KR20150083115A - 리보조절인자 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20150083115A
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알렉산더 에이. 그린
펭 이인
제임스 제이. 콜린스
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
트러스티스 오브 보스턴 유니버시티
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Abstract

본 발명은 특히 활성화 및 억제 리보조절인자, 스위치, 및 트리거 및 싱크 RNA를 포함하는 신규 다기능성 부류의 리보조절인자, 및 샘플, 예컨대 웰 중 RNA 검출을 위한 및 단백질 합성 및 발현을 조절하는데 있어서의 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

리보조절인자 조성물 및 사용 방법 {RIBOREGULATOR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
연방정부 지원 연구
본 발명은 DARPA가 수여한 승인 번호 635-67116-XXXX-167832-435548-0002.66625 및 미국 국립 보건원이 수여한 승인 번호 1DP2OD007292 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가진다.
관련 출원
본원은 2012년 11월 6일 출원된 미국 가출원 번호 61/722825 및 2013년 7월 9일 출원된 미국 가출원 번호 61/843934를 우선권 주장하며, 이들 가출원 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
리보조절인자는 핵산 서열에 대한 반응으로 세포에서 변화를 가져오는 RNA 서열이다. 전형적으로 단백질 번역을 조절하거나, mRNA 분해를 일으키는 이러한 RNA 기반 장치는 유전자 발현에 대하여 감수성인 제어, 상이한 대사 경로를 통한 대사 유동의 전환, 및 세포 사멸에 대한 합성적 제어를 비롯한, 합성 생물학 분야에서 많은 적용을 위해 사용되어 왔다.
유전자 발현을 제어하는 리보조절인자에서, 단백질 번역 억제는 관심 유전자 (GOI) 상류의 이중체 RNA 영역 내의 보통 단일 가닥인 리보솜 결합 부위 (RBS)의 격리에 의존하여 왔다. 따라서, RBS가 GOI 상류의 헤어핀 내에 격리되어 있는 mRNA는 시스-억제된 RNA (crRNA)이다. 트랜스-활성화 RNA (taRNA)가 crRNA에 결합하여, 억제 RNA 이중체를 언와인딩하여 현 단일 가닥 RBS를 노출시키고, 하류 유전자의 번역을 활성화시키는, 조작된 crRNA에 기반하는 리보조절인자가 구축될 수 있다. GOI의 발현을 감소시키는 리보조절인자에서, GOI의 RBS 및 개시 코돈 둘 모두 트리거(trigger) RNA의 부재에서 노출된다. 그러나, RBS 및 출발 코돈에 대한 안티센스를 보유하는 트랜스-억제 RNA (trRNA)는 리보조절인자에 결합하여 하류 유전자의 번역을 강하게 억제시킬 수 있다.
지난 10여 년간에 걸쳐 연구원들은 원핵 세포에서 유전자 발현을 제어하는 다수의 상이한 리보조절인자 시스템을 개발해 왔다. 이러한 기존 시스템들은 다수의 반복 디자인 모티프를 이용해 왔다. 대다수의 리보조절인자들은 루프-선형 상호작용을 사용하여 crRNA/트랜스-RNA 혼성화 반응이 앞으로 진행되도록 구동시켰다. 이러한 상호작용에서, 가닥 중 한쪽 가닥 중의 선형 단일 가닥 영역은 나머지 다른 한 가닥 중의 이중체의 단부에서 확립된 루프에 결합한다. RNA 서열의 3차 구조가 루프 내의 염기가 바깥쪽으로 플립핑하여 선형 RNA 가닥과의 결합이 용이하게 이루어지도록 하는 키싱 루프 구조를 형성하는 것이 이러한 상호작용에서 필수적이다. 중요하게는, 이러한 키싱 루프 구조는 오직 루프 영역 내부의 특이 서열과 함께 하는 경우에만 확립되는 바, 이는 가능한 crRNA 디자인의 개수를 심하게 제한할 수 있다.
기존의 리보조절인자 시스템들은 모두 GOI의 번역을 방해하기 위해 RBS를 격리시키는 것에 의존해 왔다. 이러한 디자인 선택은 2가지 중요한 의미를 내포한다. 첫째, 합성 생물학 분야에서 유전적 회로를 최적화시키는데 있어서의 많은 작업들은 세포내 단백질 수준을 미세하게 조정하기 위해 RBS의 강도를 다양하게 하는데 의존한다. RBS 서열이 이들 리보조절인자의 기능상 일부가 되기 때문에, 리보조절인자 RBS를 변이체로 간단히 대체할 수 없고, 새 RBS의 강도에 따라 달라지는 장치의 출력 특징을 예측 방식으로 예상할 수 없다. 추가로, RBS를 변화시키기 위해서는 트랜스-RNA의 서열을 그에 상응하여 변형시켜야 할 것이다. 두번째, 유전자 발현을 활성화시키는 리보조절인자의 경우, RBS를 격리시키는 리보조절인자는 crRNA RBS 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 taRNA 서열에 의해 활성화되어야 한다. 결과적으로, 비결합 taRNA는 리보솜 결합에 대하여 탈억제된 crRNA 종과 경쟁할 수 있다. 대안적으로, taRNA 내의 RBS 서열은 또한 줄기 영역 내에서 격리되어 있을 수 있다. 이러한 추가의 2차 구조는 crRNA와의 결합의 동역학적 성질 및 리보조절인자의 역학적 범위를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 부분적으로는 관심 세포 또는 샘플에서 내인성 RNA를 비롯한 RNA에 의해 활성화될 수 있는 프로그램가능 리보조절인자를 제공한다. 상기 프로그램가능 리보조절인자는 이전에는 부분적으로 본원에 개요되어 있는 서열 제약을 비롯한 심각한 제약에 기인하여 가능하지 않았다. 본 발명의 신규한 리보조절인자는 taRNA (트리거 RNA) (및 taRNA가 혼성화하는 crRNA (예컨대, 스위치 RNA)의 상응하는 영역)의 서열에 충분한 자유를 제공함으로써 예를 들어, RNA, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 내인성 RNA에 의해 활성화될 수 있도록 한다. 단백질 리포터, 예컨대 형광 리포터에 커플링되었을 때, 상기 리보조절인자는 살아있는 세포 또는 다른 유형의 RNA 함유 샘플 중의 RNA 수준을 실시간으로 프로빙할 수 있는 센서로서의 역할을 할 것이다. 본 발명은 세포 (또는 샘플)로부터 RNA를 수거할 필요 없이 내인성 RNA를 실시간으로 검출하고 정량화하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 생리학적 카피수로 존재하는 RNA를 검출하는데 충분한 감도를 가진다.
본 발명의 리보조절인자는 선행 기술의 것보다 서열에 있어 제약을 덜 받으며, 따라서 다양한 리보조절인자가 생성될 수 있고, 중요하게는 단일 시스템, 예컨대 세포에서 함께 사용될 수 있다. 지금까지는 선행 기술의 리보조절인자를 사용할 경우 그러한 직교성(orthogonality)은 가능하지 않았다. 본 발명의 리보조절인자는 또한 그의 구조를 위해 RBS에 의존하지 않는다. 그 결과, 리보조절인자의 기능에는 영향을 주지 않으면서 RBS를 변형시킬 수 있다. 본 발명의 리보조절인자의 프로그램가능 성질을 통해 고차 세포 논리를 "플러그 앤 플레이" 방식으로 실행할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 본 발명의 리보조절인자 (토홀드(toehold) 스위치 RNA 및/또는 토홀드 억제인자 포함) 및/또는 taRNA (트리거 RNA) 및/또는 싱크 RNA 조성물을 사용하여, 하나 이상의 내인성 RNA의 수준을 검출 (감지) 및 측정하는 방법, 세포 또는 샘플 중 하나 이상의 단백질을 동시에 고감도로 제어하는 방법 (번역 제어 포함), 세포 또는 샘플 중 복합 논리 연산을 실행하는 방법, 세포 또는 샘플 중에서 프로그램화하는 방법, 살아있는 시스템에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 검출하는 방법, 및 시험관내 번역 시스템에서 RNA 및 SNP RNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 시스-억제 RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 RNA (taRNA)는 전체적으로 또는 부분적으로 RNA로 구성될 수 있다. 이는 자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. crRNA는 또한 본원에서는 스위치 RNA로도 지칭될 수 있다. taRNA (또는 트리거 RNA)에의 결합으로 crRNA/스위치 RNA로부터 관심 단백질이 번역되는 바, crRNA란, 전형적으로 상기 결합이 이루어질 때까지는 억제된 RNA를 의미한다. 트리거 RNA의 crRNA/스위치에의 결합은 일부 경우에서는, 및 본원에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 토홀드 도메인을 통해 일어난다.
