물체는 3차원 스캐폴드 내에 함유되지 않을 수 있다. 예를 들어, 유도 신호가 전기장인 실시예에서, 전기장을 생성하기 위해 사용된 전극은 스캐폴드 내에 함유되지 않을 수 있다. 다른 실시예에서, 전기장을 생성하기 위해 사용된 전극은 스캐폴드 내에 함유될 수 있다.
두 개 이상의 신경돌기가 겹쳐지는 영역을 형성하기 위한 장치의 비-제한 예는 도 21g에서 보여진다. 일부 실시예에서, 장치는 하나 이상의 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진하도록 구성되고 배열된 제1 챔버(400) 및 제2 챔버(405)에 연결된 채널(402)를 함유할 수 있다. 장치는 적어도 제1 채널의 일부와 나란히 배열된 제1 전극 쌍(410)도 포함할 수 있다. 제1 전극 쌍은 적어도 제1 챔버의 일부와 겹쳐질 수 있고, 상기 전극 쌍 사이의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하(예, 약 150 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하)이다. 특정 실시예에서, 제1 전극 쌍은 적어도 제2 챔버의 일부와 겹쳐질 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 제1 채널의 일부는 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있다. 일부 예에서, 전체 제1 채널은 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있어서, 신경돌기의 성장은 스캐폴드 내에서 발생한다. 특정 경우에서, 제1 전극 쌍 중에 적어도 하나의 전극(예, 각각의 전극)은, 도 1e에 도해한 바와 같이, 적어도 제1 챔버의 일부와도 겹쳐지는 또 다른 전극과 쌍을 형성할 수 있다.
특정 실시예에서, 장치는 유도 신호(예, 교류 전기장)를 사용하여 신경돌기들 사이에서 신경망을 형성하도록 신경돌기의 신장을 지향적 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 뉴런(예, 뉴런의 제1 군집)은 제1 챔버에 도입되고, 하나 이상의 뉴런(예, 제2 군집)은 제2 챔버에 도입된다. 채널은 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있어서, 채널 내에서의 신경돌기 신장은 스캐폴드에서 발생한다. 일부 실시예에서, 제1 챔버와 교차하는 전극들의 일부는 신경돌기가 제1 채널을 향해 전극 쌍 사이의 영역 안으로 신장하도록 유도할 수 있다. 일부 실시예에서, 제2 챔버에서 하나 이상의 뉴런으로부터 신장하는 하나 이상의 신경돌기는 제1 전극 쌍 사이의 영역 내에서 신장할 수 있다. 제1 전극의 일부가 제2 챔버와 겹쳐지는 실시예에서, 제2 챔버와 겹쳐지는 제1 전극의 일부는 신경돌기가 전극 쌍 사이의 영역 안으로 향해 신장하도록 유도하고 신경돌기의 성장을 전극들 사이의 영역으로 국한 시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 제1 채널에서 제1 챔버로부터 신장하는 하나 이상의 신경돌기 및 제2 챔버로부터 신장하는 하나 이상의 신경돌기는 제1 채널에서 만나서 신경망을 형성할 수 있다.
보통, 임의의 적합한 뉴런으로부터의 신경돌기는 임의의 다른 적절한 뉴런으로부터의 신경돌기와 겹쳐지거나 신경 연결을 형성할 수 있다. 상이한 뉴런으로부터(예, 상이한 세포체, 상이한 뉴런 유형, 상이한 뉴런의 부류 등)의 신경돌기 또는 동일한 뉴런(예, 상이한 세포체, 상이한 뉴런 유형, 상이한 뉴런의 부류 등)이 사용될 수 있다고 이해되어야 한다.
본원에서 설명한 바와 같이, 전기적 신호는 생세포(예, 뉴런)를 배양할 수 있는 장치에 인가될 수 있다. 일부 실시예에서, 장치는 생세포의 유지 및 성장에 도움이 되는 환경(예, 인큐베이터)에 놓여지고, 그 장치에 전기적 신호를 인가할 수 있는 시스템에 연결되어야 할 지도 모른다. 본원에서 설명한 바와 같이, 세포 유지 및 성장에 도움이 되는 환경에서, 장치에 전기적 신호를 제공할 수 있는 시스템은 도 4에서 보여진다. 일부 실시예에서, 도 4에서 보는 바와 같이, 전기적 신호는, 하나 이상의 전극에 전기적 신호를 유지 및/또는 경로 재설정하고 전기적 신호를 발생시킬 수 있는 회로-기판 스택(circuit-board stack)(125) 에 연결되는 커넥터(124)를 사용하여 칩(123) 상에서 장치에 인가될 수 있다. 특정 실시예에서, 스택(125)은 전체 스택을 조정하는 미니컴퓨터(121)에 연결될 수 있다. 일부 경우에서, 미니컴퓨터는 스택의 작동(예, 장치에서 전극을 가로지르는 전기적 신호의 적용 및 유지)을 자체적으로 제어할 수 있다. 일부 예에서, 웹 서버와 같은 장치는 미니컴퓨터 상에 설치될 수 있어서, 각 전극들에 대한 파라미터(예, 전압, 빈도)는 실시간으로 원격으로 바꿀 수 있다(예, 인터넷(120)을 통함, 원격 컴퓨터 연결을 통해 등).
본원에서 설명한 바와 같이, 다른 구성들 중 채널, 챔버 및 전극들을 포함하는 장치는, 물리적 유도 신호를 사용하여 신경돌기 성장의 변화 및 신경 연결의 형성에서 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 장치 구성들의 특징(예, 크기, 제작 물질, 배열)은 장치의 작동에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신경돌기 성장을 변화시키기 위하여, 장치는 하나 이상의 구성(예, 챔버, 채널, 전극)을 가질 수 있다. 특정 경우에서, 장치는 미세유동 장치(microfluidic device)일 수 있다. 보통, 장치 구성들의 특징은 원하는 바에 따라 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 채널 또는 채널과 전극의 교차각은 약 0° 이상, 약 15° 이상, 약 45° 이상, 약 90° 이상, 약 135° 이상, 또는 약 150° 이상일 수 있다. 일부 예에서, 각은 180° 이하, 약 150° 이하, 약 115° 이하, 약 90° 이하, 약 60° 이하, 또는 약 30° 이하일 수 있다. 전술한 범위들의 조합도 가능하다(예, 약 0° 이상 및 약 135° 이하). 다른 값들도 가능하다. 특정 실시예에서, 전극은 다른 전극과 다른 각도로 채널을 교차할 수 있다. 반대로, 전극은 다른 전극과 동일한 각도로 채널을 교차할 수 있다. 일부 실시예에서, 전극은 다른 채널과의 각도와 다른 각도로 채널과 교차할 수 있다. 다른 예에서, 전극은 다른 채널과 동일한 각도로 채널을 교차할 수 있다.
다른 실시예에서, 챔버의 크기는 원하는 바에 따라 선택될 수 있다. 챔버가 임의의 적절한 단면 크기를 가질 수 있다고 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 챔버는 약 2,000 마이크론 이하, 약 1,000 마이크론 이하, 약 750 마이크론 이하, 약 600 마이크론 이하, 약 500 마이크론 이하, 약 300 마이크론 이하, 약 200 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하, 약 25 마이크론 이하, 약 10 마이크론 이하, 또는 약 5 마이크론 이하의 최대 단면 크기를 가질 수 있다. 일부 예에서, 챔버는 약 0.01 마이크론 이상, 약 0.1 마이크론 이상, 약 1 마이크론 이상, 약 5 마이크론 이상, 약 10 마이크론 이상, 약 20 마이크론 이상, 약 50 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 400 마이크론 이상, 약 600 마이크론 이상, 약 900 마이크론 이상, 또는 약 1,500 마이크론 이상의 최대 단면 크기를 가질 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 1 마이크론 이상 및 약 1,000 마이크론 이하). 최대 단면 크기의 다른 값도 가능하다.
일부 경우에서, 챔버의 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 단면 크기(예, 높이 및 폭)는 약 750 마이크론 이하, 약 500 마이크론 이하, 약 300 마이크론 이하, 약 200 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하, 약 20 마이크론 이하, 약 10 마이크론 이하, 또는 약 5 마이크론 이하일 수 있다. 일부 예에서, 챔버의 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 단면 크기는 약 0.01 마이크론 이상, 약 0.1 마이크론 이상, 약 1 마이크론 이상, 약 5 마이크론 이상, 약 10 마이크론 이상, 약 25 마이크론 이상, 약 50 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 400 마이크론 이상, 또는 약 600 마이크론 이상일 수 있다. 전술한 범위들의 조합도 가능하다(예, 약 10 μm 이상 및 약 500 μm 이하). 다른 값들도 가능하다.
챔버는 특정 폭-대-높이 비를 가질 수 있다. 특정 예에서, 챔버의 폭 대 높이의 비는 약 1:1 이상, 약 2:1 이상, 약 5:1 이상, 약 10:1 이상, 약 15:1 이상, 약 20:1 이상, 약 50:1 이상, 약 100:1 이상, 약 200:1 이상, 약 300:1 이상, 또는 약 400:1 이상일 수 있다. 일부 예에서, 폭-대-높이 비는 약 500:1 이하, 약 400:1 이하, 약 300:1 이하, 약 200:1 이하, 약 100:1 이하, 약 50:1 이하, 약 20:1 이하, 약 15:1 이하, 약 10:1 이하, 약 5:1 이하, 또는 약 2:1 이하일 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 1:1 이상 및 약 20:1 이하). 다른 값도 가능하다.
챔버는 또한 적어도 2:1의 종횡비(최대 평균 단면 크기에 대한 길이), 더 구체적으로 적어도 3:1, 8:1, 또는 20:1의 종횡비를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 채널, 채널 세그먼트, 또는 채널 일부는 매우 큰 종횡비, 예컨대, 적어도 100:1, 500:1, 또는 1000:1을 갖는다.
일부 실시예에서, 챔버는 약 1mm 이상, 약 5mm 이상, 약 10mm 이상, 약 20mm 이상, 약 40mm 이상, 약 60mm 이상, 또는 약 80mm 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 길이는 약 100mm 이하, 약 90mm 이하, 약 70mm 이하, 약 50mm 이하, 약 30mm 이하, 또는 약 10mm 이하일 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 1mm 이상 및 약 100mm 이하). 길이의 다른 값들도 가능하다.
일부 실시예에서, 채널의 크기는 원하는 바에 따라 선택될 수 있다. 일부 실시예에서, 채널의 높이는 전기장의 존재 또는 부재하에서 성장하는 뉴런의 배향에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 채널의 높이는 신경돌기 성장이 2차원 또는 3차원 평면에 구속되도록 유발할 수 있다. 일 예에서, 채널의 높이는 상대적으로 작을 수 있어서(예, 약 10 마이크론 이하, 약 5 마이크론 이하), 성장 원뿔은 공간적으로 구속되고 3차원적으로 성장할 수 없고, 예컨대 z 방향을 따라서 제한된다. 일부 예에서, 채널의 높이는 상대적으로 클 수 있어서(예, 약 50 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 300 마이크론 이상, 약 1000 마이크론 이상), 성장 원뿔은 공간적으로 구속되지 않고 3차원적으로 성장할 수 있다.
채널은 임의의 적절한 단면 크기를 가질 수 있다고 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 채널은 약 1cm 이하, 약 5000 마이크론 이하, 약 2000 마이크론 이하, 약 1000 마이크론 이하, 약 500 마이크론 이하, 약 300 마이크론 이하, 약 200 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하, 약 5 마이크론 이하, 약 2 마이크론 이하, 또는 약 1 마이크론 이하의 최대 단면 크기를 가질 수 있다. 일부 예에서, 채널은 약 0.1 마이크론 이상, 약 1 마이크론 이상, 약 5 마이크론 이상, 약 10 마이크론 이상, 약 25 마이크론 이상, 약 50 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 300 마이크론 이상, 약 500 마이크론 이상, 약 1000 마이크론 이상, 약 2000 마이크론 이상, 또는 약 5000 마이크론 이상의 최대 단면 크기를 가질 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 1 마이크론 이상 및 약 2000 마이크론 이하). 최대 단면 크기의 다른 값들도 가능하다.
일부 경우에서, 채널의 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 단면 크기(예, 높이, 높이 및 폭)는 약 2000 마이크론 이하, 약 1000 마이크론 이하, 약 500 마이크론 이하, 약 300 마이크론 이하, 약 200 마이크론 이하, 약 100 마이크론 이하, 약 50 마이크론 이하, 약 30 마이크론 이하, 약 20 마이크론 이하, 약 10 마이크론 이하, 약 5 마이크론 이하, 약 2 마이크론 이하, 또는 약 1 마이크론 이하일 수 있다. 일부 예에서, 채널의 적어도 하나 또는 적어도 두 개의 단면 크기는 약 0.01 마이크론 이상, 약 0.1 마이크론 이상, 약 1 마이크론 이상, 약 5 마이크론 이상, 약 10 마이크론 이상, 약 25 마이크론 이상, 약 50 마이크론 이상, 약 75 마이크론 이상, 약 125 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 300 마이크론 이상, 약 500 마이크론 이상, 또는 약 1000 마이크론 이상일 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 0.1 마이크론 이상 및 약 10 마이크론 이하, 약 1 마이크론 이상 및 약 2000 마이크론 이하). 다른 값들도 가능하다.
채널은 특정 폭-대-높이 비를 가질 수 있다. 특정 예에서, 채널의 폭 대 높이의 비는 약 1:1 이상, 약 1.6:1 이상, 약 3:1 이상, 약 5:1 이상, 약 10:1 이상, 약 15:1 이상, 또는 약 20:1 이상일 수 있다. 일부 예에서, 폭-대-높이 비는 약 30:1 이하, 약 20:1 이하, 약 15:1 이하, 약 10:1 이하, 약 5:1 이하, 또는 약 2:1 이하일 수 있다. 전술한 범위의 조합도 가능하다(예, 약 1:1 이상 및 약 20:1 이하). 다른 값들도 가능하다.
