KR20150094715A - 발현 카세트 - Google Patents

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KR20150094715A
KR20150094715A KR1020157018351A KR20157018351A KR20150094715A KR 20150094715 A KR20150094715 A KR 20150094715A KR 1020157018351 A KR1020157018351 A KR 1020157018351A KR 20157018351 A KR20157018351 A KR 20157018351A KR 20150094715 A KR20150094715 A KR 20150094715A
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카츠유키 도도
타카히사 츠키하라
마유미 시모무라
코이치 이노우에
히데토 쵸노
준이치 미네노
마사나리 키타가와
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 (1) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역; 및 (2) 상기 발현 조절영역에 결합 가능한 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산으로써, 상기 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 핵산을 포함하는 발현 카세트, 그 발현 카세트를 사용하는 포유동물 세포에 있어서의 목적 산물의 발현방법, 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법, 및 포유동물 세포에 있어서의 목적 산물의 제조방법, 및 그발현 카세트를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

발현 카세트{EXPRESSION CASSETTE}
본 발명은 유전자 공학적 산물의 제조에 유용한 발현 카세트, 및 당해 발현 카세트의 이용에 관한 것이다.
재조합 단백질 등의 폴리펩티드 생산에는 원핵생물, 효모, 곤충세포, 원충, 포유동물 세포 등에, 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터를 사용해서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 도입하고, 숙주세포 내의 단백질 생산 시스템을 사용해서 전사ㆍ번역시키는 방법이 사용되고 있다. 그 중에서도, 포유동물 세포를 사용한 방법은 번역 후 변형이 인간과 동일할 것, 포유동물 유래의 단백질의 접힘을 정확하게 수행할 수 있는 것 등으로부터, 단백질 공학분야, 분자유전학 분야뿐만 아니라, 면역 공학분야, 유전자 치료분야, 의약품 제조분야의 연구 또는 임상으로의 응용에 적합하다.
그렇지만, 포유동물 세포를 사용한 재조합 단백질의 생산방법에서는, 원핵생물이나 효모를 사용한 방법과 비교하면, 산물이 충분하게 수득되지 않는 경우가 많다. 이 문제의 해결을 목적으로 하는 기술로서, 예를 들면, 인간 세포에 있어서의 재조합 단백질 발현계에 있어서, 트랜스 활성화계를 가지는 단백질 발현계에 에피솜 유지계 및 강력한 프로모터/인핸서를 부가한 기술(특허문헌 1)이나, 인간 면역부전 바이러스 1형(이하, HIV-1)의 트랜스 활성화 응답서열(Trans Activation Responsive Region, 이하, TAR이라고 기재한다.) 결합 인자인 인간 유래 TRBP의 TAR으로의 결합작용에 의해, CMV 프로모터와 TAR을 가지는 발현 조절영역의 제어 하에서, 단백질의 발현을 향상시키는 기술(비특허문헌 1) 등이 알려져 있다.
국제공개 제2002/027005호 팸플릿
The Journal of Biological Chemistry, 제278권, 제4440-4448쪽 (2003)
본 발명의 목적은 번잡한 조작없이 목적 산물 등을 고발현시키는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 목적 산물의 발현량을 향상시키는 방법을 예의 검토했다. 그 결과, 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 상기 결합영역에 결합하는 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 동작 가능하게 접속한 발현 카세트를 창제했다. 그리고 상기 카세트를 제1 발현 카세트(이하, '전사 활성화 인자 발현 카세트' 라고도 언급한다.)로 하는 포유동물 세포로의 도입과, 전사 활성화 인자 발현 카세트와 동일한 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산 서열을 동작 가능하게 접속한 제2 발현 카세트(이하, '목적 산물 발현 카세트' 라고도 언급한다.)의 포유동물 세포으로의 도입을 조합시키는 것에 의해서, 목적 산물의 발현량이 향상하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다(도 1). 본 발명에 의하면, 폴리펩티드의 생산뿐만 아니라, RNA나 바이러스 벡터의 생산도 고효율로 달성된다.
본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
(1) 하기 (1) 및 (2)를 포함하는 발현 카세트:
(1) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역; 및
(2) 상기 발현 조절영역에 결합 가능한 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산으로써, 상기 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 핵산.
(2) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 더욱 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 상기 (1)에 기재된 발현 카세트.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 발현 카세트.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 발현 카세트.
(5) 포유동물 세포에서의 목적 산물의 발현방법으로써, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 방법:
(a) 제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트, 및, 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 세포에 도입하는 공정; 및
(b) 공정(a)에서 수득된 세포를 배양하는 공정,
여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는다.
(6) 포유동물 세포에서의 목적 산물의 발현방법이며, 하기(a) 및 (b)를 포함하는 방법:
(a) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 추가로 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 상기 (1)에 기재된 발현 카세트를 세포에 도입하는 공정; 및
(b) 공정(a)에서 수득된 세포를 배양하는 공정.
(7) 상기 (5) 또는 (6)에서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 발현방법.
(8) 상기 (5) 내지 (7) 중 어느 하나에서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 발현방법.
(9) 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법으로써,
제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트, 및, 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포유동물 세포에 도입하는 공정을 포함하고,
여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는 방법.
(10) 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법으로써,
전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 추가로 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 상기 (1)에 기재된 발현 카세트를 포유동물 세포에 도입하는 공정을 포함하는 방법,
(11) 상기 (9) 또는 (10)에서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 제조방법.
