CN105025980B - 用于动态可配置神经网络的神经突生长的电动力约束 - Google Patents

用于动态可配置神经网络的神经突生长的电动力约束 Download PDF

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Abstract

总体描述了用于改变神经突生长的系统和方法。在某些实施方案中，系统可以包括包含神经突的神经元和能够产生物理导向因子的电极。物理导向因子可以被用于改变神经突的生长并且在时间上和在空间上可以是动态的，使得神经突生长能以空间方式和/或时间方式改变。神经突生长的动态控制可以被用于形成方向性的神经连接、交叉部和/或重叠。系统包括能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室；通道，其中通道被连接于室，其中通道具有小于或等于约20微米的高度和/或宽度；以及交叉通道的至少一个电极对，其具有小于或等于约200微米的中心到中心电极间距，并且其中的多个电极对交叉通道。

Description

用于动态可配置神经网络的神经突生长的电动力约束
相关申请
本申请要求于2013年1月14日提交且名称为“Electrokinetic Confinement ofNeurite Growth for Dynamically Configurable Neural Networks”的美国临时专利申请第61/752,183号的优先权，将其整体通过引用并入本文以用于各种目的。
政府资助
本发明在政府支持下并利用国家科学基金会授予的编号为DBI-0852654的资助金和国家卫生研究院授予的编号为RO1-NS066352的资助金完成。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
提供了用于改变神经突生长的系统和方法。
背景技术
在体内发育神经突同时经受在空间上和时间上变化的导向因子的影响。这些导向因子使神经元能够形成功能性的神经网络。例如，来自非洲爪蟾蜍(Xenopus)幼体中的视网膜神经节细胞的早期的神经突在视神经交叉处交叉呈十字形以形成对侧的连接，但是某些之后的神经突由于增高的ephrin-B型配体表达被从中线排斥，并且不交叉。研究和操纵这样的过程要求能够随着神经突发育同时在时间和空间上提供控制的方法和系统。此外，同时还需要能够形成具有分布在短距离上的几个神经突的小神经网络和具有分布在较长距离上的数量较多的神经突的大神经网络的可扩展的方法和系统。现有的方法不能够动态地改变神经突发育和/或不容易扩展。因此，需要改进的方法和系统。
发明内容
提供了用于改变神经突生长的系统和方法。本发明的主题涉及，在某些情况下的，相互有关的产品、对特定的问题的可选择的解决方案和/或一个或多个系统和/或产品的多个不同的用途。
在实施方案的一个集合中，一系列的方法被提供。在一个实施方案中，方法包括提供包括一个或多个神经突的神经元，提供交变电流电场，以及使用交变电流电场定向引导一个或多个神经突的伸长。
在另一个实施方案中，方法包括使用交变电流电场定向引导神经突的伸长。
在另一个实施方案中，方法包括使用由两个或多于两个电极产生的场影响神经突的生长。电极之间的中心到中心间距小于或等于约200微米。
在另一个实施方案中，方法包括使用电场在多个方向影响神经突的生长。电场在神经突的附近具有大于或等于约100V/m的强度。
在另一个实施方案中，方法包括提供包括神经突的神经元，提供物理导向因子，以及使用物理导向因子控制神经突的生长。物理导向因子能够可逆地阻止神经突的生长。
在另一个实施方案中，方法包括允许神经突在第一取向上的生长以及把非机械致动的物理导向因子应用于神经突，由此影响神经突使得神经突的生长在第二取向上发生。
在另一个实施方案中，方法包括提供多于一个神经元，其中每个神经元包括一个或多个神经突。方法还包括提供电场，独立于另外的神经突而控制一个神经突，以及由所述多于一个神经元形成神经网络。
在一个实施方案中，方法包括使用导向因子使第一神经突与第二神经突重叠。
在另一个实施方案中，方法包括引导神经突的生长使其与第二神经突重叠。
在一个实施方案中，方法包括使用电场在三维支架(scaffold)内定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
在另一个实施方案中，方法包括使用电场在三维支架内加速神经突伸长。
在实施方案的另一个集合中，一系列的产品被提供。在一个实施方案中，产品包括能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室、通道、以及多个电极对。通道被连接于室并且通道具有小于或等于约20微米的高度和/或宽度。一个电极对包括具有小于或等于约200微米的中心到中心间距的两个电极。所述多个电极对交叉通道。
在另一个实施方案中，产品包括连接于第一通道的第一室、与第一通道的至少一部分对准的第一电极对、连接于第二通道的第二室、以及与第二通道的至少一部分对准的第二电极对。第一电极对的一部分可以与第一室的至少一部分重叠并且第二电极对的一部分可以与第二室的至少一部分重叠。在某些例子中，第一通道和第二通道在具有大于约10微米的高度的重叠区处交叉。
在另一个实施方案中，产品包括连接于第一室和第二室的第一通道以及与第一通道的至少一部分对准的第一电极对。在某些例子中，第一电极对的一部分与第一室的至少一部分重叠并且第一电极对之间的中心到中心间距小于或等于约200微米。
根据本发明的各种非限制性的实施方案的以下的详细描述，同时参照附图考虑，本发明的其他的优点和新颖的特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文献包括矛盾的和/或不一致的公开内容的情况下，本说明书应当主导。
附图说明
本发明的非限制性的实施方案将参照附图以实施例的方式被描述，附图是示意性的并且不旨在按比例进行绘制。在附图中，被图示的每个相同的或近似地相同的部件通常由单个数字表示。为了清楚的目的，不是每个部件都在每个附图中被标记，也不是所示出的本发明的每个实施方案的每个部件都在每个附图中被标记，在这些情况下，图示对于使本领域的技术人员理解本发明不是必需的。在附图中：
图1A-E图示了大体上涉及改变神经突生长的本发明的某些实施方案；
图2A-D图示了大体上涉及形成神经连接的本发明的某些实施方案；
图3图示了根据本发明的一个实施方案的神经网络；
图4图示了根据本发明的各种实施方案的电系统；
图5A-B图示了根据本发明的某些实施方案的用于改变神经突生长的装置；
图6图示了根据本发明的各种实施方案的神经突生长；
图7图示了根据本发明的一个实施方案的神经突生长；
图8A-B图示了根据本发明的一个实施方案的装置部件的特征；
图9A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
图10A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
图11A-B图示了根据本发明的一个实施方案的模型的特征；
图12图示了根据本发明的各种实施方案的用于形成神经连接的装置；
图13图示了根据本发明的某些实施方案的神经突的生长；
图14A-B图示了根据本发明的一个实施方案的动作电位记录和荧光图像；
图15A-B图示了根据本发明的某些实施方案的装置部件的特征。
图16图示了根据本发明的某些实施方案的用于改变神经突生长的装置；
图17图示了大体上涉及改变神经突的取向的本发明的某些实施方案；
图18图示了大体上涉及指引在某个区中的神经突生长以及加速神经突伸长的本发明的某些实施方案；
图19图示了大体上涉及减慢神经突伸长的本发明的某些实施方案；
图20图示了大体上涉及改变神经突的取向的本发明的某些实施方案；
图21A-G图示了根据本发明的一个实施方案的用于引导神经突的装置；
图22图示了根据本发明的某些实施方案的使用支架填充通道的方法；
图23图示了根据本发明的一个实施方案的对于各种电压的细胞活力和在各种电压的细胞的图像的图；
图24图示了根据本发明的某些实施方案的在电极对之间的区中的神经突生长。
具体实施方式
本发明大体上涉及一个或多个神经元的神经长出。用于改变神经突生长的系统和方法被总体描述。在某些实施方案中，系统(例如微流体性的系统)可以包括具有神经突(例如轴突)的神经元和能够产生物理导向因子(例如电运动力)的部件。物理导向因子可以被用于改变神经突的生长并且可以在时间上和在空间上是动态的，使得神经突生长能够以空间和/或时间的方式被改变。在某些例子中，部件可以是电极并且物理导向因子可以是由电场(例如交变电流电场)产生的电运动力。在某些情况下，系统可以包括多于一个神经元，每个神经元包括一个神经突。在某些这样的情况下，一个或多个物理导向因子可以被用于形成神经突之间的单向的连接。这些系统可以非常好地适合于在神经突生长、神经信号传递和形成面向工程的神经网络的定量研究中的应用，但是这些系统也可以在其他的应用中使用。
在活体生物中的神经突生长通过导向因子被指引，导向因子的表达同时在空间上和时间上变化，以形成功能性的神经连接。现有的用于研究神经突生长和/或形成神经连接的系统和方法使用静态的几何构型，并且不能够动态地改变在神经突上应用的导向因子。此外，这些系统和方法中的许多不能够被容易地扩展以由跨越很大的距离的大量的神经突形成神经网络。
已经发现，在本发明的某些实施方案的背景下，对神经突生长和面向可扩展的神经网络的形成的空间和时间控制可以使用动态的物理导向因子(例如电动力的现象)被实现。神经突生长的动态控制开启了多种应用，所述应用的范围从发育生物学(例如发育神经科学)到再生性的装置(例如用于周围神经损伤的设备)。
用于使用动态的物理导向因子改变神经突(例如轴突、树突)的装置的一个实施例在图1A中示出。如在图1A中例证性地示出的，装置10可以容纳包括一个或多个神经突20的位于室25中的神经元15。装置可以包括室25，其能够容纳活细胞并且促进细胞生长，神经突可以在其中生长的通道30，和能够产生物理导向因子的电极35。在某些实施方案中，室和通道可以被配置为使得神经元细胞体16被约束于室，同时一个或多个神经突可以生长到通道30中。在一个实施例中，通道可以具有小于神经元细胞体但大于神经突的平均尺寸的尺寸(例如高度、宽度、横截面积)。通道的尺寸，在某些例子中，也可以限制占据通道的神经突的数量和神经突的方向性。例如，通道的横截面积可以允许单个神经突占据通道。在其它的例子中，通道的横截面积可以允许多个神经突(例如神经突的集群)占据通道。在某些实施方案中，通道可以起作用以通过把神经突生长约束至一个维度而限制神经突的方向性。例如，如在图1B-1D上示出的，把室25连接于第二室25-2的通道30的宽度防止神经突改变取向。因此，进入通道30的正在生长的神经突将朝向室25-2伸长。在其他的实施方案中，通道可以允许多维度的生长，例如方向和平面的改变。在某些例子中，神经突和神经元细胞体可以在通道30中生长。
在某些实施方案中，电极35中的一个或多个可以交叉通道30的至少一部分。在某些情况下，一个或多个电极可以交叉所有的通道，而在其他的情况下，一个或多个电极可能不交叉所有的通道。在某些实施方案中，电极相对于通道的取向(例如夹角)影响神经突生长在物理导向因子存在时如何被改变。例如，在其中物理导向因子是力的实施方案中，电极的取向可以决定力的方向。在一个实施例中，当电极垂直于通道(即90°夹角)时，如在图1A中示出的，平行于通道的力可以被产生。应当理解，电极不施加对神经突生长的物理阻挡并且可以被用于产生非接触的(即无接触的)物理导向因子。
在某些实施方案中，一个或多个电极可以与一个或多个通道的至少一部分对准和重叠。在某些情况下，一个或多个电极的整个的长度可以与一个通道对准和重叠，而在其他的情况下，一个或多个电极的长度的一部分可以不与通道对准和/或重叠。在某些实施方案中，电极相对于通道的取向(例如一个或多个电极与通道平行对准和重叠)影响神经突生长在物理导向因子存在时如何改变。例如，在某些实施方案中，电极的取向可以把神经突生长约束于特定的区、路径和/或平面。
在某些实施方案中，电场36(例如，交变电流电场、直流电电场)在两个电极(即电极对)之间产生，如在图1A中示出的。电场可以产生一个或多个可以改变神经突的生长的物理导向因子(例如电动力的现象、焦耳加热)。在某些实施方案中，物理导向因子可以被集中至特定的附近位置处(例如，在电极之间、邻近电极)。例如，物理导向因子的产生可能要求电场高于某个强度(例如100V/m)。物理导向因子不可能在低于电场门限强度的区域中产生。
改变装置10中的神经突生长的一个实施例在图1B-1D中示出。如例证性地在图1B中示出的，装置10可以容纳位于能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室25中且具有第一神经突20-1和第二神经突20-2的神经元15。电极35交叉通道30的一部分。图1B示出了生长期之后在装置10中的神经突20-1和20-2的生长的示意性表示。在生长期期间，神经突20-1和20-2分别地生长到通道30-1和30-2中，并且朝向室25-2伸长。在某些实施方案中，在电极35A和35B之间施加电压，以产生防止神经突20-1经过电极35B伸长的物理导向因子。神经突20-2在物理导向因子不存在时可以伸长至室25-2，如在图1B中示出的。
改变神经突生长的另一个实施例在图1E中进行了图示。如在图1E中示出的，装置100可以容纳位于能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室125-1中的具有多个神经突(例如，120-1、120-2、120-3、120-4)的神经元。在某些实施方案中，装置可以包括电极。在某些实施方案中，一个或多个电极的至少一部分可以与通道重叠。例如，如在图1E中图示的，两个电极对，电极对135和电极对136，的一部分可以与室重叠。在某些实施方案中，由电极产生的物理导向因子可以指引一个或多个神经突(例如，120-1、120-2、120-3)从神经元伸长到电极对之间的区。在某些例子中，电极的至少部分可以与通道130的至少一部分重叠并对准。例如，如在图1E中图示的，电极135A和136A与通道130的一部分对准并重叠。在某些实施方案中，所述一个或多个电极可以实质上平行于通道的壁。在某些例子中，电极的一部分可以实质上平行于通道的壁。在生长期期间，神经突120-1、120-2、120-3、和120-4生长到通道130中并且朝向室125-2伸长。在某些实施方案中，电压被施加于电极135A和136A，以产生把生长(例如伸长)约束在电极135A和136A之间的区内并且防止神经突120-1、120-2和120-3在被通道130界定的整个区内生长的物理导向因子。神经突120-4在物理导向因子不存在时可以在电极135A和136A之间的区的外部的区中生长。