본 발명은 코딩 도메인에의 작동가능한 연결을 통해 모듈 방식으로 사용될 수 있는 crRNA를 고려한다. 본 발명은 crRNA를 탈억제시키거나 또는 활성화시키는데 모듈 방식으로 사용될 수 있는 taRNA도 추가로 고려한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 단일 가닥 토홀드 도메인, 개시 코돈을 포함하는 완전 또는 부분적 이중 가닥 줄기 도메인, 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인을 포함하는 토홀드 crRNA (토홀드 스위치) 리보조절인자를 제공한다. 토홀드 crRNA/토홀드 스위치는 루프 도메인에 위치하는 RBS 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (하기 기술되는 바와 같이) 임의로 코딩 도메인에 작동가능하게 연결된 1개 초과의 crRNA를 포함하는 RNA로서, 여기서 다중 crRNA는 동일한 taRNA (트리거 RNA)에 의해 또는 상이한 taRNA (트리거 RNA)에 의해 활성화될 수 있는 것인 RNA를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단일 taRNA가 하류 코딩 서열의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 실시양태에서, 토홀드 crRNA 리보조절인자는 단일 판독치를 사용하여 복수 개의 taRNA의 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (1) 단일 가닥 토홀드 도메인, 개시 코돈을 포함하는 완전 또는 부분적 이중 가닥 줄기 도메인, 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인을 포함하는 crRNA 리보조절인자, 및 (2) 코딩 도메인을 포함하는 토홀드 리보조절인자 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 줄기 도메인 중 상보적 영역에 혼성화하는 taRNA는 하류 코딩 서열의 발현을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 하류 코딩 서열의 발현을 활성화시키기 위해서는 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 taRNA, 또는 taRNA 모두가 요구된다. 시스템 및 장치라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 제한하는 것은 아니지만, 임의의 조합으로 crRNA (스위치 RNA), taRNA (트리거 RNA), 싱크 RNA 등을 포함하는 리보조절인자 성분의 집합물을 의미한다.
일부 실시양태에서, 리보조절인자는 스페이서 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 저분자량 아미노산을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 약 9-33개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 약 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 줄기 도메인과 코딩 도메인 사이에 위치되어 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 33개 초과의 뉴클레오티드 길이이고, 다른 리보조절인자를 비롯한, 단일 및 이중 가닥 영역을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 줄기 도메인은 개시 코돈의 상류 (5') 및/또는 하류 (3')에 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈 상류의 서열은 약 6개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈 하류의 서열은 약 9개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈 하류의 서열은 종결 코돈을 코딩하지 않는다.
일부 실시양태에서, 코딩 도메인은 리포터 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 일부 실시양태에서, 코딩 도메인은 비-리포터 단백질을 코딩한다. 본원에서 사용되는 바, 비-리포터 단백질은 리포터 단백질 이외의, 또는 그를 대신하는 방식으로 사용되거나 또는 작용하는 임의의 단백질이다. 비-리포터 단백질은 세포 또는 샘플 중의 또 다른 엔티티와 상호작용할 수 있으며, 이로써 세포 또는 샘플에, 또는 또 다른 모이어티에 변화를 일으킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 토홀드 도메인의 서열은 자연 발생 RNA에 상보적이다. 자연 발생 RNA는 관심 세포로부터 (예컨대, 내인성 유전자의 유전자좌로부터) 발현될 수 있는 RNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, 토홀드 도메인의 서열은 비-자연 발생 RNA에 상보적이다. 비-자연 발생 RNA는 관심 세포에서 자연적으로는 발현되지 않고 (예컨대, 이는 내인성 유전자의 유전자좌로부터는 발현되지 않고), 대신 관심 세포 내로 도입된 외인성 핵산으로부터 발현될 수 있는 RNA일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 리보조절인자 중 임의의 것의 토홀드 도메인에 혼성화하고, 2차 구조를 포함하지 않거나 최소의 2차 구조를 포함하는 제1 도메인, 및 토홀드 도메인의 하류 (3')에 있는 서열에 혼성화하는 제2 도메인을 포함하는 트랜스-활성화 RNA (taRNA)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 도메인은 토홀드 도메인에 대해 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 제2 도메인은 토홀드 도메인 하류의 서열에 대해 100% 미만으로 상보적일 수 있다.
taRNA는 1개 초과의 RNA 가닥으로 구성될 수 있고, 조합된 상기 다중 RNA는 crRNA와의 혼성화를 위한 제1 및 제2 도메인을 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 RNA는 혼성화를 통해 다중 taRNA가 인접하도록 함으로써 그가 리보조절인자와 효율적으로 혼성화할 수 있게 하는데 사용될 수 있다. 상기 실시양태에 대한 예는 도 9 및 10에 도시되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 crRNA 리보조절인자 중 하나 이상의 것, 및/또는 임의의 상기 트랜스-활성화 RNA (taRNA) 중 하나 이상 것을 포함하는 시스템을 제공한다. taRNA는 모두 자연 발생 RNA일 수 있거나, 또는 모두 비-자연 발생 RNA일 수 있거나, 또는 자연 발생 RNA 및 비-자연 발생 RNA의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 시스템은 그 자신들 간에 최소의 크로스토크를 가지는, 복수 개의 리보조절인자 (예컨대, 임의로 동족 taRNA/트리거 RNA와 함께, 복수 개의 crRNA/스위치)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 (예컨대, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 그 미만보다 작은 수준으로) 최소의 크로스토크를 가지는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 토홀드 crRNA/스위치를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 토홀드 crRNA/스위치는 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 그 초과보다 큰 평균 온/오프 형광 비를 가진다. 일부 경우에서, 본 발명은 약 400을 비롯한, 약 200-665 범위의 평균 온/오프 형광 비를 가지는 복수 개의 토홀드 crRNA/스위치을 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시스템 중 복수 개의 토홀드 리보조절인자들 간의 크로스토크 수준 범위는 약 2% 내지 20% 미만, 또는 약 2% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 15%이다. 상기 시스템은 8, 9, 10개 등을 비롯한, 7개 이상의 토홀드 리보조절인자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다.
일부 실시양태에서, 시스템은 무세포 시험관내 시스템이다.
일부 실시양태에서, crRNA 리보조절인자 및 taRNA는 서로 혼성화된다.
일부 실시양태에서, taRNA에 대한 crRNA 리보조절인자의 비는 1 미만, 0.5 미만, 또는 0.1 미만이다.
일부 실시양태에서, crRNA 리보조절인자 또는 리보조절인자 시스템은 제1 핵산에 포함되어 있고, taRNA는 제2 핵산에 포함되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산은 제1 플라스미드이고, 제2 핵산은 제2 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 제1 플라스미드는 중간 카피의 복제 기점을 포함하고, 제2 플라스미드는 고 카피의 복제 기점을 포함한다. 플라스미드는 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 crRNA 리보조절인자 또는 리보조절인자 시스템 중 임의의 것을 포함하거나, 상기 crRNA 리보조절인자 또는 리보조절인자 시스템 중 임의의 것을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 트랜스-활성화 RNA (taRNA) 중 임의의 것을 포함하거나, 상기 taRNA 중 임의의 것을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 토홀드 crRNA 리보조절인자 시스템 중 임의의 것을 샘플과 조합하는 단계로서, 여기서 crRNA 리보조절인자는 내인성 RNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 리보조절인자 시스템은 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 내인성 RNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 내인성 RNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계, 및 내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 RNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 코딩 도메인의 번역을 허용하는 조건은 RNA, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 리보솜, tRNA 등으로부터 단백질을 제조하는 모든 필수 기구를 포함하는 조건이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 내로 상기 토홀드 리보조절인자 시스템 중 임의의 것을 도입하는 단계로서, 여기서 crRNA 리보조절인자는 세포내 내인성 RNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 리보조절인자 시스템은 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하는 것인 단계, 및 내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 중 RNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질의 양은 내인성 RNA의 양의 지표이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 토홀드 리보조절인자 시스템 중 임의의 것을 상기 상보적 taRNA 중 임의의 것과 조합하는 단계로서, 여기서 토홀드 crRNA 리보조절인자는 taRNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 토홀드 리보조절인자 시스템은 비-리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 taRNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 taRNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계를 포함하는, 단백질 번역을 제어하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (1) 리보솜 결합 부위를 포함하는 완전 또는 부분적 이중 가닥 줄기 도메인, 및 루프 도메인을 포함하는 비콘 crRNA 리보조절인자, (2) 코딩 도메인, 및 (3) 줄기 도메인과 코딩 도메인 사이에 존재하는 개시 코돈을 포함하는 비콘 리보조절인자 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 줄기 도메인은 개시 코돈의 상류 (5')에 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시 코돈 상류의 서열은 약 6개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 코딩 도메인은 리포터 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다. 일부 실시양태에서, 코딩 도메인은 비-리포터 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 루프 도메인의 서열은 자연 발생 RNA에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 루프 도메인의 서열은 비-자연 발생 RNA에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 루프 도메인은 약 21개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 루프 도메인은 약 15-30개의 뉴클레오티드 길이 범위이다.