채널은 또한 적어도 50:1의 종횡비(최대 평균 단면 크기에 대한 길이), 더 구체적으로 적어도 75:1, 90:1, 또는 150:1의 종횡비를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 채널은 매우 큰 종횡비, 예컨대, 적어도 200:1, 500:1, 또는 1,000:1, 또는 10,000:1의 종횡비를 갖는다.
일부 실시예에서, 채널은 약 50 마이크론 이상, 약 100 마이크론 이상, 약 200 마이크론 이상, 약 400 마이크론 이상, 약 600 마이크론 이상, 또는 약 800 마이크론 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 길이는 약 1,000 마이크론 이하, 약 750 마이크론 이하, 약 450 마이크론 이하, 약 250 마이크론 이하, 약 150 마이크론 이하, 또는 약 75 마이크론 이하일 수 있다. 전술한 범위들의 조합도 가능하다(예, 약 100 마이크론 이상 및 약 750 마이크론 이하). 길이의 다른 값들도 가능하다.
일부 실시예에서, 적어도 채널의 일부는 3차원 스캐폴드로 채워질 수 있다. 3차원 스캐폴드는 생세포 또는 생세포의 일부를 보유하고 세포 성장 및 발달(예, 신경돌기 성장)을 촉진할 수 있다. 일부 실시예에서, 3차원 스캐폴드는 다중 차원(예, 3차원)에서 신경돌기 성장을 용이하게 할 수 있다. 보통, 스캐폴드는 생세포 또는 생세포의 일부를 보유하고 세포 성장 및 발달을 촉진할 수 있는 임의의 적절한 물질로부터 형성될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 적합한 스캐폴드 물질을 알 수 있을 것이다. 적합한 스캐폴드 물질의 비-제한 예는 콜라겐, 라미닌, 폴리사카라이드, 폴리펩티드, 겔 매트릭스, 세포외 착물(예, 매트리겔), 매트릭스 단백질(예, 피브로넥틴, 겔라틴), 히드로겔, 엘라스틴, 테나신, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 성장 인자, 및 그의 조합을 포함한다.
일부 실시예에서, 적어도 채널의 한 표면의 일부는 분자로 관능화될 수 있다. 일부 실시예에서, 분자는 뉴런 및/또는 신경돌기의 성장을 변화시킬 수 있고/변화시킬 수 있거나 표면의 일부에 뉴런 및/또는 신경돌기의 결합을 변화시킬 수 있다. 일부 예에서, 분자는 세포체 또는 신경돌기 성장 및/또는 결합을 강화(예, 가속화)할 수 있다. 다른 예에서, 분자는 세포체 또는 신경돌기 성장 및/또는 결합을 감소시킬 수 있다. 특정 경우에서, 분자는 화학적 유도 신호일 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 본원에서 제공된 내용에 기초하여 적합한 분자에 대한 지식을 가지고 있을 것이다.
일부 실시예에서, 뉴런 또는 생세포는 해마 뉴런(hippocampus neurons), 후근 신경절(dorsal root ganglion), 망막 신경절 뉴런(retinal ganglion neurons), 골지 I 뉴런(Golgi I neurons), 골지 II 뉴런(Golgi II neurons), 농세포(basket cells), 베츠 세포(betz cells), 루가로 세포(lugaro cells), 중간 가시 뉴런(medium spiny neurons), 푸르킨예 세포(purkinje cells), 렌쇼세포(renshaw cells), 단극 브러쉬 세포(unipolar brush cells), 과립 세포(granule cells), 전각 세포(anterior horn cells), 운동 뉴런(motoneurons), 방추 세포(spindle cells), 가단극성 뉴런(pseudounipolar neurons), 다극성 뉴런(multipolar neurons), 중간 뉴런(interneurons), 운동 뉴런(motor neurons), 감각 뉴런(sensory neurons), 성세포(stellate cells), 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
하기 참조는 모든 목적을 위해 참조로서 그 전부가 본원에 포함된다: 2013년 1월 14일에 출원된, 발명의 명칭 "Electrokinetic Confinement of Neurite Growth for Dynamically Configurable Neural Networks"의 미국 가출원번호 61/752,183
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 도해하기 위한 의도일 뿐, 본 발명의 전체 범위를 예시하지는 않는다.
실시예 1
이 실시예는 배양된 래트 해마 뉴런에서 액손 성장을 동적으로 제어하기 위한 교류 전기장의 사용을 설명한다. 대략 105 Hz의 빈도에서 보통 전압의 적용은 전극에 인접한 액손의 발달을 멈추도록 유도할 수 있지만, 전기장으로부터 멀어진 액손은 무억제 성장을 보인다. 전극을 온(on) 또는 오프(off)로 전환하는 것에 의해, 전극을 가로지르는 액손 경로는 역으로 억제되거나 허용될 수 있다.
교류 동전기력이 액손 성장에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 두 개의 넓은 미세유체 챔버로 구성되고 그 중 하나에서 뉴런이 배양되는, 액손 단리 장치에 기반한, 도 1a 및 5a-b에서 보여진, 미세유체 플랫폼이 개발되었다. 두 개의 챔버는 액손 과성장이 1차원에 구속되는 평행 마이크로채널의 배열에 의해 연결되었다. 마이크로채널 내에 교류 전기장의 적용을 허용하기 위하여, 미세유체 플랫폼은 서로 맞물려있는 금 전극(15μm 간격으로 15μm 폭)으로 기-패턴화된 유리에 결합되었다. 전극이 마이크로채널에 수직으로 진행하도록 유리 및 PDMS를 결합시키는 것에 의해, 교류 동전기력은 채널에 평행하게 작용하여 1차원 액손 성장을 차단하도록 적용될 수 있다.
배양 챔버에 뉴런을 첨가함에 따라, 마이크로채널에 진입하는 많은 신경돌기들과 함께 대규모의 신경돌기 과성장이 시험관내에서(DIV) 4일동안 발생했다(도 5a). 도 1a는 미세유체 뉴런 동전기 플랫폼의 장치의 예시적인 단면을 보여준다. 도 5a는 4일째에 시험관 내에서 장치에서 성장하는 뉴런의 이미지이다. 도면에서 기준자는 50 마이크론이다. 도 5b는 4-웰 인터페이스 및 전기 인터페이스를 보여주는 사진이다. 기준자는 1cm이다.
교류 신호가 전극에 인가된 다음에, 액손 성장은 모니터링된다. 전극과 교차하지 않은 마이크로채널에서, 액손은 마이크로채널의 길이를 통해 성장한다(도 1c-d). 그러나, 전극을 구비한 마이크로채널 내에 액손은 전기장이 인가되는 경우에 전극에서 성장을 멈추었다(도 1c). 전기장이 일단 꺼지면, 액손은 마이크로채널을 통해 그들의 성장을 재개하였으며(도 1d), 이는 그들이 아직 생존해있다는 것을 나타낸다. 교류 전기장이 액손 성장에 미치는 영향을 정량하기 위하여, 교류 신호의 빈도 및 전압 진폭 모두는 7일동안 시험관 내에서 적용 후에 변화되었다. 빈도는 100 kHz ~ 1 MHz의 범위로 제한되고 전압은 0~3 Vp -p로 제한되어, 현저한 온도 증가(△T~σV2/k, σ는 배지 전기 전도도이고, k는 그의 열전도도이며, 여기서, 최대 전압에서 세포 배양 배지에서 △T~7℃) 또는 고-전도도 해마 배양 배지에서의 전기분해(σm = 0.98±0.08S/m로 측정됨)를 회피했다. 교류 신호의 빈도 및 전압 모두는 액손 길이에 현저한 영향을 미쳤고, 낮은 빈도의 경우에는 주어진 전압에서 액손 과성장의 높은 억제를 초래했다(도 6).
도 1c는 시험관 내 4일째에, 수직으로 맞물린 전극들을 구비한 마이크로채널 내에서 액손 성장의 가색(false-color) 이미지이다. 뉴런은 생-세포 시각화 목적을 위하여 튜불린-GFP 배큘로바이러스로 접종되었다. 폐쇄 화살표는 마이크로채널을 통해 성장하는 전극을 구비하지 않은 대조군 채널 내의 액손을 지시한다. 개방 화살표는 전극 모서리에서 멈추는 전극을 구비한 마이크로채널 내에 액손을 지시한다. 빈도는 100 kHz이었고, 전압은 2 V였다. 기준자는 150 마이크론이다. 도 1d는 4일간 시험관 내에서 전기장의 적용 후, 시험관 내 6일째에서 액손 성장의 형광 가색 이미지이다. 폐쇄 화살표는 액손의 말단을 지시한다. 도 6은 전압 온(ON) 상태의 칩에서 7일 배양 후, 액손 길이 vs 전압의 표준화 그래프이다(***: p<0.001). 도면에서, n은 두 개의 독립적인 반복 실험으로 측정된 액손의 수를 나타낸다.
도 7은 대조 실험군(전기장 적용 없음) 및 AC 동전기 효과에 의해 차단된 액손에 관한 플랫폼에서 시간에 따른 액손의 길이를 보여준다. 제1 전극까지의 거리 및 채널의 말단까지의 거리는 형광색으로 강조된다. 주 몸체 구획으로부터의 액손은 약 3일에서 제1 전극에 도달하는 반면에, 교류 차단으로부터 액손을 해방시킨 후 액손 신장은 1일 미만의 시간이 걸린다. 이런 결과는 시험관 내에서 4일 및 6일 사이에서 관찰된 액손 신장이 차단된 액손 신장으로부터의 결과이고 세포체 구획으로부터 성장하는 새로운 수상 돌기로부터의 결과가 아니라는 것을 강하게 시사한다.
도 8은 (배양 배지에서 1 mM의 농도에서) 온도-의존성 형광 강도를 갖는 형광단, 로다민 B를 사용하여 전극 주변에서 온도의 측정값을 보여준다. 도 8a는 전극 주변에서 로다민 B의 가색 이미지이다. 색은 온도의 공간 분포를 나타낸다. 로다민 B 형광 강도는 온도가 증가함에 따라 감소하여, 어두운 색 영역은 오렌지 색 영역에 비해 더 높은 온도를 지시한다. 따라서, 전극이 없는 미세유체 챔버(영역 1)는 오렌지색(차가움)인 반면에, 전극을 구비한 마이크로채널(영역 3)은 적색(따뜻함)이다. 가장 높은 온도 영역은 전극이 PDMS(영역 2)에 결합되는 곳으로 볼 수 있고, 더 구체적으로 그루브에서, 그리고 액손이 전압 > 3.5 Vp -p에서 더 이상 성장하지 않는 것으로 발견되는 전극에 매우 인접한 곳(영역 2의 좌측)에서 볼 수 있다. 기준자는 50 마이크론을 나타낸다. 도 8b는 추출 온도들의 플롯이다. 주어진 빈도에서 5초동안 전압을 가하고, 각 지점은 세 개의 다른 서로 맞물린 전극들로 이루어진 TRITC 필터 세트로 이미지를 찍은 것(500 ms 노출시간, 고정 카메라)에 있고, 각 온도-제어된 단계는 37.5℃로 세팅된다. 각 이미지에 대하여, 240 x 480 마이크론으로부터의 형광 강도(영역 2)는 공간적으로 그리고 세 개의 전극을 가로질로서 평균냈고, 검정선과 비교했다. 보정은 로다민 B 형광 강도의 온도 의존성을 결정하기 위해 핫플레이트를 사용하여 수행되었으며, 이를 통해 문헌에서 관찰된 것과 부합하는 측정 기울기를 얻었다(-1.3%/℃). 측정 온도는 빈도에 독립적이며, 줄 발열로 예상되는 전압과 함께 선형적으로 증가한다.
실시예 2
이 실시예는 신경돌기의 성장 원뿔에 영향을 미치는 동전기의 모델링에 대해 설명한다. 이론에 구속됨 없이, 모델은 유전영동이 물리적 유도 신호를 야기하는 사역 교류 동전기 효과라는 것을 시사한다.
동전기 효과의 메커니즘은 어떤 유형의 교류 동전기 현상이 도 1d의 결과에 부합하는지를 결정하는 것에 의해 파악될 수 있다. 성장 원뿔 상에서 작용하는 상이한 교류 동전기력은 모델링되었다.
성장 원뿔은 폭에 비해 10배 작은 액손에 연결된 유리 표면에 근접하여 타원체로 형상화되었고, 그의 많은 부분은 그의 성장을 조정하는 액틴 필라멘트로 구성된다. 성장 원뿔은 세 개의 쉘(shell)로 구성된 코어-쉘 편원 물체로 모델링되었다(도 9): (1) 액틴층(폭 a = 2μm, 높이 b = 200 nm), (2) 세포질층(균질 높이 dcyt = 300nm) 및 (3) 세포막(균질 높이 dmem = 10nm). 이 물체의 특징 길이는 a1=b+dmem 및 a2=a3=a+dcyto+dmem이었다. 이런 분극성 물체는 3개의 힘에 노출되었다: 순수 유체(즉, 입자의 부재하에서) 상에서 작용하는 전기유체역학 힘인 교류 전기삼투(ACEO) 및 전열 효과(ETE), 및 성장 원뿔 그 자체 상에서 작용하는 유전영동(DEP).
ACEO는 AC 신호가 인가되는 경우에 전극 표면 근처에서 발생된 유동을 지칭한다. 상기 유동은 접선 전기장 및 유도 이중층 전하의 산물이 최대에 도달하는 빈도에서 최대가 되는 빈도-의존성 유동이다. 공-평면 전극 ACEO을 모델링하는 종래 방법에 이어서, 전극 상에서 시간-평균 ACEO 속도(<u ACEO >)는 하기 식으로 주어지며, 여기서 Ω ACEO 는 무차원 빈도이고, ε m 은 배지의 유전율이고, σ m 은 배지 전도도이고, V 0 은 전극에 가해진 전위이고, r은 힘이 평가되는 극좌표이고(여기서 r은 성장 원뿔의 절반 길이로 세팅된다), λ d 는 전해질/전극 인터페이스의 디바이(Debye) 길이이고, ω는 교류 신호의 빈도이다.