在某些实施方案中，被约束在电极之间的神经突可以具有与在实质上相同的条件(培养环境、温度、压力、湿度等等)下的不被约束在电极之间的神经突相比的增强的(例如加速的)生长(例如伸长)。在某些这样的实施方案中，平行于电极对的至少一部分(例如与通道对准并且重叠的部分)测量的神经突的长度可以大于在电极对的外侧(即不被约束在电极对内)但是在实质上相同的条件下培养的神经突的长度。不希望被理论限制，相信，神经突生长被增强，因为被物理导向因子(例如电场)导致的力限制神经突的生长锥的有效的探测区域。与其有效探测区域不被限制的神经突相比，区域的减少减少了被花费在探测环境的时间总量。在某些实施方案中，神经突伸长可以使用电场在三维支架内加速。在某些这样的实施方案中，用于产生场的电极可以不被容纳在支架内。
在某些实施方案中，神经突的生长的改变可以是可再配置的，如在图1C-D中图示的。图1C示出了包括具有在通道30中生长的神经突的多个神经元的装置10的图像。电极35在通道30-3交叉通道30并且产生在通道30-3中的物理导向因子。在某些实施方案中，在通道30-3中生长的神经突被防止伸长经过电极35B朝向室25-2，如由空心箭头指示的。在不交叉电极的通道30-4中生长的神经突可以朝向室25-2伸长，如由实心箭头指示的。在某些实施方案中，关闭电压消除物理导向因子，这可以逆转神经突生长的改变。如在图1D中示出的，在物理导向因子消除之后，在通道30-3中的神经突可以朝向室25-2伸长，如由实心箭头指示的。
如本文描述的，神经突生长可以使用物理导向因子被改变。改变神经突生长可以涉及改变神经突的一个或多个生长特性。例如，神经突长度和取向二者都可以被改变。在某些例子中，实质上神经突生长的所有的特性都可以被改变。神经突特性的非限制性的示例包括生长速率、神经突长度、取向(例如方向)、位置(例如平面、尺寸)和生长锥特性(例如，肌动蛋白极化)。其他的生长特性也是可能的。通常，任何合适的生长特性都可以被改变。
在某些实施方案中，术语因子或导向因子具有本领域的技术人员已知的一般含义。因子可以指可以被神经元细胞体或神经突接收到并且被该神经元细胞体或神经突翻译为关于一个或多个生长特性的指令的信号(化学物、力等等)。导向因子可以指在被神经元细胞体或神经突翻译为关于一个或多个生长特性的指令之后，根据在实质上相同的条件但是不存在该因子的情况下的所述生长特性的正态统计分布改变一个或多个生长特性、并且允许所述生长特性被改变或控制的因子。在某些例子中，引导或影响神经突生长可以涉及改变一个或多个生长特性在延长的时间时期内的正态统计分布(例如，至少约一个小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约1日、至少约2日、至少约4日、至少约一周)。
在某些实施方案中，物理导向因子具有本领域的技术人员已知的一般含义。例如，在某些实施方案中，物理导向因子是非化学信号，其可以被神经突接收到并且被该神经突翻译为关于一个或多个生长特性的指令。物理导向因子的非限制性的示例包括电动力现象(例如，介电电泳、电渗透、电热效应)、能量(例如热能)、机械力(例如被流体流动产生的、与结构阻挡物的相互作用)、非机械致动的力、光学因子及其组合。应当理解，虽然物理导向因子可以不涉及化学物种对神经突的直接应用，物理导向因子可以产生化学物种和/或使化学物种改变神经突生长。在某些实施方案中，非机械致动的力可以指不起源于一个或多个机械致动元件或不由一个或多个机械致动元件(例如机械致动以自旋的粒子)产生的非接触力。在某些实施方案中，物理导向因子可以起源于不直接接触神经突和/或用作对神经突生长的物理阻挡的一个或多个元件或由其产生。
物理导向因子用于改变神经突生长的方式可以取决于多种因素，例如围绕神经突的几何约束(例如，结构阻挡物)、哪些生长特性被影响、其他的导向因子的存在、物理导向因子的强度、物理导向因子的空间性质和/或时间性质，等等。在其中存在多于一个神经突的实施方案中，物理导向因子用于改变神经突生长的方式可以不同于另一个神经突和/或对于一个神经突的生长改变的结果可以不同于另一个神经突。在某些情况下，该方式和结果可以是实质上相同的。因此，神经突生长改变的结果可以根据实施方案变化。
例如，在某些实施方案中，改变神经突生长可以涉及影响神经突的生长，使得至少一个生长特性不同于神经突的自然生长特性。在某些实施方案中，改变神经突生长可以导致对一个或多个生长特性的控制(例如神经突长度、生长方向、生长速度)。在一个实施例中，物理导向因子可以决定神经突的生长速率并且可以可逆地抑制或阻止生长，例如，如在图1A-B中图示的。在另一个实施例中，如在图1E中图示的，物理导向因子可以增强(例如加速)神经突的生长速率。在某些实施方案中，物理导向因子的对生长速率的影响可以通过比较在物理导向因子存在时所生长的神经突的延伸长度与在实质上相同的条件下且物理导向因子不存在时所生长的神经突的延伸长度的比较而进行量化。例如，在其中物理导向因子抑制或阻止生长的实施方案中，在物理导向因子(例如非接触的物理导向因子)的存在下所生长的神经突的延伸长度与在物理导向因子不存在时所生长的神经突的延伸长度的比率小于或等于约1:1，小于或等于约0.8:1，小于或等于约0.6:1，小于或等于约0.5:1，小于或等于约0.4:1，小于或等于约0.2:1，或小于或等于约0.1:1。
在其中物理导向因子增强生长的实施方案中，在物理导向因子(例如非接触的物理导向因子)存在时所生长的神经突的延伸长度与在物理导向因子不存在时所生长的神经突的延伸长度的比率可以大于或等于约1:1，大于或等于约1.2:1，大于或等于约1.3:1，大于或等于约1:5，大于或等于约1.8:1，大于或等于约2:1，大于或等于约3:1，大于或等于约4:1，大于或等于约5:1，大于或等于约6:1，大于或等于约7:1，或大于或等于约8:1。在某些实施方案中，该比率可以小于或等于约10:1，小于或等于约9:1，小于或等于约8:1，小于或等于约7:1，小于或等于约6:1，小于或等于约5:1，小于或等于约4:1，或小于或等于约2:1。上文提到的范围的所有的组合都是可能的(例如，大于或等于约1.2:1且小于或等于约10:1，大于或等于约1.5:1且小于或等于约10:1，大于或等于约2:1且小于或等于约10:1)。神经突的延伸长度可以根据实施例12中的描述被确定。
在某些实施方案中，物理导向因子可以通过给予神经突特定的方向性或取向而改变生长。例如，在某些实施方案中，物理导向因子可以是排斥在电场区中的生长的电场区。在某些这样的实施方案中，朝向电场区的神经突生长(例如伸长)可以改变其生长方向以避开该电场区，使得神经突在遇到电场区之前和之后的生长角度具有非零的相对改变。例如，如在图17的(a)中示出的，神经突可以具有在遇到电场区之前的第一生长方向202A和在遇到电场区之后的第二生长方向202B。由第一生长方向和第二生长方向形成的角度可以是非零的。在某些实施方案中，多个神经突在遇到电场区之前和之后的生长角度的平均相对改变可以是非零的。相反地，在某些实施方案中，在物理导向因子不存在(例如图17的(a)中的对照区)的多个神经突的生长角度的平均相对改变可以是零和/或可以具有比遇到物理导向因子的神经突低很多的数值。
例如，在某些实施方案中，在遇到物理导向因子(例如交变电流电场)之前和之后的多个神经突的生长角度的平均相对改变的数值可以大于或等于约10度，大于或等于约15度，大于或等于约25度，大于或等于约30度，大于或等于约45度，大于或等于约60度，或大于或等于约75度。在某些例子中，在遇到物理导向因子(例如交变电流电场)之前和之后的多个神经突的生长角度的平均相对改变的数值可以小于或等于约90度，小于或等于约85度，小于或等于约80度，小于或等于约75度，小于或等于约60度，或小于或等于约45度。上文提到的范围的所有组合也是可能的(例如，大于或等于30度且小于或等于约90度，大于或等于45度且小于或等于约90度)。在某些实施方案中，生长角度的平均相对改变的数值在高于某个电场强度时可以显著增加。例如，在某些实施方案中，生长角度的平均相对改变的量值可以大于或等于45度，条件是神经突附近的电场强度大于或等于约100V/m。
在某些例子中，物理导向因子可以在一维、二维或三维空间中沿着特定的路径定向引导神经突伸长。在某些例子中，定向引导神经突涉及引导规定方向上的神经突生长。例如，如在图20的(a)中图示的，物理导向因子245(例如，非机械致动的物理导向因子)可以被施加于在xy平面上的第一取向250中生长的神经突并且使神经突在例如z方向(即xz平面或yz平面)的第二取向255中生长。
在某些实施方案中，物理导向因子可以在多个方向影响神经突的生长，使得生长在多于一个方向被改变。在某些例子中，神经突生长可以被改变多于一次。通常，神经突生长可以被改变任何合适的数量的次数。例如，装置可以包括以相同的或不同的方式影响神经突生长的多个物理导向因子。例如，用于形成神经元连接的装置可以包括约束神经突和/或加速神经突伸长的物理导向因子以及把神经突的取向从第一取向(例如xy平面)改变至第二取向(例如yz或xz平面)的物理导向因子。在某些实施方案中，神经突生长的多重的改变可以被用于允许第一神经突的集群重叠第二神经突的集群而不形成神经连接。
在某些实施方案中，物理导向因子可以是连续的。例如，因子可以在应用全过程中连续地改变神经突的生长。应当理解，持续的引导不一定等效于静态的引导，因为方式和/或生长结果的改变可以随时间和/或空间改变。在某些实施方案中，物理导向因子可以是不连续的，使得因子定时和/或定点变化。例如，交变电流电场(例如，交变电流非均匀电场)可以被用于通过切换电极对之间的电压接通和断开可逆地阻止神经突生长。在另一个实施例中，电极对的阵列可以被用于通过提供在时间和空间上变化的局部电场动态地引导伸长。
在某些实施方案中，一个或多个物理导向因子可以被电场产生。电场可以是交变电流电场，例如非均匀的交变电流电场，或直流电电场。通常，任何类型的电场都可以被使用。然而，在某些实施方案中(例如，当紧邻的电极的靠得很近时、当电压很高时)，直流电场可以不被使用，这是由于电解和/或大量的焦耳加热的风险，它们对神经元和/或电极可能是有害的。在某些这样的实施方案中，非均匀的交变电流电场能够克服直流电场的问题，因为高的频率能够最小化有害的电化学反应并且减少焦耳加热的程度。在某些实施方案中，非均匀的交变电流电场对于产生期望的物理因子可能是必需的，代替例如均匀的交变电流电场或直流电场。
通常，电场可以通过多种机制产生物理导向因子。不被理论限制，相信，电动力的现象可以在物理导向因子的产生中起重要作用。在某些实施方案中，电动力的现象使电运动力被施加在神经突和/或其周围环境上。这些力的特性(例如来源、类型、大小、方向)可以决定物理导向因子改变神经突生长的方式。例如，垂直的电运动力可以导致生长被阻止，而非垂直的力可以使神经突改变其取向。在某些实施方案中，电动力的现象和所得到的力对于交变电流(AC)电场和直流电(DC)电场可以不同。在其他的实施方案中，对于交流和直流场的电动力的现象和所得到的力可以是实质上相同的。
在某些实施方案中，电场的某些性质(例如强度、频率)可以影响物理导向因子的性质并且由此影响神经突生长的改变。例如，在给定的电压下，具有较低的频率的AC场可以导致比具有较高的频率的AC场大的神经突生长的抑制。在某些实施方案中，具有某个频率范围的交变电流电场可以被使用。例如，在某些实施方案中，交变电流场的频率可以大于或等于约100Hz，大于或等于约500Hz，大于或等于约1,000Hz，大于或等于约5,000Hz，大于或等于约10,000Hz，大于或等于约50,000Hz，大于或等于约100,000Hz，或大于或等于约500,000Hz。在某些例子中，交变电流电场的频率可以小于或等于约1,000,000Hz，小于或等于约500,000Hz，小于或等于约100,000Hz，小于或等于约50,000Hz，小于或等于约10,000Hz，小于或等于约5,000Hz，小于或等于约1,000Hz，或小于或等于约500Hz。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约100Hz且小于或等于约1,000,000Hz)。其他的值也是可能的。
在某些实施方案中，电场的强度可以影响物理导向因子的性质。在一个实施例中，可能存在用于物理导向因子的产生的门限值，使得物理导向因子可以在低于某个强度时不被产生。通常，电场的强度可以根据期望进行选择。例如，在某些实施方案中，电场的强度可以大于或等于约50V/m，大于或等于约100V/m，大于或等于约200V/m，大于或等于约500V/m，大于或等于约1,000V/m，大于或等于约5,000V/m，大于或等于约10,000V/m，大于或等于约50,000V/m，大于或等于约100,000V/m，或大于或等于约500,000V/m。在某些例子中，电场的强度可以小于或等于约1,000,000V/m，小于或等于约500,000V/m，小于或等于约100,000V/m，小于或等于约50,000V/m，小于或等于约10,000V/m，小于或等于约5,000V/m，小于或等于约1,000V/m，小于或等于约500V/m，大于或等于约200V/m。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约100V/m且小于或等于约1,000,000V/m)。其他的值也是可能的。
在某些实施方案中，产生电场的电极的紧邻性可以影响物理导向因子的性质(例如，向邻近处的集中；生长被改变的方式)。例如，具有小的中心到中心间距(例如1微米)的电极对或许能够把被集中的电场施加于神经突的生长锥，而具有较大的中心到中心间距(例如大于200微米)的电极对或许不能够施加被集中的电场。通常，在电极上的中心到中心间距可以被选择以实现期望的结果。例如，在某些实施方案中，电极之间的中心到中心间距可以小于200微米，小于或等于约150微米，小于或等于约125微米，小于或等于约100微米，小于或等于约75微米，小于或等于约50微米，小于或等于约30微米，小于或等于约10微米，或小于或等于约1微米。在某些例子中，电极之间的中心到中心间距可以大于或等于约0.1微米，大于或等于约1微米，大于或等于约5微米，大于或等于约15微米，大于或等于约30微米，大于或等于约60微米，大于或等于约100微米，大于或等于约140微米，或大于或等于约180微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1微米且小于或等于约100微米)。其他的值也是可能的。
在某些实施方案中，其他的导向因子的存在可以影响物理导向因子的性质。例如，在某些实施方案中，物理导向因子可以把神经突沿着具有由另一个导向因子(例如机械导向因子)导致的对生长的阻挡物的路径定向引导。在某些实施方案中，该另一个导向因子的力可以大于物理导向因子或与其成比例，使得沿着该路径的神经突生长被抑制或阻止。在某些实施方案中，物理导向因子可以把神经突的取向改变至具有比最初的取向大的有效的探测区域的路径。在某些这样的实施方案中，神经突生长(例如，伸长)可以相对于在物理导向因子不存在时在最初的取向中的神经突生长被抑制或减慢。例如，在包含被在第一取向上对准的纤维(例如胶原纤维)的三维支架中的第一取向上的神经突生长可以提供促进神经突生长的追踪线机械导向因子。在某些这样的实施方案中，神经突可以相对于第一取向在第二取向上更慢地生长。