(12) 상기 (9) 내지 (11) 중 어느 하나에서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 제조방법.
(13) 포유동물 세포에서의 목적 산물의 제조방법으로써, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 방법:
(a) 상기 (5) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 목적 산물을 발현시키는 공정; 및
(b) 발현한 목적 산물을 얻는 공정,
(14) 하기 (1) 및 (2)를 포함하는 키트:
(1) 제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트; 및
(2) 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속되도록 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 삽입 가능한 부위를 포함하는 제2 발현 카세트,
여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는다.
(15) 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트가 각각 다른 핵산 구축물에 탑재되어 있다, (14)에 기재의 키트,
(16) 상기 (14)에서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트가 동일한 핵산 구축물에 탑재되어 있는 키트.
(17) 제1 발현 카세트가 또한 제1 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속되도록 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 삽입 가능한 부위를 포함하는 상기 (1)에 기재된 발현 카세트를 포함하는 키트.
(18) 상기 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 키트.
(19) 상기 (14) 내지 (18) 중 어느 하나에서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 키트.
본 발명에 의해, 세포 내에서의 전사 활성화 인자의 공급에 유용한, 전사 활성화 인자 발현 카세트가 제공된다. 또, 이 전사 활성화 인자 발현 카세트와, 상기 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 발현 조절영역에 가지는 목적 산물 발현 카세트를 사용한, 목적 산물의 발현방법 및 제조방법 및 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법이 제공된다. 또 상기 방법에 사용되는 키트가 제공된다. 본 발명은 단백질 공학분야, 분자 유전학분야뿐만 아니라, 면역 공학분야, 유전자 치료분야, 의약품 제조분야의 기초연구 또는 임상응용에 있어서 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 개념을 나타내는 도면이고, 도 A는 일반적인 목적 산물 발현 카세트의 개략도이고, 도 B는 Tat를 발현하는 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 TAR에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역을 포함하는 목적 산물 발현 카세트를 사용한, 본 발명의 발현방법의 개략도이다.
도 2는 실시예 2-(1)에 있어서 조제한 세포 라이세트를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 각 시험조건에서의 Tat 시그널 강도를 나타내는 도면이다.
본 명세서에서 발현 카세트란, 목적 산물을 발현시키기 위해서 필요한 요소를 포함한 핵산 구축물을 가리킨다. 구체적으로는, 적어도 프로모터를 포함하는 발현 조절영역과, 상기 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 핵산 구축물을 가리킨다.
본 명세서에서, 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산에 관해서 「동작 가능하게 접속된」이란 목적 산물이 발현할 수 있도록, 발현 조절영역에 대해서 적절한 위치에서 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 배치되어 있는 것을 의미한다. 일반적으로, 발현 조절영역은 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산에 대해서 cis가 되도록 동작 가능하게 배치되지만, 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산에 직접 인접하고 있을 필요는 없고, 또 IRES(Internal Ribosome entry site) 서열이나 2A 펩티드를 코딩하는 서열 등을 통해서 배치된 복수의 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산에 배치되어 있을 수도 있다. 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 복수 배치되는 경우, 동일한 목적 산물을 발현시키는 핵산이 복수 배치되어 있을 수도 있고, 또 다른 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 복수 배치되어 있을 수도 있다.
본 명세서에서 발현 조절영역이란 발현 카세트에서의 목적 산물의 발현을 컨트롤하는 영역을 가리킨다. 구체적으로는, 프로모터를 포함하는 영역을 가리킨다. 발현 조절영역은 추가로, 전사의 조절에 관계하는 각종 조절서열을 포함할 수도 있다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에서의 프로모터로서는 포유류 세포에서 기능하는 임의의 프로모터가 예시되고, CMV 프로모터, SV40 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터, PGK 프로모터 등의 항상적 발현 프로모터, U3 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터 등이 호적하게 예시된다. 이것들의 프로모터 이외에, 공지의 유도성 프로모터, 조직ㆍ기관 특이적 프로모터, 시기 특이적 프로모터, 또는 그것들과 기능적 동등성을 가지는 돌연변이서열 등을 본 발명에 사용할 수도 있다. 본 발명에서의 프로모터로서는 하기에 기술하는 전사 활성화 인자 결합영역과 유래가 다른 프로모터가 호적하게 예시되고, 전사효율이 높은 CMV 프로모터가 특히 호적하게 예시된다.
본 발명의 발현 카세트에서의 발현 조절영역에는 전사효율을 상승시키는 것을 목적으로 하고, 프로모터의 주변이나 전사 개시점 하류의 비번역 영역에, 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열이 배치된다. 여기에서 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열로서는 RNA인 전사 활성화 인자 결합영역의 염기서열 혹은 상기 서열에 상당하는 DNA 서열이 예시된다. 전사 활성화 인자 결합영역은 특정한 전사 활성화 인자와의 상호작용(결합/괴리)에 의해, 그 발현 카세트에 포함되는 유전자의 전사효율을 상승시키는 서열이다. 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열은, 필요에 따라서 발현 벡터의 복수 개소에, 혹은 반복 서열로서 사용할 수도 있다. 상기의 상호작용은 전사 활성화 인자 결합영역으로부터 전사된 RNA와 전사 활성화 인자와의 사이에서 일어난다. 전사 활성화 인자 결합영역으로서는 HIV-1, HIV-2 및 SIV 등의 면역 부전 바이러스의 5'말단 반복서열(LTR) 내에 존재하는 TAR이 예시된다. TAR은 면역 부전 바이러스의 LTR 내에 존재하는 고차구조를 형성하는 영역이고, 여기에 전사 활성화 인자 Tat(Trans Activator)가 결합하면 면역 부전 바이러스 RNA의 전사가 촉진된다. 따라서 본 발명의 형태에서는, 전사에 의해 생성된 mRNA 상에 전사 활성화 인자 결합영역이 형성되도록, 상기의 발현 조절영역이 구축된다. 본 발명에서의 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열로서는 서열목록의 서열번호 2로 나타내는 HIV-1 유래의 TAR에 상당하는 서열을 포함하는 핵산이 특히 호적하게 예시된다. 또, 본 발명에 이용되는 TAR의 염기서열은 야생형 유래의 염기서열일 수도, 그것에 기능적으로 상동한 염기서열일 수도 있다. 기능적으로 상동한 염기서열로서는 Tat와의 결합능을 가지는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 서열목록의 서열번호 2에 기재된 염기서열에 대해서 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지는 염기서열로 이루어지는 것이 예시된다.