Figure pct00001
두 번째로, 전열 흐름은 전기장이 배지에 가해지고 줄 발열이 유발되는 경우에 유도될 수 있다. 비-균질한 전기장(이 경우에)에 대하여, 열 발생에서 공간적 변화가 있을 것이며, 이는 국부적인 유전율 및 전도도에 공간적 구배를 초래하고, 이들은 전기장에 의해 작용되어 벌크 유체 흐름을 유도한다. 시간-평균 속도 <u ETE >는 하기 식과 같으며, 여기서 η m 은 배지 점도이고, k는 배지 열 전도도이고, ( r, θ)는 힘이 평가되는 극좌표이고, τ m 은 τ m = ε m / σ m , α=0.4% K-1 및 β=2% K-1로 주어진 배지 완화 시간이다. 인자 Π는 우리가 우리의 배지 전도도에 대해 적용되는 빈도의 범위를 넘어 변화하지 않고, -0.022의 일정 값을 가진다.
Figure pct00002
ACEO 및 ETE 속도는, 정상 상태 상황에서 타원체의 마찰 인자를 통해 성장 원뿔상에서 작용하는 힘 <F EHD >으로 전환되는 전체 순 EHD 속도 <u EHD >를 제공하기 위해 더해진다.
Figure pct00003
Figure pct00004
세 번째 힘은 DEP 힘이다. 공-평면 전극 배열에서 편구면에 대하여 카스텔라나우(Castellarnau)와 같은 접근법을 사용하여, 우리는 성장 원뿔 상에 작용하는 n번째 DEP 힘을 하기 주어진 식을 이용하여 추정한다:
Figure pct00005
여기서 d는 전극들 사이의 거리(우리의 세팅에서는 d=15μm임), Ai는 타원체의 세 축 중 임의의 한 축을 따라 탈분극 인자의 성분, ε* p 및 ε* m은 i층 각각의 내부 및 외부 구획의 복소 유전율이고, n은 다중극의 순서이다. 클라우시우스 모소티 인자(Clausius-Mossotti factor, CMF)는 힘의 빈도 의존성을 포착하고, 도 10 상의 광범위한 범위의 빈도 및 몇몇 배지 전도도에 대하여 대표된다. 각 층의 유전 특성은 액틴, 뉴런 세포질 및 막에 대하여 문헌으로부터 발췌되었다. 전기장 강도가 성장 원뿔 크기에 따라 현격히 변화하기 때문에, 존스(Jones) 및 와시즈(Washizu)(1994)에 의해 제안된 클라우시우스 모소티 인자의 고차수 모멘트로 최대 n=4가 고려되었다. 우리는 이러한 고차수 다중극의 전반적인 DEP 힘에 대한 기여가 종래의 이중극 기여에 비해 훨씬 작다(~105 배 작음)는 것을 발견했다. 우리의 결과 및 문헌이 보여주듯이, 이러한 고차수의 힘은 물체를 밀쳐내어서 DEP 힘에 적극적으로 부가되고, 따라서 이는 우리의 작동 조건에서 DEP 힘이 EHD 힘에 비해 크다는 우리의 발견과 부합한다. 또한, 이 모델은 유리 표면을 갖는 성장 원뿔의 근접성 때문에 DEP 힘의 편차에 기여하지 않는다. 그러나, 린치 등(Lynch et al.)은 유리 표면에 결합된 적혈구 세포의 DEP 힘을 측정했고, 힘이 종래의 코어-쉘 단리된-입자 모델과 잘 부합한다는 것을 발견했다. 그러므로, 우리의 시스템에서 성장 원뿔에 대하여 동일한 거동이 추정될 수 있다.
모든 힘은 빈도 및 전압 의존성이기 때문에, 유도 EHD 및 DEP 힘의 상대적 규모는 빈도 및 전압 진폭의 범위에 걸쳐서 플로팅되었고(도 10b), 이러한 힘의 절대값이 도 11에 플롯팅되었다. DEP 힘 및 EDH 흐름 모두는 전극으로부터 성장 원뿔을 밀쳐내기 위해 협력하여 작용한다. 결과로 얻은 모델은 성장 원뿔 상에 가해진 힘의 추세 및 차수에 관한 확고한 정보를 제공한다. EHD 힘은 200 kHz ~ 1MHz 빈도 범위에 걸쳐서 거의-일정한 반응을 갖는 반면에, DEP 힘 규모는 강력하게 빈도 의존성이다(도 3SB). 우리는 DEP 힘이 열이 최소인 저 전압에서(대략 < 2.70 Vp -p) EHD 힘에 비해 크다는 것을 발견했다. 빈도와 관련해서, EHD는 약 250 kHz 초과의 빈도에서 더 현격해지는데, 그 이유는 성장 원뿔의 CMF의 규모(그리고 따라서 DEP 힘)는 f>100 kHz에서 감소한다.
액손 차단 데이터 조사한 결과(도 1d), 저 빈도(f<250 kHz)가 가장 작은 액손 길이를 가져왔고 DEP/EHD 비가 가장 큰 경우라는 것을 발견했다(도 3b). 유사하게, 모델은 고 빈도(f>250 kHz)에서 DEP 힘의 규모의 감소를 보이지만, 빈도를 증가시키는 경우에 실험적으로 증가하는 액손 길이가 관찰되었다(따라서 작은 동전기 효과를 가짐). 또한, 모델은, 주어진 빈도에서 전압이 증가함에 따라 DEP/EHD 비는 감소한다는 것을 보여주지만, 실험은 100 kHz를 제외한 모든 빈도에서 전압이 증가함에 따라 액손 길이가 증가하는 것을 보인다. 흥미롭게도, 이런 최저 빈도는 DEP/EHD vs 빈도 플롯(도 9b)에서 정점(피크)에 해당할 수 있는데, 여기서 DEP 힘은 큰 전압 범위에 걸쳐서 EHD에 비해 더 강하다. 따라서, 정량적 액손 길이 데이터에서의 추세(도 1d)는 발달된 액손이 DEP 힘에 의해 작용되는 메커니즘과 가장 부합한다. 모델 및 파라미터의 값들에 있어서, 성장에 가해지는 최대 DEP 힘은 ~66 pN(도 11)으로 밝혀졌고, 이는 실험관 내에서 척추 접합 뉴런 액손의 성장 원뿔에 의해 가해진 견인력, 및 성장 원뿔 인력을 유발하기 위한 네트린-1(Netrin-1)에 의해 가해진 힘의 규모와 동일하다.
이런 교류 동전기 모델은 비-제한 가설이지만, 고-강도 교류 전기장으로부터의 액손 성장의 억제를 추진하는 잠재적인 공정으로의 통찰력을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 메커니즘은 전기장-유도 액틴 분극화를 통하는 것과 같이 세포내에서 작용할 수 있고, 장래의 연구에 있어서 아주 흥미로운 방안이다.
도 9a는 우리의 분석에서 사용된 성장 원뿔 모델의 개략도이다. 도 9b는 성장 원뿔 상의 DEP 및 EHD 힘 사이에 모델링 비율이다.
도 10은 시뮬레이션된 성장 원뿔 모델의 클라우시우스-모소티 인자를 보여준다. 도 10a는 몇몇 배지 전도도에 관한 제1차(쌍극자) 모델을 보여주고, 도 10b는 1차 DEP 힘 및 뉴런 배지 전도도에서 다중극의 수를 증가시키기 위한 n번째 힘 사이의 비를 보여준다. 삽화 플롯은 성장 원뿔의 CMF의 n번째 다중극의 구체적인 도면을 나타낸다. DEP 힘의 고차수는 제1차 힘에 비해 몇 십배 작다.
도 11은 본 연구에서 사용된 빈도 및 전압 범위에 걸쳐서 유전영동(FDEP) 힘 및 유체역학적(FEHD) 힘의 시뮬레이션된 값을 보여준다. EHD 힘은 빈도 전반에서 거의 일정한 반응을 갖는 반면에, DEP 힘 규모는 200 kHz ~ 1MHz에서 강하게 빈도 의존성이며, 이는 실험적으로 관찰된 경향과 부합한다.
실시예 3
이 실시예는 액손이 통과하도록 하거나 이를 방지하는 전극 '게이트'의 쌍으로 구성된 액손-폐쇄 시스템을 통해 액손-다이오드를 제작하기 위하여 본 발명의 액손 신장을 역학적으로 제어하는 용도를 설명한다.
동전기 액손 차단의 역학적 특성은 액손의 한 방향 성장을 형성하여 액손 다이오드를 형성하도록 활용된다. 액손 다이오드는 액손이 오직 한 측에서부터만 성장하도록 허용하는 자물쇠가 있는 게이트와 같이 작용하는 두 개의 전극 세트를 사용했다(도 2a). 장치는 이등변삼각형으로 배열된 세 개의 마이크로챔버 칩이었고, 여기서 각각의 마이크로챔버는 용액 이동을 위한 6개의 웰과 접속하는(도 12) 그들 고유의 입구 및 출구 공간을 갖는다(도 2b). 각각의 마이크로챔버는 마이크로채널을 통해서 다른 마이크로챔버와 연결되었고, 마이크로채널 안에서는 액손만이 성장할 수 있다(높이 ~3 마이크론). 각각의 마이크로채널은 마이크로채널의 각 말단에서 두 개의 전극 세트를 배치하는 것에 의해(바닥-교류-바닥) 형성된 두 개의 액손 "게이트"를 갖는다(도 2b). 액손 다이오드를 제작하기 위하여, 마이크로챔버들의 쌍 각각을 연결하는 게이트는 동적 방식으로 개방되고 폐쇄되었다. 교류 전압이 꺼지는 경우에, 게이트는 개방되고, 액손은 전극을 지나 자유롭게 성장한다. 교류 신호가 켜지는 경우에, 게이트는 폐쇄되고 액손은 게이트를 가로질러 진행할 수 없다. 게이트를 폐쇄하도록 가해진 교류 시호의 파라미터는 f=100 kHz 및 V= 3 Vp -p로 세팅되었는데, 그 이유는 이것이 신경돌기 과성장을 차단하는데에 효과적이라고 발견되었기 때문이다(도 1d).
우리는 최초 폐쇄된 게이트(교류 전압이 인가됨)를 구비한 세 개의 마이크로챔버 각각에 뉴런을 배치하고(도 2ci), 24시간 후에, 마이크로채널에서 두 개의 게이트 중 하나는 개방되고(교류 전압은 꺼짐), '상류' 마이크로챔버로 불리는 한 마이크로챔버로부터 액손이 마이크로채널 안으로 연장하도록 하면서(도 2ci-ii), 반대편 "하류" 마이크로챔버 내에 액손은 폐쇄된 게이트에 의해 차단된 채로 유지한다. 뉴런 연결의 방향성은, 게이트가 개방되어 액손이 오직 상류 마이크로챔버로부터 하류 마이크로챔버로만 진행하도록 하는 것에 의해 규정되었다. 액손이 개방 게이트를 지나서 연장되면, 두 개의 게이트의 상태는 반대로 되었다: 먼저 개방 게이트가 폐쇄되고 이전에 폐쇄된 게이트는 개방되었다(도 2c-iii). 그렇게 해서, 마이크로채널에서의 상류 액손은 제2 게이트를 지나 연장할 것이고 하류 뉴런 군집과의 연결을 수립할 것이다. 제1 게이트가 이제 폐쇄되기 때문에, 하류 마이크로챔버로부터의 액손은 상류 마이크로챔버로 이동할 수 없고, 마이크로채널에 갇히거나 하류 마이크로챔버 내에서 유지될 것이다. 최종적으로, 양쪽 게이트가 폐쇄되어 액손이 마이크로채널을 통해 추가적으로 이동하는 것을 방지한다(도 2Civ). 상류로부터 하류 마이크로챔버까지의 액손의 길이(n=12)는 이 과정 중에 측정되었다(도 13). 액손은 전기장이 켜져있는 한 활성화된 전극을 통과하지 않는 것을 알 수 있다. 또한, 성장 원뿔은 활성화된 전극(시간이 흐르면서 감소된 성장 원뿔 배지 위치의 표준 편차)으로부터 되돌아오지 않는다. 게이트가 개방되는 경우에, 액손 성장 과정은 42±7 마이크론/일의 속도로 연속되었으며, 이런 속도는 채널의 중간에서 관찰된 성장률(72±10 마이크론/일)에 비해 현저히 느린 것(41%의 상대 오차)이다. 이는 전기장 때문에 이전에 접근 불가능했던 면적을 성장 원뿔이 탐사하는데 걸리는 시간으로 설명될 수 있다. 마지막으로, 하류 액손은 일단 게이트가 켜지면 상류 게이트를 통과하지 않고 그 앞에 머물렀다. 이러한 동전기 액손 차단의 특정 시공간적 적용은 "액손-폐쇄 시스템"으로 불린다.
도 2c는 액손 다이오드의 측면 개략도를 보여주고, 도 2b 및 12는 세 개의 마이크로팸버 및 전극을 보여주는 액손 다이오드 칩의 이미지이다.