如本文描述的，一个或多个物理导向因子可以被用于改变来自多于一个神经元的神经突的生长。在其中存在多于一个神经元(每个具有至少一个神经突)的实施方案中，可再配置的物理导向因子可以被用于形成方向性的神经连接，例如轴突二极管、神经回路和神经网络。用于使用可再配置的物理导向因子形成方向性的神经连接的装置40的一个实施例在图2A中示出。在某些实施方案中，装置40可以类似于装置10。如在图2A中例证性地示出的，以横截面形式示出的装置40可以容纳位于室25中的具有第一神经突20-1的神经元15以及位于室25-2中的具有第二神经突20-2的第二神经元15-2。装置可以包括多个室(例如，25和25-2)，其能够容纳活细胞并且促进细胞生长，至少一个通道(例如，30A)，其连接两个室并且来自每个神经元的神经突可以在其中生长，以及能够产生物理导向因子的电极35。电极35可以被成对地布置。例如，三个电极可以被布置为形成两个电极对并且每个电极对可以产生电场36，所述电场产生一个或多个物理导向因子。在某些实施方案中，每个电极对可以作为具有锁定器的门。门可以在电压被施加在电极上时被关闭(即锁定)，并且在电压不存在时被打开。在某些例子中，如在图2A中图示的，电极对交叉邻近该室的通道。在其它的例子中，电极与通道的交叉位置可以变化，并且存在的电极对的数量也可以变化。例如，两个或多于两个电极对可以在沿着其长度的任意点交叉通道。通常，电极对的位置可以根据期望进行选择。室和通道也可以被配置为使得神经元细胞体被约束于室，同时神经突可以生长到每个通道中。
使用一个或多个可再配置的物理导向因子的方向性的神经连接的形成的一个实施例在图2B-C中示出。如在图2B中例证性地示出的，在平面图中示出的装置40可以含有被分别地容纳在第一室25-1、第二室25-2和第三室25-3中的第一神经元15-1、第二神经元15-2和第三神经元15-3。装置可以包括神经突可以分别在其中生长的第一通道30-1B、第二通道30-2B和第三通道30-3B。在某些实施方案中，如在图2B中示出的，装置被配置为使得每个室被唯一的一个通道连接于另一个室，使得每个室被连接于两个通道。在其他的情况下，每个室可以被多于一个通道连接于另一个室。如在图2B中示出的，三个电极(即两个门)可以交叉邻近该室的每个通道。
用于使用装置40形成通道中的方向性的神经连接(例如轴突二极管)的方法，根据实施方案的一个集合，在图2C-D中被示出。图2C示出了用于图2D中的轴突二极管系统的每个图像的电场的存在，如被“x”指示的，或不存在，如被虚线指示的。如在图2C的i和图2D的i中示出的，轴突二极管的形成在神经突进入通道(例如30-1B)的每个终端端部31和32时开始。两个电极对(即三个电极)被定位为邻近每个终端端部并且用作门。为了形成单向的连接，电压可以被施加于在每个终端端部处的门以锁定该门。在某些实施方案中，神经连接的方向性由哪个门首先被打开(即电压的消除)定义。例如，如在图2C的ii和图2D的ii中示出的，电压被施加于邻近终端端部32的电极。在某些情况下，电场产生在电极对附近的可逆地阻止或抑制神经长出的物理导向因子。电压不被施加于邻近终端端部31的电极，使得神经元可以生长经过通道。神经元的生长锥由白色的箭头指示。一旦神经突的生长锥经过邻近31的两个门并且接近邻近32的门，那么邻近终端端部32的门被转动打开并且邻近终端端部31的门被转动锁定，如在图2C的iii和图2D的iii中示出的。在某些实施方案中，邻近终端端部31的门被锁定，以防止另一个神经突在通道中生长。此外，邻近终端端部32的门被打开以允许神经突连接。在某些实施方案中，在轴突二极管形成之后，所有的门都被锁定以防止其他的神经突进入通道。在某些实施方案中，这种打开和关闭门的方法可以被重复以形成另外的神经连接。
使用一个或多个可再配置的物理导向因子形成方向性的神经网络的一个实施例在图3中示出。在某些实施方案中，装置40可以被用于形成神经网络。为了形成神经网络，门被打开和关闭，与上文的实施例相似，使得神经连接在室25-1和25-2以及室25-2和25-3之间形成。连接不在室25-1和25-3之间形成，如被图3中的具有“X”的箭头指示的。在某些实施方案中，连接可以是单向的，如在图3中示出的。连接的方向被箭头指示并且在相反的方向的方向性的连接的缺乏被具有“X”的箭头指示。
在某些实施方案中，一个或多个导向因子(例如，物理的和无接触的导向因子)可以被用于引导在两个和/或三个维度中的神经突生长并且形成复杂的神经网络。例如，在某些实施方案中，一个或多个导向因子可以被用于使第一神经突或神经突的集群重叠第二神经突或神经突的集群，例如，使用了导向因子(例如，物理的和无接触的导向因子)。在某些这样的实施方案中，一个或多个导向因子的使用允许神经突重叠而不形成神经连接或形成在重叠区中的相对地少的神经连接。例如，在某些实施方案中，第一集群中的形成在重叠区处的与第二集群中的神经突的连接的神经突的百分数可以小于或等于约10％，小于或等于约8％，小于或等于约5％，小于或等于约3％，小于或等于约2％，小于或等于约1％，小于或等于约0.75％，小于或等于约0.5％，小于或等于约0.25％，小于或等于约0.1％，小于或等于约0.05％，小于或等于约0.01％，或小于或等于约0.001％。
在某些实施方案中，第一神经突的集群可以在三维支架内重叠第二神经突的集群。在某些这样的情况下，导向因子可以是非接触的物理导向因子(例如，电场)。在某些实施方案中，被用于产生导向因子的物体可以不被容纳在三维支架内。例如，在其中导向因子是电场的实施方案中，被用于产生电场的电极可以不被容纳在支架内。在其他的实施方案中，被用于产生电场的电极可以被容纳在支架内。
用于形成两个或多于两个神经突在其处重叠的区的装置的一个非限制性的实施例在图21F中示出。在某些实施方案中，装置可以容纳第一室300，第一室300调整和布置为容纳一个或多个活细胞并且促进细胞生长，而且被连接于第一通道305。装置还可以容纳第一电极对310，第一电极对310与第一通道的至少一部分对准，使得第一电极对的一部分与第一室的至少一部分重叠。在某些情况下，第一电极对中的至少一个电极(例如电极中的每个电极)可以与同时与第一室的至少一部分重叠的另一个电极形成配对，如在图1E中图示的。装置可以还容纳第二室320，第二室320调整和布置为容纳一个或多个活细胞并且促进细胞生长，而且被连接于第二通道325。在某些例子中，装置容纳与第二通道的至少一部分对准的第二电极对330。第二电极对的至少一部分可以与第二室的至少一部分重叠。在某些情况下，第二电极对中的至少一个电极(例如电极中的每个电极)可以与同时与第一室的至少一部分重叠的另一个电极形成配对，如在图1E中图示的。在某些实施方案中，重叠区中的通道的高度可以是高至足以允许在三个维度中的神经突生长，如在下文更详细地描述的。例如，第一通道和第二通道可以在具有以下高度的重叠区处交叉：大于约20微米且小于或等于约1000微米(例如大于约20微米且小于或等于约500微米、大于或等于约50微米且小于或等于约1000微米、大于约20微米、大于或等于约50微米)。在某些实施方案中，第一通道和第二通道的至少一部分可以被三维支架填充，如在下文更详细地描述的。在某些例子中，整个的第一通道和第二通道可以被三维支架填充。
在某些实施方案中，如在图21F中图示的，第二电极对在第二通道与第一通道重叠的部分中可以是不连续的。在某些这样的情况下，第二电极对可以具有允许第一电极对经过下述区域的缝隙335，在该区域处各个通道交叉且第一电极对与第二电极对中的至少一个电极交叉或重叠。
在某些实施方案中，装置可以被用于使神经突重叠而不形成神经连接。在某些实施方案中，一个或多个神经元(例如，神经元的第一集群)被接种在第一室中并且一个或多个神经元(例如，第二集群)被接种在第二室中。通道可以被三维支架填充，使得在通道内的神经突伸长在支架中发生。在某些实施方案中，与第一室重叠的电极部分可以把神经突伸长朝着第一通道引导至电极对之间的区中。在某些例子中，伸长到在电极之间的支架区内中的神经突可以被抑制经过电极对中的一个或多个电极。不被理论限制，相信，围绕电极的边缘的电场抑制和防止神经突在在电极对的外侧的区中伸长。在某些这样的情况下，神经突被约束以在在电极之间的支架区内伸长，并且，在某些例子中，沿着实质上平行于一个或多个电极的方向。在某些实施方案中，第一电极对用于定向引导神经突的至少一部分从第一室到达第一电极对的端部(例如位置340)。应当理解，电极可以不在三维支架内并且在电极之间的区可以指在电极之间但是不一定直接物理地接触电极的三维空间。
与第二室重叠的电极部分也可以把神经突伸长朝着第二通道引导至电极对之间的区中并且把神经突的生长约束于电极之间的区。在某些实施方案中，在第二通道中的神经突可以伸长至重叠区和遇到来自第一电极对的电场(例如交变电流电场)。由第一电极对产生的电场可以抑制在强电场区(例如，其中来自第一电极的电场的强度大于或等于约100V/m)中的神经突生长。在某些实施方案中，在第二通道中的神经突可以改变取向以包围由第一电极对产生的强电场区。例如，神经突可以改变它们的取向的z轴分量以包围强电场，如在图20的(a)中图示的。不被理论限制，相信，z轴改变防止在第一通道中的神经突和在第二通道中的神经突之间的接触并且因此防止神经连接的形成。在某些实施方案中，第二电极对的部分可以继续以影响神经突越过第一电极的伸长方向的x轴分量和y轴分量。在某些这样的实施方案中，在神经突伸长经过第一电极对之后，神经突被再次引入第二电极对之间的区中和/或继续在其中伸长。
在某些实施方案中，一个或多个导向因子可以被用于使用导向因子(例如物理导向因子)定向引导第一和第二神经突的集群的伸长以形成第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。在某些实施方案中，一个或多个导向因子可以被用于定向引导在第一神经突的集群和第二神经突的集群的三维支架内的神经突伸长以形成神经网络。在某些这样的情况下，导向因子可以是非接触的物理导向因子(例如电场)。在某些实施方案中，被用于产生导向因子的物体可以不被容纳在三维支架内。例如，在其中导向因子是电场的实施方案中，被用于产生电场的电极可以不被容纳在支架内。在其他的实施方案中，被用于产生电场的电极可以被容纳在支架内。
用于形成两个或多于两个神经突在其处重叠的区的装置的一个非限制性的实施例在图21G中示出。在某些实施方案中，装置可以含有被连接于调整和布置为容纳一个或多个活细胞并且促进细胞生长的第一室400和第二室405的通道402。装置也可以包括与第一通道的至少一部分对准的第一电极对410。第一电极对可以与第一室的至少一部分重叠并且其中第一电极对之间的中心到中心间距小于或等于约200微米(例如，小于或等于约150微米、小于或等于约100微米、小于或等于约50微米)。在某些实施方案中，第一电极对可以与第二室的至少一部分重叠。在某些实施方案中，第一通道的至少一部分可以被三维支架填充。在某些例子中，整个的第一通道可以被三维支架填充，使得神经突的伸长在支架内发生。在某些情况下，第一电极对中的至少一个电极(例如电极中的每个电极)可以与同时与第一室的至少一部分重叠的另一个电极形成配对，如在图1E中图示的。
在某些实施方案中，装置可以被用于使用导向因子(例如交变电流电场)定向引导神经突的伸长以形成在神经突之间的神经网络。在某些实施方案中，一个或多个神经元(例如，神经元的第一集群)被接种在第一室中并且一个或多个神经元(例如，第二集群)被接种在第二室中。通道可以被三维支架填充，使得在通道内的神经突伸长在支架中发生。在某些实施方案中，与第一室重叠的电极部分可以把神经突伸长朝向第一通道引导至电极对之间的区中。在某些实施方案中，从在第二室中的一个或多个神经元伸长的一个或多个神经突可以在第一电极对之间的区内伸长。在其中第一电极的一部分与第二室重叠的实施方案中，与第二室重叠的第一电极部分也可以引导神经突伸长朝向并进入电极对之间的区中，并且把神经突的生长约束于在电极之间的区。在某些实施方案中，从第一通道中的第一室伸长的一个或多个神经突和第一通道中的从第二室伸长的一个或多个神经突可以在第一通道中相遇并且形成神经网络。
通常，来自任何合适的神经元的神经突都可以与来自任何其他合适的神经元的神经突重叠或与其形成神经连接。应当理解，来自不同的神经元(例如不同的细胞体、不同的神经元类型、不同的神经元类别等等)或相同的神经元(例如不同的细胞体、不同的神经元类型、不同的神经元类别等等)的神经突可以被使用。
如本文描述的，电信号可以被施加于能够培养活细胞(例如神经元)的装置。在某些实施方案中，装置可能需要被放置在有益于活细胞的维护和生长的环境中(例如在培育器中)并且被附接于允许电信号被施加于装置的系统。能够在对于细胞维护和生长有益的环境中的同时把电信号提供至如本文描述的装置的系统，在图4中示出。在某些实施方案中，如在图4中示出的，使用被联接于电路板组件125的连接器124可将电信号施加于芯片123上的装置，电路板组件可以产生电信号并且把电信号重路由和/或保持至一个或多个电极。在某些实施方案中，组件125可以被连接于小型计算机121，小型计算机121控制整个的组件。在某些情况下，小型计算机可以自主地控制组件的操作(例如，电信号的施加和保持在装置中的电极之间)。在某些例子中，装置，例如web服务器，可以被安装在小型计算机上使得对于每个电极的参数(例如电压、频率)可以被远程地(例如通过互联网120、通过远程计算机连接等等)实时地改变。
如本文描述的，包括通道、室和电极、以及其他部件的装置可以在使用物理导向因子的神经突生长的改变和神经连接的形成中使用。在某些实施方案中，装置部件的特征(例如尺寸、制造材料、布置)可以影响装置的操作。例如，为了改变神经突生长，装置可以具有一个或多个微尺度部件(例如，室、通道、电极)。在某些情况下，装置可以是微流体性的装置。通常，装置部件的特征可以根据期望进行选择。
在某些实施方案中，电极与通道或通道的夹角可以大于或等于约0℃，大于或等于约15℃，大于或等于约45℃，大于或等于约90℃，大于或等于约135℃，或大于或等于约150℃。在某些例子中，该角度可以小于或等于180℃，小于或等于约150℃，小于或等于约115℃，小于或等于约90℃，小于或等于约60℃，或小于或等于约30℃。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，小于或等于约0℃且小于或等于约135℃)。其他的值也是可能的。在某些实施方案中，一个电极可以以与另一个电极不同的角度交叉通道。相反地，一个电极可以以与另一个电极实质上相同的角度交叉通道。在某些例子中，一个电极可以以与另一个通道不同的角度交叉通道。在其它的例子中，一个电极可以以与另一个通道相同的角度交叉通道。