본 명세서에서 전사 활성화 인자란 RNA 결합능을 가지는 단백질로써, 단독으로, 혹은 이량체나 복합체를 형성해서 RNA에 결합하고, 프로모터에 의존하고 있는 전사의 효율을 더욱 상승시키도록 작용하는 인자를 가리킨다. 전사 활성화 인자로서는 HIV-1, HIV-2, 및 SIV등의 면역 부전 바이러스의 전사 활성화 인자인 Tat, 인간 유래의 트랜스 활성화 인자인 TRBP가 예시된다. 본 발명에서의 전사 활성화 인자로서는 서열목록의 서열번호 1로 나타내는 HIV-1의 전사 활성화 인자인 Tat가 특히 호적하게 예시된다. Tat는 면역 부전 바이러스의 LTR에 포함되는 TAR에 결합하는 것에 의해서 면역 부전 바이러스 RNA의 전사를 촉진하는 인자이다. 따라서 전사 개시점보다 하류에 TAR를 가지는 발현 조절영역으로부터의 전사는, Tat에 의해 촉진된다. 또, 본 발명에 이용되는 Tat는 야생형일 수도, 그 변이체일 수도 있다. 변이체로서는 TAR와의 결합능을 가지는 것인 한 특별하게 한정은 없지만, 서열목록의 서열번호 1에 기재된 염기서열에 코딩되는 아미노산 서열에 대해서 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 변이체가 예시된다.
본 발명에 의해 제공되는 전사 활성화 인자 발현 카세트는 프로모터와, 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 상기 결합영역에 결합하는 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 동작 가능한 상태에서, 바람직하게는 전사 개시부위와 번역 시작부위 사이에 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열이 위치하도록 접속하는 것에 의해서 제작할 수 있다. 더 바람직하게는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열과 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산은, 예를 들면 500 염기 이하, 바람직하게는 300 염기 이하, 더 바람직하게는 100 염기 이하의 DNA 단편을 개재해서 접속하는 것에 의해서 제작할 수 있다. 이렇게 해서 제작된 전사 활성화 인자 발현 카세트는 발현한 전사 활성화 인자가, 동 카세트로부터 전사되는 mRNA 상의 전사 활성화 인자 결합영역에 상호작용함으로써, 전사 활성화 인자가 발현이 더욱 촉진된다는 양의 피드백(positive feedback) 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서의 목적 산물의 발현 카세트는 프로모터와, 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 동작 가능한 상태로 접속하는 것에 의해서 제작할 수 있다. 이것들의 핵산은 소망하는 산물이 수득되면 천연 유래의 것일 수도, 인공합성의 것일 수도 있다. 또, 이것들의 핵산의 염기서열은 천연형의 염기서열일 수도, 천연형의 염기서열에 있어서 1이상의 염기가 치환, 결실, 및/또는 삽입되어 이루어지는 염기서열일 수도 있다. 상기의 전사 활성화 인자 결합영역은 병용하는 전사 활성화 인자 발현 카세트로부터 발현되는 전사 활성화 인자가 결합하는 서열이다. 목적 산물로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면, 형광 단백질이나 각종 성장인자, 효소, 항체 등의 폴리펩티드가 예시된다. 또, 반드시 번역을 거친 것일 필요는 없고, rRNA , tRNA, 핵내 저분자 RNA, shRNA, siRNA, 및 안티센스 RNA 등, 전사 산물인 핵산일 수도 있다.
본 발명의 발현방법은 상기의 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 상기의 목적 산물 발현 카세트를 세포에 도입하고, 그 세포를 배양하는 것에 의해 달성된다. 본 발명의 발현방법에서의 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 목적 산물 발현 카세트의 2종의 카세트의 발현 조절영역은 각각, 전사 활성화 인자 발현 카세트에 의해 발현하는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는다.
본 발명의 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법은 상기의 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 상기의 목적 산물 발현 카세트를 세포에 도입하는 것에 의해 달성된다.