일부 실시양태에서, 비콘 crRNA 리보조절인자는 제한하는 것은 아니지만, 루프 도메인을 포함하는 결합 도메인 (즉, 그의 상보적 taRNA에 혼성화하는 도메인)을 포함한다. 결합 도메인은, 약 9개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고 줄기 도메인 중에 존재할 수 있는 루프 도메인 상류 (5')의 영역을 포함할 수 있다.
줄기 도메인은 약 23 bp 길이일 수 있다. 줄기 도메인은 약 15 bp 내지약 30 bp 범위일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 비콘 리보조절인자 중 임의의 것의 루프 도메인에 혼성화하고, 2차 구조를 포함하지 않거나 최소의 2차 구조를 포함하는 제1 도메인, 및 줄기 도메인 중에 존재하며 루프 도메인의 상류 (5')에 있는 서열에 혼성화하는 제2 도메인을 포함하는 트랜스-활성화 RNA (taRNA)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 제1 도메인은 루프 도메인에 대해 100% 상보적이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의로 코딩 도메인에 작동가능하게 연결된, 임의의 상기 비콘 crRNA 리보조절인자 중 하나 이상의 것, 및 상기 상보적 트랜스-활성화 RNA (taRNA) 중 임의의 것을 포함하는 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 무세포 시험관내 시스템이다.
일부 실시양태에서, 비콘 crRNA 리보조절인자 및 taRNA는 서로 혼성화된다.
일부 실시양태에서, taRNA에 대한 비콘 crRNA 리보조절인자의 비는 1 미만, 0.5 미만, 또는 0.1 미만이다.
일부 실시양태에서, 비콘 crRNA 리보조절인자 (또는 시스템)은 제1 핵산에 포함되어 있고, taRNA는 제2 핵산에 포함되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 핵산은 제1 플라스미드이고, 제2 핵산은 제2 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 제1 플라스미드는 중간 카피의 복제 기점을 포함하고, 제2 플라스미드는 고 카피의 복제 기점을 포함한다. 플라스미드는 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 비콘 crRNA 리보조절인자 (또는 시스템) 중 임의의 것, 또는 상기 비콘 crRNA 리보조절인자 (또는 시스템) 중 임의의 것을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 트랜스-활성화 RNA (taRNA) 중 임의의 것, 또는 상기 taRNA 중 임의의 것을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비콘 리보조절인자 시스템을 샘플과 조합하는 단계로서, 여기서 비콘 crRNA 리보조절인자는 내인성 RNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 비콘 리보조절인자 시스템은 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 내인성 RNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 내인성 RNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계, 및 내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 RNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 내로 비콘 리보조절인자 시스템을 도입하는 단계로서, 여기서 비콘 crRNA 리보조절인자는 세포내 내인성 RNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 비콘 리보조절인자 시스템은 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하는 것인 단계, 및 내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계를 포함하는, 세포 중 RNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP)이다.
일부 실시양태에서, 리포터 단백질의 양은 내인성 RNA의 양의 지표이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비콘 리보조절인자 시스템을 상보적 taRNA와 조합하는 단계로서, 여기서 비콘 crRNA 리보조절인자는 taRNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 비콘 리보조절인자 시스템은 비-리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 taRNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 taRNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계를 포함하는, 단백질 번역을 제어하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 측면 및 실시양태는 본원에서 더욱 상세하게 기술될 것이다.
도 1. 토홀드 리보조절인자 crRNA 염기 디자인의 개략도. 상응하는 taRNA는 서열 5'-b-a-3'를 가지며, 여기서 도메인 a 및 b는 각각 도메인 a* 및 b*의 역 상보체이다.
도 2. 6개의 불활성화된 토홀드 리보조절인자 crRNA의 억제 수준의 특징규명.
도 3. 고성능 토홀드 리보조절인자에 대하여 수득된 온/오프 모드 형광 비.
도 4. IPTG로 유도된 후 3시간 경과하였을 때의, 61개의 토홀드 리보조절인자로 이루어진 한 세트에 대하여 수득된 온/오프 모드 형광 비.
도 5. 비콘 리보조절인자 염기 디자인. taRNA는 서열 5'-b-a-3'를 가진다.
도 6. 6개의 비콘 리보조절인자 장치로 이루어진 한 세트에 대하여 수득된 온/오프 형광 강도 중간값. 적색 점선은 온/오프 비 = 10을 표시한다.
도 7. 소형 RNA ryhB를 표적화하는 비콘 리보조절인자의 반응. 리보조절인자 센서는 1 mM IPTG를 사용하여 유도하고, ryhB는 0.5 mM 2,2'-디피리딜을 사용하여 유도하였다. 리보조절인자 센서는 GFP의 출력을 ~5배만큼 증가시킴으로써 증가된 세포내 ryhB 수준에 대해 반응하였다.
도 8. 서열 5'-b-a-3'을 가지는 표적을 감지하도록 프로그램화된 (a) 토홀드 및 (b) 비콘 리보조절인자에 기초한 다른 내인성 센서에 대한 디자인 개략도. 두 디자인 모두 단백질 번역을 억제시키기 위해 AUG 출발 코돈 전후로 강력한 RNA 이중체를 사용한다. (a) 중요한 2차 구조를 가지는 RNA 표적의 강력한 결합을 촉진시키기 위해 (일부 실행에서, 21개 초과의 뉴클레오티드 (nt)의) 연장된 토홀드를 가지는 토홀드 리보조절인자. crRNA 줄기 언와인딩 영역의 크기는 축소되지만, 줄기 최근접 RBS는 짧고 (전형적으로 6개의 염기쌍 (bp)), 동시에 언와인딩될 가능성이 있기 때문에, 번역의 트랜스-활성화가 허용될 것이다. (b) 비콘 리보조절인자는 표적 결합을 위해 더욱 큰 루프 (전형적으로 32-nt)를 가지며, 이에 RBS는 루프에서 더욱 큰 프로그램가능성을 허용하게 된다.
도 9는 두 taRNA가 함께 작동하여, 리보조절인자 crRNA에 혼성화하는 5'-a-b-3' 서열에 기여하는 시스템을 도시한 것이다. (a) RNA 가닥인 A 및 B는 입력값이고, 가닥 C인 crRNA는 게이트로서 작용한, 2-입력값 AND 게이트 시스템을 개략적으로 도시한 것이다. (b) RNA 가닥 A, B 및 C의 모든 조합에 대하여 수득된 온/오프 형광 비.
도 10은 5'-a-b-3' 서열의 어느 부분도 함유하지 않는 제3 taRNA에 의해 5'-a-b-3' 서열의 일부를 포함하는 두 taRNA가 각각 인접하게 위치하는 것인 시스템을 도시한 것이다.
도 11. 리보조절인자를 사용한 생체내에서의 2-입력값 OR 논리 실행. (a) 시스템 중 3개의 프로그램화된 RNA 가닥. (b) 생체내 OR 게이트 활성화 개략도. (c) 시스템에 대해 상이한 입력값 RNA의 전사시 GFP로부터의 온/오프 형광의 유동 세포측정법 측정결과. 오프인 경우, 게이트에 대한 비-동족 taRNA가 발현된다.
도 12. 생체내에서의 6-입력값 OR 게이트 실생. (a, 상단) OR 게이트 시스템은 GFP 유전자 상류에 일련으로 배열된 6개의 crRNA로 구성된다. (a, 중간) 상응하는 6개의 taRNA 입력값 모두 LB/IPTG 플레이트 상에서 유도된 이. 콜라이(E. coli) 콜로니로부터의 GFP 발현을 활성화시킨 것으로 나타났다. 대조적으로, 4개의 상이한 비-동족 taRNA는 OR 게이트 구축물과 함께 발현되었을 때, GFP 제조를 유도하지 못했다. (b) OR 게이트 시스템에 대한 온/오프 모드 GFP 형광 비의 유동 세포측정법 측정결과. GFP 누설 수준이 최저인 비-동족 taRNA (Y)와 비교하였을 때, 6개의 프로그램화된 입력값 RNA인 tarRNA는 모두 10배 초과로 더 높은 GFP 발현을 보였다.
도 13. (a) 6-입력값 AND 게이트 시스템의 개략도. 게이트는 입증된 토홀드 리보조절인자 crRNA로부터의 서열을 함유하는 연장된 헤어핀으로 구성된다. 6개의 입력값 RNA 트리거는 상응하는 taRNA로부터의 서열 및 이웃하는 입력값 가닥에의 결합을 위한 혼성화 도메인을 함유한다. (b) 입력값 A 내지 F의 명시된 조합에 노출된 6-비트 AND 게이트에 대한 이. 콜라이 콜로니로부터의 GFP 형광에 관한 영상. 맨 우측열에 제시되어 있는 바와 같이, 6개의 입력값이 모두 존재할 때에만 강력한 GFP 발현이 관찰되었다.