도 2c는 성장 원뿔이 지향적인 백색 화살표에 의해 정확히 지시되는 액손-폐쇄 시스템의 개략적 이미지(좌) 및 상 이미지(우)를 보여준다. 채널의 중간은 백색 점에 의해 강조된다. 로마자는 하기를 설명한다: (i) 액손이 마이크로채널에 진입할 수 없도록 게이트가 모두 폐쇄됨; (ii) 좌측 게이트는 개방되고, 단일 액손은 좌측으로부터 진입함; (iii) 좌측 게이트는 폐쇄되고 우측 게이트는 개방됨; (iv) 제1 액손이 게이트를 지나 완전히 통과한 후에 모든 게이트가 폐쇄됨. 도 13은, 좌측 게이트 및 우측 게이트의 활성 시간에 따른, 상류 마이크로챔버(청색) 및 하류 마이크로챔버(적색)으로부터 이동하는 액손의 측정된 길이의 그래프이다.
실시예 4
이 실시예는 기능성, 조작된 신경망의 어셈블리를 보여주기 위하여 세 개의 액손-락(axon-locks)에 의해 분리된 세 개의 뉴런의 집합으로 구성되는 신경 회로의 발달을 보여준다. 활동전위 기록들은 교류 동전기 효과가 액손을 해하지 않는 다는 것을 증명했고, Ca2+ 이미징은 시냅스 연결의 한 방향성 성질을 증명했다.
액손-락 시스템을 사용하여, 기능성 액손 다이오드의 제작이 증명되었다. 액손 다이오드는 개발되었고, 생체내에서 뉴런 경로 유도의 방향성을 모방하기 위해 시험관 내에서 사용되었다. 방향성은 말초 신경 손상 후에 그리고 발달 중에 올바른 연결을 만들기 위한 액손의 재생에 매우 중요하다. 약간의 시험관 시스템은 방향성 연결을 만들 수 있다. 교류 동전기 효과는 재구성력의 이점을 갖는데, 그 이유는 전기장이 자유의사로 켜지거나 꺼질 수 있기 때문이다. 따라서, 발달한 액손의 성장을 역동학적으로 폐쇄하거나 해지하는 능력은 신경망의 생성을 자극하는 가능성을 가진다. 특히, 신경 유도 도관에서 액손의 선택적 성장은 그들의 타켓으로의 액손의 경로 지정을 향상시킬 수 있고, 액손의 잘못된-성장 및 부적절한 신경분포를 방지한다.
다중 액손 다이오드를 사용하여 신경망을 생성하기 위하여, 전극 게이트는 액손을 챔버로 유도하기 위하여 동적으로 개방되고 닫히며, 챔버 'A'는 챔버 'B'와 지향적으로 연결되었고, 챔버 'B'는 챔버 'C'와 지향적으로 연결되었지만, 챔버 'C'는 챔버 'A'에 어떤 방향으로도 연결되지 않았다(도 6a).
우리는 교류 전기장이 액손의 활동전위 발생 및 전파 능력에 손상을 가하지 않는 다는 것을 증명하기 위해 활성 게이트를 통과하는 액손의 기능성을 먼저 검사했다. 활동전위 측정값을 얻기 위하여, 우리는 다이오드를 통과하는 액손에서 활동전위 전파를 모니터링하기 위하여 게이트 전극을 자극하고 기록하는 전극으로 고쳤다. 전극들의 제1 세트는 자극 전극으로 사용되었고 제2 세트는 기록 전극으로 사용되었다.
도 14a는 액손-락들 중 하나를 통과한 액손들의 세트로부터의 활동전위 측정값을 보여준다. 각각의 자극 펄스가 가해지는 경우에, 활동전위는 전체 다이오드를 통과하는 액손을 따라 더 기록되었고, 액손-락 시스템이 활동전위 발생 또는 전파를 간섭하지 않는다는 것을 발견했다.
이어서, 방향성 망의 시냅스가 활성화되었는지에 대해 확인했다. 오레곤 그린 BAPTA 1(Oregon Green BAPTA 1)은, 활동전위가 KC1 첨가와 함께 유도되는 경우에 유발된 Ca++ 유동을 시각화하기 위한 착색제로 사용되었다. KC1 자극은 다른 외부 저장소에 선택적으로 압력을 가하는 것에 의해 단일 마이크로챔버에 국한되었다. KC1이 챔버 'A'에 첨가되는 경우에, 탈분극화는 모든 세개의 챔버에서 관찰되었고(도 14b, 좌측), 그 반면에 챔버 'B'로 KC1의 첨가는 챔버 'B' 및 'C'에서 Ca++ 진동만을 유발했고(도 14b, 가운데), 챔버 'C'로 KC1의 첨가는 챔버 'C'에서의 진동만을 유도했다(도 14b, 우측). 이러한 결과는 챔버 'A'가 챔버 'B'에 그리고 챔버 'C'에 연결된다는 것을 증명하고(도 14b, 좌측), 그리고 기능성 시냅스가 챔버 'A'에서 유래한 뉴런으로부터의 신호를 챔버 B를 거쳐 챔버 C로 전달할 수 있다는 것을 또한 증명한다. 또한, 자극 챔버 'B'가 챔버 'C'에서 Ca++ 진동을 유도하지만(도 14b, 가운데) 자극 챔버 'C'가 챔버 'B'에서 Ca++ 진동을 유도하지 않는다(도 14b, 우측)는 관찰은, 두 개의 챔버들이 액손 다이오드에 의해 직접적으로 연결된다는 것을 증명한다. 결론적으로, 이러한 결과는 우리의 액손-락 시스템에서 해마 뉴런의 직접적으로 연결된 망들이 형성되는 능력을 증명한다.
도 3은 액손-락 시스템에 의해 구성된 시험관에서의 신경망의 12일째 형광 적외선 이미지이다. 무늬없는 화살표는 다이오드의 방향을 나타낸다. 도 14a는 자극 신호(검정색) 및 하류에서 기록된 신호(유색)를 보여주는, 활동전위 기록을 보여준다. 도 14a는 뉴런들의 하부-군집 각각을 차례차례 자극하는 경우에(+KC1으로 표시됨) 오레곤 그린 BAPTA 1-염색된 뉴런의 적외선 형광 이미지이다. 기준자는 50 마이크로인다.
도 15는 차정수압(differential hydrostatic pressure)을 사용하는 것에 의한 흐름의 구획화를 보여준다. 압력은 각 마이크로챔버에 연결된 유입 및 유출 저장소에 배치된 액체의 부피에 의해 유도된다. 그러므로, 옳은 액체 부피를 배치하는 것에 의해, 유동이 한 마이크로챔버로부터 다른 마이크로챔버로 향하도록 하여 뉴런의 한 군집에만 화학물질의 국소 적용을 함유하도록 할 수 있다. 도 15a-b는 유동이 국한되지 않는 경우 및 유동이 국한되는 경우 각각에 대한 세 개의 마이크로챔버들의 형광 이미지이다. 화살표는 플럭스의 방향 및 유입/유출구에 주입된 액체의 양의 부피를 지시한다. 유동은 10 마이크로몰의 플루오레세인 및 1 마이크로몰의 형광 폴리스티렌 비드를 한 저장소 안에 주입하는 것에 의해 시각화되었다.
실시예 5
이 실시예는 실험에서 사용된 재료 및 방법을 설명한다.
동전기 장치의 마이크로제작 및 뉴런 플레이팅에 대한 제조.
마이크로유체 침은 150 mm 유리 웨이퍼 상에서 제작되었다. 표준 포토리소그래피(photolithography) 단계에 이어서, 10/100 nm Ti/Au 이중층은 이-빔(e-beam) 증착되었고, 아세톤 중에서 들어올림은 전극을 드러냈다. 이어서, 웨이퍼는 다이로 절단되어 개별의 침을 얻었다. 마이크로채널은 두 개의 유형의 구성을 포함한다: 세포 주입용 고 채널(100μm) 및 액손 성장용 얕은 채널(3μm의 높이). 그들은 얇은 저항(SU-8 2005) 및 두꺼운 저항(SU8-2050)으로 2단계 리소그래피 공정을 사용하여 제작된 SU-8(마이크로켐) 마스터로부터 몰딩되었다. 이후, 마이크로채널은 탈가스화되고 경화된 PDMS(Sylgard 184(Dow Corning)의 경화제와 9:1의 질량비)로 몰딩되었다. 플라스틱 마스터는 최종 PDMS 복제를 위해 미래의 금형으로서 사용되었다. 마이크로그루브는 공기 플라스마 노출(2분) 및 메탄올 중에 침지(5분) 후에 양안 하에서 수동적으로 나란히 배열되었다. 조립된 칩은 100℃에서 30분 동안에 경화되었다.
두 개의 다른 마이크로유체 칩은 이 방법으로 제작되었다. 첫번째는 마이크로그루브의 배열(길이: 450μm; 폭 5μm; 높이: 3μm )에 의해 분리된 직사각형 마이크로채널(길이: 4000μm; 폭: 500μm; 높이: 100μm)로 만들어진 두-구획 칩이었다(도 1). 두번째 칩(도 4)은 이등변삼각형으로 배치된 세 개의 마이크로챔버(직경: 500μm, 높이: 100μm)에 연결된 5 mm 구멍 뚫린 유입 및 유출 저장소로 만들어진 세-구획 칩이었다. 각 저장소는 마이크로채널(길이: 450μm; 폭: 50μm; 높이: 3μm)을 통해 다른 저장소에 연결되었다. 마이크로채널은 배양기에서 24시간 동안 0.1 mg/mL의 폴리-l-리신(시그마알드리치)으로 코팅되었다. 이후에 채널은 탈이온수(DI)로 3회 세척되었고, 2시간 동안 20 ug/mL 라미닌(시그마알드리치)로 코팅되었다. 채널은 다시 탈이온수로 3회 세척되었고, 2 mM 글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신(해마 배양 배지)을 함유하는 뉴런배양용 기본배지-B27(neurobasal-B27)로 3회 세척하고 채웠다. 마이크로유체 칩은 사용할 때까지 항온조에 배치했다.
해부 및 세포 배양
모든 동물 실험은 동물관리의 MIT 의원회 및 비교의학부(MIT committee of animal care and division of comparative medicine)에 의해 승인되었고, 동물보호에 대한 기관, 주, 및 연방 지침을 준주했다. 해마는 E18 Sprague Dawley 래트(Charles River 실험실)로부터 수확했고, 10 mM HEPES를 사용하여 pH 7.3으로 버퍼된 냉각 행크 평형 식염수(Hank's balanced salt solution, HBSS)에서 소화시켰다. 조직은 파파인(Worthington Biochem.) 20 U/ml를 함유하는 HEPES 버퍼된 HBSS 2 ml, 1 mM EDTA 및 1 mM L-시스테인 중에서 30분 배양에 의해 소화되었다. 다음으로, 조직은 8 ml의 해마 배양 배지로 3번 세척되었다. 세포는 1 ml의 해마 배양 배지 중에서 살살 빻았고, 혈구계산기로 카운트했고, 장치 안으로 흘려보냈다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 유지되었다.
장치내에 뉴런 시딩 (seeding)
시딩 이전에, 마이크로유체칩의 저장소는 마이크로채널로부터 배지를 제거함 없이 비워졌다. 각 유입 저장소에 대하여, 4 μL의 고밀도(> 8 106 세포/mL) 해리된 뉴런 용액은 마이크로채널의 입구에 인접하게 배치되었다. 칩은 뉴런이 코팅된 유리 상에 접착할 수 있도록 5분 동안 다시 배양기로 복귀시켰고, 시딩 공정은 고 세포 밀도를 달성하도록 3회 반복되었다. 마지막으로, 유입 및 유출 저장소는 해마 배양 배지로 신속히 채워졌고 칩은 다시 배양기로 복귀시켰다.
뉴런 트랜스펙션
프레이팅 후 24시간에, 뉴런은 판매업자에 의해 지시된 바와 같이 104 세포에 대해 2 uL의 바이러스 비율로 튜불린-GFP 바큘로바이러스(튜불린-GFP 바크맘 2.0 바이러스, Life Technology)를 트랜스펙션했다. 이후에, 세포는 16시간의 항온처리 이후에 형광에서 이미지를 찍었다.
이미지 습득
이미지는 냉각된 CCD 카메라 LaVision ImagerQE(LaVision) 및 자동화 단계 Ludl MAC 5000(Ludl)를 갖춘 Axiovert 200M(Zeiss)로 획득했다. 현미경은 Metamorph 소프트웨어(Molecular Devices)로 제어되었고 이미지는 ImageJ 및 Matlab(The Mathworks) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
배양기 안에 교류 전기 신호를 가하기 위한 심험관 내 플랫폼
교류 신호는 배양기 안에 배치된 주문제작한 플랫폼을 통해 마이크로전극에 인가되었다. 마이크로유체 칩은 나란히 배열되어 Zero Insertion Force(ZIF) 연결장치 안으로 삽입되었으며, 상기 연결장치는 아두이노 수작업 인쇄 회로 기판 스택에 연결되었다. Zero Insertion Force 연결장치는 칩을 위한 기계적 및 전기적 홀더로서 작용한다. 스택은 3개의 기판, 마스터 아두이노 기판, 직접제어발진기(DDS)-생성 교류 신호 기판, 및 라우팅 기판으로 구성되었다. DDS 기판(DDS-60 Daughtercard, Midnight Design Solution에 기초함)은 0-60 MHz 및 0-10 Vp -p의 범위에서 교류 신호를 발생시킬 수 있다. 라우팅 기판(ADG333ABR 스위치, 아날로그 장치 및 74HC595 시프트 레지스터, Texas Instruments)은 재라우팅할 수 있고 하나 이상의 전극에 교류 신호를 유지할 수 있다. 아두이노에 USB로 연결된 라즈베리 Pi 미니컴퓨터는 전체 스택을 시험 사용했다. 웹 서버는 라즈베리 Pi에 설치되어, 각 전극에 대한 빈도 및 전압은 실시간으로 웹 브라우져를 통해 원격으로 변화시킬 수 있다. 전기적 신호는 전기 스위치 및 시프트 레지스터로 구성된 수작업 아두이노 기판을 통해 각 전극에 선택적으로 보내진다. 스위치를 닫는 명령은 라즈베리 Pi에 의해 아두이노에 보내지며, 웹 서버는 지속적으로 실행된다. 아두이노 기판 및 ZIF 연결장치 모두는 배양기에 최종적으로 위치된다.