본 발명에서의 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 목적 산물 발현 카세트의 2종의 카세트는 각각 다른 핵산 구축물에 탑재된 것일 수도, 동일한 핵산 구축물에 탑재된 것일 수도 있다. 동일한 핵산 구축물에 탑재되는 경우에는, 상기 제1 발현 조절영역과 제2 발현 조절영역을 단일의 발현 조절영역에서 조달할 수 있다. 즉, 단일 상기 발현 조절영역에, 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산과 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 함께 동작 가능한 상태로 접속할 수도 있다. 이 경우, 예를 들면 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산 서열과 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산 서열의 사이에, IRES 서열이나 2A 펩티드를 코딩하는 서열 등을 삽입할 수 있다. IRES 서열이나 2A 펩티드를 코딩하는 서열을 삽입하는 경우, 이것들의 서열의 상류에 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산 서열을 하류에 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산 서열을 배치할 수도 있다. 또 그 반대일 수도 있다.
본 발명의 호적한 형태에서는 상기의 발현 카세트는 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터에 탑재해서 사용된다. 상기 플라스미드 벡터에는 특별하게 한정은 없지만, 적합하게는 포유동물용 발현 플라스미드 벡터인, pBApo-CMV DNA, pIRES Bicistronic Expression Vector(이상, TAKARA BIO INC.) 등이 예시된다. 또, 바이러스 벡터에는 특별하게 한정은 없지만, 적합하게는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 등이 예시되고, 각각 시판품을 사용할 수 있다. 또, 양발현 카세트는 각각 1종류씩 사용해도, 복수 종류 사용해도 좋다. 예를 들면, 하기 실시예 10에 기재와 같이 2종류 이상의 다른 목적 산물 발현 카세트를 포함하는 핵산 구축물을 본 발명의 발현방법에 사용할 수도 있고, shRNA 라이브러리의 발현 카세트를 포함하는 핵산 구축물이나 siRNA 라이브러리의 발현 카세트 등을 포함하는 핵산 구축물을 본 발명의 방법에 사용할 수도 있다. 또, 1종류의 목적 산물 발현 카세트를 복수 개 포함하는 핵산 구축물을 본 발명의 방법에 사용해도 좋다.
본 발명의 방법에서 발현 카세트가 도입되는 세포로서는 특히 본 발명을 한정하나 것은 아니지만, 포유동물 세포가 호적하게 예시된다. 포유동물 세포로서는 본 발명의 방법에 의해 목적 산물의 발현이 달성되는 것이라면 한정은 없다. 예를 들면, 인간 세포에 있어서는 접착계 또는 부유계의 HEK293 세포나 293T 세포, 293F 세포, 293FT 세포(모두, Life Technologies Corporation.), G3T-hi 세포(TAKARA BIO INC.: 국제공개 제06/035829호 팸플릿), HeLa 세포(ATCC CCL-2), MOLT-4 세포(ATCC CRL-1582), PER.C6(등록상표) 세포(Crucell사) 등이 예시된다. 인간 이외의 영장류 세포로서는 COS-1 세포(ATCC CRL-1650), COS-7 세포(ATCC CRL-1651) 등이, 설치류 세포로서는 CHO 세포(ATCC CCL-61), HePa1-6 세포(ATCC CRL-1830) 등이 예시된다.
본 발명에서, 발현 카세트를 세포에 도입하는 방법에는 특별하게 한정은 없지만, 도입된 발현 카세트를 포함하는 핵산 구축물이 일과성으로, 혹은 항상적으로 세포에 유지되는 공지의 도입방법이 예시된다. 예를 들면 플라스미드 벡터의 도입방법으로서는 인산 칼슘법, 리포펙션법, DEAE 덱스트란법, 폴리에틸렌이민법, 일렉트로포레이션법 등이 예시된다. 도입에는 시판의 시약, 예를 들면 TransIT(등록상표)-293 Reagent(Mirus사), Lipofectamine 2000 Reagent(Life Technologies Corporation.), FuGene(등록상표; Promega Corporation.) 등을 사용할 수 있다. 여기에서, 핵산 구축물을 세포에 도입하고, 도입된 핵산 구축물을 게놈에 통합한 세포를 선택적으로 증식시키는 방법 등에 의해, 도입한 핵산 구축물을 염색체 상에 가지는 세포를 취득할 수도 있다. 또, 바이러스 벡터를 사용하는 경우에는, 그 성질에 따른 적절한 방법으로 세포에 감염시키면 좋다. 이것들 핵산도입방법에는 시판의 키트 등을 사용할 수 있는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 발현방법에서의 세포의 배양조건은 소망하는 세포의 증식, 목적 산물의 취득을 달성할 수 있는 조건이라면 특별하게 한정은 없다. 예를 들면, 통상의 세포배양에서 사용되는 조건으로 실시할 수 있다. 예를 들면 온도 30∼37℃, 습도 90∼100%, CO2농도 3∼10%에서의 배양이 예시된다.
본 발명의 목적 산물의 제조방법은 본 발명의 발현방법을 사용해서 목적 산물을 얻는 것으로 달성된다. 목적 산물을 얻는 방법에 특별하게 한정은 없고, 예를 들면 세포 및/또는 배양 상청액으로부터 당업자에게 공지의 기술을 사용해서 목적 산물을 얻으면 좋다. 본 발명의 제조방법에서는 목적 산물은 반드시 단리할 필요는 없다. 즉, 목적 산물을 포함하는 배양물 바로 그것의 취득, 배양물로부터의 조생성물의 취득(예를 들면, 배양 상청액의 취득)도 본 발명에서의 「목적 산물을 얻는다」의 의미에 포함된다. 또, 추가로 공지의 방법을 이용해서 목적 산물을 추출, 농축, 혹은 정제할 수 있다.