도 14. 싱크 RNA에 의한 트리거 RNA 불활성화의 생체내 입증. (a) 논리 연산의 기초가 되는 분자 상호작용을 보여주는 개략도. 싱크 RNA는 트리거에의 결합에 대하여 스위치 RNA를 압도하도록 디자인된 것이다. 싱크 또한 존재할 경우에는 언제나, 상기와 같은 우선적 결합으로 인해 트리거는 스위치를 활성화시키지 못하게 된다. (b) 트리거 및 싱크 RNA의 상이한 조합을 이용하였을 때, 스위치 RNA로부터 측정된 GFP 형광. 트리거만 단독으로 발현된 경우와 비교하였을 때, 싱크가 트리거 RNA와 함께 발현된 경우, 형광은 구십 퍼센트 (90%) 억제된 것으로 관찰되었다.
도 15. 토홀드 억제인자 디자인 및 성능. (a) 토홀드 억제인자 시스템의 분자 상호작용을 보여주는 개략도. 트리거 RNA는 리보솜이 RNA 상의 결합 요소에 접근하지 못하도록 방해하는 입체형태로 스위치 RNA가 리폴딩되도록 유발한다. (b) 44개의 토홀드 억제인자로 이루어진 라이브러리로부터 측정된 억제 수준. 시스템 중 절반이 90% 초과로 억제시켰다. 각각, 90% 억제는 파선으로, 80% 억제는 점선으로 제공되어 있다.
도 16. 고성능 토홀드 억제인자에 대한 시간 경과에 따른 측정. 유도제 IPTG 첨가 후 매 시간마다인 시점에 측정하였다.
도 17. 토홀드 스위치 디자인 및 출력 특징. (a) 종래 리보조절인자 시스템은 RBS 영역에 직접 염기쌍을 형성함으로써 번역을 억제시킨다. RNA-RNA 상호작용은 RNA 헤어핀 중의 YUNR-루프에서 루프-선형 상호작용을 통해 개시된다. 상호작용 개시 영역은 좀 더 굵은 선으로 표시되어 있다. (b) 토홀드 스위치는 출발 코돈 AUG 전후로 프로그램화된 염기쌍을 통해 번역을 억제시킴으로써 RBS 및 출발 코돈 영역이 완전히 쌍을 형성하지 못한 상태 그대로 남겨둔다. RNA-RNA 상호작용은 토홀드라 불리는 선형-선형 상호작용 도메인을 통해 개시된다. 토홀드 도메인 (a*)은 트리거 RNA 상의 상보적 도메인에 결합한다. 후속되는 분지 이동이 토홀드 스위치 mRNA를 탈억제시킴으로써 하류 유전자의 번역이 이루어질 수 있다. (c) 그의 온 및 오프 상태에서의 스위치에 대해서 측정된 GFP 모드 형광 수준 뿐만 아니라, 동일한 서열을 가지는 GFP가 발현된 양성 대조군에 대해서도 측정된 GFP 모드 형광 수준. 흑색 파선은 GFP 발현 플라스미드를 보유하지 않는 IPTG-유도된 세포로부터 수득된 배경 형광 수준을 표시한다. (d) 168개의 토홀드 스위치로 이루어진 한 세트에 대해 수득된 온/오프 GFP 형광 수준으로, 여기서 20개는 온/오프 ≥ 100인 것으로 나타났다. 삽도: IPTG로 유도한 후 상이한 시점에 성능 수준이 다양한 4개의 토홀드 스위치에 대하여 측정된 온/오프 GFP 형광.
도 18. 토홀드 스위치 직교성 종합 평가. (a) 스위치 mRNA 및 트리거 RNA의 676개의 쌍별 조합을 발현하는 이. 콜라이의 콜로니로부터의 GFP 형광. GFP를 발현하는 콜로니는 동족 스위치 및 트리거 가닥을 함유하는 세포에서 대각선을 따라 육안으로 관찰되었다. 대각선 밖의 성분은 비-동족 RNA 성분 사이의 최소한의 상호작용의 결과로서 낮은 형광을 가진다. (b) 모든 트리거-스위치 조합에 대하여 유동 세포측정법에 의해 측정된 크로스토크로서, 이를 통해 강력한 전체 시스템 직교성을 확인할 수 있었다. (c) 토홀드 스위치 및 다수의 이전 RNA 기반 조절인자에 대한 직교 라이브러리 역학적 범위 (임계 크로스토크 수준의 역수) 및 직교 라이브러리 크기 비교.
도 19. 토홀드 스위치의 서열 분석 및 정방향 조작. (a) 토홀드 스위치 출력 특징에 중요한 영역 및 파라미터. (b) 스위치 mRNA 줄기에서 상위 및 하위 3개의 염기쌍에서 G-C 염기쌍의 개수에 대한 함수로서의 168개의 구성원으로 이루어진 토홀드 스위치 라이브러리에 대한 평가. 도면에서 배경 사각형의 색상은 명시된 GC 염기쌍 형성 제약을 충족시킨 리보조절인자 세트에 대한 평균 온/오프 GFP 형광에 상응하는 것이다. 각 사각형 안의 동그라미의 색상은 제약을 충족시킨 각 성분에 대하여 수득된 실제 온/오프 비에 상응하는 것이다. (c) 13개의 정방향 조작된 토홀드 스위치로 이루어진 세트에 대하여 수득된 온/오프 GFP 형광 비. 흑색 파선은 168개의 무작위 서열 토홀드 스위치로 이루어진 전체 세트에 대하여 측정된 평균 온/오프 형광 수준을 표시한다. 삽도. 정방향 조작된 스위치 번호 6번 및 9번에 대하여 시간 경과에 따라 측정된 결과. (d) 온/오프 비가 특정 값을 초과한 무작위 서열 및 정방향 조작된 라이브러리 성분의 백분율.
도 20. 토홀드 스위치의 열역학적 분석. (a) 무작위 서열 토홀드 스위치 라이브러리로부터 얻은 온/오프 수준의 서브세트에 대해 적용된 상이한 열역학적 파라미터의 함수로서의 R2 값 지도. 그의 줄기의 상위에 약한 A-U 염기쌍을 가지는 스위치의 서브세트의 경우, ΔGRBS-링커 파라미터 (적색 표시)와 가장 강력한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. (b) ΔGRBS-링커를 정의하는데 사용된 줄기 상부 염기쌍의 위치 및 서열 범위를 보여주는 개략도. (c) 헤어핀 줄기 상위에 A-U 염기쌍이 있는 토홀드 스위치 라이브러리 중 68개의 성분에 대하여 측정된 온/오프 비와 ΔGRBS-링커 사이의 상관관계. (d) 정방향 조작된 시스템의 세트에 대해 측정된 온/오프 비와 ΔGRBS-링커 사이의 강력한 상관관계.
도 21. 토홀드 스위치를 사용한 비의존적 조절 및 mRNA 기반 유발. (a) 각각 GFP 및 mCherry를 비의존적인 방식으로 조절하는 RNA A 및 B에 의해 유발된 2개의 직교 토홀드 스위치. (b) RNA A 및 B의 4개의 입력값 조합 모두를 발현하는 세포에 대한 GFP 및 mCherry 형광의 2차원 히스토그램을 통해 IPTG로 유도한 후 4시간 동안의 의도된 시스템 거동을 확인할 수 있었다. (c) mRNA-반응성 토홀드 스위치는 c*로 표시된 연장된 토홀드 도메인을 사용하여 광범위한 2차 구조를 가지는 mRNA 트리거에 결합하고, GFP 리포터의 발현을 활성화시킨다. (d) mCherry mRNA, 및 항생제 저항성을 부여하는 cat 및 aadA mRNA에 의해 활성화된 일련의 토홀드 스위치에 대한 온/오프 GFP 형광 비. (e) 그의 억제 및 활성 상태에서 mCherry 센서에 대한 유동 세포측정법으로부터 수득된 모드 GFP 및 mCherry 형광. GFP-보유 플라스미드를 함유하지 않는 유도되지 않은 세포 및 GFP 또는 mCherry를 발현하는 유도된 세포로부터 대조군 발현 수준을 수득하였다.
본 발명은 2개의 일반 부류의 리보조절인자: 토홀드 리보조절인자 및 비콘 리보조절인자를 제공한다. 둘 모두 세포, 예컨대 원핵 세포를 비롯하 다양한 시스템에서 단백질 제조 (또는 번역)를 활성화시키는데 사용될 수 있다. 유전자 발현을 위한 이전의 조작된 리보조절인자와 달리, 이들 "장치"는 가상의 임의 서열의 별개의 RNA를 사용하여 트랜스-활성화될 수 있다. 활성화 RNA의 서열이 리보솜 결합 부위 (RBS) 서열과 관련될 필요는 없다.