액손 길이 측정
모든 그루브는 형광현미경 하에서 사진으로 찍혔고 액손의 길이는 Matlab로 측정되었다. 이미징 알고리즘은 먼저 명암 및 밝기를 강화하고, 다음으로 이미지를 이진화한 후(각 이미지에 대해 수동으로 최적화된 역치값), 허프 변환을 적용하고, 마지막으로 채널 모서리와 액손의 말단 사이에 갭을 측정하는 것으로 구성된다. 각 전압 및 빈도에 있어서, 우리는 관찰된 액손 길이(도 6에서 AL) 사이의 거리 및 채널의 모서리와 제1 전극(도 6에서 DCE) 사이의 거리의 비율로서 표준화된 액손 길이를 정의했다. 액손-락 시스템에 있어서, 액손 길이는 이전에 비해 동일한 알고리즘으로 측정되었다. 성장 원뿔이 전극에 의해 가려지는 경우에, 위치는 전극 폭의 오차를 갖고 전극의 가운데에 있다고 추정되었다.
신경망 자극
뉴런은 오레곤 그린 BAPTA1(Life Technologies)로 1시간 동안 염색되었고, 배지로 세척되었다. 서브-군집만을 자극하기 위하여, 20 uL의 90mM KC1 용액은 하나의 마이크로챔버의 유입구에만 주입되었다. 뉴런의 다른 군집의 저장소는 50 uL 배지 각각에 채워졌고, 그 결과 챔버들 사이에 압력차이를 만들었으며, 이에 의해 주입된 마이크로챔버에서 KC1이 흘러넘치는 것을 방지했다. 이런 유체 유동 구획화의 구체적인 내용은 추가적인 정보에서 주어진다.
활동전위 기록
활동전위는 액손-락 삼각형 칩에서 마이크로전극 그 자체를 통해 기록되었다. 동일한 마이크로채널로부터의 마이크로전극은 자극 전극으로서 연결되었고 ZIF 모듈을 통해 기록 전극으로서 연결되었다. 펄스 생성기(TTi)는 전류 변환기(Isolator-10, Axon Instruments)에 연결된 후 자극 전극에 연결되었다. 기록 전극은 로크인 증폭기(x104 gain, ISO-80, World Precision Instruments)에 연결되었고 PC 오실로스코프에 연결되었다(PicoScope, PC oscilloscope software). 이후, 신호는 Matlab 안으로 보내졌고 일시적으로 동기화되었다.
통계학적 분석
액손 중단 분석에 있어서, 차이점은 두 개의 독립적인 실험으로부터 짝지어지지 않은 스튜턴트 t-테스트에 의해 다루어졌으며, 여기서 각 실험 조건은 중복해서 수행되었다. 모든 분석에 있어서: * p-값<0.05; **p-값<0.01; ***p-값<0.001.
실시예 6
이 실시예는 전극들(예, 전기-마아키로유체 칩)을 함유하는 마이크로유체 장치에서 3차원 콜라겐 매트릭스(예, 콜라겐 스캐폴드)의 선택적 패턴을 설명한다.
콜라겐은 마이크로유체 채널 안에서 및/또는 다른 마이크로유체 구조에서 추가적인 패턴화 채널 또는 추가적인 장치의 필요없이 선택적으로 패턴화되었다. 마이크로유체 채널의 높이에 따라서, 방법은 마이크로유체 칩의 정의된 면적을 콜라겐으로 관류시키기 위하여 균형이 잡히는 모세관류에 기초되었다. 요약하면, 콜라겐은 전체 마이크로유체 칩 안으로 흘렀고, 칩 내에 잔류 유동 때문에 아크릴산(AA)만을 사용하여 특정 마이크로채널에서 콜라겐을 제거했다. 아크릴산은 콜라겐 스캐폴드의 가용화를 가져오는 콜라겐 피브릴들 사이에서 안정한 수소 결합을 방해하는 것으로 알려져 있다. 프로토콜의 구체적인 것은 실시예 11에서 더 설명된다. 도 16은 마이크로유체 칩의 횡단면의 도해 및 마이크로유체 칩 그 자체의 사진을 보여준다. 도 16a는 챔버 내에 뉴런체를 포함하는 구획화된 전기-마이크로유체 칩 및 다양한 높이의 콜라겐 스캐폴드로 성장할 수 있는 액손의 개략도이다.도 16a는 전기장 없이 시험관 내에서 6일 후에(DIV) 5 마이크론 높이의 콜라겐 스캐폴드로 성장하는 액손의 명시야 X10 사진이다. 액손은 콜라겐 스캐폴드 내에 세포체 구획으로부터 배향된 성장을 보여줬다. 도 16c는 페트리 접시 내에서 마이크로유체 칩의 사진이다. 전기적 연결은 칩의 하부 상에서 볼 수 있다.
실시예 7
이 실시예는 5 마이크론 높이를 갖는 마이크로그루브 내에서 콜라겐 스캐폴드의 액손 성장을 유도하기 위한 교류 전기장의 사용을 설명한다. 전극의 표면형태는 액손 성장에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 3 Vpp 및 150 kHz에서 교류의 적용은 고전기장 영역에서 액손 성장을 못하게 했고, 액손이 방향을 바꾸어 저전기장 영역에서 성장하도록 유도하였다.
도 16에 도시된 바와 같은 마이크로유체 칩은, 교류 동전기력이 마이크로채널 기하학적 제한 및 전기장 분포를 조합하는 것에 의해 콜라겐 스캐폴드 내에서 액손 성장을 3차원으로 유도할 수 있다는 가설을 다루기 위해, 공-평면 전극 및 기능화된 표면상에서 성장하는 뉴런이 함께 사용되었다. 가설을 다루기 위하여, 래트 E-18 해마 뉴런의 발달은 그루브 높이 및 전극 기하학을 변화시키면서 실시예 5 및 6에서 설명된 전기-마이크로유체 칩에서 관찰되었다.
마이크로그루브 높이(h)가 5 μm였던 경우에, 액손 성장은 성장 원뿔의 공간적 제한 때문에 단일 평면으로 제한되었다. 세포 저장소에 뉴런의 시딩 후 24시간 째에, 액손은 전극을 향해 마이크로채널 안으로 연장하기 시작했다. 이 지점에서, 전기장은 3 Vpp 및 150 kHz에서 교류를 가하는 것에 의해 활성화되었다. 제어 칩에서, 남은 장들은 비활성화되었다. 세포는 24시간마다 이미지로 담아서, 성장성 및 생존성을 모니터링 했다.
시험관 내에서 4일 이내에(4 DIV), 제어 칩 내의 액손은 도 17에서 보인 바와 같이 완전한 마이크로채널(600μm x 600μm)을 채웠다. 성장속도의 차이는 비활성화된 전극위로 성장하는 액손들 또는 제어 영역(화살표 201)에서 성장하는 액손들 사이에서 관찰되지 않을 수 있으며, 이는 전극의 표면형태(h=200 nm)가 성장에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다. 개별 세포는 세포 저장소로부터 마이크로채널안으로 이동했다. 높이 제한 때문에, 이들은 아마도 발달하는 액손으로부터의 유도 안내 이후에 좁은 개구부 안으로 압착되어 들어가는 신경교세포였다.
활성화된 칩의 제어 영역에서(화살표 201) 액손은 비활성화된 칩에서와 실질적으로 동일한 성장속도 및 밀도를 보였다(도 17a 참조). 반면에, 전기장 영역은 액손 성장으로부터 거의 자유로웠다. 물론 액손은 제1 전극의 앞에서 선회하고 저전기장 강도의 영역에 도달할 때까지 전기장 선을 따라 이동한다(화살표 202). 전극 및 평행 액손 사이의 거리는 대략 5-10μm이었다.
도 17b는 인가전압의 기능으로서 평가된 성장 방향에 변화를 보여준다. 각 조건에 대하여, 한 개의 채널을 각각 구비한 세 개의 다른 샘플들의 전기장 영역은 최소 50 수상 돌기를 함유하는 각각의 시험된 채널로 분석되었다. 도면에서 보여진 각분포는 전기장을 만나기 전 및 후에 성장 각도의 상대적 변화를 보여준다. 검은색 선은 각 전압에 대한 중앙값 각도이다. 비활성화된 전극(0 V)에 있어서, 신경 돌기는 채널에 평행하게 성장했고(중앙값 = 0°), 양측으로 동등하게 발생한 성장 방향에서 매우 작은 변화를 가졌다(±10°). 성장 방향의 유사한 편차는 1 Vpp를 갖는 활성화된 장에 대해서도 발견될 수 있었다. 그러나, 중앙값 각도는 약간 음의 방향으로 시프트되었고(-2.5°), 이는 전극으로부터 벗어나는 것을 의미한다. 이 전압에서의 DEP 힘은 최소이고 관찰된 변화는 아마도 교류 동전기에 연결되지 않는다. 2 Vpp의 적용은 -50° 내지 -85°의 범위를 갖고 평균 거의 -70°로 선회하도록 유도한다. 3 Vpp는 -90°로 가장 크게 돌아서도록 하고, 전극에 대한 평행 성장은 도 17a에서 관찰되었다. 2-3 Vpp의 범위에서, 실시예 2에서 설명된 모델은 성장 원뿔 상에서 작용하는 66 pN의 최대 DEP 힘을 추정한다. 이 힘은 성장 원뿔이 신체에서 선회하도록 유도하는 견인력과 동일한 크기 정도였다. 그러므로, DEP는 성장 방향에서 변화를 유도할 가능성이 높다. 최종적으로, 전극에서 4 Vpp는 신경 돌기의 상처를 발생시켰고, 각분포는 확인될 수 없었다(0°에서의 선). 이러한 발견은 실시예 13에서 설명한 다른 전압에서 세포 생존성 시험과 부합되었다.
일부 경우에서, 개별 액손은 측으로부터 전기장 영역 안으로 뚫고 들어왔다. 이는 불균일한 전기장 및 서로 맞물린 전극 배열의 모서리에서 감소된 DEP의 결과일 수 있다. 일부 실험에서, 채널벽 바로 옆으로 성장하는 개별 액손의 위반은 관찰되었다. 이것은 채널벽과 같은 강력한 기계적 신호가 DEP 효과를 초과하고 액손이 전기장 영역 안으로 성장할 가능성이 있다. 5 μm 높이에 있어서, 채널 내에 스캐폴드의 존재 또는 부재는 동일한 거동을 야기했다. 성장 원뿔은 스캐폴드와 상호작용하는 대신에 기능화된 표면과 크게 상호작용했다. 그러므로, 낮은 채널 높이에 있어서, 채널을 채운 스캐폴드는 배지로 채워진 높은 채널과 동일한 것으로 여겨질 수 있다.
실시예 8
이 실시예는 콜라겐 스캐폴드에서 액손 성장 속도를 강화하기 위한 교류 전기장의 사용을 설명한다. 이 실시예는 액손 성장의 화학적 그리고 무접촉 촉진을 증명한다.
깔때기 형상 전극은 도 18a에서 보는 바와 같이 신호 및 접지 전극의 근방 내에서 액손의 동전기 국한의 영향을 조사하기 위해 사용되었다. 백색 파선은 제어 영역(화살표 205) 및 깔때기 영역(청색 화살표)에서 발달하는 액손의 성장 원뿔을 표시한다. 액손은 깔때기 효과를 증명하기 위하여 도 18a에서 추적되었다(화살표 205). 도 18a는 깔때기-유사 디자인의 전극을 구비한 5 마이크론 두께의 콜라겐으로 채워진 마이크로채널에서 액손의 발달에 대한 이미지이다(4 DIV, 100 kHz, 3 Vp -p). 깔때기 전극 사이(화살표 206)에 있는 액손은 비활성화된 전극(제어, 화살표 205) 위에 있는 액손에 비해 더 빠르게 성장했다. 삽도는 깔때기 효과를 강조하는 개별 액손들의 추적과 함께 전극의 곡선부(207) 내에서 액손의 깔대기화(funneling)를 보여준다. 나아가, 비국한된 액손에 비해 증가한 성장 속도를 관찰했다. 효과를 정량화하기 위하여, 발달한 액손의 길이는 측정되었다. 도 18b는 상이한 인가전압 및 대조군 칩(전극 없음)에 대해 6 DIV 후에 깔때기 영역에서 연장 길이를 보여준다. 도 18b는 동일한 전기장하에서 6 DIV 후에 신경돌기 연장 길이의 그래프이다. 깔때기 내에 액손을 국한 시키는 것은 2D 표면(유리) 상에서의 액손에 비해 또는 비활성화된 전극(0 V) 위의 5 mm-두께 겔에서 2-3V에 대해 그의 성장 속도를 현저히 향상시켰다.(***, p<0.001; **, p<0.01). 현저한 차이는 대조군, 비활성화된 전극, 및 1 Vpp(l1v=450μm) 사이에서 관찰되지 않았다. 전압을 2 Vpp로 증가시키는 것은 연장 길이가 l2v=680μm으로 현저히 증가하도록 유도했다. 더 강력한 전기장인 3 Vpp에서, 연장 길이(13v=960μm)는 대조군에 비해 2배를 초과했다. 액손의 공간적 국한외에, 성장 속도의 증가가 관찰되었다. 성장 원뿔은 교류 동전기력이 유효 탐색 영역을 1-D 선으로 제한했기 때문에 환경의 검증을 위해 적은 시간이 필요했다고 가설을 세웠다.
실시예 9
이 실시예는 10 마이크론 높이를 갖는 마이크로그루브 내에서 콜라겐 스캐폴드에서 액손 성장을 늦추는 교류 전기장의 사용을 설명한다. 전기력 및 기계력의 조합은 액손 성장을 늦추기 위해 사용되었다.