본 발명의 방법은 단일 폴리펩티드나 RNA를 얻는 형태에 한정되지 않는다. 예를 들면, 복수의 단백질과 핵산으로 이루어지는 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터의 제조방법도 본 발명의 1형태이다. 상기 바이러스 벡터의 제조방법으로서는 바이러스 벡터 제조에 필요한 단백질의 발현 카세트와 바이러스 입자에 봉입되는 핵산의 발현 카세트를, 전사인자 발현 카세트와 함께 세포에 도입하고, 그 세포를 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건으로 배양하고, 세포 내 및/또는 배양 상청액에 생산된 바이러스 벡터를 취득하는 방법이 예시된다.
본 발명의 방법에는 추가로 본 발명의 발현 카세트의 전사효율을 상승시키는 폴리펩티드 등을 사용할 수 있다. 상기의 폴리펩티드로서는 예를 들면 ELL2, AFF4, ENL, AF9, 또 p-TEFb이나, 그것을 구성하는 CyclinT1, cdk9 등의 전사 신장 인자가 예시된다. 추가로, RNA 폴리머라아제 II를 사용할 수도 있다. 이것들의 폴리펩티드는 공지의 방법을 사용해서 세포 중에서 발현시켜도 좋다.
본 발명에 의해, 본 발명의 발현 카세트를 함유하는 키트도 제공된다. 1형태에서는, 본 발명의 키트는 상기의 전사 활성화 인자 발현 카세트를 함유하는 키트이다. 다른 형태에서는, 본 발명의 키트는 상기의 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및, 이 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역, 및 상기 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속되도록 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 삽입 가능한 부위를 포함하는 발현 카세트(목적 산물 발현용 카세트)를 함유하는 키트이다. 예를 들면, 전사 활성화 인자 발현 카세트를 탑재한 벡터와 목적 산물 발현용 카세트를 탑재한 벡터의 조합, 혹은 이것들 양 카세트를 탑재한 벡터가 본 발명의 키트의 형태로서 예시된다. 양 카세트를 탑재한 벡터에서는 단일 발현 조절영역에서 전사 활성화 인자와 목적 산물을 발현시켜도 좋다. 본 발명의 키트에 사용되는 벡터로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터가 예시된다. 또, 본 발명의 키트는 취급 설명서, 핵산도입용이나 클로닝용의 시약, 및/또는 숙주세포 등을 추가로 포함할 수 있다. 숙주세포를 추가로 포함하는 경우, 본 발명의 전사 활성화 인자 발현 카세트가 미리 그 숙주세포에 도입되어 있을 수도 있다. 본 발명의 키트는 상기의 본 발명의 방법의 실시에 특히 유용하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: Tat와 TAR를 사용한 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 목적 산물 발현 카세트의 구축
(1) 전사 활성화 인자 발현 카세트: pCMVTAR-Tat 플라스미드의 구축
pBApo-CMV DNA(TAKARA BIO INC.)의 멀티클로닝사이트에, HIV-1의 NL4-3주 유래의 Tat를 코딩하는 핵산(서열번호 1)을 삽입하고, pCMV-Tat 플라스미드를 구축했다. 여기에서 pBApo-CMV DNA란 시토메갈로바이러스 유래의 프로모터(CMVIE 프로모터) 및 단순 포진바이러스 티미닌키나아제의 폴리A 시그널로 구성 되는 포유류 세포용의 유전자 발현 플라스미드이다. 계속해서 HIV-1의 LTR 유래의 TAR에 상당하는 서열을 포함하는 핵산(서열번호 3)을 PCR로 취득하고, 이 핵산을 상기 pCMV-Tat 플라스미드의 CMV 프로모터와 Tat를 코딩하는 핵산 사이에 삽입하고, pCMVTAR-Tat 플라스미드를 제작했다. 여기에서, pCMVTAR-Tat 플라스미드는 상기 플라스미드로부터 발현한 Tat가 동 플라스미드의 TAR에 결합함으로써, Tat 발현이 더욱 촉진된다는 양의 피드백 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
(2) 목적 산물 발현 카세트: pCMVTAR-AcGFP1 플라스미드의 구축
pBApo-CMV DNA의 멀티클로닝사이트에, 서열번호 3으로 나타내는 핵산을 삽입하고, pCMV-TAR 플라스미드를 구축했다. 다음에, 상기 pCMV-TAR 플라스미드의 TAR의 하류에 위치하는 멀티클로닝사이트에, 형광 단백질 AcGFP1을 코딩하는 핵산을 삽입하고, pCMVTAR-AcGFP1 플라스미드를 구축했다. 또, 컨트롤로서 pBApo-CMV DNA의 멀티클로닝사이트에 AcGFP1을 코딩하는 핵산을 삽입하고, pCMV-AcGFP1 플라스미드를 구축했다.
실시예 2: Tat 발현에 의한 AcGFP1 발현 증강작용
(1) AcGFP1 형광강도에 의한 평가
표면 처리된 12웰 플레이트(Becton, Dickinson and Company.)에 접착성의 293T 세포를 1웰당 2.5×105개/1㎖로 파종하고, CO2 인큐베이터(37℃, 습도 95%, CO2농도 5%)에서 배양했다. 배지에는 소 태아혈청(FBS, Life Technologies Corporation.)을 10%가 되도록 첨가한 DMEM 배지(sigma-Aldrich Co., Ltd.)를 사용했다. 24시간의 배양 후, 배양세포에 플라스미드를 도입했다. 도입은, 사용한 플라스미드의 종류와 량(1웰당)이 다른 9종류의 시험조건을 설치해서 실시했다. 각 시험조건에서 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 1에 나타낸다. 또, 플라스미드의 도입은 TransIT-293을 사용해서 키트 첨부의 프로토콜에 따라서 실시했다.