이러한 신규의 리보조절인자는 여러가지 장점을 가진다. 첫째, 본 발명의 많은 리보조절인자는 단일 세포에서 동시에 활성을 띨 수 있으며, 이들은 각각 오직 그의 동족 (특이) 표적과 상호작용한다. 이를 통해 다중 세포 활성을 동시에 제어할 수 있다. 둘째, 본 발명의 리보조절인자는 시스템 크로스토크가 낮고, 프로그램가능성이 높은 생체내 복합 핵산 회로 내로 혼입될 수 있다. 셋째, 본 발명의 리보조절인자는 내인성 RNA로부터 단백질 (예컨대, 리포터 단백질) 제조를 유발할 수 있다. 리보조절인자 출력이 형광 단백질 리포터와 커플링되었을 때, 이들 리보조절인자는 세포에서 내인성 RNA에 대해 유전적으로 코딩가능한 센서 및 영상화 프로브로서의 역할을 한다. 다른 단백질, 예컨대 세포 메카니즘에 관여하는 단백질의 경우, 이들 리보조절인자를 사용한 유전자 발현의 활성화는 생명 공학에서의 새로운 적용을 위해 세포에 내인성인 경로와 합성 유전자 네트워크 사이의 상호작용을 촉진시킬 수 있다.
그러므로, 본 발명은 다양한 신규 리보조절인자, 및 그로부터 유도된 "장치"로서, 앞서 기술된 리보조절인자와 비교하여 현저히 개선된 다양성, 직교성 및 기능성을 제공하는 "장치"를 제공한다. 단지 리보솜이 RBS에 결합하는 것을 파괴시킴으로써만 번역을 억제시키는 선행 기술의 리보조절인자와는 달리, 본 발명의 특정 리보조절인자는 (일부 경우에는) 리보솜 도킹을 허용하지만, (모든 경우에서) 리보솜의 개시 코돈에의 접근을 차단함으로써 번역 개시를 방해하고, 일반적으로 그의 연장을 방해한다. 이러한 접근법이 가지는 이점은 RBS는 더 이상 트랜스-RNA 서열의 일부가 될 필요가 없으며, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열에 의존하지 않으면서, 단지 전반적인 서열 제약도 거의 없는 새 리보조절인자가 디자인될 수 있다는 점이다. 추가로, 이러한 새로운 리보조절인자는 crRNA와 트랜스-RNA 사이의 혼성화를 구동시키는데 키싱-루프 상호작용에 의존하지 않는다. 대신, 그의 강도가 간단히 초기 RNA-RNA 상호작용을 구동시키는 뉴클레오티드의 개수를 변경시킴으로써, 및/또는 그의 염기 조성물을 변경시킴으로써 합리적으로 제어될 수 있는 것인, 선형-선형 (또는 큰-루프-선형) RNA 상호작용을 사용한다. 그에 반해, 키싱 루프 상호작용에서 염기 조성 및/또는 서열 길이의 변화는 상호작용 도메인의 3차 구조에 영향을 줄 수 있고, 혼성화 반응의 동역학적 성질을 감소시킬 수 있다.
리보조절인자에 대한 일반적 개념
리보조절인자는 오픈 리딩 프레임의의 번역 및 이에 따라 단백질의 제조를 억제 또는 활성화시키는데 사용될 수 있는 RNA 분자이다. 억제는 mRNA 분자의 5' 비번역 영역 (5' UTR) 내의 조절성 핵산 요소 (시스-억제 RNA 또는 crRNA)의 존재를 통해 달성된다. 핵산 요소는 상보적 염기쌍 형성을 통해서 줄기 도메인 및 루프 도메인을 포함하는 헤어핀 구조를 형성한다. 헤어핀 구조는 리보솜에 의한 mRNA 전사체에의 접근을 차단하여 번역을 방해한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 원핵 세포를 포함하는 실시양태를 비롯한, 헤어핀 구조의 줄기 도메인은 리보솜 결합 부위 (RBS)를 격리시킨다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 진핵 세포를 포함하는 실시양태를 비롯한, 헤어핀 구조의 줄기 도메인은 mRNA의 5' UTR 내의 출발 (또는 개시) 코돈 상류에 위치한다. 트랜스로 발현되고 작용하는 RNA (그리고 이에 따라 트랜스-활성화 RNA 또는 taRNA로 지칭됨)은 crRNA와 상호작용하고, 헤어피 구조를 변경시킨다. 이러한 변경을 통해 리보솜은 출발 코돈 상류의 전사체 영역에 접근할 수 있게 되고, 이로써 RNA는 그의 억제된 상태로부터 해방되고, 전사체로부터의 단백질 번역은 촉진된다. crRNA는 전형적으로 조작된 RNA 분자이다. taRNA는 비록 일부 경우에서는 본원에 기술된 바와 같이, 시스템, 예컨대 세포 내의 내인성, 자연 발생 RNA의 영역일 수도 있지만, 이는 조작된 분자일 수 있다.
본 발명은 일반적으로 오픈 리딩 프레임의의 번역을 조절함으로써 제어하기 위해 RNA 분자를 사용하여 단백질 발현을 전사 후 조절하기 위한 핵산, 구축물, 플라스미드, 숙주 세포 및 방법을 제공한다.
본 발명은 모듈식 crRNA 코딩 핵산 및 모듈식 taRNA 코딩 핵산을 고려한다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용되는 바, 모듈식 crRNA 코딩 핵산이란 오픈 리딩 프레임 (또는 관심 유전자에 대한 코딩 도메인)을 포함하지 않는 핵산 서열을 의미한다. 상기 모듈식 crRNA는 토홀드 crRNA 또는 비콘 crRNA일 수 있다. 따라서, 본 발명은 (예컨대, 관심 유전자에 대한 코딩 도메인을 포함하는) 그의 최종 형태의 리보조절인자 또는 리보조절인자 성분 (예컨대, 관심 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 토홀드 crRNA 또는 비콘 crRNA)을 고려한다.
본 발명은 추가로 crRNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 taRNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 추가로, 본 발명은 2개 이상의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 세트를 제공한다. 제1 올리고뉴클레오티드 세트는 그의 서열이 crRNA 서열을 함께 포함하는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 또한 그의 서열이 taRNA 서열을 함께 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 세트를 제공한다. 용이한 클로닝을 위해, 클로닝을 방해할 수도 있는 올리고뉴클레오티드 내에서의 줄기 형성을 회피하기 위해서는 각각이 2개의 줄기-형성부를 포함하는 단일 올리고뉴클레오티드보다는 단일 줄기-형성부를 포함하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 상이한 클로닝 단계에서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 본원에서 언급되는 추가 성분 중 임의의 것과 함께 키트로 제공될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 한쪽 단부 또는 양쪽 단부에 제한 부위를 포함할 수 있다.
토홀드 리보조절인자
토홀드 리보조절인자 시스템에서, crRNA 및 트랜스-RNA 종 사이의 상호작용은 crRNA 줄기의 5' 단부에 위치하는 단일 가닥 RNA 도메인을 통해 매개된다. 토홀드 도메인으로 지칭되는 상기 도메인은 crRNA 줄기를 언와인딩할 수 있을 정도로 충분한 결합 친화도를 가지는 트랜스-RNA를 제공한다. 트랜스-RNA와 토홀드 도메인 사이의 상보성 정도는 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%이다. 최적의 리보조절인자 동역학적 성질을 위해, 트랜스-RNA는 최소의 2차 구조를 가지고, crRNA의 토홀드 도메인에 완전한 상보성 (즉, 100%)을 가져야 한다. 본원에서 사용되는 바, 2차 구조란 예를 들어, 헤어핀 구조, 줄기 루프 구조 등을 비롯한, 비-선형 구조를 의미한다. 따라서, 트랜스-RNA는 그의 사용 조건하에서 2차 구조를 형성할 가능성이 거의 없거나, 전혀 없는 서열로 구성된다. 통상의 기술자는 수동으로 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 상기 서열을 결정할 수 있다.
토홀드 리보조절인자 crRNA는 그의 줄기 도메인 내에서는 RBS를 격리시키지 않는다. 대신, RBS는 억제 줄기 도메인에 의해 형성된 루프 도메인으로 한정된다. 이를 통해 개시 코돈 바로 앞 (상류 또는 5') 및 바로 뒤 (하류 또는 3')의 영역은 줄기 도메인 내에서 격리될 수 있고, 이로써 번역 개시는 좌절된다. crRNA 토홀드, 줄기, 및 루프 도메인 각각의 길이는 하기 상세하게 설명되는 바와 같이, 토홀드 리보조절인자의 성능에 영향을 주지 않으면서 매우 크게 바뀔 수 있다. 추가로, crRNA 줄기 도메인은 비록 다수의 벌지(bulge) 또는 쌍을 잘못 이룬 염기를 함유할지라도 그의 억제 효율을 유지할 수 있는 바, 이로써 출발 코돈 AUG 서열을 함유하지 않는 트랜스-RNA는 리보조절인자를 유발할 수 있다. 비록 다른 기준, 예컨대 고도의 2차 구조가 조절인자의 반응에 영향을 줄 수 있기는 하지만, 원칙적으로는 벌지의 내성을 통해 내인성 RNA를 비롯한 임의 taRNA 서열은 토홀드 리보조절인자로의 입력값 RNA로서의 역할을 할 수 있게 된다.