그루브 높이는 h=10μm로 증가했고, 뉴런은 마이크로유체 칩에 시딩되었다. 세포 수용기내에 뉴런의 시딩 후 24시간째에, 액손은 전극을 향해 마이크로채널 안으로 연장하기 시작했다. 이 시점에서, 전기장은 활성화되었고, 1 Vpp 및 3 Vpp 사이에서 상이한 전위는 150 kHz의 빈도로 인가되었다. 전극을 구비하지 않거나 비활성화된 전극을 가진 대조군 칩이 사용되었다.
6 DIV 이후에 도 19에서 보여지는 바와 같이 형광 이미징에 의해 형광 이미지를 얻었다.
스캐폴드의 존재는 기능화된 표면 위에서 성장 속도를 대략 30% 향상시켰다. 전극에 150 kHz에서 1 Vpp를 인가하는 것은 과성장에 현저한 효과를 갖지 않았다. 그러나, 2 Vpp 및 3 Vpp는 액손의 길이를 각각 32% 및 48% 현저히 감소시켰다. 성장 자극에 대하여 가능한 설명은 스캐폴드 충전 프로토콜의 결과로서 성장 방향에 평행한 콜라겐 섬유의 배열이다. 배열된 콜라겐 섬유는 액손 성장을 촉진하는 추적-유사 기계적 유도 신호를 제공했는데, 이는 아마도 어떤 경로/신호를 결정하는데 결리는 시간의 감소 때문이다.
제시된 모델에 기초한 시뮬레이션은 150 kHz에서 1 Vpp에 대해 오직 10 pN의 DEP 힘을 예측했다. 이런 이유로, 성장 원뿔상에 가해진 힘은 기판 강도와 같이 다른 유도 신호에 의해 쉽게 능가했다. 이는 연장 길이에 저전압이 미치는 영향이 관찰되지 않는 이유에 대해 설명할 수 있다. 반면에, 더 높은 전압(2-3 Vpp)은 연장 길이에서 현저한 감소를 유도했다. 가능한 설명은 마이크로채널의 물리적 국한 및 연장 길이의 감소를 초래하는 전기장의 반발 효과 사이에서 경쟁을 초래하는 채널 상부를 향한 전극으로부터 밀어 올려지고 밀려나는 성장 원뿔의 공간적 국한일 것이다.
도 19a는 6 DIV(100 kHz, 3 Vp -p) 이후에 10 mm-두께 콜라겐-채워진 마이크로채널에서 액손 발달의 이미지이다. 전극 위로 성장하는 액손(화살표 211)은 전극으로부터 벗어난 것(화살표 210)보다 더 짧다. 도 19b는 다양한 전기장 강도에 대하여 동일한 전기장하에서 6 DIV 이후에 신경돌기 연장 길이의 그래프이다. 콜라겐에서의 액손 성장은 전압의 증가와 함께 감소하고, 2D 표면(유리)상에서의 성장에 비해 느릴 수 있다.(***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.1).
실시예 10
이 실시예는 50 마이크론 높이를 갖는 콜라겐 스캐폴드의 깊이에서 액손 성장을 들어올려서 액손 연장이 다차원(예, xy 평면, yz 평면, xz 평면)으로 발생 되도록 교류 전기장을 사용하는 것에 대해 설명한다.
3차원 성장 환경을 모방하기 위하여, 마이크로그루브 높이는 콜라겐 스캐폴드로 채워진 50μm로 증가되었다. 이러한 스캐폴드에서 성장하는 액손은 전기장이 콜라겐에서 연장함에 따라 깊이에서 방향을 전환할 것이라는 가설을 세웠다. 세포 저장소에서 뉴런의 시딩 후 약 24시간 째에, 신경돌기는 스캐폴드가 채워진 마이크로채널 안으로 연장하여 전극을 향해 나아가기 시작했다. 이 시점에서, 전기장은 활성화되었고, 1 Vpp 및 3 Vpp 사이의 다양한 전위는 150 kHz의 일정 빈도에서 적용되었다. 전극을 갖지 않거나 비활성화된 전극을 갖는 대조군 칩이 사용되었다.
도 20a는 50μm 높이로 성장하는 액손, 6 DIV 후에 콜라겐-채워진 채널, 및 활성화된 전극(3 Vpp, 150 kHz)의 공초점 이미지 및 개략도를 보여준다. 공초점 이미지는 도 20a에서의 적색선을 따라 스캐폴드가 채워진 마이크로채널을 가로지르는 형광 액손의 측면도를 보여준다. 전기장에 대하여 노출이 없는 경우(상부), 대부분의 액손은 채널의 유리 바닥에 근접하여 성장했다. 활성화된 전극(바닥) 위로 성장한 액손은 z 방향으로 굴절되었다. 액손 굴절은 스캐폴드 내에서 공초점 현미경을 사용하여 관찰되고 정량되었다. 도 20b는 이미지 가공으로부터의 출력 및 공초점 현미경에 의해 생성된 3D 이미지의 측면 복원을 보여준다. 측면 공초점 이미지는 비활성화된(상부) 및 활성화된(하부) 전극에 대하여, 도 20a에서 점선을 따라 채널을 가로지르는 액손을 보여준다. 전기장이 없는 경우, 액손은 채널의 높이를 따라 유의하게 분포되었다. 전기장이 인가된 경우, 전극에 근접하여 성장하는 액손은 z-단계(직선)을 수행했다. 전기장 영역에서 액손의 가장 낮은 높이는 수평 점선에 의해 표시되었다. 도 20c는 대조 및 1 Vpp 내지 3 Vpp의 상이한 전압에 대한 제1 액손의 평균 높이를 보여준다(***, p<0.001; **, p<0.01). 대조군은 전극이 없는 채널 또는 비활성화된 전기장을 갖는 채널 중 어느 하나로 수행되었다. 높이의 현저한 차이는 전극이 없는 채널, 비활성화된 전극이 있는 채널, 또는 150 kHz에서 1 Vpp를 갖는 채널에서의 성장들 사이에서 관찰되지 않았다. 2-3 Vpp 사이의 인가전압에 있어서, 전극에 근접하여 z-방향으로 성장하는 액손의 현저한 상승이 있었다. 2 Vpp에 있어서, 가장 낮은 액손은 전극 위에서 평균 높이 7±1.5μm로 상승했고, 3 Vpp에 대해 10±2μm로 상승했다. 액손의 상승은 전기장 영역이 줄어든 후에 더 신속하게 이루어지는 것으로 주목했다. 또한, 전기장을 지난 후에 채널 바닥에 인접하여 성장하는 액손은 적었다. 액손은 동전기력에 의해 신속히 상향으로 반발되었고 고전기장 영역을 지나간 후에 다시 유의하게 지향되는 것으로 보였다. 동전기력은 상향으로 그리고 전극의 모서리로부터 벗어나도록 작용했으며, 이는 액손이 고전기장 영역을 넘어서는 '단계'를 수행하도록 유발한다.
실시예 11
이 실시예는 신경돌기들의 제1 및 제2 군집이 제1 및 제2 군집 내에 신경돌기들 사이에 신경 연결을 형성하지 않고 3차원 매트릭스 내에서 겹쳐지도록 유발하기 위한 교류 전기장을 사용하는 방법을 설명한다.
어떻게 실시예 6-10에서 설명된 이러한 유닛 작동이 다양한 응용에서 사용될 수 있는지를 도해하기 위하여, 조정가능한 액손 교차를 만들기 위한 방법이 개발되었다. 상기 실시예들에서 설명된 정지(stopping), 깔때기(funnel), 및 푸싱(pushing) 기능성은 액손 교차를 만들기 위해 혼합되었다. 칩 디자인은 도 21a에서 보여지고, 하기로 구성된다:
1 - 형광으로 염색된 구획화되고 유동적으로 단리된 뉴런들의 두 개의 개별 군집들;
2 - 액손에 포커싱한 마이크로유체 포커싱 그루브로, 빔은 칩의 활성부를 향하고;
3 - 깔때기 형상 전극, 각 그루브에 대해 한 쌍; 및
4 - 겹침 영역.
활성 영역 또는 겹침 영역은 유도 및 푸싱 전극의 조합, 및 액손이 밀어올려질 수 있는 로컬 50 마이크론의 높은 마이크로그루브였다. 장치에서, 콜라겐은 그루브에서 선택적으로 주입되었고 세포체가 시딩되는 마이크로채널로부터 제거되었다. 채널 방향에서 액손 성장을 복돋기 위하여, 뉴런 구획들(도 21a의 좌측) 및 뉴런이 없는 뉴런 구획(우측)들 사이에서 정수압(HP) 차이를 유지하는 것은 액손 성장을 30% 이상 증가시켰다(HP가 없는 경우에 액손이 다른 구획과 연결되는데 8 내지 9일이 소모되었지만, HP가 있는 경우에는 5 내지 6일 소요되었다). 도 21a는 액손 가교 장치의 스티치 전달 사진(20배 확대)이다. 두 개의 유동적으로 단리된 뉴런 군집은 마이크로채널 내에 플레이팅되고 개별적으로 염색되었다. 구획화된 그루브는 삽도에서 강화되는 가교 영역을 향해 액손이 발달하고 집중하도록 한다. 이것은 실제 비접촉 겹침 영역 앞에서 액손 빔을 집중시키는 깔때기 전극으로 구성되었다. 기준자는 100마이크론을 지시한다.
어떤 전기장 또는 HP 없이, 액손 성장은 명확히 등방성이지만, 도 21b에서 보이는 바와 같이 초기 방향을 유지하는 것을 선호한다(형광 정량은 초기 채널의 방향과 동일한 방향에서 78±12%의 성장률을 보였다). 도 21b는 마이크로채널로부터의 정수압 또는 어떠한 전기장 없이 겹침영역의 형광 스티치 사진(20배 확대)을 보여준다. 기준자는 100 마이크론을 나타낸다. 액손 성장은 외부 그루브를 향하도록 유도되었고 모든 인접 그루브에 위치되었다. 이 경우에서, 두 개의 군집들 모두로부터의 신경돌기는 겹침영역에서 서로 겹쳤지만, 신경돌기들은 신경 연결을 형성했을 뿐만 아니라 모든 채널에서 돌출되었다. 반면에, 전기장이 활성화되고 HP가 21c에서 보는 바와 같이 유지되는 경우에, 겹침 영역은 명백히 액손의 빔에 포커싱을 맞추어서, 그들이 뉴런 연결을 형성하지 않고 겹쳐지고, 다른 채널에서 자라나고, 동일한 방향 내에서 그들의 성장을 증가시켰다. 도 21c는 전기장 활성화되고 정수압을 갖는 가교 영역의 형광 스티치 사진(20배 확대)을 보여준다. 기준자는 100 마이크론을 지시한다. 액손의 고도의 다발형성은 겹침 영역의 출구에서 관찰되었다. 각 상황의 인접 행렬은(각각 1 및 2) C1 및 C2로 주어진다.
Figure pct00006
대안으로, 뉴런 연결은 두 개의 대향 군집을 사용하여 만들어질 수 있다. 대향 뉴런의 두 개의 군집은 도 7d-e에서 보는 바와 같이 액손 가교 장치에서 양방향으로 연결되었다. 뉴런 연결을 구성하기 위하여, 전기장은 활성화되었고(150 kHz 및 4 Vpp) HP는 유출 수직 저장소에서 낮게 유지되었다. 이런 상황 각각의 인접 행렬은(각각 1 및 2) C1 및 C2로 주어진다.
Figure pct00007
실시예 12
이 실시예는 실시예 6-13에서 사용된 재료 및 방법을 설명한다.
동전기 장치의 마이크로제작
마이크로유체 칩은 표준 현미경 유리 슬라이드(25 x 75 x 1.1mm, Sigma) 상에서 제작되었다. 10/100nm Ti/Au 이중층은 e-빔 증착을 사용하여 표준 현미경 슬라이드 상에 증착되었다. 층은 표준 리소그래피를 사용하여 구조화되고 250mL H2O + 200mL HCl + 100mL HNO2 중에서 4분간 습식-식각되었다. 이어서, HCL:물(2:1)에서 10분간 제2 습식-식각은 잔류 티타늄을 제거하기 위하여 수행되었다.
마이크로채널은 두 가지 유형의 구성성분을 포함한다: 세포 주입을 위한 높은 채널(100 마이크론) 및 액손 성장을 위한 얕은 채널(5-50 마이크론 높이). 그들은, 얇은 저항(SU-8 2005) 및 두꺼운 저항(SU8-2050)으로 2단계 리소그래피 공정을 사용하여 제작된 SU-8(마이크로켐) 마스터로부터 몰딩되었다. 이후, 마이크로채널은 탈가스화되고 경화된 PDMS(Sylgard 184(Dow Corning)의 경화제와 9:1의 질량비)로 몰딩되었다. 마이크로그루브는 공기 플라스마 노출(2분) 및 메탄올 중에 침지(5분) 후에 양안 하에서 수동적으로 나란히 배열되었다. 조립된 칩은 100℃에서 30분 동안에 경화되었다. 초기 몰딩 이후에, 플라스틱 마스터는 장치의 추가적인 복제를 위해 제작되었다. 이후에, PDMS 금형은 입체현미경(M80, Leica)을 사용하여 전극에 나란히 수동적으로 배열되었고, 공기 플라즈마에 2분간 노출시킨 후 유리 기판에 결합시켰다. 조립된 칩은 80℃에서 30분 동안에 경화되었다.