在某些实施方案中，室的尺寸可以根据期望进行选择。应当理解，室可以具有任何合适的横截面尺寸。例如，在某些实施方案中，室可以具有以下的最大横截面尺寸：小于或等于约2,000微米、小于或等于约1,000微米、小于或等于约750微米、小于或等于约600微米、小于或等于约500微米、小于或等于约300微米、小于或等于约200微米、小于或等于约100微米、小于或等于约50微米、小于或等于约25微米、小于或等于约10微米、或小于或等于约5微米。在某些例子中，室可以具有以下的最大横截面尺寸：大于或等于约0.01微米、大于或等于约0.1微米、大于或等于约1微米、大于或等于约5微米、大于或等于约10微米、大于或等于约20微米、大于或等于约50微米、大于或等于约100微米、大于或等于约200微米、大于或等于约400微米、大于或等于约600微米、大于或等于约900微米、或大于或等于约1,500微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1微米且小于或等于约1,000微米)。最大横截面尺寸的其他的值也是可能的。
在某些情况下，室的至少一个或至少两个横截面尺寸(例如高度和宽度)可以小于或等于约750微米，小于或等于约500微米，小于或等于约300微米，小于或等于约200微米，小于或等于约100微米，小于或等于约50微米，小于或等于约20微米，小于或等于约10微米，或小于或等于约5微米。在某些例子中，室的至少一个或至少两个横截面尺寸可以大于或等于约0.01微米，大于或等于约0.1微米，大于或等于约1微米，大于或等于约5微米，大于或等于约10微米，大于或等于约25微米，大于或等于约50微米，大于或等于约100微米，大于或等于约200微米，大于或等于约400微米，或大于或等于约600微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约10μm且小于或等于约500μm)。其他的值也是可能的。
室可以具有某个宽度与高度比率。在某些例子中，室的宽度与高度的比率可以大于或等于约1:1，大于或等于约2:1，大于或等于约5:1，大于或等于约10:1，大于或等于约15:1，大于或等于约20:1，大于或等于约50:1，大于或等于约100:1，大于或等于约200:1，大于或等于约300:1，或大于或等于约400:1。在某些例子中该宽度与高度比率可以小于或等于约500:1，小于或等于约400:1，小于或等于约300:1，小于或等于约200:1，小于或等于约100:1，小于或等于约50:1，小于或等于约20:1，小于或等于约15:1，小于或等于约10:1，小于或等于约5:1，或小于或等于约2:1。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1:1且小于或等于约20:1)。其他的值也是可能的。
室也可以具有以下的纵横比(长度与最大的平均横截面尺寸)：至少2:1，更典型地至少3:1、8:1或20:1。在某些情况下，通道、通道片段或通道部分具有非常大的纵横比，例如，至少100:1、500:1或1000:1。
在某些实施方案中，室可以具有以下的长度：大于或等于约1mm、大于或等于约5mm、大于或等于约10mm、大于或等于约20mm、大于或等于约40mm、大于或等于约60mm、或大于或等于约80mm。在某些例子中，长度可以小于或等于约100mm，小于或等于约90mm，小于或等于约70mm，小于或等于约50mm，小于或等于约30mm，或小于或等于约10mm。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1mm且小于或等于约100mm)。长度的其他的值也是可能的。
在某些实施方案中，通道的尺寸可以根据期望进行选择。在某些实施方案中，通道的高度可以影响电场存在或不存在时生长神经元的取向。例如，通道的高度可以使神经突生长被约束于二维的或三维的平面。在一个实施例中，通道的高度可以是相对较小(例如，小于或等于约10微米、小于或等于约5微米)，使得生长锥被在空间上约束并且不能够在三维中生长并且被限制，例如，被限制成沿着z方向。在某些例子中，通道的高度可以是相对较大(例如，大于或等于约50微米、大于或等于约100微米、大于或等于约200微米、大于或等于约300微米、大于或等于约1000微米)，使得生长锥不被在空间上约束并且能够在三维中生长。
应当理解，通道可以具有任何合适的横截面尺寸。例如，在某些实施方案中，通道可以具有以下的最大横截面尺寸：小于或等于约1cm、小于或等于约5000微米、小于或等于约2000微米、小于或等于约1000微米、小于或等于约500微米、小于或等于约300微米、小于或等于约200微米、小于或等于约100微米、小于或等于约50微米、小于或等于约25微米、小于或等于约10微米、小于或等于约5微米、小于或等于约2微米、或小于或等于约1微米。在某些例子中，通道可以具有以下的最大横截面尺寸：大于或等于约0.1微米、大于或等于约1微米、大于或等于约5微米、大于或等于约10微米、大于或等于约25微米、大于或等于约50微米、大于或等于约100微米、大于或等于约200微米、大于或等于约300微米、大于或等于约500微米、大于或等于约1000微米、大于或等于约2000微米、或大于或等于约5000微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1微米且小于或等于约2000微米)。最大横截面尺寸的其他的值也是可能的。
在某些情况下，通道的至少一个或至少两个横截面尺寸(例如高度、高度和宽度)可以小于或等于约2000微米，小于或等于约1000微米，小于或等于约500微米，小于或等于约300微米，小于或等于约200微米，小于或等于约100微米，小于或等于约50微米，小于或等于约30微米，小于或等于约20微米，小于或等于约10微米，小于或等于约5微米，小于或等于约2微米，或小于或等于约1微米。在某些例子中，通道的至少一个或至少两个横截面尺寸可以大于或等于约0.01微米，大于或等于约0.1微米，大于或等于约1微米，大于或等于约5微米，大于或等于约10微米，大于或等于约25微米，大于或等于约50微米，大于或等于约75微米，大于或等于约125微米，大于或等于约200微米，大于或等于约300微米，大于或等于约500微米，或大于或等于约1000微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约0.1微米且小于或等于约10微米、大于或等于约1微米且小于或等于约2000微米)。其他的值也是可能的。
通道可以具有某个宽度与高度比率。在某些例子中，通道的宽度与高度的比率可以大于或等于约1:1，大于或等于约1.6:1，大于或等于约3:1，大于或等于约5:1，大于或等于约10:1，大于或等于约15:1，或大于或等于约20:1。在某些例子中，该宽度与高度比率可以小于或等于约30:1，小于或等于约20:1，小于或等于约15:1，小于或等于约10:1，小于或等于约5:1，或小于或等于约2:1。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约1:1且小于或等于约20:1)。其他的值也是可能的。
通道也可以具有以下的纵横比(长度与最大的平均横截面尺寸)：至少50:1，更典型地至少75:1、90:1或150:1。在某些情况下，通道可以具有非常大的纵横比，例如，至少200:1、500:1、1,000:1或10,000:1。
在某些实施方案中，通道可以具有以下的长度：大于或等于约50微米、大于或等于约100微米、大于或等于约200微米、大于或等于约400微米、大于或等于约600微米、或大于或等于约800mm。在某些例子中，长度可以小于或等于约1,000微米，小于或等于约750微米，小于或等于约450微米，小于或等于约250微米，小于或等于约150微米，或小于或等于约75微米。上文提到的范围的组合也是可能的(例如，大于或等于约100微米且小于或等于约750微米)。长度的其他的值也是可能的。
在某些实施方案中，通道的至少一部分可以被三维支架填充。三维支架或许能够容纳活细胞或活细胞的部分并且促进细胞生长和发育(例如神经突生长)。在某些实施方案中，三维支架可以帮助在多个维度中(例如在三维中)的神经突生长。通常，支架可以从任何合适的能够容纳活细胞或活细胞的部分并且促进细胞生长和发育的材料形成。本领域的技术人员将知道合适的支架材料。合适的支架材料的非限制性的示例包括胶原、层粘连蛋白、多糖、多肽、凝胶基质、胞外复合物(例如，基质胶)、基质蛋白质(例如，纤连蛋白、明胶)、水凝胶、弹性蛋白、腱生蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、生长因子及其组合。
在某些实施方案中，通道的一个表面的至少一部分可以被分子功能化。在某些实施方案中，分子可以改变神经元和/或神经突的生长和/或改变神经元和/或神经突到表面部分的附接。在某些例子中，分子可以增强(例如加速)细胞体或神经突生长和/或附接。在其它的例子中，分子可以减少细胞体或神经突生长和/或附接。在某些情况下，分子可以是化学物导向因子。本领域的技术人员将基于本文提供的描述知道合适的分子。
在某些实施方案中，神经元或活细胞可以选自由以下组成的组：海马神经元、背根神经节、视网膜神经节神经元、高尔基I神经元、高尔基II神经元、篮状细胞、贝茨细胞、lugaro细胞、中型多棘神经元、浦肯野细胞、闰绍细胞、单极刷细胞、颗粒细胞、前角细胞、运动神经元、纺锤形细胞、假单极神经元、多极子神经元、中间神经原、运动神经元、感觉神经元、星状细胞及其组合。通常，任何合适的神经元都可以被使用。
以下的参考文献为了所有目的以其整体通过引用并入本文：美国临时专利申请第61/752,183号，于2013年1月14日提交，并且名称为“Electrokinetic Confinement ofNeurite Growth for Dynamically Configurable Neural Networks”。
以下的实施例意图例证本发明的某些实施方案，但是不示例本发明的全部范围。
实施例1
本实施例描述了使用交变电流(AC)电场用于动态地控制被培养的大鼠海马神经元中的轴突生长。发现，以在105Hz的数量级的频率的适度的电压的施加可以使正在发育的轴突在毗邻于电极处被停止，同时远离电场的轴突展示不被抑制的生长。通过切换电极接通或断开，电极之间的轴突通路可以被可逆地抑制或允许。
为了确定交变电流运动力是否能够影响轴突生长，开发了微流体性的平台，如在图1A和5A-B中示出的，基于轴突隔离装置，其主要由两个宽的微流体性的室组成，在其中的一个室中培养神经元。两个室由把轴突长出限制至一个维度的平行的微通道的阵列连接。为了允许交变电流电场在微通道内的施加，微流体性的平台被粘合于已经被互相交叉的金电极(被间隔15μm的15μm宽度)预图案化的玻璃。通过粘合玻璃和PDMS使得电极垂直于微通道延伸，平行于通道起作用以阻挡一维的轴突生长的交变电流运动力可以被施加。
在把神经元加入至培养室后，广泛的神经突长出在体外(DIV)发生4日，使许多神经突进入微通道(图5A)。图1A示出了微流体性的神经元电动力平台的装置的被图示的横截面。图5A是在装置中在体外在四日生长的神经元的图像。图中的刻度条是50微米。图5B是示出了4井流体性的接口和电接口的照片。刻度条是1cm。
然后AC信号被施加于电极并且轴突生长被监视。在不与电极交叉的微通道中，轴突生长经过微通道的长度(图1C-D)。然而，当场被施加时，在具有电极的微通道中的轴突在电极处的生长停止(图1C)。一旦场被关闭，那么轴突恢复它们经过微通道的生长(图1D)，指示它们仍然是有活力的。为了量化AC场具有的对轴突生长的影响，AC信号的频率和电压幅度二者都在在体外持续施加7天之后被变化。频率被限于100kHz-1MHz的范围并且电压被限于0-3Vp-p的范围以避免显著的温度升高(ΔT～σV2/k，其中σ是介质电导率并且k是其热导率，因此在细胞培养基中在最大电压下ΔT～7℃)或在高电导率海马神经元培养基中的电解(在σm＝0.98±0.08S/m测量到的)。AC信号的频率和电压二者具有对轴突长度的显著的影响，使在给定的电压下使用较低的频率导致轴突长出的较大的抑制(图6)。
图1C是在微通道中的轴突生长的荧光性的假彩色图像，在体外使用了垂直的互相交叉的电极4天。神经元被微管蛋白-GFP杆状病毒感染用于活细胞可视化目的。封闭的箭头表示在生长经过微通道的没有电极的对照通道中的轴突。空心箭头表示在电极边缘处停止的具有电极的微通道中的轴突。频率是100kHz并且电压是2V。刻度条是150微米。图1D是在体外持续4天的施加电场之后在体外6天的轴突生长的荧光性的假彩色图像。封闭的箭头表示轴突的端部。图6是在使电压接通的芯片中培养7天之后的标准化的轴突长度相对于电压的图。(***：p<0.001)。在该图中，n是指在两个独立的复制的实验内测量到的轴突的数量。
图7示出了在用于对照实验(没有场施加)和用于被AC电动力学效应阻挡的轴突的平台中的随时间变化的轴突的长度。距第一电极以及距通道的端部的距离被突出显示。来自主体隔室的轴突在大约3日内到达第一电极，而在把轴突从AC阻挡释放之后的轴突伸长耗费小于1日。该结果显著地表明在体外4日和体外6日之间的观察到轴突伸长来源于被阻挡的轴突伸长以及没有新的树突从细胞体隔室生长。
图8A-8B示出了使用罗丹明B进行的电极周围的温度测量，罗丹明B是具有温度相关的荧光强度的荧光团(在培养基中的浓度为1mM)。图8A是围绕电极的罗丹明B的假彩色图像。颜色代表温度的空间分布。罗丹明B荧光强度随着增加的温度减少，所以暗颜色的区域指示与橙色区域相比的更高的温度。因此，无电极的微流体性的室(区域1)是橙色(较冷的)，而具有电极的微通道(区域3)是红色(较暖的)。可以在电极被粘合于PDMS之处(区域2)并且更具体地在沟槽中并且靠近于电极处(区域2的左侧)看到最高温度区域，其中轴突被发现在电压>3.5Vp-p时不再进行生长。刻度条指示50微米。图8B是提取的温度的折线图。每个点包括施加给定频率的电压持续5秒并且使用具有三个不同的互相交叉的电极的TRITC滤波器集合取得图像(500ms曝光时间，固定的照相机增益)，每个电极都在温度受控的阶段被设置为37.5℃。对于每个图像，来自240×480微米的区域(区域2)的荧光强度在空间上并且跨越三个电极被平均，并且与校准曲线进行比较。使用热板进行校准，以确定罗丹明B荧光强度的温度依赖性，获得与在文献中观察到的斜率一致的测量到的斜率(-1.3/℃)。测量到的温度独立于频率并且随着电压超线性地(supralinearly)增加，这将是焦耳加热所期望的。
实施例2
本实施例描述了在神经突的生长锥上的电动力学效应的建模。不被理论限制，该模型表明介电电泳是导致物理导向因子的作为起因的AC电动力学效应。
电动力学效应的机制可以通过确定哪个类型的AC电动力的现象与图1D中的结果是一致的而被辨别。作用在生长锥上的不同的交变电流运动力被建模。