비-제한적인 토홀드 리보조절인자 부류의 예는 도 1에 제시된 디자인 파라미터를 가진다. 이러한 부류의 crRNA는 길이가 약 12-뉴클레오티드 (nt)인 토홀드 도메인, 및 길이가 약 11-nt이고, 임의로 그의 3' 단부에 RBS 서열 AGAGGAGA를 함유하는 루프 도메인을 포함한다. 출발 코돈 (즉, AUG) 측면에 6-bp 이중체 스페이서 영역 및 9-bp 이중체 영역을 포함하는 줄기 도메인은 상기 루프 도메인 바로 옆에 인접해 있다. 종결 코돈이 번역을 조기 종결시킬 수 있기 때문에, 출발 코돈 하류 (3')의 9-nt는 그가 확실하게 어떤 종결 코돈도 코딩하지 않도록 프로그램화되었다. 추가로, 출발 코돈 트리아드 맞은 편의 3-nt 영역은 완전하게 쌍을 형성하지 못하였고, 이로써 crRNA 줄기 도메인은 3-nt 길이의 벌지를 가지게 되었다. 9-nt 이중체 영역이 관심 유전자 (GOI)의 폴딩에 영향을 주는 아미노산을 코딩할 가능도를 감소시키기 위하여, 다수의 저분자량 잔기를 함유하는 일반 21-nt (7-아미노산) 스페이서 도메인을 crRNA 줄기 도메인과 코딩 도메인 (예컨대, GOI 또는 리포터 단백질을 코딩하는 도메인) 사이에 삽입하였다.
도 1에 도시된 실시양태는 비-제한적인 것이며, 길이 및 기능이 상이한, 다른 리보조절인자도 본 발명에 의해 고려되고, 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 토홀드 도메인, 줄기 도메인, 루프 도메인 및 링커 도메인의 길이 뿐만 아니라, 줄기 도메인 내의 이중체 영역의 길이도 도 1에 제시된 실시양태의 길이와 상이할 수 있다.
추가의 토홀드 리보조절인자 시스템 디자인이 실시예 7에 기술되어 있다.
도 3에 제시되어 있는 바와 같이, 토홀드 리보조절인자는 표적 RNA를 사용하여 taRNA 종에서 강력한 트랜스-활성화를 나타낼 수 있으며, 여기서 형광은 유도 후 단지 2 내지 3시간 경과한 후에도 200배 초과만큼 증가될 수 있다. 추가로 60개의 토홀드 리보조절인자 디자인에 대하여 생체내에서 동일한 측정을 수행하였고, 온/오프 비는 도 4에 제시되어 있다. 시험된 리보조절인자 중 대략 ⅓ 정도가 그의 동족 taRNA의 존재하에서 50배 이상만큼 GFP 출력을 증가시킨다.
추가의 실험 시험을 통해서도 또한 본 발명자들은 최적의 토홀드 리보조절인자 연산을 위해 필요한 crRNA 2차 구조 및 도메인 길이에 관해 더욱 잘 이해할 수 있었다. taRNA 초기 결합을 위해서는 길이가 5 또는 6-nt 이상인 토홀드 도메인이 바람직하다. 그러므로, 토홀드 도메인은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 또한, GOI가 번역될 수 있도록 하기 위해서는 taRNA는 오직 crRNA 줄기의 ⅔만을 언와인딩시키기만 하면 된다는 것 또한 발견하게 되었다. 이러한 관찰 결과에 기초하면, 줄기 도메인은 crRNA에서의 적절한 억제를 위해 12 bp만큼 작을 수 있다. 그러나, 줄기 도메인은 길이가 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 염기쌍을 포함하는, 12 bp보다 긴 것일 수 있다. 추가로, 루프 길이를 12-nt로 연장시키고, RBS를 정규 샤인-달가르노 서열을 포함하는 약간 더 강력한 버전으로 교체하는 것이 crRNA에 의한 억제 정도를 감소시키지는 않았다. 따라서, 루프 도메인은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 토홀드 리보조절인자의 변형이 도 8a에 제시되어 있고, 실시예 7에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명은 추가 특징을 가지는 crRNA/스위치를 추가로 제공한다. 일부 경우에서, 헤어핀 줄기의 상위 3개의 염기는 A-U 염기쌍일 수 있다. 일부 경우에서, 줄기의 하위 3개의 염기쌍은 2개의 강력한 G-C 염기쌍 및 1개의 A-U 염기쌍을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 스위치 토홀드의 길이는 약 12- 내지 약 15-nt 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 후자의 특징은 트리거 RNA와 그의 스위치 RNA 사이의 초기 결합을 강화시킬 수 있다. 일부 경우에서, 헤어핀 루프의 크기는 스위치 활성화시 출력 단백질의 번역을 증강시키기 위해 약 11- 내지 약 15-nt 범위일 수 있다. 일부 경우에서, 루프 크기는 15-nt이다. 추가의 다른 경우에서, 스위치 줄기에서 18개의 염기 중 처음 15개를 언와인딩하는 동족 트리거가 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 특징들 모두를 비롯한, 상기 특징들 중 하나 이상이 동시에 사용될 수 있다. 실시예는 상기 리보조절인자를 사용하였을 때의 결과를 입증한다.
1개 초과의 트리거 RNA를 통해 작용하거나, 또는 1개 초과의 트리거 RNA를 감지하는 본원에 기술된 토홀드 리보조절인자는 논리 게이트로 사용될 수 있다. 도 12 및 13에는 본 발명의 이러한 추가의 실시양태가 예시되어 있다. 도 12에는 선형 방식으로 함께 연결된 복수 개의 헤어핀 구조 (즉, 줄기-루프 구조, crRNA), 및 하류의 GOI 코딩 서열을 포함하는 토홀드 리보조절인자가 도시되어 있다. 본 도면에서, 리보조절인자는 6개의 헤어핀 구조를 포함하고, GOI는 GFP이다. 각 헤어핀 구조는 입력값 RNA 트리거 (또는 taRNA)에 상보적인 토홀드 서열에 연결되어 있다. 각각의 입력값 RNA 트리거 (또는 taRNA)는 하류의 GOI의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 리보조절인자는 GOI의 발현을 관찰하기 위해서는 입력값 RNA 중 단 하나만의 존재를 필요로 하는 바, 이에 "OR" 게이트로서 지칭된다. 이러한 OR 게이트는 입력값 RNA 트리거 (또는 taRNA) 중 임의의 것이 발현되고, 그에 상응하는 crRNA 서열에 결합하였을 때, GFP의 발현을 활성화시킨다. 본 도면에는 개별 입력값 RNA 트리거 A-F 또는 비-동족 RNA 트리거 W-Z의 존재하의 온/오프 형광 비가 추가로 제시되어 있다. 온/오프 비는 비-동족 RNA 트리거와 비교하였을 때, 입력값 RNA 트리거의 존재하에서 훨씬 더 크다.
도 13에는 연장된 줄기 영역이 가지는 단일 헤어핀 (crRNA) 구조를 포함하는 "AND" 게이트가 도시되어 있다. crRNA는, 각각이 taRNA에 대한 결합 도메인으로서의 역할을 하는 복수 개의 영역을 코딩한다. 입력값 RNA (또는 taRNA)는 서로 혼성화하고, crRNA 줄기 중 상응하는 부위 또한 언와인딩할 수 있다. 이러한 시스템은 오직 입력값 RNA 트리거 모두가 존재할 때 활성화되고, 이로써 crRNA를 완전하게 언와인딩한다. 이는 GOI의 발현을 관찰하기 위해서는 입력값 RNA 모두를 필요로 하는 바, 이에 AND 게이트로서 지칭된다. 본 도면은 3, 4, 5 및 6개의 입력값 RNA 트리거의 상이한 조합의 존재하의 GFP 형광을 보여주는 사진을 추가로 제공한다.
추가의 다른 측면에서, 본 발명은 트리거 RNA가 그의 동족 스위치 RNA에 대해 작용하지 못하도록 방해함으로써 시스템의 활성화를 막는데 또는 생체내 회로에 또 다른 논리층을 추가하는 수단으로서 유용하다는 것을 인정한다. 본원에서는 본원에서 "싱크 RNA"로 지칭되는 RNA를 사용하여 트리거 RNA의 활성을 감소시키거나, 제거하는 방법을 제공한다. 싱크 RNA는 그의 동족 트리거 가닥에의 결합에 대해 스위치 RNA를 압도하도록 디자인된 것이다. 이러한 시스템에서, 측면 서열 v* 및 u*가 각각 트리거 RNA의 5' 및 3' 단부에 부가된다 (도 14a). 트리거에 대한 동족 싱크 RNA는 트리거의 중앙 b*-a* 영역 및 그의 측면 도메인에 완전하게 상보적이다. 결과적으로, 싱크-트리거 RNA 상호작용의 열역학적 성질은, 보다 짧은 b*-a* 서열을 통해 이루어지는 트리거 RNA와 그의 동족 스위치 사이의 상호작용보다 훨씬 더 강력하다. 이러한 효과를 통해 트리거는 싱크에 우선적으로 결합하게 되고, 트리거 RNA가 스위치에 결합하는 경우, v* 및 u* 도메인은 트리거가 스위치를 오프시키도록 구동시키는 분지 이동 과정을 완료하는데 싱크 RNA가 사용할 수 있는 노출된 토홀드로서 거동할 것이다. 싱크-트리거 혼성화가 더욱더 잘 이루어질 수 있도록 하기 위해, 싱크 RNA는 트리거 RNA보다 더 높은 수준으로 발현된다. v* 및 u* 도메인의 길이는 특정 시스템에 따라 달라질 수 있다. 어느 도메인이든 이는 시스템으로부터 완전하게 제거될 수 있으며, 다른 도메인이 존재하는 한, 원하는 네트워크 거동은 여전히 유지할 수 있다. 다시 말해, 싱크 RNA는 측면 도메인 중 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, v* 및 u* 도메인의 길이는 12 내지 21-nt일 수 있다.