Figure pct00001
도입 후의 세포는, CO2 인큐베이터에서 2일간 배양했다. 도입의 다음날에, 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에서 각 웰의 배지를 교환하고, 2일간의 배양 종료 후, 세포를 회수했다. 회수한 세포 중, 5×105개의 세포를, PBS(Life Technologies Corporation.)로 세정한 후, 50㎕의 1×SDS sample buffer(50mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 0.005% bromophenol blue, 100mM dithiothreitol)를 첨가하고, 95℃, 5분간의 열처리를 실시하고, 세포 라이세트로 했다. 나머지의 세포는 Flow cytometry에 적용하고, 세포 중에 발현한 AcGFP1에 의한 형광을 측정했다. 형광이 관측된 세포의 평균 형광강도를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
그 결과, Tat 발현 플라스미드를 사용하지 않는 조건(시험조건 1)에서는, AcGFP1 형광강도가 낮았다. 한편, Tat 발현 플라스미드를 사용한 조건 하(시험조건 3∼8)에서는, 각 Tat 발현 플라스미드의 사용량에 상관해서 AcGFP1 형광강도가 높아졌다. 추가로 Tat 발현 플라스미드로서 본 발명의 전사 활성화 인자 발현 카세트를 가지는 pCMVTAR-Tat 플라스미드를 사용한 조건 하(시험조건 6∼8)에서는, 현저에 형광강도가 높아졌다. 특히 0.2㎍의 pCMVTAR-Tat를 사용한 조건(시험조건 8)에서는, 시험조건 1과 비교해서 10배 이상의 형광강도가 수득되었다. 이것으로부터, AcGFP1 발현은, Tat의 존재에 의해 높아지고, 또한 Tat 발현량에 상관하는 것이 나타났다. 추가로 pCMVTAR-Tat 플라스미드의 양의 피드백 효과로 Tat 발현이 높아지는 것에 의해, AcGFP1 발현이 현저하게 증강하는 것이 나타났다.
(2) SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 평가
실시예 2-(1)에서 조제한 세포 라이세트를, SDS-폴리아크릴아미드 겔에 1레인(lane)당 세포 2×104개분 어플라이하고, 전기영동을 실시했다. 전기영동 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색했다. 염색된 겔 화상을 도 2에 나타낸다. 다음에, 염색된 겔 화상을 스캐너로 스캐닝하고, 화상해석 소프트웨어 LuminoShot(등록상표) Analyzer 2.0(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 AcGFP1의 밴드의 시그널 강도를 산출했다. 또, 시그널 강도의 산출은 아래와 같이 실시했다. 우선, 각 레인의 25kDa 부근에 존재하는 AcGFP1의 밴드와, 15kDa 부근의 293T 세포 유래 단백질의 밴드의 시그널 강도를 수치화했다. 다음에, 15kDa 부근의 293T 세포 유래 단백질의 밴드의 시그널 강도를 기준으로 해서, AcGFP1의 밴드의 시그널 강도를 보정했다. 추가로 AcGFP1의 밴드의 시그널 강도 보정값으로부터, 네거티브 컨트롤(레인9)의 25kDa 부근의 시그널 강도를 빼고, 수득된 값을 AcGFP1의 밴드의 시그널 강도로 했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
도 2에 나타내는 바와 같이, pCMV-AcGFP1 플라스미드를 사용한 조건 하(레인1)에서는, AcGFP1의 밴드는 전혀 확인할 수 없었다. 한편, Tat 발현 플라스미드를 사용한 조건 하(레인3∼8)에서는 AcGFP1을 메이저 밴드로서 확인할 수 있었다.
또, 표 3에 나타내는 바와 같이, Tat 발현 플라스미드를 사용한 조건(시험조건 3∼8)에서는, 각 Tat 발현 플라스미드의 사용량에 상관해서 시그널 강도가 상승했다. 또, pCMVTAR-Tat를 사용한 조건(시험조건 6∼8)에서는 pCMV-Tat를 사용한 조건(시험조건 3∼5)과 비교해서, 현저하게 시그널 강도가 상승했다. 이것으로부터, AcGFP1 발현은, Tat의 존재에 의해 높아지고, 또한 Tat 발현량에 상관하는 것이 나타났다. 추가로, pCMVTAR-Tat 플라스미드의 양의 피드백 효과로 Tat 발현이 높아지는 것에 의해, AcGFP1 발현은 현저하게 증강된 것이 추측되었다.