몇몇 마이크로유체 칩은 이 방법으로 제작되었다. 콜라겐 스캐폴드에서 액손 성장에 교류 전기장이 미치는 효과를 평가하기 위하여, 2-구획 칩은 평면(길이: 600 마이크론; 폭 600 마이크론; 높이: 5 내지 50 마이크론 )의 배열에 의해 분리된 직사각형 마이크로채널(길이: 4000 마이크론; 폭: 500 마이크론; 높이: 100 마이크론)로 구성되었다. 액손 가교 칩은 사각형으로 배치된 4개의 내부 저장소(높이: 1000 마이크론, 높이: 100 마이크론)에 연결된 5-mm 구멍뚫린 유입 및 유출 저장소로 만들어진 4 구획 칩이었다. 각 저장소는 마이크로채널(길이: 500 마이크론; 폭: 50 마이크론; 높이: 5 마이크론)을 통해 다른 저장소에 연결되었다
표면 처리 및 코팅
(전극을 구비한)유리 기판을 세척하기 위하여, 유리 기판은 7X 세제(MP Biomedicals)로 1시간 동안 가열했고, 탈이온수로 10초간 세척한 뒤, 아세톤, 이소프로판올 및 탈이온수로 세척한 뒤, 마지막으로 200℃ 오븐에서 2시간 동안 구웠다. 구운 후에, 기판은 플라즈마-세척되었고 PDMS 마이크로유체에 결합되었다. 채널은 폴리-D-리신(0.1mg/ml, Sigma)으로 채워지고 적어도 20시간 동안 37℃에서 배양했다. 헐거워진 PDL을 제거하기 위하여, 채널은 주 채널을 비우지 않고 탈이온수로 2회 세척되었다. 이어서, 채널은 라미닌(20μg/ml, Sigma)으로 채워졌고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 라미닌은 흡입되었고, 채널은 Plating Media(DMEM + 10% FBS + 1% PS + 1% L-글루타민)으로 3회 이리저리 세척했다. 이런 방식으로 기능화된 칩은 37℃에서 세포 시딩하기 이전에 최대 2시간 동안 저장되었다. 해마 배양 배지는 2mM 글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 신경돌기 성장 배지-B27였다.
콜라겐 스캐폴드의 선택적 패턴화
콜라겐(10mg/ml, Gibco)은 1분간 완충용액(2M NaOH와 함께 2X PBS 중에 250mM HEPES, pH7.4)과 함께 얼음 상에서 혼합되었다. 콜라겐 대 완충용액의 비율은 원하는 최종 콜라겐 농도에 의존했지만, 1:1에 근접했다. 칩 안으로 피펫팅(pipetting) 하기 이전에, 클라겐 용액은 섬유 두께를 제어하기 위하여 얼음 상에서 10-30분 배양되었다.
첫 번째로, 결합된 칩은 폴리-d-리신 및 라미닌으로 기능화되어서 세포 저장소내에 뉴런 체세포의 접착을 가능하게 했다. 두번째로, 모든 마이크로유체 채널은 콜라겐 유형 I 용액이 스캐폴드 유입구를 통해서 채워졌고 완전히 겔화될 때까지 37℃에서 배양되었다. 그 후, 아세트산(0.2M, pH 3.5)은 콜라겐을 불안정화하기 위하여 세포 저장소 안으로 피펫팅되었다. 마이크로유체 채널이 산에 의해 식각되는 것을 방지하기 위하여, 정수압은 피펫팅 세포 배지에 의해 유입구 안으로 가해졌다. 37℃에서 식각된지 30분 후에, 불안정화된 스캐폴드는 세포 유출구를 통해 조심스럽게 흡입되었다. 산 및 잔류물을 제거하기 위하여, 채널은 버퍼 세포 배지로 3회 세척되었다. 도 22는 모세관 충전(22-1) 및 마이크로유체 패턴화(22-2)에서 사용된 프로토콜의 도해를 보여준다. 도 22a는 배지 저장소(점선), 세포와 스캐폴드 저장소(100μm) 및 마이크로채널(50μm)을 구비한 전자-마이크로유체 칩을 보여준다. 도 22b는 콜라겐으로 채워지고 구조의 완전한 겔화 후에 전자-마이크로유체 칩을 도해한다. 도 22c는 마이크로채널이 스캐폴드 채워진 저장소로부터 정수압의 적용에 의해 보호되지만 산이 세포 저장소를 식각 한 후의 전자-마이크로유체 칩을 도해한다. 도 22d는 불안정화된 스캐폴드가 흡입되고 과잉산 및 잔류물들이 완충 용액으로 제거된 후의 전자-마이크초유체 칩을 도해한다. 도 22e는 공정 및 시간으로부터의 시간이 지남에 따른 이미지이고, 500μm/분의 식각률은 유도될 수 있다. 그 결과, 스캐폴드는 전극 채널 및 배지 저장소에만 남아있고, 이와 동시에 세포 저장소는 비워지고 세포의 시딩을 위해 준비된다.
해부 및 세포 배양
모든 동물 작업은 허가되었고 동물보호에 관한 기관, 주, 및 연방 지침을 준수했다. 해마는 E18 Sprague Dawley 래트(Charles River 실험실)로부터 수확했고, 10 mM HEPES를 사용하여 pH 7.3으로 버퍼된 냉각 행크 평형 식염수(Hank's balanced salt solution, HBSS)에서 소화시켰다. 조직은 파파인(Worthington Biochem.) 20 U/ml를 함유하는 HEPES 버퍼된 HBSS 2 ml, 1 mM EDTA 및 1 mM L-시스테인 중에서 30분 배양에 의해 소화되었다. 다음으로, 조직은 8 ml의 해마 배양 배지로 3번 세척되었다. 세포는 1 ml의 해마 배양 배지 중에서 살살 빻았고, 혈구계산기로 카운트했고, 35,000 세포/mm2의 밀도로 플레이팅했다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 유지되었다. 세포 배지는 3일마다 50%를 새롭게 했다. 정수압을 유지하기 위하여, 뉴런 구획의 저장소는 매일 배지로 조직적으로 채워졌고, 다른 저장소들은 저장소 표면을 건조하지 않고 비웠다.
장치 내에 뉴런 시딩
시딩 이전에, 배지를 마이크로채널로부터 제거하지 않으면서 마이크로유체 칩의 저장소는 비워졌다. 각각의 유입/유출 저장소에 대하여, 6μL의 플레이팅 배지는 유출구에 배치되었고, 직후에, 4μL의 고밀도(>8 106 세포/mL) 수확 뉴런 용액은 주입 저장소에 배치되었다. 칩은 뉴런들이 코팅된 유리 상에 접착하도록 하기 위하여 5분간 다시 배양기에 넣었고, 시딩 공정은 3회 반복되었다. 마지막에서, 유입 및 유출 저장소는 해마 배양 배지로 신속히 채워졌고, 칩들은 다시 배양기에 넣었고, 실시예 5에서 설명된 교류 전기장을 가하기 위해 시험관 내 플랫폼 안에 연결되었다.
뉴런 트랜스펙션
각각의 형광 렌티바이러스에 있어서, tdTomato 또는 EGFP 중 어느 하나는 린디바이러스 전달 플라스미드 내에 CMV 프로모터 이후 및 마멋 간염 전사후 조절 요소(Woodchuck Hepatitis Posttranscriptional Regulatory Element, WPRE) 이전에서 복제되고 Stbl3 세포에서 증폭되었다. 바이러스를 제조하기 위하여, 낮은 통로에서(10 미만) 300만 HEK293FT 세포(Life Technologies)는 T-225 플라스크 내에서 10% FBS(Hyclone)로 보충된 DMEM 중에서 트랜스펙션되기 하루 전에 시딩되었다. 세포는 20 ug의 전달 플라스미드(tdTomato 또는 EGFP 중 어느 하나), 15 ug의 psPAX2 및 10 ug의 pVSVg(Addgene)와 함께 100 ul의 리포펙타민 2000과 200 ul의 Plus 시약(Life Technologies)를 사용하여 OptiMEM에서 트랜스펙션되었다. 6시간 후, 배지는 제거되었고, 10% FBS 및 1% BSA로 보충된 DMEM으로 교환되었다. 60시간 후, 상청액은 제거되었고 4℃에서 10분간 3000rpm에서 원심분리되었다. 이 상청액은 0.45 um 저단백질 결합 필터(Millipore)를 통과해 여과되었다. 300배 농도의 바이러스 입자를 달성하기 위하여, 여과된 렌티바이러스는 4℃에서 2시간 동안 24,000rpm에서 한외여과되었고(Sorvall), 이후에 1% BSA로 보충된 D10 중에 4℃에서 밤새도록 재현탁되었다. 앨리쿼트는 뉴런 형질도입시 까지 -80℃에서 저장되었다.
이미지 습득
이미지는 냉각된 CCD 카메라 LaVision ImagerQE(LaVision) 및 자동화 Ludl MAC 5000(Ludl)이 구비된 Axiovert 200M(Zeiss)를 이용하여 습득되었다. 현미경은 Metamorph 소프트웨어(Molecular Devisces)로 제어되었고 이미지는 ImageJ 및 Matlab(The mathworks) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 이미지들의 세트는 Fiji용 ImageJ 플러그인과 함께 스티치되었다.
뉴런의 수를 정량하기 위한 이미지 분석
뉴런체는 스티치된 이미지 상에서 ImageJ 플러그인 MOSAIC를 사용하여 세어졌다.
신경염의 편차 각도, 성장 속도 및 액손 높이를 정량하기 위한 이미지 분석
신경돌기 정렬 및 높이의 정량화는 다음과 같이 수행되었다: 콜라겐 스캐폴드를 갖는 하나의 채널을 함유한 세 개의 샘플의 이미지는 각 조건에 대해 분석되고 Matlab(MathWorks)를 사용하여 정량되었다. 하나의 샘플은 최소 50개의 수상돌기를 함유했다. 반사 강도의 역치값은 배경으로부터 신경돌기를 단리하기 위해 정의되었다. 각 수상돌기의 주된 축에 타원을 맞추는 것에 의해, 주된 채널 방향에 대한 신경돌기의 각도가 결정되었다. 정렬 방향에 평행한 수상돌기의 배향은 0°의 각도에 일치했다. 신경돌기의 각분포는 배향 각도의 상대적 빈도에 기초하고 가우시안 반치선폭(FWHM)에 맞추는 것에 의해 결정되었다. 초기 궤도의 편차는 신결돌기를 따라서 평가 지점에서의 각도가 이전에 50 마이크론일 때보다 10% 이상 변화하는 것으로 규정되었다. 편차는 이후 이러한 각도들 사이에 상대적 차이로 기록되었다. 각 신경돌기의 길이는 콜라겐으로 채워진 마이크로채널의 시작에서 끝날때까지 측정되었다. 추이에 따른 방향의 변화는 각 연장의 전체 길이를 따라 추적하는것에 의해 고려되었다. 고립되고 명백히 단리되는 신장은 다른 신장과의 혼합 가능성을 배제하기 위해서만 측정되었다. 성장 속도는 이러한 측정 사이에서 상대적 측정 길이를 시간의 흐름에 따라 나누는 것에 의해 평가되었다. 3-D에서 액손 높이는 Matlab에서 형광 공초점 이미지 스택의 후-처리에 의해 결정되었다. 스크립트는 노이즈를 제거하고 액손의 중심을 결정하기 위해 가우시안 필터를 함유했다. 플롯은 채널의 개별 슬라이스에서 검출된 중심을 함유한다.
통계적 분석
액손 정지 분석에 있어서, 차이점들은 두 개의 독립적인 실험으로부터의 짝없는 스튜던트 t-테스트에 의해 다루어졌고, 여기서 각 실험 조건은 중복하여 수행되었다. 모든 분석에 대해: * p-값<0.05; ** p-값<0.01; *** p-값<0.001.
실시예 13
이 실시예는 고강도 교류 전기장에서의 세포 생존능력 및 전극 내에서 발달하는 액손을 국한시키는 방법에 대해 설명한다.
고강도 교류 전기장에서의 세포 생존능력
고강도(E>105 V/m) 교류 전기장에 뉴런을 노출시키는 것은 액손의 발달에 해를 끼치는 결과를 가져올 수 있다. 이 문제를 다루기 위하여, 세포 및 신경돌기 외관은 명시야 현미경을 사용하여 실험 과정 동안에 매 24시간 동안 모니터링되었다. 또한, 상이한 전압에 대한 노출 후 세포 생존은 칼세인 AM(Invitrogen) 염색으로 조사되었다. 칼세인 AM은 효소 반응을 통해 생세포 내에서 형광을 띤다.
도 23a는 0-4 Vpp에 노출된 지 4일 후에 생존가능(형광) 세포의 수를 보여준다. 현저한 차이는 대조군, 2 Vpp 및 3 Vpp 사이에서 관찰되지 않았다. 오직 세포의 일부만 4 Vpp에서 생존했다. 도 23a는 상이한 전압에서 평균 생존가능 세포의 수에 대한 그래프이다. 도 23b는 3 Vpp에서 생존가능 세포 배양을 보여준다. 도 23c는 4 Vpp에서 약간의 상호연결을 가진 둥근 흰색의 뉴런을 보여준다. 도 23d는 대조군 채널에서 건강한 신경돌기를 보여준다. 도 23e는 4 Vpp에서 둥글고 불규칙한 신경돌기를 보여준다. 세포 저장소의 명시야 이미지는 4 Vpp에서 건강하지 않은 배양(흰색 및 둥근 세포, 약간의 상호연결)(도 23c)에 비해 3 Vpp에서 건강한 세포 배양(도 23b)을 보여줬다. 동일한 관찰은 마이크로채널에서 액손에 대해서 만들어질 수 있다. 대조군 채널로부터의 생존가능한 액손에 비해(도 23d), 4 Vpp 인가전위를 갖는 전극 옆에서 성장하는 액손은 그 수가 더 적었고 둥글고 불규칙한 성장을 보였다.