도 14b는 모델 판독치로서 GFP를 사용한 이. 콜라이에서의 싱크-트리거-스위치 RNA 시스템의 거동을 보여주는 것이다. 본 발명은 GFP가 관심 단백질 (또는 유전자)로 대체된 다른 시스템을 고려한다는 것을 이해할 것이다. 스위치 RNA가 단독으로 발현되었을 때, GFP 리포터 단백질의 출력은 낮다. 트리거 및 스위치가 공동으로 발현되었을 때, 결합이 일어나고, 스위치는 강력하게 활성화되어 GFP 출력이 증가하게 된다. 그러나, 3개의 RNA 모두가 공동으로 발현되었을 때에는 우선적인 싱크-트리거 RNA 결합의 결과로서 GFP 출력은 그의 완전히 활성화된 수준으로부터 ~90% 하락하게 된다. 전반적으로, 출력 단백질은 오직 싱크 부재하에서 트리거 RNA가 존재할 경우에만 발현되고; 그렇지 않다면, 장치로부터의 단백질 출력은 낮다. 그 결과, 본 시스템은 트리거 RNA가 A 입력값을 나타내고, 싱크 RNA가 B 입력값을 나타내는 것인 논리 연산 A N-IMPLY B를 수행한다. 이 경우, 스위치 RNA는 A N-IMPLY B 연산을 실행하는 게이트로서의 역할을 하고, 출력은 스위치 RNA에 의해 조절되는 단백질이다.
본 접근법은 또한 하기에서 논의되는 토홀드 억제인자에 직접적으로 적용될 수 있다. 트리거/싱크 조합이 억제인자와 함께 사용될 때, 시스템은 오직 싱크 부재하에서 트리거 RNA가 발현될 경우에만 오프된다. 이러한 거동은 트리거가 A 입력값으로서의 역할을 하고, 싱크가 B 입력값인 A IMPLY B 연산과 같다.
싱크 RNA/트리거 RNA 시스템은 임계 회로에 적용될 수 있다. 도 14에 제시된 실험은 트리거, 스위치, 및 싱크 RNA를 각각 일정한 수준으로 사용하였다. 유리 트리거 RNA를 세포로부터 확실하게 완전히 제거하기 위해 트리거 RNA에 비해 화학량론상 과량으로 싱크 RNA 또한 발현시켰다. 그러나, 트리거 및 싱크 RNA 둘 모두의 수준을 변경할 수 있는 것으로 허용된다면, 본 시스템은 임계 거동을 제공할 수 있다. 예를 들어, 싱크 RNA의 발현은 중간 수준 정도로 일정하게 유지되지만, 트리거 RNA의 발현은 낮은 수준에서부터 높은 수준까지 다양하다면, 스위치 RNA는 일단 트리거 RNA 농도가 싱크 RNA 농도의 것 (또는 세포 또는 비-세포 환경에서 RNA 혼성화 거동의 가변성을 조건부로 하는 특정 비율의 싱크 RNA 농도)을 초과한 후에 활성화될 것이다. 대안적으로, 트리거 RNA의 발현은 일정하게 유지되고, 싱크 RNA의 발현은 다양하다면, 싱크 RNA는 트리거 RNA 활성의 조절인자로서 작용함으로써 싱크 RNA 농도의 함수로서 스위치 RNA로부터의 단백질 출력을 상향 또는 하향 조정한다. 이러한 조정은 신경 네트워크 거동 (예를 들어, 문헌 [Qian et al. Nature, 475:368-372, 2011] 참조)에, 및 다수 및 소수 게이트를 구축하는데 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 (관심 유전자에 대한 코딩 서열을 포함하는) 스위치 RNA, 트리거 RNA, 및 싱크 RNA를 포함하는 토홀드 리보조절인자 조성물 (또는 시스템 또는 장치)을 고려한다. 일부 경우에서, 트리거 RNA는 활성화 RNA이다 (즉, 그가 충분한 수준으로 존재할 때, 스위치 RNA로부터의 단백질 발현 (또는 번역)을 활성화시키고, 이로써 관심 코딩 서열의 단백질 발현 (또는 번역)을 활성화시킨다). 일부 경우에서, 트리거 RNA는 억제 RNA이다 (즉, 그가 충분한 수준으로 존재할 때, 스위치 RNA로부터의 단백질 발현 (또는 번역)을 억제시키고, 이로써 관심 코딩 서열의 단백질 발현 (또는 번역)을 억제시킨다). 스위치 RNA, 트리거 RNA 및 싱크 RNA 간의 서로 관련된 구조적 특징은 본원에 기술되어 있는 바와 같다.
본원에서 간략하게 논의되는 바와 같이, 토홀드 리보조절인자는 또한 단백질 번역의 억제인자로서의 역할을 할 수 있다. 본 발명에 따라, 신규 가닥 재구성 메카니즘에 의해 트리거 RNA에 대한 반응으로 관심 유전자의 번역을 억제시킬 수 있는 새 부류의 리보조절인자를 제공한다. 이러한 스위치 RNA/트리거 RNA 리보조절인자 시스템은 본원에서 그의 토홀드 기반 상호작용 메카니즘의 결과로서 토홀드 억제인자로서 지칭된다. 이러한 RNA 장치의 분자적 실행은 도 15a에 제시되어 있다. 토홀드 억제인자는 2개의 RNA: 관심 유전자의 코딩 서열(들)을 함유하는 스위치 RNA 및 스위치로부터의 단백질 번역이 종결되도록 유발하는 트리거 RNA로 구성된다. 도시된 일례에서, 스위치 RNA는 길이가 약 15-nt인 5'-토홀드 도메인을 함유한다. 이러한 토홀드 다음으로는 길이가 약 30-nt이고, 9-nt 루프를 함유하는, 줄기를 포함하는 줄기-루프 영역이 이어진다. 줄기를 형성하는 도메인 b 및 c는 각각 약 18-nt 및 12-nt이다. 줄기는 줄기 하단으로부터의 8-, 16-, 및 24-nt인 3개의 위치에 벌지를 함유한다. 이러한 벌지의 도입으로 전사 종결 가능도는 감소되지만, 성공적인 연산을 위해 필요한 것은 아니다. 벌지는 또한 반드시 성공적인 스위치 연산을 반드시 방해하지 않으면서, 다른 위치로 이동될 수 있고, 개수가 증가될 수 있다. 루프 크기 또한 연산에 영향을 주지 않으면서 변경될 수 있다. 줄기 영역 다음으로는 (5'에서 3' 방향으로) 4-nt 스페이서, RBS 서열 (본 수행에서 8-nt), 6-nt 스페이서, 출발 코돈 AUG, 9-nt 스페이서, 21-nt 링커, 및 이어서, 관심 유전자에 대한 코딩 서열을 함유하는 단일 가닥 영역이 이어진다. 스위치 RNA에서 출발 코돈 영역에의 RBS 노출 결과로서, 트리거 RNA의 부재하에서 발현의 전원은 온 상태가 된다.
트리거 RNA는 도 15a에 제시된 바와 같이, 스위치 RNA의 조기 영역에 완벽하게 상보적인 서열을 함유하는 단일 가닥 RNA이며, 이로써 그의 총 길이는 45-nt이다. 트리거 RNA 및 스위치 RNA가 공동으로 발현되었을 때, 트리거 RNA는 스위치 RNA의 토홀드 도메인에 결합하여 스위치 줄기와의 분지 이동 반응을 완료하게 된다. 줄기 치환으로 스위치 RNA의 30-nt 및 루프가 완전하게 노출된다. 이러한 새로 노출된 염기는 신속하게 리폴딩될 수 있다. 이러한 가닥 재구성은 스위치 RNA의 하류 염기가 새 헤어핀 도메인을 형성하게 한다. 이러한 헤어핀은 유전자의 출발 코돈 주변의 영역을 격리시켜 토홀드 스위치 번역 활성인자 시스템에서의 스위치 RNA와 동일한 방식으로 억제시킨다. 추가로, 토홀드 억제인자에 의해 형성된 트리거-스위치 RNA 복합체를 통해, 결국에는 관심 유전자/단백질의 번역을 재활성화시키는 서열 5'-b*-a*-3'을 가지는 활성화 트리거 RNA와 상호작용할 수 있는 연장된 토홀드를 가진 헤어핀이 형성된다는 것은 주목할만하다. 별개의 억제 및 활성화 트리거를 포함하는 상기 시스템의 거동은 A가 억제 트리거이고, B가 활성화 트리거인 A IMPLY B 게이트와 같다.