生长锥被在玻璃表面附近椭球地控制形状，连接于是10倍小于其宽度的轴突，并且其很大部分包括协调其的生长的肌动蛋白丝。生长锥被建模为由三个外壳组成的核-壳扁圆物体(图9)：(1)-肌动蛋白层(宽度a＝2μm，高度b＝200nm)，(2)-细胞质层(均匀的高度d细胞质＝300nm)和(3)-细胞膜(均匀的高度d膜＝10nm)。该物体的特征长度是a1＝b+d膜和a2＝a3＝a+d细胞质+d膜。该可极化的物体被暴露于3个力：AC电渗透(ACEO)和电热效应(ETE)，其是作用在纯流体(即在颗粒不存在时)上的电流体动力的力以及介电电泳(DEP)，其作用在生长锥本身上。
ACEO是指当AC信号被施加时在电极表面附近产生的流动。其是频率相关的流动，在切向的电场和所产生的双层电荷的乘积达到最大时的频率下达到最大。遵循传统的方法以建模共面的电极ACEO，在电极上的时间平均的ACEO速度(<uACEO>)表示如下：
其中其中，ΩACEO是无量纲的频率，εm是介质的介电常数，σm是介质电导率，V0是被施加在电极上的电势，r是力在其处被评价的极坐标(在此r被设置为生长锥的半长度)，λd电解质/电极界面的德拜长度并且ω是AC信号的频率。
第二，电热流动可以在电场被施加在介质中并且导致焦耳加热时产生。对于非均匀的场(如在此种情况下)，在热量产生中将具有空间变化，这导致局部介电常数和电导率中的空间梯度，其在电场作用下产生总体流体流动。时间平均后的速度(uETE)是
其中其中，ηm是介质粘度，k是介质热导率，(r,θ)是力在其处被评价的极坐标，τm是给定为τm＝εm/σm的介质弛豫时间，α＝-0.4％K-1且β＝2％K-1。因子Π不在我们对于我们的介质电导率应用的频率的范围内变化并且具有-0.022的恒定值。
对ACEO和ETE速度求和以给出总体的净EHD速度<uEHD>，其在稳定状态通过椭球摩擦系数(ellipsoidal friction factor)转化为作用在生长锥上的力(FEHD)。
<FEHD>＝f.<uEHD>＝f.(<uACEO>+<uETE>) (3)
其中
第三个力是DEP力。使用与Castellarnau相同的方法，对于在共面的电极配置中的扁椭球体，我们外推出作用在生长锥上的第n阶DEP力且表示为：
其中其中，d是电极之间的距离(在我们的设置中d＝15μm)，A是去极化因子沿着椭球的三个轴线中的任何一个轴线的一个分量，ε* p和ε* m分别是i层的内隔室和外隔室的复介电常数并且n是多极子的阶数。Clausius-Mossotti因子(CMF)捕获力的频率依赖性并且在图10A和10B中针对宽的频率范围以及针对几个介质电导率进行了表示。每个层的介电性质根据肌动蛋白、神经元细胞质和膜的文献信息获取。因为场强度在生长锥维度内剧烈变化，所以高至n＝4的Clausius-Mossotti因子的高阶矩(图10B)，如由Jones和Washizu引入的(1994)高阶矩，被考虑。我们发现，这些高阶的多极子对总体的DEP力的贡献远远小于(大约105倍更小的)经典的偶极子的贡献。这些较高阶的力，如我们的结果和文献已经示出的，排斥物体并且因此对增加DEP力有贡献，并且因此与我们的发现是一致的，即，在我们的操作条件DEP力大于EHD力。此外，该模型不把由于生长锥与玻璃表面紧邻而导致的DEP力中的偏差考虑在内。然而，Lynch等人测量附接于玻璃表面的红血球的DEP力并且发现该力与经典的核-壳隔离的颗粒模型十分一致。因此，在我们的系统中可以对于生长锥假定相同的行为。
因为所有的力都是频率和电压相关的，所以所产生的EHD和DEP力的相对大小在频率和电压幅度的范围内进行了绘制(图10B)并且这些力的绝对值在图11A和11B上进行了绘制。DEP力和EDH流动二者配合作用，以排斥生长锥远离电极。所得到的模型提供关于被施加在生长锥上的力的趋势和力的大小的量级的可靠的信息。EHD力在200kHz-1MHz的整个频率范围具有几乎恒定的响应，而DEP力的大小具有很强的频率相关性。我们发现，在低电压(大约<2.70Vp-p)下，DEP力大于EHD力，在其中加热是最小的。在频率方面，EHD在高于大约250kHz的频率成为更显著的，因为生长锥的CMF(以及因此产生的DEP力)的大小在f>100kHz时减少。
检查轴突堵塞数据(图1D)，我们发现，较低的频率(f<250kHz)导致最小的轴突长度，并且此时DEP/EHD比率是最大的。相似地，模型示出了在较高的频率(f>250kHz)的DEP力的大小的减少，同时在实验中观察到，当升高频率时，增加的轴突长度——以及因此产生的较小的电动力学效应。此外，模型示出了DEP/EHD比率随着在给定频率下的电压增加而减少，而实验显示出在除了100kHz之外的所有频率，随着电压的增加，轴突长度增加。有趣的是，该最低的频率可能对应于DEP/EHD与频率的关系图中的峰(图9B)，其中DEP力在很大的电压范围内比EHD更大。因此，定量的轴突长度数据中的趋势(图1D)与发育的轴突通过其被DEP力作用的机制是非常一致的。使用该模型和参数的值，发现，被施加在生长上的最大的DEP力是大约66pN(图11A和11B)，其与由体外脊髓连合的神经元轴突的生长锥施加的拉力和由Netrin-1施加以导致生长锥吸引的力在同一个数量级。
应当被理解，该AC电动力学建模是非限制性的假设，但是却提供了对根据高强度AC电场驱动轴突生长的抑制的可能的过程的理解。可选择的机制可以在细胞内起作用，例如通过通过场产生的肌动蛋白极化，并且是用于未来的研究的有效的途径。
图9A是在我们的分析中使用的生长锥模型的示意图。图9B是在生长锥上的DEP力和EHD力之间的被建模的比率。
图10A和10B示出了生长锥模型的被模拟的Clausius-Mossotti因子。图10A示出了用于多个介质电导率的第一阶(偶极子)模型并且图10B示出了第一阶DEP力和用于在神经元介质电导率上增加多个多极子的第n阶力之间的比率。插图折线图表示生长锥的CMF的第n阶多极子的详细视图。高阶DEP力比第一阶力小几个数量级。
图11A和11B示出了在本研究中使用的整个频率范围和电压范围的介电电泳力(FDEP)和电流体动力(FEHD)的被模拟的值。EHD力在整个频率具有几乎恒定的响应，而DEP力的大小在200kHz-1MHz范围中具有很强的频率相关性，这是与实验地观察到的趋势一致的。
实施例3
本实施例描述了使用本发明中对轴突伸长的动态控制，通过由允许或防止轴突经过的一对电极‘门’组成的轴突-锁定系统来创建轴突-二极管。
电动力学轴突阻挡的动态的本质被利用以形成轴突的单向的生长，并且因此形成轴突二极管。轴突二极管使用在锁定中类似于门作用的电极的两个集合以允许轴突仅从一侧生长跨越(图2A)。装置是三微室芯片，被布置为等边三角形，使每个微室具有与6个用于溶液转移的井(图12)接口连接的各自的入口和出口储存器(图2B)。每个微室经过仅轴突可以在其中生长的微通道(高度～3微米)连接于另一个微室。每个微通道具有通过把电极的两个集合(接地-AC-接地)放置在微通道的每个端部处而形成的两个轴突‘门’(图2B)。为了创建轴突二极管，连接每对微室的门以动态的方式打开和关闭。当其AC电压被关闭时，门被打开并且轴突自由地生长超出电极。当AC信号被接通时，门被关闭并且轴突不能够行进跨越门。被施加以关闭门的AC信号的参数被设置为f＝100kHz和V＝3Vp-p，因为发现这些参数在阻挡神经突长出上是有效的(图1D)。
我们通过首先把神经元装板在三个微室中的每个中，使门初始地被关闭(AC电压被施加)，证明二极管的功能性(图2C的i)。在24小时之后，在微通道中的两个门中的一个被打开(AC电压被切断)，允许来自一个微室，被称为‘上游’微室，的轴突把轴突延伸入微通道中(图2C的i-ii)，而在相对的“下游”微室中的轴突保持被关闭的门阻挡。神经元连接的方向性由哪个门被首先打开定义，使轴突仅沿从上游微室至下游微室的方向通过。一旦轴突已经延伸超出开放的门，那么两个门的状态被逆转：最初开放的门被关闭并且在之前关闭的门被打开(图2C的iii)。在这样操作时，在微通道中的上游轴突将延伸超出第二门并且建立与下游神经元集群的连接。因为第一门现在被关闭，所以来自下游微室的轴突不能够迁移至上游微室并且将被俘获在微通道中或保持在下游微室中。最后，两个门被关闭以防止任何另外的轴突迁移经过微通道(图2C的iv)。从上游微室至下游微室的轴突长度(n＝12)在该过程期间被测量(图13)。可以看到，只要场被启动，轴突就不通过被激活的电极。此外，生长锥不从被激活的电极返回(生长锥中间位置的标准偏差随着时间消失)。当门被打开时，轴突生长过程以42±7微米/日的速率继续，与在通道的中部中观察到的生长速率(72±10微米/日)相比，这慢了很多(41％的相对误差)。这可以被解释为，直到这时，生长锥才访问(explore)在之前因为电场而不可到达的表面。最后，一旦门被加电，下游轴突就停留在上游门的前方，而不经过该门。电动力学轴突堵塞的这种特定的空间-时间应用被称为“轴突-锁定系统”。
图2C示出了轴突二极管的侧视示意图并且图2B和12是轴突二极管芯片的图像，其中示出了三个微室和电极。
图2C示出了轴突-锁定系统的示意图(左)和相位图像(右)，其中生长锥由所定位的白色的箭头指出。通道的中部被白色点强调。罗马数字描述以下内容：(i)两个门都被关闭，使得没有轴突进入微通道；(ii)左门被打开，并且唯一的一个轴突从左进入；(iii)左门被关闭并且右门被打开；(iv)在第一轴突完全经过且超出门之后两个门都被关闭。图13是从上游微室(蓝色)和下游微室(红色)迁移的轴突的测量长度以及左门和右门的激活计时的图。
实施例4
本实施例描述了由三个轴突-锁定分隔的神经元的三个集群组成的神经回路的形成，以演示功能性的工程神经网络的组装。动作电位记录演示AC电动力学效应不损害轴突，并且Ca2+成像演示了突触的连接的单向的本质。
使用轴突-锁定系统，演示了功能性的轴突二极管的构建。轴突二极管已经被在体外形成和使用以模仿在体内的神经元路径引导的方向性。方向性对于再生轴突以在周围神经损伤之后和在发育期间创建合适的连接是至关重要的。几乎没有体外系统能够创建方向性的连接。交流电动力学效应具有可再配置能力的优点，因为电场可以根据意愿被启动和关闭。因此，动态地锁定或释放正在发育的轴突的生长的能力对于神经元网络的创建具有使人激动的潜力。特别地，在神经引导导管中的轴突的选择性的生长可以改进轴突朝着它们的目标的导向并且防止轴突的误萌芽和不合适的神经支配。
为了使用多个轴突二极管产生神经网络，电极门被动态地打开和关闭以引导轴突使得室‘A’在一个方向与室‘B’连接，并且室‘B’在一个方向与室‘C’连接，而室‘C’不在任一个方向连接于室‘A’(图6A)。
我们首先检查通过活动的门的轴突的功能性以验证交流电场不损伤轴突的产生和传送动作电位(AP)的能力。为了进行动作电位测量，我们将门电极重新设想为刺激和记录电极以监视在通过二极管的轴突中的AP传播。电极的第一集合被作为刺激电极使用并且第二集合被作为记录电极使用。
图14A示出了来自已经通过轴突-锁定中的一个轴突-锁定的轴突的集合的动作电位读数。当每个刺激脉冲被施加时，沿着通过整个的二极管的轴突另外记录AP，确定轴突-锁定系统不干扰AP产生或传播。
方向性的网络的突触是否是激活的随后被确定。Oregon Green BAPTA1被作为着色剂使用以可视化当动作电位被KCl添加剂诱发时诱出的Ca++通量。KCl刺激通过选择性地加压另一个外储存器被限制到单个微室(图15A和15B)。当KCl被加入到室‘A’时，去极化被在所有的三个室中观察到(图14B，左)，而向室‘B’加入KCl仅诱出在室‘B’和‘C’中的Ca++振荡(图14B，中)，并且向室‘C’加入KCl仅产生在室‘C’中的振荡(图14B，右)。这些结果表明室‘A’被连接于室‘B’并且被连接于室‘C’(图14B，左)，并且还表明功能性的突触能够把来自起源于室‘A’中的神经元的信号通过室B转移至在室‘C’中的那些信号。此外，以下的观察，即刺激室‘B’产生在室‘C’中的Ca++振荡(图14B，中)但是刺激室‘C’不产生在室‘B’中的Ca++振荡(图14B，右)，表明两个室被轴突二极管定向连接。总体上，这些结果表明在我们的轴突-锁定系统中创建海马神经元的被定向连接的网络的能力。
图3是由轴突-锁定系统配置的12日体外神经元网络的荧光性的假彩色图像。平面箭头表示二极管的方向。图14A示出了动作电位记录，示出了刺激信号(黑色)和下游被记录的信号(有颜色的)。图14A是当依次地刺激神经元的每个子集群(由+KCl表示)时的OregonGreen BAPTA1-染色的神经元的假彩色的荧光图像。刻度条是50微米。
图15A和15B示出了通过使用差异性的流体静压力的流动的隔室化。通过放置在被连接于每个微室的入口和出口储存器中的液体的体积产生压力。因此，可能的是，通过放置正确的液体体积，把流动从一个微室导向至另一个微室，并且因此包含了仅向仅神经元的一个集群的局部应用化学物。图15A-B分别是当流动不被限制和当流动被限制时的三个微室的荧光图像。箭头指示通量的方向以及被添加到入口/出口中的液体的体积和量。通过把10微摩尔的荧光素和1微摩尔的荧光性的聚苯乙烯注射在一个储存器中将流动可视化。
实施例5
本实施例描述了在实验中使用的材料和方法。
电动力学装置的微制造和用于神经元装板的制备。
微流体芯片在150mm的玻璃晶片上制造。在标准的光刻步骤之后，利用电子束沉积一个10/100nm的Ti/Au双层并且在丙酮中剥离(lift-off)以暴露电极。然后对晶片进行管芯切割以获得单独的芯片。微通道包括两个类型的部件：用于细胞注射的高通道(100μm)和用于轴突生长的浅通道(高度为3μm)。它们由结合薄的(SU-8 2005)和厚的(SU8-2050)抗蚀剂使用两步光刻工艺制造的SU-8(Microchem)母版模塑。微通道然后使用已脱气并且已固化的PDMS(与固化剂的质量比9:1，Sylgard 184，道康宁)被模塑。塑料母版然后被用作用于最终的PDMS复制的未来的模具。微沟槽在暴露于空气等离子体(2分钟)并且在甲醇中浸没(5分钟)之后，在双目镜下手动对准。已组装的芯片被在100℃固化持续30分钟。
两个不同的微流体芯片被以这种方式构建。第一个(图1A)是由被微沟槽的阵列(长度：450μm；宽度：5μm；高度：3μm)分隔的矩形的微通道(长度：4000μm；宽度：500μm；高度：100μm)制造的二隔室芯片。第二芯片(图2A)是由被连接于被放置在等边三角形中的三个微室(直径：500μm，高度：100μm)的5-mm打孔的入口和出口储存器制造的三隔室芯片。每个储存器经过微通道(长度：450μm；宽度：50μm；高度：3μm)被连接于另一个储存器。微通道被0.1mg/mL的聚l-赖氨酸(Sigma Aldrich)在培育器中包覆持续24小时。通道然后被使用去离子(DI)水漂洗3次并且使用20μg/mL的层粘连蛋白(Sigma Aldrich)包覆持续2小时。通道被使用去离子水再次地洗涤3次并且使用含有2mM谷氨酰胺和100U/ml盘尼西林/链霉素(海马神经元培养基)的Neurobasal-B27洗涤和填充3次。微流体芯片被放置在培育器中直到使用。
解剖和细胞培养。