실시예 2에서 설명된 모델에 따르면, 배지의 가열을 포함하는 전기유체역학적 효과는 3 Vpp 초과의 전압에 대해 깊은 연관성을 갖게 된다. 이는 세포 생존능 실험의 관찰과 부합되었다. 그러나, 일부 실험에서, 세포체는 몇일 후에 응집되었다. 이는 아마도 세포 접착 분자(PDL 및 라미닌)의 분해 또는 부족한 증착 및 전기장 효과에 연결되지 않은 것이 원인이었다.
세포 생존능에 대한 교류 동전기의 영향은 배지의 과도한 가열이 이루어지지 않은 중간정도의 전압에 대하여 최소였다.
전극 내에서 발달하는 액손의 국한
뉴런이 전극들 사이에 배치되는 경우에, 액손은 전기장의 부근에서 발달하고, 도 24에서 보여지는 바와 같이 전극들의 모서리 사이에서 국한된다.
본 발명의 몇몇 실시예는 본원에서 설명되고 구현되었지만, 당해 분야의 통상의 기술자는 기능을 수행하고/수행하거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 상상할 것이고, 각 변형물 및/또는 개조물은 본 발명의 범위내에 있는 것으로 생각된다. 더 일반적으로, 통상의 깃루자는 본원에서 설명된 모든 파라미터, 크기, 재료, 및 구성은 예시적인 것이고, 실제 파라미터, 크기, 재료 및/또는 구성은 특정 응용 또는 본 발명의 교시가 사용되기 위한 응용에 의존할 것이라고 쉽게 인식할 것이다. 통상의 기술자는 본원에 설명된 본 발명의 특정 실시예에 대한 많은 등가물을 단지 일반적인 실험을 사용하여 인식하거나 알 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시예는 예시의 방식으로 제시되는 것이고, 구체적으로 설명되고 청구된 범위만이 아니라 본 발명은 첨부된 청구항의 범위 및 그의 등가물 내에서 실시될 수 있다. 본 발명은 각 개별적 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 설명된 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법 중 두 개 이상의 임의의 조합은, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 한, 본 발명의 범위내에 포함된다.
본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 부정 관사 "a" 및 "an"는 특별히 지시되지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본원 명세서 및 청구범위에서 사용된 관용구 "및/또는"은 연결된 요소, 즉 일부 경우에서 결합하여 제시되거나 다른 경우에서 분리적으로 제시되는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 다른 요소들이 "및/또는" 절에 의해 특별히 식별되어 이러한 요소들이 연관되거나 연관되지 않은 것이 특별히 식별되는 것을 제외하고, 명백히 지시되지 않는 한, 다른 요소들은 임의적으로 제시될 수 있다. 따라서, 비-제한 예로서, "A 및/또는 B"이 개방형 언어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우에, 일 실시예로서, B 없는 A(B 외에 다른 요소를 임의적으로 포함함); 또 다른 실시예에서, A 없는 B(A 외에 다른 요소를 임의적으로 포함함); 또 다른 실시예에서, A와 B 모두(다른 요소들을 임의적으로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
본원 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 리스트에서 구성을 분리하는 경우에, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석될 수 있는데, 즉, 많은 요소들 또는 나열된 요소들 중 적어도 하나를 포함하고 또한 하나 이상을 포함하는 것으로, 그리고 임의적으로 추가적인 나열되지 않은 구성을 포함하는 것으로 해석될 것이다. 청구항에 사용된 "~중 하나만" 또는 "~중 정확히 하나"와 같은 오직 명백히 지시된 용어, 또는 "~로 구성되는"은 다수의 또는 나열된 요소들 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "~중 하나", "~중 오직 하나", 또는 "~중 정확히 하나"와 같은 배타성의 용어에 의해 선행되는 경우에 배타적인 대체물을 지시하는 것(즉, 이것 또는 저것, 그렇지만 둘 모두는 아님)으로 해석될 것이다. "~로 본질적으로 구성되는"이 청구항에서 사용되는 경우에, 그 의미는 특허에서 사용된 통상적인 의미이다.
본원 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 요소들의 나열과 관련하여 사용된 관용구 "적어도 하나"는 나열된 요소들 중 임의의 하나 이상의 요소들로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 나열된 요소들 내에서 특별히 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 필수적으로 포함하는 것이 아니고 나열된 요소들 중에 요소들의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이런 정의는 "적어도 하나"가 지시하는 나열된 요소들 내에서 특이적으로 식별된 요소들 외에 이러한 특이적으로 식별된 요소들과 연관되거나 연관되지 않은 요소들이 임의적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비-제한 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는, 등가물로 "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 등가물로 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시예에서, B가 존재하지 않고 하나 이상을 임의적으로 포함하는 적어도 하나의 A(그리고 B 이외에 다른 요소들을 임의적으로 포함함); 또 다른 실시예에서, A가 존재하지 않고 하나 이상을 임의적으로 포함하는 적어도 하나의 B(그리고 A 이외에 다른 요소들을 임의적으로 포함함); 및 또 다른 실시예에서, 하나 이상을 임의적으로 포함하는 적어도 하나의 A, 및 하나 이상을 임의적으로 포함하는 적어도 하나의 B(그리고 다른 요소들을 임의적으로 포함함); 등을 지시할 수 있다.
상기 본원 명세서뿐만 아니라 청구항에서, "포함하는(comprising)", "포함하는(including)", "보유하는(carrying)", "갖는(having)", "함유하는(containing)", "수반하는(involving)", "유지하는(holding)" 등은 개방형, 즉 포함하지만 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 할 것이다. 오직 "구성되는(consisting of)" 및 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 미국특허청 심사지침서 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형일 것이다.

Claims (81)

  1. 하나 이상의 신경돌기를 포함하는 뉴런을 제공하는 단계;
    교류 전기장을 제공하는 단계; 및
    교류 전기장을 이용하여 하나 이상의 신경돌기의 신장을 지향적으로 유도하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 교류 전기장을 사용하여 신경돌기의 신장을 지향적으로 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 두 개 이상의 전극에 의해 생성된 전기장을 이용하여 신경돌기의 성장에 영향을 미치는 단계를 포함하되,
    상기 전극 간의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 신경돌기 근방에서 약 100 V/m 이상의 규모를 가진 전기장을 이용하여 다중-지향적인 신경돌기의 성장에 영향을 미치는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 신경돌기를 포함하는 뉴런을 제공하는 단계;
    신경돌기의 성장을 역으로 저지할 수 있는 물리적 유도 신호(physical guidance cue)를 제공하는 단계; 및
    물리적 유도 신호를 사용하여 신경돌기의 성장을 제어하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 배향으로의 신경돌기의 성장을 허용하는 단계; 및
    신경돌기에 비-기계적으로-작동된 물리적 유도 신호(non-mechanically-actuated guidance cue)를 가하여, 신경돌기의 성장이 제2 배향으로 일어나도록 신경돌기에 영향을 미치는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계.
  7. 하나 이상의 신경돌기를 각각 포함하는 하나 초과의 뉴런을 제공하는 단계;
    전기장을 제공하는 단계;
    다른 신경돌기와 독립적으로 신경돌기를 제어하는 단계;
    하나 초과의 뉴런으로부터 신경망을 형성하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진할 수 있는 챔버;
    챔버에 연결되며 약 20 마이크론 이하의 폭 및/또는 높이를 갖는 채널; 및
    복수의 전극쌍을 포함하되,
    상기 전극쌍은 약 200 마이크론 이하의 중심 간격을 갖는 두 개의 전극을 포함하고; 그리고
    상기 복수의 전극쌍은 채널을 교차하는 것을 특징으로 하는 물품.
  9. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    일 방향성 뉴런 연결을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    액손 다이오드를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 재구성 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    2차원으로 신경돌기 신장을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    3차원으로 신경돌기 신장을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장의 규모가 100 V/m 미만인 채널로의 성장을 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장을 변화시키는 것에 의해 신경돌기의 성장을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 교류 전기장인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장의 규모는 약 100 V/m 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장의 빈도는 약 100 Hz 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기의 성장에 영향을 미치는 단계는 신경돌기 성장을 저지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 전극들 사이의 중심 간격이 약 200 마이크론 이하인 두 개 이상의 전극에 의해 생성되는 것읕 특징으로 하는 방법.
  21. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신장을 지향적으로 유도하는 단계는 3차원 스캐폴드 내에서 신경돌기 성장을 지향적으로 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 겔 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기 성장에 영향을 미치는 단계는 본질적으로 동일한 조건하에서 전기장의 부재에서의 신경돌기 신장에 비해 신경돌기 신장을 가속화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기 성장에 영향을 미치는 단계는 제1 배향으로 신경돌기 신장을 역으로 저지하는 단계 및 제2 배향으로 신경돌기 신장을 허용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 배향은 생성된 전기장에 수직인 전극의 축에 대하여 90° 이상의 각도에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 배향은 xy 평면 중에 있고, 제2 배향은 yz 또는 xz 평면 중에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    물리적 유도 신호는 비-기계적으로-작동된 유도 신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    뉴런은 해마 뉴런(hippocampus neurons), 후근 신경절(dorsal root ganglion), 및 망막 신경절 뉴런(retinal ganglion neurons)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 비-균일한 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 채널은 3차원 스캐폴드를 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  32. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 겔 매트릭스인 것을 특징으로 하는 물품.
  33. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  34. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    채널의 높이는 약 20 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  35. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    채널의 높이는 약 10 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  36. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전극쌍은 두 개의 평행한 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  37. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    중심 간격은 약 100 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  38. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    중심 간격은 약 50 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  39. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    생세포는 뉴런인 것을 특징으로 하는 물품.
  40. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    생세포는 해마 뉴런(hippocampus neurons), 후근 신경절(dorsal root ganglion), 및 망막 신경절 뉴런(retinal ganglion neurons)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 물품.
  41. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    복수의 전극쌍은 3차원 스캐폴드 내에 함유되지 않은 것을 특징으로 하는 물품.
  42. 유도 신호를 사용하여 제1 신경돌기가 제2 신경돌기와 겹쳐지도록 유발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제2 신경돌기와 겹쳐지도록 신경돌기의 성장을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 3차원 스캐폴드 내에서, 전기장을 사용하여 신경돌기들의 제1 및 제2 군집 사이에서 신경망을 형성하도록 제1 신경돌기 및 제2 신경돌기의 신장을 지향적으로 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 3차원 스캐폴드 내에서, 전기장을 사용하여 신경돌기 신장을 가속화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1 채널에 연결된 제1 챔버;
    적어도 제1 채널의 일부와 나란히 배열된 제1 전극쌍;
    제2 채널과 연결된 제2 챔버; 및
    적어도 제2 채널의 일부와 나란히 배열된 제2 전극쌍
    을 포함하되,
    상기 제1 전극쌍의 일부는 적어도 상기 제1 챔버의 일부와 겹쳐지고, 상기 제2 전극쌍의 일부는 적어도 상기 제2 챔버의 일부와 겹쳐지며,
    상기 제1 채널 및 상기 제2 채널은 약 10 마이크론 초과의 높이를 갖는 겹침 영역(overlap region)에서 교차하는 것
    을 특징으로 하는 물품.
  47. 제1 챔버 및 제2 챔버에 연결된 제1 채널; 및
    적어도 제1 채널의 일부와 나란히 배열된 제1 전극쌍
    을 포함하되,
    상기 제1 전극쌍의 일부는 적어도 상기 제1 챔버의 일부와 겹쳐지고,
    제1 전극쌍 사이의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하인 것
    을 특징으로 하는 물품.
  48. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 채널과 나란히 배열된 제2 전극쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  49. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 전극쌍은 제1 채널에 실질적으로 평행한 것을 특징으로 하는 물품.
  50. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 전극쌍은 제2 채널에 실질적으로 평행한 것을 특징으로 하는 물품.
  51. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 전극쌍은 제1 전극쌍에 실질적으로 수직인 것을 특징으로 하는 물품.
  52. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 채널은 약 10 마이크론 이상의 높이를 갖는 것을 특징으로 하는 물품.
  53. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    겹침 영역의 높이는 약 500 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  54. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 전극쌍의 일부는 적어도 제2 챔버의 일부와 겹쳐지는 것을 특징으로 하는 물품.
  55. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 전극쌍의 일부는 적어도 제2 챔버의 일부와 겹쳐지는 것을 특징으로 하는 물품.
  56. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 전극쌍 사이의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 물품.
  57. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장을 가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  58. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    생세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  59. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    생세포는 해마 뉴런(hippocampus neurons), 후근 신경절(dorsal root ganglion), 및 망막 신경절 뉴런(retinal ganglion neurons)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 물품.
  60. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 채널은 3차원 스캐폴드를 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  61. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 겔 매트릭스인 것을 특징으로 하는 물품.
  62. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  63. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 및 제2 전극 사이의 중심 간격은 약 200 마이크론 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 교류 전기장인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장의 규모는 약 100 V/m 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장의 빈도는 약 100 Hz 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 및 제2 챔버는 생세포를 보유하고 세포 성장을 촉진하도록 구성되고 배열되는 것을 특징으로 하는 물품.
  68. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    겹침은 3차원 스캐폴드 내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 신경돌기는 제2 신경돌기와 다른 뉴런으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제2 신경돌기는 신경돌기와 다른 뉴런으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    성장을 유도하는 단계는 유도 신호를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    유도 신호는 물리적 유도 신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    유도 신호는 전기장인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 교류 전기장인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    제1 및 제2 신경돌기가 겹쳐지는 경우에, 제1 신경돌기의 10% 미만이 제2 신경돌기와 신경 연결을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기는 신경 연결을 형성함 없이 제2 신경돌기와 겹쳐지는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기는 해마 뉴런(hippocampus neurons), 후근 신경절(dorsal root ganglion), 및 망막 신경절 뉴런(retinal ganglion neurons)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 뉴런으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 겔 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    스캐폴드는 콜라겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    전기장은 비-균일한 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 선행하는 청구항들 중 어느 한 청구항에 있어서,
    신경돌기는 액손인 것을 특징으로 하는 방법.
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