실시예 3: pCMVTAR -Tat의 Tat 단백질 발현 증강효과
실시예 2와 동일하게, 접착성의 293T 세포에 AcGFP1 발현 플라스미드 및 Tat 발현 플라스미드를 도입했다. 또, 본 실시예에서는 배양 담체로서 표면 처리된 6웰 플레이트(Becton, Dickinson and Company.)를 사용하고, 1 웰당의 세포 파종조건을 6×105개/2.5㎖로 했다. 도입에 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
도입 후의 세포는, CO2 인큐베이터에서 1일간 배양한 후, 회수했다. 회수한 세포의 일부를 Flow cytometry에 적용하고, 실시예 2와 같은 현저한 AcGFP1 발현 증강 효과를 확인했다. 나머지의 세포 중, 1×106개를 사용해서 실시예 2와 동일하게 세포 라이세트를 조제했다. 이 라이세트를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하고, 항HIV-1Tat 항체(Abcam사),및 샘플간의 전기영동량의 평가용으로서 항α-tubulin 항체(Cell Signaling Technology, Inc.)를 사용해서 웨스턴 블로팅을 실시했다. 항체의 검출에는 SuperSignal(등록상표) West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 사용하고, 검출은 화학발광검출장치 LuminoShot(등록상표)140(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 캡쳐하고, 각 시그널 강도를 수치화하고, (Tat 시그널 강도/α-Tubulin 시그널 강도)을 산출하고, 이것을 보정된 Tat 시그널 강도로 했다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3에서, Tat 발현 플라스미드로서, 본 발명의 전사 활성화 인자 발현 카세트를 가지는 pCMVTAR-Tat를 사용함으로써, pCMV-Tat와 비교해서 분명하게 Tat 발현량이 향상하는 것이 나타났다. 따라서 AcGFP1의 발현 증강은 Tat의 발현 증강효과에 의한 것이 나타났다.
실시예 4: 부유성 293 세포에서의 AcGFP1 발현 증강작용
(1) AcGFP1 형광강도에 의한 평가
부유성의 293 세포의 배양 시스템인 FreeStyle293 Expression system(Life Technologies)을 사용하고, 키트의 프로토콜에 따라서 125㎖ 플라스크에 부유성의 293 세포를 2×107개/20㎖의 조건으로 파종, 배양하고, AcGFP1 발현 플라스미드를 도입했다. 각 시험조건에 있어서 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
도입 후의 세포는 CO2 인큐베이터에서 2일간 배양했다. 그 후에 Flow cytometry에 적용하고, 세포 중에 발현한 AcGFP1에 의한 형광을 측정했다. 형광이 관측된 세포의 평균 형광강도를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00006
그 결과, 접착성의 293T 세포와 동일하게, 부유성 293 세포에서도 pCMVTAR-Tat와 pCMVTAR-AcGFP1을 사용한 조건(시험조건 3, 4)에서 AcGFP1 발현이 현저에 증강하는 것이 나타났다.
실시예 5: 전사 활성화 인자 발현 카세트, 및 목적 산물 발현 카세트를 동일분자에 가지는 플라스미드의 구축
pCMVTAR-AcGFP1 플라스미드의 AcGFP1을 코딩하는 서열의 하류에 피코르나바이러스 유래의 IRES 서열 및 Tat를 코딩하는 핵산(서열번호 1)을 삽입한 플라스미드를 구축하고, pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat라고 명명했다.
실시예 6: Tat 발현에 의한 AcGFP1 발현 증강작용
실시예 5에서 구축한 pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat를 사용하고, 접착성 293T 세포에서의 AcGFP1 발현 증강작용을 평가했다. 평가는 실시예 2와 동일하게 실시했다. 단, 1웰당의 세포 파종조건을 1.5×105개/1㎖로 했다. 각 시험조건에 있어서 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
도입후의 세포는 CO2 인큐베이터에서 2일간 배양했다.그 후에 Flow cytometry에 적용하고, 세포 중에 발현한 AcGFP1에 의한 형광을 측정했다. 형광이 관측된 세포의 평균 형광강도를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
그 결과, pCMVTAR-AcGFP1-IRES-Tat를 사용한 조건(시험조건 2)에서, AcGFP1 발현이 현저에 증강하는 것이 나타났다. 즉, 본 발명의 전사인자 발현 카세트와 목적 산물 발현 카세트는 단일 플라스미드에 탑재해도 목적 산물의 발현을 증강시킨다.
실시예 7: 분비형 단백질 G- CSF 발현 플라스미드의 구축
pCMV-AcGFP1 , pCMVTAR-AcGFP1 및 pCMVTAR-AcGFP-IRES-Tat의, AcGFP1을 코딩하는 핵산 대신에 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)를 코딩하는 핵산을 삽입한 플라스미드를 구축하고, 각각, pCMV-G-CSF, pCMVTAR-G-CSF, pCMVTAR-G-CSF-IRES-Tat라고 명명했다.
실시예 8: Tat 발현에 의한 G- CSF 발현 증강작용
실시예 7에서 구축한 G-CSF 발현 플라스미드를 사용해서 접착성 293T세포 및 부유성 293 세포에서의 G-CSF 발현 증강작용을 평가했다. 접착성 293T 세포로의 유전자도입은 실시예 2와 동일하게 실시했다. 또, 세포 파종조건은 5×105개/2㎖로 했다. 부유성 293 세포로의 도입은 실시예 4와 동일하게 실시했다. 또, 세포 파종조건은 125㎖ 플라스크에 4.5×107개/30㎖로 했다. 각 시험조건에 있어서 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 9에 나타낸다.
Figure pct00009
도입 후의 세포는 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 2, 5 및 7일째에 배양 상청액을 0.08㎖ 씩 샘플링했다. 샘플링한 배양 상청액은 G-CSF량의 측정에 사용되었다. 측정은 Human G-CSF Assay Kit(IBL Co., Ltd.)를 사용하고, 키트의 프로토콜에 따랐다. 그 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure pct00010
그 결과, 세포외분비 단백질인 G-CSF에 있어서도 TAR와 Tat를 사용한 본 발명의 발현 카세트를 사용한 조건(시험조건 3∼5, 9∼11)에서 대폭적인 발현량의 향상이 나타났다.