所有的动物相关的工作都被麻省理工学院动物保护委员会和比较医学分会(MITCommittee of Animal Care and Division of Comparative Medicine)批准并且遵守协会、州和联邦对动物福利的指南。海马神经元从E18Sprague Dawley大鼠(Charles RiverLaboratories)获取，并且在被10mM HEPES，pH 7.3缓冲的冰冷却的Hank's平衡盐溶液(HBSS)中溶解。组织通过在2ml的含有20U/ml的木瓜蛋白酶(Worthington Biochem.)、1mMEDTA和1mM L-半胱氨酸的被HEPES缓冲的HBSS中培育30分钟而被溶解。然后，组织被8ml的海马神经元培养基漂洗三次。细胞被在1ml的海马神经元培养基中温和地磨碎，使用血球计计数，并且被流进该装置中。细胞被保持在37℃，5％的CO2。
在装置中的神经元接种。
在接种之前，微流体芯片的储存器被清空，而不从微通道除去介质。对于每个入口储存器，4μL的高密度(>8 106个细胞/mL)已离解的神经元溶液被放置为邻近微通道的入口。芯片被返回至培育器持续5分钟以使神经元附着在被包覆的玻璃上并且接种过程被重复3次以实现高的细胞密度。在结束时，输入和输出储存器迅速地被海马神经元培养基填充并且芯片被返回至培育器。
神经元转染。
在装板之后24小时，神经元被使用微管蛋白-GFP杆状病毒(Tubulin-GFP Bacmam2.0病毒，Life Technologies)转染，其比率为对于104个细胞使用2μL的病毒，如被分布器指示的。细胞然后在16小时的培育之后被在荧光中成像。
图像获取。
图像使用装配有被冷却的CCD摄像机La Vision ImagerQE(La Vision)和自动化平台Ludl MAC 5000(Ludl)的Axiovert 200M(Zeiss)被获取。显微镜被Metamorph软件(Molecular Devices)控制并且图像使用ImageJ和Matlab(The Mathworks)软件被分析。
用于把AC电信号施加到培育器中的体外平台。
AC信号通过被放置在培育器内侧的定制的平台被施加于微电极。微流体芯片被对准并且被插入被联接于Arduino自制的印刷电路板组件的无插拔力(ZIF)连接器中。无插拔力连接器用作芯片的机械保持器和电保持器。组件主要由3个板组成，主Arduino板、直接数字合成(DDS)产生的AC信号板和路由板。DDS板(基于DDS-60子板，Midnight DesignSolution)能够产生在0-60MHz和0-10Vp-p范围内的AC信号。路由板(使用模拟器件公司的ADG333ABR开关，以及德州仪器公司的74HC595移位寄存器)能够把AC信号重路由并且保持至一个或多个电极。Raspberry Pi小型计算机通过USB被连接于Arduino，控制整个组件。web服务器被安装在Rasberry Pi上，使得用于每个电极的频率和电压可以通过web浏览器被实时地远程地改变。电信号被选择性地发送至每个电极，具体通过由电开关和移位寄存器组成的自制的arduino板。闭合开关的命令被web服务器正在其上持续地运行的RasberryPi发送至arduino。arduino板和ZIF连接器二者最终都被放置在培育器中。
轴突长度测量。
所有的沟槽都被在落射荧光下拍照并且轴突的长度使用Matlab被测量。成像算法包括首先增强对比度和亮度，然后二进制化图像(门限值针对每个图像手动优化)，然后应用霍夫变换并且最终测量通道边缘和轴突的端部之间的缝隙。对于每个电压和频率，我们把被标准化的轴突长度定义为观察到的轴突长度(在图6上AL)和通道的边缘与第一电极之间的距离(在图6上DCE)之间的比率。对于轴突-锁定系统，轴突长度使用与上文相同的算法被测量。当生长锥被电极隐藏时，该位置被假定为是电极自身的中部，具有电极宽度的误差。
神经元网络刺激。
神经元被Oregon green BAPTA1(Life Technologies)染色持续1小时并且使用介质洗涤。为了仅刺激一个子集群，20μL的90mM KCl溶液仅被注射在一个微室的入口中。神经元的另一个集群的储存器中的每个被50μL的介质填充，从而创建室之间的压力差以防止KCl从被注射的微室流出。这种流体流动隔室化的细节在补充性信息中给出。
动作电位记录。
动作电位通过微电极本身被记录在轴突-锁定三角形芯片中。来自同一个微通道的微电极通过ZIF模块被连接，作为刺激电极并且作为记录电极。脉冲发生器(TTi)被联接于换流器(Isolator-10，Axon Instruments)然后联接于刺激电极。记录电极被联接于锁定放大器(104倍增益，ISO-80，World Precision Instruments)并且被联接于PC示波器(PicoScope，PC示波器软件)。信号然后被输出到Matlab中并且被在时间上同步化。
统计分析。
对于轴突阻塞分析，差异通过来自两个独立的实验的不成对的学生的t检验被解决，其中每个实验条件被复制地进行。对于所有的分析：*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001。
实施例6
本实施例描述了在含有电极的微流体装置(例如电微流体芯片)中的三维胶原基质(例如胶原支架)的选择性的图案化。
胶原被在微流体通道和/或其他的微流体结构内侧选择性地图案化，而没有对于额外的图案化通道或另外的设备的需要。取决于微流体通道的高度，方法基于毛细管流动平衡以使用胶原灌注微流体芯片的被定义的区域。简单描述，胶原在整个微流体芯片内流动并且在某些微通道中排除胶原，为了芯片中的流动平衡，所述某些微通道仅使用丙烯酸(AA)。已知AA断裂胶原小纤维之间的稳定的氢键，导致胶原支架的溶液化。该方案的详细描述在实施例11中进一步被描述。图16示出了微流体芯片的横截面的图示和微流体芯片本身的图片。图16中的(a)是包括在室中的神经元体以及可以生长到具有变化的高度的胶原支架中的轴突的被隔室化的电微流体芯片的示意图。图16中的(b)是在6日之后在体外(DIV)没有任何场的、在5微米高的胶原支架中发育的轴突的明视场放大10倍的图片。轴突显示出来自胶原支架内的细胞体隔室的定向生长。图16中的(c)是在培养皿内的微流体芯片的照片。电连接部在芯片的下部上可见。
实施例7
本实施例描述了使用交流电场引导在具有5微米的高度的微沟槽内的胶原支架中的轴突生长。电极的表面形状不影响轴突生长。然而，3Vpp和150kHz的交变电流的施加排斥在强电场区中的轴突生长并且使轴突改变方向并且在低电场区中生长。
微流体芯片，例如在图16中示出的那些，结合共面电极和在已功能化的表面上的生长的神经元共同使用，以解决交流电动力学力能够通过组合微通道几何约束和电场分布来引导在胶原支架中的三个维度上的轴突生长的假设。为了解决这个假设，大鼠E-18海马神经元的发育在电微流体芯片中被观察到，如上文在实施例5和6中描述的，所述实施例具有变化的沟槽高度和电极几何构型。
当微沟槽高度(h)是5μm时，轴突生长被限制于单一平面，这是因为生长锥的空间约束。在神经元在细胞储存器中接种24小时之后，轴突开始延伸进朝向电极的微通道中。在这时，电场通过施加以3Vpp和150kHz的交变电流被激活。在对照芯片中，场保持不被激活。细胞被每24小时成像以监视生长和活力。
在体外的四日(4DIV)之内，在对照芯片中的轴突填充整个微通道(600μm×600μm)，如在图17中示出的。在未激活的电极上的轴突生长之间或在对照区中的轴突生长(箭头201)之间未能观察到生长速度上的差异，显示出电极的表面形状(h＝200nm)不影响生长。各个细胞从细胞储存器迁移到微通道中。因为高度限制，这些细胞最可能是神经胶质细胞，这些细胞挤进窄的开口中，遵循来自发育的轴突的导向因子。
在已激活的芯片的对照区(箭头201)中，轴突显示出与在未激活的芯片中近似相同的生长速度和密度(见图17的(a))。然而，相反的是，电场区近似地没有轴突生长。轴突实际上在第一电极之前转向并且跟随场线，直到到达较低场强的区(箭头202)。电极和平行的轴突之间的距离是约5-10μm。
图17的(b)示出了被评估为所施加的电压的函数的生长方向的改变。对于每个条件，三个不同的样品，每个具有一个通道，的电场区被分析，使每个被测试的通道容纳最小50个树突。在图中示出的角度分布代表在与电场相遇之前和之后的生长角度的相对的改变。黑色线是针对每个电压的中间角度。使电极不被激活(0V)，神经突平行于通道生长(中间值＝0°)并且在生长方向上仅具有小的改变，其同样地发生于两侧(±10°)。生长方向上的相似的偏离在使用1Vpp被激活的场时也能被发现。然而，中间角度略微地漂移到负值(-2.5°)，意味着远离电极。在该电压下的DEP力是最小的并且假定观察到的改变与交流电动力学无关。2Vpp的施加导致平均值接近-70°的转向，且具有-50°至-85°的范围。3Vpp导致高至-90°的最大的转向和与电极平行的生长，如在图17的(a)中观察到的。在2-3Vpp的范围内，在实施例2中描述的模型估计作用在生长锥上的66pN的最大DEP力。该力与导致生长锥在主体中的转向的牵引力处于相同的数量级。因此，DEP可能是生长方向改变的原因。最后，在电极上的4Vpp导致神经突的损伤并且没有角度偏差可以被测定(线在0°)。这些发现与在实施例13中描述的在不同电压下的细胞活力测试是一致的。
在某些情况下，各个轴突从侧部进入电场区中。这可能是在互相交叉的电极阵列的边缘处的不均匀电场以及因此减少的DEP的结果。在某些实验中，直接地紧邻通道壁生长的各个轴突的进入被观察到。可能的是，强的机械因子例如通道壁超过DEP效应并且允许轴突生长到电场区中。对于5μm高度，支架在通道中的存在或不存在导致相同的行为。生长锥主要与已功能化的表面互相作用，代替与支架互相作用。因此，对于小的通道高度，被支架填充的通道可以被视为等于被介质填充的高通道。
实施例8
本实施例描述了将交流电场用于增强在胶原支架中的轴突生长速度的用途。本实施例表明轴突生长的化学促进和无接触促进。
漏斗状电极被用于研究在信号和接地的电极的附近的轴突的电动力学约束的影响，如在图18的(a)中示出的。白色虚线标记在对照区中(箭头205)和在漏斗区中(蓝色箭头)发育的轴突的生长锥。轴突被在图18的(a)中追踪(箭头205)以表明漏斗效应。图18的(a)是在具有漏斗状设计(4DIV，100kHz，3Vp-p)的电极的5微米厚的被胶原填充的微通道中的轴突发育的图像。在漏斗电极之间的轴突(箭头206)比在未激活的电极上方的轴突(对照，箭头205)更快地生长。插图示出了在电极207的弯曲的部分内的轴突的漏斗引导，追踪了各个轴突以强调漏斗效应。此外，与不被约束的轴突相比的生长速度的增加被观察到。为了量化该效应，正在发育的轴突的长度被测量。图18的(b)示出了对于在不同的被施加的电压下在6DIV之后的在漏斗区和对照芯片(无电极)中的延伸长度。图18的(b)是在同一个场下在6DIV之后的神经突延伸长度的图。把轴突约束在漏斗内显著地增强它们在2-3V下如相对于在2D表面(玻璃)上的或在未激活的电极(0V)上方的5mm厚的凝胶中的轴突的生长速度。(***，p<0.001；**，p<0.01)。没有显著的差异在对照、未激活的电极和1Vpp(11v＝450μm)之间被观察到。电压增加至2Vpp导致延伸长度变为12v＝680μm的显著的升高。在具有3Vpp的甚至更强的场中，延伸长度(13v＝960μm)是对照的两倍多。除了轴突的空间约束之外，生长速度的增加被观察到。假设，生长锥需要更少的用于环境探测的时间，因为交流电运动力把有效的探测区域限制于1-D线。
实施例9
本实施例描述了将AC场用于减慢在具有10微米的高度的微沟槽内的胶原支架中的轴突生长的用途。电学力和机械力的组合被用于减慢轴突生长。
沟槽高度被增加至h＝10μm并且神经元被接种在微流体芯片中。在神经元在细胞储存器中接种24小时之后，轴突开始延伸到朝向电极的微通道中。在此时，电场被激活并且在1Vpp至3Vpp之间的不同的电势被以恒定的150kHz的频率施加。没有电极或具有未激活的电极的对照芯片被使用。
荧光图像在6DIV之后通过荧光成像被获得，如在图19上示出的。
支架的存在把已功能化的表面上生长速度提高了近似30％。把150kHz的1Vpp施加于电极不具有对长出的显著的影响。然而，2Vpp和3Vpp分别把轴突的长度显著地减少32％和48％。对于生长促进的一个潜在的解释是作为支架填充方案的结果的平行于生长方向的胶原纤维的对准。被对准的胶原纤维提供促进轴突生长的轨道状的机械导向因子，可以根据所花费的时间的减少决定哪个路径/因子被采用。
基于所提出的模型的模拟预测对于150kHz的1Vpp，DEP力仅10pN。因此，在生长锥上所施加的力被其他的导向因子例如基板刚性容易地超过。这可以解释为什么没有对延伸长度的影响在低的电压被观察到。相反地，较高的电压(2-3Vpp)产生延伸长度的显著的减少。一个可能的解释将是生长锥的空间约束，其可能已经使生长锥被向上并且远离电极朝向通道顶部推动，导致微通道的物理约束和电场的排斥效应之间的竞争，从而导致延伸长度的减少。
图19的(a)是在6DIV(100kHz，3Vp-p)之后在10mm厚的被胶原填充的微通道中的轴突发育的图像。在电极上方的轴突生长(箭头211)比远离电极的那些轴突生长(箭头210)短。图19的(b)是对于同一个场在各种场强度下在6DIV之后的神经突延伸长度的图。在胶原中的轴突生长随着增加的电压减少，并且可以比在2D表面(玻璃)上的生长慢。(***，p<0.001；**，p<0.01；*，p<0.1)。
实施例10
本实施例描述了将AC场用于推动轴突在具有50微米的高度的胶原支架的深度中生长的用途，使得轴突延伸在多个维度上发生(例如，xy平面、yz平面、xz平面)。
为了仿真三维生长环境，微沟槽高度被增加至50μm，被胶原支架填充。假设，在这样的支架中的轴突生长随着电场在胶原中的延伸而在深度上偏转。在神经元接种在细胞储存器中约24小时之后，神经突开始延伸进朝向电极的被支架填充的微通道中。在此时，电场被激活并且在1Vpp至3Vpp之间的不同的电势被以恒定的150kHz的频率施加。没有电极或具有未激活的电极的对照芯片被使用。
图20的(a)示出了在已激活的电极(3Vpp，150kHz)和6DIV之后的在50μm高的被胶原填充的通道中的轴突生长的示意性的并且共焦的图像。共焦的图像示出了沿着图20的(a)中的红线横穿被支架填充的微通道的荧光性的轴突的侧视图。因为没有暴露于场(顶部)，所以轴突的大多数靠近通道的玻璃底部生长。越过已激活的电极生长的轴突(底部)在z方向上偏转。使用共焦显微镜观察轴突偏转并且在支架内量化。图20的(b)示出了来自由共焦显微镜产生的3D图像的图像处理和侧视图重构的输出。侧视图共焦图像示出了沿着图20的(a)中的虚线横穿通道的未激活电极(顶部)和已激活电极(底部)的轴突。在没有电场的情况下，轴突沿着通道的高度统计分布。在施加场时，靠近于电极的轴突生长进行z跃变(实线)。场区中的轴突的最低高度由水平虚线表示。图20的(c)示出了对于对照和从1Vpp至3Vpp的不同电压的第一轴突的平均高度(***，p<0.001；**，p<0.01)。对照使用没有电极的或具有未激活的场的通道进行。没有高度的显著的差异在没有电极的、具有未激活的电极的或使用150kHz的1Vpp的通道中的生长之间被观察到。对于在2-3Vpp之间的被施加的电压，在靠近于电极的轴突的z方向上的生长存在显著的升高。对于2Vpp，在电极上的最低的轴突升高至3Vpp下的7±1.5μm至10±2μm的平均高度。