실시예 9: 항 인간 CD3 항체 발현 플라스미드의 구축
pCMVTAR-AcGFP1 의, AcGFP1을 코딩하는 핵산 대신에 항 인간 CD3 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 핵산을 삽입한 플라스미드를 각각 구축하고, pCMVTAR-HC, pCMVTAR-LC라고 명명했다.
실시예 10
실시예 9에서 구축한 항 인간CD3 항체 발현 플라스미드를 사용해서 접착성 293T세포 및 부유성 293 세포에서의 항 인간 CD3 항체 발현 증강작용을 평가했다. 접착성 293T 세포로의 도입은 실시예 2와, 부유성 293 세포로의 도입은 실시예 8과 동일하게 실시했다. 각 시험조건에 있어서 사용한 플라스미드의 종류와 양을 표 11에 나타낸다.
Figure pct00011
도입 후의 세포는 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 2 , 5 및 7일째에 배양 상청액을 0.04㎖ 씩 샘플링했다. 샘플링한 배양 상청액은 항 CD3 항체 생산량의 측정에 사용되었다. 측정은 Mouse IgG EIA Kit(TAKARA BIO INC.)를 사용하고, 키트의 프로토콜에 따랐다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00012
그 결과, 항 인간 CD3 항체에 있어서도 TAR와 Tat를 사용한 본 발명의 발현 카세트를 사용한 조건(시험조건 2, 5)에서 대폭적인 발현량의 향상이 나타났다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은 단백질 공학분야, 분자 유전학분야뿐만 아니라, 면역 공학분야, 유전자 치료분야, 의약품 제조분야의 기초 연구 또는 임상응용에 있어서 매우 유용하다.
서열표 프리텍스트
SEQ ID NO:1: Tat coding sequence
SEQ ID NO:2: Nucleic acid sequence corresponding to TAR
SEQ ID NO:3: Nucleic acid sequence including sequence corresponding to TAR
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Expression cassette <130> 671802 <150> JP 2012-269902 <151> 2012-12-11 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat coding sequence <400> 1 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60 gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca 120 aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag 180 aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac 240 ccgacaggcc cgaaggaata g 261 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence corresponding to TAR <400> 2 gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccc 59 <210> 3 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence including sequence corresponding to TAR <400> 3 gtacttcaag aactgctgat atcgagcttg ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc 60 agggaggcgt ggcctgggcg ggactgggga gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc 120 agctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 180 ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctc 213

Claims (19)

  1. 하기 (1) 및 (2)를 포함하는 발현 카세트:
    (1) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역; 및
    (2) 상기 발현 조절영역에 결합 가능한 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산으로써, 상기 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 추가로 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 발현 카세트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 발현 카세트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 발현 카세트.
  5. 포유동물 세포에 있어서의 목적 산물의 발현방법으로써, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 방법:
    (a) 제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트, 및, 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 세포에 도입하는 공정; 및
    (b) 공정(a)에서 수득된 세포를 배양하는 공정,
    여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는다.
  6. 포유동물 세포에 있어서의 목적 산물의 발현방법으로써, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 방법:
    (a) 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 추가로 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 제 1 항에 기재된 발현 카세트를 세포에 도입하는 공정; 및
    (b) 공정(a)에서 수득된 세포를 배양하는 공정.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 발현방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 발현방법.
  9. 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법으로써,
    제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트, 및, 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 포함하는 제2 발현 카세트를 포유동물 세포에 도입하는 공정을 포함하고,
    여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 방법.
  10. 목적 산물을 발현하는 세포의 제조방법으로써,
    전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 가지는 발현 조절영역에, 추가로 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산이 동작 가능하게 접속된 제 1 항에 기재된 발현 카세트를 포유동물 세포에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 제조방법.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 제조방법.
  13. 포유동물 세포에 있어서의 목적 산물의 제조방법으로써, 하기 (a) 및 (b)를 포함하는 방법:
    (a) 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 목적 산물을 발현시키는 공정; 및
    (b) 발현한 목적 산물을 얻는 공정.
  14. 하기 (1) 및 (2)를 포함하는 키트:
    (1) 제1 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속된 전사 활성화 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 카세트; 및
    (2) 제2 발현 조절영역과 당해 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속되도록 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 삽입 가능한 부위를 포함하는 제2 발현 카세트,
    여기에서, 상기 제1 발현 조절영역 및 상기 제2 발현 조절영역은 제1 발현 카세트에 코딩되어 있는 전사 활성화 인자가 결합하는 전사 활성화 인자 결합영역에 상당하는 서열을 갖는다.
  15. 제 14 항에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트가 각각 다른 핵산 구축물에 탑재되어 있는 키트.
  16. 제 14 항에 있어서, 제1 발현 카세트와 제2 발현 카세트가 동일한 핵산 구축물에 탑재되어 있는 키트.
  17. 제1 발현 카세트가 추가로, 제1 발현 조절영역에 동작 가능하게 접속되도록 목적 산물을 발현시키기 위한 핵산을 삽입 가능한 부위를 포함하는 제 1 항에 기재된 발현 카세트를 포함하는 키트.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성화 인자가 면역 부전 바이러스의 Tat 또는 기능적으로 상동한 그 변이체인 키트.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 활성화 인자 결합영역이 면역 부전 바이러스의 트랜스 활성화 응답서열 또는 그것에 기능적으로 상동한 서열인 키트.
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