还要注意的是，轴突的升高比在电场区之后的掉落发生得更迅速。此外，在经过场之后的靠近于通道底部存在更少的轴突生长。似乎是，轴突被电运动力迅速地向上排斥并且在经过高场区之后再次地本身被统计学地取向。电运动力向上地并且远离电极的边缘作用，使轴突进行在强电场区上的‘跃变’。
实施例11
本实施例描述了使用AC场使第一神经突的集群和第二神经突的集群在三维基质内重叠而不形成第一集群和第二集群中的神经突之间的神经连接的方法。
为了例证在实施例6-10中描述的这些单元操作可以如何被用于各种应用，用于创建可调节的轴突交叉的方法被创建。在上文的实施例中描述的停止、漏斗引导和推动功能性被组合以创建轴突交叉。芯片设计被在图21A中示出并且由以下组成：
1-被隔室化并且流体地隔离的神经元的被荧光地染色的两个分别的集群；
2-把轴突束朝向芯片的活动部分集中的微流体集中沟槽；
3-漏斗形状电极，每对用于一个沟槽；以及
4-重叠区。
活动地带或重叠区是引导和推动电极和在其中轴突可以被向上推动的局部的50微米高的微沟槽的组合。在该装置中，胶原被选择性地注射在沟槽中并且被从细胞体被在其处接种的微通道中除去。为了促进在通道方向的轴突生长，发现，保持神经元隔室(在图21A上的左侧)和不具有神经元的隔室(右侧)之间的流体静力压力(HP)差异把轴突生长增加至少30％(轴突连接于没有HP的其他的隔室耗费8至9日，相对于具有HP的5至6日)。图21A是轴突桥接装置的被联接的透射图片(×20的放大)。两个被流体地隔离的神经元集群被装板并且在微通道中分别地染色。被隔室化的沟槽允许轴突朝向在插图中被增强的桥接区发育和汇聚。其由在实际的无接触的重叠区之前汇聚轴突束的漏斗电极组成。刻度条指示100微米。
没有任何场或HP，轴突生长明显是各向同性的，具有朝向保持初始的方向的倾向(荧光定量示出了在初始的通道的同一个方向的78±12％的生长速率)，如在图21B中示出的。图21B示出了没有任何来自微通道的场或流体静力压力的重叠区的荧光性的被联接的图片(放大×20)。刻度条指示100微米。轴突生长被朝向外部沟槽引导并且位于所有的毗邻的沟槽中。在这种情况下，来自两个集群的神经突在重叠区处重叠，但是神经突形成神经连接并且也在所有的通道中突出。相反地，当场被激活并且HP被保持时，如在图21C中示出的，重叠区清楚地汇聚轴突的束，允许它们重叠而不形成神经连接，在其他的通道中萌芽，并且增加它们的在同一个方向内的生长。图21C示出了具有已激活的场和流体静力压力的桥接区的荧光性的被联接的图片(放大×20)。刻度条指示100微米。轴突的高度的肌束震颤被在重叠区的出口处观察到。每种情况(1和2各自地)的邻接矩阵由C1和C2给出。
可选择地，神经连接可以使用两个相对的集群被制造。相对的神经元的两个集群被在轴突桥接装置中双向连接，如在图7D-E中示出的。为了构建神经连接，场被激活(150kHz和4Vpp)并且在输出垂直储存器中将HP保持为低。每种情况(1和2各自地)的邻接矩阵由C1和C2给出。
实施例12
本实施例描述了在实施例6-13中使用的材料和方法。
电动力学装置的微制造。
微流体芯片在标准显微镜载玻片(25×75×1.1mm，Sigma)上制造。10/100nm Ti/Au双层使用电子束沉积被沉积在标准显微镜载玻片(25×75×1.1mm，Sigma)上。然后使用标准光刻并且在250mL H2O+200mL HC1+100mL HNO2中湿蚀刻持续4分钟来构建该层。后续地，在HCL:水(2:1)中进行第二湿蚀刻10分钟以除去其余的钛。
微通道包括两个类型的部件：用于细胞注射的高通道(100微米)和用于轴突生长的浅通道(在5-50微米高度上)。它们从结合薄的(SU-8 2007)和厚的(SU8-2050)抗蚀剂使用二步光刻工艺制造的SU-8(Microchem)母版模塑。微通道然后使用已脱气的并且已固化的PDMS(与固化剂，Sylgard 184，Dow Corning，的质量比率为9:1)被模塑。微沟槽在暴露于空气等离子体(2分钟)之后被在双目镜下手动地对准并且浸没在甲醇中(5分钟)。已组装的芯片在100℃被持续固化30分钟。在初始的模塑之后，塑料母版被制造以用于装置的进一步的复制。PDMS模具然后使用立体显微镜(M80，Leica)被手动地对准至电极并且在暴露于空气等离子体2分钟之后被粘合在玻璃基板上。已组装的芯片在80℃被持续固化30分钟。
多个微流体芯片被以这种方式构建。为了评价AC场对在胶原支架中的轴突生长的影响，二隔室芯片被制造，其具有被平面阵列(长度：600微米；宽度：600微米；高度：5至50微米)分隔的矩形微通道(长度：4000微米；宽度：500微米；高度：100微米)。轴突桥接芯片是四隔室芯片，由被连接于被放置在正方形中的四个内储存器(长度：1000微米，高度：100微米)的5mm打孔的入口和出口储存器制成。每个储存器通过微通道(长度：500微米；宽度：50微米；高度：5微米)连接于另一个储存器。
表面处理和包覆。
为了清洁玻璃基板(具有电极)，玻璃基板被在7×清洁剂(MP Biomedicals)中煮沸持续1h，在去离子水中漂洗持续10s，使用丙酮、异丙醇和去离子水清洁并且最后在烘箱中在200℃烘烤持续2h。在烘烤之后，基板被等离子体清洁并且被粘合于PDMS微流体。通道被聚D-赖氨酸(0.1mg/ml，Sigma)填充并且被在37℃持续培育至少20小时。为了除去游离的PDL，通道被使用去离子水洗涤两次而不清空主通道。接着，通道被层粘连蛋白(20μg/ml，Sigma)填充并且被在37℃持续培育2小时。层粘连蛋白被吸出并且通道被使用平板培养基(DMEM+10％FBS+1％PS+1％L-谷氨酰胺)从一侧至另一侧洗涤3次。以这种方式被功能化的芯片在细胞接种之前以37℃持续储存最长2小时。海马神经元培养基是含有2mM谷氨酰胺和100U/ml盘尼西林/链霉素的neurobasal-B27。
胶原支架的选择性图案化。
胶原(10mg/ml，Gibco)在冰上与缓冲溶液(在2×PBS中250mM HEPES，pH 7.4，外加2M NaOH)混合持续1分钟。胶原与缓冲剂的比率取决于期望的最终的胶原浓度但是接近于1:1。在移液入芯片中之前，胶原溶液在冰上被培育10-30分钟以控制纤维厚度。
首先，已粘合的芯片被聚d-赖氨酸和层粘连蛋白功能化以允许神经元胞体在细胞储存器中的附着。第二，整个微流体通道被胶原I型溶液经过支架入口填充并且被在37℃培育至直到完全的凝胶化。然后乙酸(0.2M，pH 3.5)被移液入细胞储存器中以使胶原不稳定。为了防止蚀刻时酸进入微流体通道中，流体静力压力通过把细胞介质移液入入口中被施加。在37℃下蚀刻30分钟之后，已脱离稳定的支架经过细胞出口被小心地吸出。为了除去酸和残留物，通道被缓冲的细胞介质冲洗三次。图22示出了用于毛细管填充22-1和微流体图案化22-2的准则的图示。图22中的A示出了具有介质储存器(虚线)，细胞和支架储存器(100μm)和微通道(50μm)的电微流体芯片。图22中的B图示了结构被胶原填充和完全凝胶化之后的电微流体芯片。图22中的C图示了酸蚀刻细胞储存器之后的电微流体芯片，在酸蚀刻的同时，微通道被来自被支架填充的储存器的流体静力压力的施加保护。图22中的D图示了在已脱离稳定的支架被吸出并且过度的酸和其余部分被缓冲溶液除去之后的电微流体芯片。图22中的E是该过程的时间变化图像，并且在时间上可得到500μm/分钟的蚀刻速率。作为结果，支架仅保持在电极通道中和保持在介质储存器中，同时细胞储存器是空的并且可用于细胞的接种。
解剖和细胞培养。
所有的动物相关的工作都被批准并且遵守协会、州和联邦对于动物福利的指南。海马神经元从E18Sprague Dawley大鼠(Charles River Laboratories)获得，并且在被10mM HEPES，pH 7.3缓冲的冰冷却的Hank's平衡盐溶液(HBSS)中溶解。组织通过在2ml的含有20U/ml的木瓜蛋白酶(Worthington Biochem.)、1mM EDTA和1mM L-半胱氨酸的被HEPES缓冲的HBSS中培育30分钟而被溶解。然后，组织被8ml的海马神经元培养基漂洗三次。细胞被在1ml的海马神经元培养基中温和地磨碎，使用血球计计数，并且被以35,000个细胞/mm2的密度装板。细胞被保持在37℃，5％CO2。细胞介质每3日被更新50％。为了保持流体静力压力，神经元隔室的储存器每日被介质系统性地填充并且其他的被清空，而不干燥储存器表面。
在装置中的神经元接种。
在接种之前，微流体芯片的储存器被清空，而不从微通道除去介质。对于每个入口/出口储存器，6μL的平板培养基被放置在出口中并且紧随其后，4μL的高密度(>8 106个细胞/mL)收获的神经元溶液被放置在入口储存器处。芯片被返回至培育器持续5分钟以使神经元附着在被包覆的玻璃上并且接种过程被重复3次。在结束时，输入和输出储存器迅速地被海马神经元培养基填充并且芯片被返回至培育器并且插入体外平台中以施加如在实施例5中描述的AC场。
神经元转染。
对于每个荧光性的慢病毒属，tdTomato或EGFP在CMV启动子之后并且在土拨鼠肝炎转录后调节元件(WPRE)之前被在慢病毒转移质粒中克隆并且被在Stbl3细胞中扩增。为了产生病毒，3百万低传代(小于10)HEK293FT细胞(Life Technologies)在转染前一天在T-225烧瓶中接种在被10％FBS(Hyclone)补充的DMEM中。细胞被在OptiMEM中使用100μL的Lipofectamine 2000和200μL的具有20μg的转移质粒(tdTomato或EGFP)、15μg的psPAX2、和10μg的pVSVg(Addgene)的Plus试剂(Life Technologies)转染。在6小时之后，介质被除去并且被由10％FBS和1％BSA补充的DMEM代替。在60小时之后，上层清液被除去并且被在4℃以3000rpm离心持续10分钟。该上层清液通过0.45μm低蛋白键合过滤器(Millipore)过滤。为了实现病毒颗粒的300倍浓度，已过滤的慢病毒属被在4℃以24,000rpm超速离心(Sorvall)持续2小时并且然后在4℃下在由1％BSA补充的D10中再悬浮一整夜。等分部分被在-80℃储存，直到神经元转导。
图像获取。
图像使用装配有被冷却的CCD摄像机LaVision ImagerQE(LaVision)和自动平台Ludl MAC 5000(Ludl)的Axiovert 200M(Zeiss)被获取。显微镜被Metamorph软件(Molecular Devices)控制并且图像使用ImageJ和Matlab(The Mathworks)软件被分析。图像的集合使用用于Fiji的ImageJ插件被联接在一起。
图像分析以量化神经元的数量。
神经元体在所联接的图像上使用ImageJ插件MOSAIC进行计数。
图像分析以量化偏向角、生长速度和神经元的轴突高度。
神经突对准和长度的量化被如下地进行：含有一个具有胶原支架的通道的三个样品的图像通过使用Matlab(Math Works)对每个条件进行分析和量化。一个样品含有最少50个树突。反射强度的门限值被定义为能将神经突与背景区分开。通过对每个树突的长轴拟合一个椭圆，神经突与主通道方向的角度被测定。树突的平行于对准方向的取向对应于0°的角度。神经突的角度分布基于取向角度的相对频率(被分类为180个角度的分组)并且通过对高斯半高全宽(FWHM)的拟合被测定。初始的轨线的偏离被定义，使得在沿着神经突的评价点处的角度具有与前一个50微米(5倍于生长锥直径)相比的多于10％改变。偏离然后被记录为是那些初始轨线与角度之间的相对的差异。每个神经突的长度从其在被胶原填充的微通道的开始处的起始点至其端部进行测量。沿着其路线的方向的改变通过沿着每个延伸部的整个的长度进行跟踪被考虑在内。孤立并且被清楚地隔离的延伸部被测量，仅为了排除与其他的延伸部的混淆的可能性。生长速度然后通过把相对的测量到的长度除以那些测量之间的时间变化被评价。3-D形式的轴突高度通过荧光性的共焦图像组件在Matlab中的后处理被测定。脚本容纳高斯滤波器以减少噪声并且以测定轴突的中心。折线图包含在通道中的各个切片中所检测到的中心。
统计分析。
对于轴突阻塞分析，差异通过来自两个独立的实验的不成对的学生的t检验被解决，其中每个实验条件被复制地进行。对于所有的分析：*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001。
实施例13
本实施例描述了在高强度交流电场的细胞活力和约束在电极内发育轴突的方法。
在高强度交流电场的细胞活力。
把神经元暴露于高强度(E>105V/m)交流电场可能导致对轴突发育的损害。为了解决该问题，细胞和神经突的外观在实验期间使用明视场显微镜在每个24h中被监视。此外，对暴露于不同电压之后的细胞存活使用钙黄绿素AM(体外生成)染色进行了研究。钙黄绿素AM在活细胞中通过酶促反应成为荧光性的。
图23中的(a)示出了在暴露于0-4Vpp四日之后的有活力的(荧光性的)细胞的数量。没有显著的差异在对照、2Vpp和3Vpp之间被观察到。仅细胞的一部分在4Vpp下存活。图23中的(a)是在不同电压下的活细胞的平均数量的图。图23中的(b)示出了在3Vpp的活细胞培养。图23中的(c)示出了在4Vpp几乎没有互相连接的圆形的发白的神经元。图23中的(d)示出了在对照通道中的健康的神经突。图23中的(e)示出了在4Vpp的圆形的并且不规则的神经突。细胞储存器的明视场图像示出了在3Vpp的健康的细胞培养(图23中的(b))，与在4Vpp的不健康的培养(发白的并且圆形的细胞，几乎没有互相连接)(图23中的(c))形成对比。相同的观察可以对于在微通道中的轴突做出。与来自对照通道的有活力的轴突(图23中的(d))相比，使用4Vpp施加电势的电极附近生长的轴突在数量上较少并且显示出了圆形的并且不规则的生长。
根据在实施例2中描述的模型，电流体动力效应包括介质的加热对于大于3Vpp的电压变得更相关。这与细胞活力实验的观察是一致的。在某些实验中，然而，细胞体在几日之后团聚。假定这归因于细胞粘附分子(PDL和层粘连蛋白)的降解或不充分的沉积并且与电场效应无关。
所得出的结论是，交流电动力学对细胞活力的影响对于中等电压是最小的，前提是没有介质的过度的加热发生的话。
约束在电极内发育轴突。
当神经元被夹在电极本身之间时，轴突在电场的附近发育，被限制在电极的边缘之间，如在图24上示出的。
虽然本发明的多个实施方案已经在本文中被描述和图示，但是本领域的技术人员将容易地设想多种其他的用于执行各个功能和/或获得在本文中描述的结果和/或优点中的一个或多个结果和/或优点的手段和/或结构，并且这样的变化和/或修改中的每个都被视为在本发明的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地意识到，本文描述的所有的参数、尺寸、材料和配置都表示是示例性的并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于本发明的教导内容所应用于的一个或多个具体的应用。本领域的技术人员将意识到，或能够仅仅使用例行实验而断定，本文所描述的发明的具体实施方案的许多等效物。因此将理解，上文的实施方案仅以例子的方式提供并且在所附的权利要求和其等效物的范围内，本发明能以不同于所具体描述和要求保护的内容的方式被实践。本发明涉及本文描述的每个单独的特征、系统、产品、材料、试剂盒和/或方法。此外，两个或多于两个这样的特征、系统、产品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、产品、材料、试剂盒和/或方法不是相互矛盾的话，也被包括在本发明的范围内。
不定冠词“一(a)”和“一个(an)”，如本文在说明书中和在权利要求中使用的，除非清楚地指示相反的意思，否则应当被理解为意指“至少一个”。
短语“和/或”，如本文在说明书中和在权利要求中使用的，应当被理解为意指如此被结合的元素的“一个或二个”，即，在某些情况下结合地存在并且在其他的情况下分离地存在的元素。除非清楚地指示相反的意思，否则，除了被“和/或”条目特别地指代的元素之外，其他的元素可以可选择地存在，而不管其与那些被特别地指代的元素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性的实施例，对“A和/或B”的引用，在与开放的语言例如“包括”共同地使用时，可以在一个实施方案中指代有A没有B(可选择地包括除了B的元素)；在另一个实施方案中，指代有B没有A(可选择地包括除了A的元素)；在又一个实施方案中，指代A和B二者(可选择地包括其他的元素)；等等。
如本文在说明书中和在权利要求中使用的，“或”应当被理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的意思。例如，当分隔列表中的条目时，“或”或“和/或”应当被解释为是包括性的，即，包括至少一个，而且包括多个元素或元素列表中的多于一个元素，以及，可选择地，包括另外的未列出的条目。除非术语清楚地指示相反的意思，否则，例如“…中的仅一个”或“…中的唯一一个”，或，当“由…组成”在权利要求中使用时，都将指代包括多个元素或元素列表中的唯一一个元素。通常，术语“或”，如本文使用的，当被排他性的术语例如“任一个”、“…中的一个”、“...中的仅一个”或“…中的唯一一个”引导时，应当仅被解释为表示排他性的替代形式(即“一个或另一个而不是两个”)。“实质上由…组成”，当在权利要求中使用时，应当具有其在专利法领域中使用的一般含义。
如本文在说明书中和在权利要求中使用的，短语“至少一个”，在用于一个或多个元素的列表时，应当被理解为指代选自来自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但是不一定包括在元素列表内具体列出的每个元素中的至少一个和每个元素，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许不同于短语“至少一个”指代的元素列表内所具体标识的元素的元素可以可选地存在，无论其与那些被特别标识的元素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性的实施例，“A和B中的至少一个”(或，等效地，“A或B中的至少一个”、或，等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指代至少一个，可选地包括多于一个A，没有B存在(并且可选择地包括除了B的元素)；在另一个实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个B，没有A存在(并且可选择地包括除了A的元素)；在又一个实施方案中，指代至少一个，可选地包括多于一个A，并且至少一个，可选地包括多于一个B(并且可选择地包括其他的元素)；等等。
在权利要求中，以及在上文的说明书中，所有的过渡短语例如“包括”、“包含”、“承载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、和类似的短语将被理解为是开放的，即，被理解为意指包括但不限于。仅过渡短语“由…组成”和“实质上由…组成”应当分别是封闭的或半封闭的过渡短语，如在美国专利局专利审查程序办公手册的2111.03节中提出的。

Claims (56)

1.一种用于改变神经突生长的体外方法，包括：
提供包括一个或多个神经突的之前隔离的神经元；
提供交变电流电场；以及
将非均匀的交变电流电场定位在所述神经突的伸长场上以通过排斥在所述交变电流电场的区中的神经突生长来定向引导一个或多个神经突的伸长。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
提供物理导向因子，其中，所述物理导向因子能够可逆地阻止所述神经突的生长；以及
使用所述物理导向因子控制所述神经突的生长。
3.根据权利要求1所述的方法，包括形成轴突二极管。
4.根据权利要求2所述的方法，包括形成轴突二极管。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，特征在于，所述交变电流电场的强度小于100V/m。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，特征在于，所述交变电流电场通过电极之间具有小于或等于200微米的中心到中心间距的两个或多于两个电极产生。
7.根据权利要求5所述的方法，特征在于，所述交变电流电场通过电极之间具有小于或等于200微米的中心到中心间距的两个或多于两个电极产生。
8.根据权利要求1-4和7中的任一项所述的方法，其中，定向引导伸长包括定向引导在基板上或在三维支架内的神经突伸长。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，定向引导伸长包括定向引导在基板上或在三维支架内的神经突伸长。
10.根据权利要求6所述的方法，其中，定向引导伸长包括定向引导在基板上或在三维支架内的神经突伸长。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述支架是包括胶原的凝胶基质。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述支架是包括胶原的凝胶基质。
13.根据权利要求1-4、7和9-11中的任一项所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上相同的条件下相对于在所述交变电流电场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。
14.根据权利要求5所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上相同的条件下相对于在所述交变电流电场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。
15.根据权利要求6所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上相同的条件下相对于在所述交变电流电场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。
16.根据权利要求8所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上相同的条件下相对于在所述交变电流电场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，影响神经突的生长包括在实质上相同的条件下相对于在所述交变电流电场不存在时的神经突伸长加速神经突伸长。
18.根据权利要求1-4、7、9-11和14-17中的任一项所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
19.根据权利要求5所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
20.根据权利要求6所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
21.根据权利要求8所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
22.根据权利要求12所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
23.根据权利要求13所述的方法，其中，影响神经突的生长包括可逆地阻止在第一取向上的神经突伸长并且允许在第二取向上的神经突伸长。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述第二取向处于相对于垂直于所产生的电场的电极的轴线的大于或等于90度的角。
25.根据权利要求19-23中的任一项所述的方法，其中，所述第二取向处于相对于垂直于所产生的电场的电极的轴线的大于或等于90度的角。
26.根据权利要求1-4、7、9-11、14-17和19-24中的任一项所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
27.根据权利要求5所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
28.根据权利要求6所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
29.根据权利要求8所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
30.根据权利要求12所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
31.根据权利要求13所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
32.根据权利要求18所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
33.根据权利要求25所述的方法，其中，引导神经突的生长是使第一神经突与第二神经突重叠。
34.根据权利要求1-4、7、9-11、14-17、19-24和27-33中的任一项所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
35.根据权利要求5所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
36.根据权利要求6所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
37.根据权利要求8所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
38.根据权利要求12所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
39.根据权利要求13所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
40.根据权利要求18所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
41.根据权利要求25所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
42.根据权利要求26所述的方法，特征在于，在三维支架内，定向引导第一神经突和第二神经突的伸长以形成在第一神经突的集群和第二神经突的集群之间的神经网络。
43.根据权利要求1-4、7、9-11、14-17、19-24、27-33和35-42中的任一项所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
44.根据权利要求5所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
45.根据权利要求6所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
46.根据权利要求8所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
47.根据权利要求12所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
48.根据权利要求13所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
49.根据权利要求18所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
50.根据权利要求25所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
51.根据权利要求26所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
52.根据权利要求34所述的方法，其中，所述交变电流电场的频率大于或等于100Hz。
53.根据权利要求34所述的方法，其中，所述第一神经突起源于与所述第二神经突不同的神经元。
54.根据权利要求35-42中的任一项所述的方法，其中，所述第一神经突起源于与所述第二神经突不同的神经元。
55.一种用于改变神经突生长的产品，包括：
能够容纳活细胞并且促进细胞生长的室；
通道，其中，所述通道被连接于所述室，其中，所述通道具有小于或等于20微米的高度和/或宽度；以及
多个电极对，其中，一个电极对包括具有小于或等于200微米的中心到中心间距的两个电极，并且
其中，所述多个电极对与所述通道交叉且被调整为在所述通道上提供交变电流电场以用于排斥所述通道上的神经突生长。
56.根据权利要求55所述的产品，包括：
连接于第一通道的第一室；
与所述第一通道的至少一部分对准的第一电极对，其中，所述第一电极对的一部分与所述第一室的至少一部分重叠；
连接于第二通道的第二室；以及
与所述第二通道的至少一部分对准的第二电极对，其中，所述第二电极对的一部分与所述第二室的至少一部分重叠，其中，所述第一通道和所述第二通道在具有大于10微米的高度的重叠区处交叉。
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