토홀드 활성인자 스위치와 같이, 토홀드 억제인자는 가상의 임의 서열을 가지는 트리거 RNA를 채용할 수 있다. 결과적으로, 고도의 직교성을 가진 큰 억제인자 라이브러리를 디자인할 수 있다. 추가로, 외인성 및 내인성 RNA에 대한 반응으로 번역 억제를 유발하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 토홀드 억제인자에 기반한 고차 논리 회로를 고려하고, 제공한다. 그가 토홀드 활성인자 스위치와 유사하다고 가정할 때, 토홀드 억제인자 스위치는 번역 활성인자와 매우 동일한 방식으로 복합 논리 시스템 내로 도입될 수 있다.
따라서, 일부 측면은 도 9, 10 및 13에 제시되어 있는 억제인자 버전의 시스템인 NAND 논리 게이트를 제공한다. N-비트 NAND 논리는 기능성 트리거 RNA를 제조하는 N-입력값 RNA 가닥에 의해 형성된 복합체를 사용하여 수행될 수 있다. 간단한 2-비트 케이스인 경우, 두 입력값 RNA는 2-비트 AND 시스템에 대해 사용된 taRNA와 동일한 방식으로 서로 결합하도록 프로그램화된다. 이들 입력값 RNA는 각각 단지 스위치 RNA에 대한 동족 트리거의 일부만을 함유하며, 이로써 각각은 그 단독으로는 스위치 상태를 바꾸는데 요구되는 분지 이동을 수행하지 못한다. 그러나, 두 입력값 RNA 모두 결합하였을 때, 이들은 완전한 트리거 RNA 서열을 형성하여 스위치 토홀드에 결합할 수 있고, 그의 줄기를 언와인딩함으로써 번역 억제를 일으킨다. 상기 기반 개념은 적절한 순서로 함께 결합되어 있는 다중 입력값 RNA들 중 완전한 트리거 RNA 서열을 나누어 트리거 서열을 제공함으로써 N-비트 연산으로 확장될 수 있다. 대제 접근법에서, 각각이 트리거 서열의 대략 절반을 제공하도록 두 입력값을 사용할 수 있다. 이어서, N-2 프로그램화된 입력값 RNA의 조리을 통해 상기 두 입력값이 인접하게 위치하도록 한다.
다른 측면은 도 11 및 12에 제시된 억제인자 버전의 시스템인 NOR 논리 게이트를 제공한다. 관심 단백질에 대한 코딩 서열 상류에 위치하는 연결된 토홀드 억제인자 헤어핀을 사용함으로써 N-비트 NOR 논리를 평가할 수 있다. 간단한 2-비트 NOR 케이스인 경우, NOR 게이트는 유전자 상류의, 한 쌍의 직교 토홀드 억제인자로 구성된다. 어느 한 트리거 RNA의 부재하에서, 두 토홀드 억제인자 모두에 대한 출발 코돈 및 RBS는 노출되고, 번역에 이용가능하다. 트리거 RNA 중 단 하나만이 노출된 경우, RBS-출발 코돈 영역 중 하나는 번역에 대해 자유로운 상태 그대로 유지되고, 리보솜은 그의 경로를 따라 강력한 헤어핀을 언와인딩하는데 충분한 진행도를 가진다. 결과적으로, 2-비트 NOR 게이트는 오직 두 트리거 RNA 모두가 발현되고, 토홀드 억제인자 도메인 둘 모두에 대한 가닥 재구성을 유발한 경우에만 전원은 오프 상태가 될 수 있다. 이러한 기반 개념은 N-비트 NOR 게이트 연산으로 확장될 수 있다.
본원에서 제공되는 리보조절인자는 복합 논리 회로에 사용될 수 있다. 일례로, 토홀드 스위치 및 토홀드 억제인자는 AND/NAND, OR/NOR, 및 IMPLY/N-IMPLY 연산에 대한 고차 논리 회로 내로 도입될 수 있다. 이러한 계산적 접근의 모듈 방식을 통해 연계된 입력값 트리거 및 싱크 RNA의 네트워크와 함께 연결된 토홀드 조절인자 헤어핀을 함유하는 단일 연장된 게이트 RNA 중 상기의 모든 연산을 조합함으로써 더욱더 복합한 계산을 수행할 수 있다. 중요하게는, 본원에서 제공된 계산적 요소의 염기 세트를 통해 예컨대,
(A AND B) OR (C AND D) OR (E AND F AND G)와 같이, 그를 분리된 정규형 (즉, 중첩 NOT 및 AND 표현에 적용되는 외적 OR 연산)인 표현으로 분해하거나, 또는
NOT(A AND B) OR (C AND (NOT D)) OR (E AND F AND G)와 같이, 싱크 RNA를 부가하여 임의의 논리 연산을 평가할 수 있다.
역시 이 또한 도입된 NAND 및 NOR 게이트를 이용함으로써 유사한 표현을 평가할 수 있다. 토홀드 조절인자를 사용하는 계산은 단일 계산 층에서 운용되고 (즉, 한 연산으로부터의 출력이 후속 연산을 위한 입력값으로서 사용될 필요가 없다), 다중 입력값 종으로 쉽게 통합될 수 있으며, 이는 그의 계산 속도를 증가시키고, 이를 통해 더 적은 개수의 게이트가 사용될 수 있다. 이는 다른 분자 계산 기법과 달리, 예컨대 [Qian et al. Science, 332:1196-1201, 2011 및 Moon et al. Nature, 491 :249-253, 2012]에 의해 기술된 것이다.
또 다른 추가의 실시양태는 다중 입력값 XOR 및 XNOR 논리를 제공하고, 적용시킨다. 일례로서, N-비트 XOR (XNOR) 계산은 OR (NOR) 게이트 및 트리거/싱크 RNA의 조합을 사용하여 실행될 수 있다. 상기 연산 이면의 주요 개념은 간단한 2-비트 XOR 케이스를 이용하여 기술될 수 있다. 상기 연산을 위한 구성적으로 발현되는 게이트 RNA는 조절되는 유전자 상류에 있는 한 쌍의 연결된 직교 토홀드 스위치를 함유하는 2-비트 OR 시스템이다. 이러한 스위치는 동족 트리거 A 및 B를 수용한다. 트리거 A 및 B의 발현은 각각 두 직교 화학적 유도제 indA 및 indB에 의해 제어된다. 각각의 트리거는 그에 상응하는 트리거에 우선적으로 결합하여 게이트내 스위치 헤어핀의 활성화를 방해하는 동족 싱크 RNA A* 및 B*를 가진다. 중요하게, 이러한 싱크 RNA는 세포에서 유도되었을 때에 그가 확실히 더 높은 농도에 도달할 수 있도록 하기 위해 트리거 RNA보다 더 높은 고 카피의 플라스미드로부터 또는 더 강력한 프로모터를 사용하여 발현된다. 추가로, 싱크 RNA A* 및 B*의 제조는 각각 indB 및 indA와 관련되어 있다. 결과적으로, indA를 성장 배지에 첨가하면, 트리거 A 및 싱크 B*의 발현이 일어날 것이며, indB를 첨가하면, 트리거 B 및 싱크 A*가 제조될 것이다.
오직 단 하나의 유도제만이 존재할 때, 트리거 RNA 및 비-동족 싱크 RNA의 발현을 통해서는 게이트 RNA 내의 스위치 헤어핀 중 하나가 활성화될 수 있다. 그러나, 두 유도제 모두가 존재할 때에는 두 트리거 RNA가 발현되지만, 싱크 RNA는 또한 더 높은 수준으로 전사된다. 이러한 싱크 RNA가 트리거 분자에 대해 게이트 RNA를 압도하고, 단백질 번역의 활성화를 방해한다. 어느 유도제도 존재하지 않을 경우, 트리거는 발현되지 않고, 게이트는 오프 상태 그대로 유지된다. 그 결과, 이러한 합성 유전자 네트워크는 2-비트 XOR 논리를 수행한다.
이러한 일반 접근법은 각각의 N 유도제가 N-1 비-동족 싱크 RNA의 보체와 함께 단일 트리거 RNA의 발현을 개시하는 N-비트 XOR 논리로 확장될 수 있다. 마지막으로, N-비트 XNOR은 N 연결된 토홀드 스위치로부터 형성된 N-비트 OR 게이트를 N 연결된 토홀드 억제인자 세트로 대체함으로써 평가된다.
비콘 리보조절인자
비콘 리보조절인자 시스템에서, crRNA는 RBS, 및 일부 경우에서, 출발 코돈을 함유하는 다양한 길이의 줄기 도메인을 포함한다 (예시적인 실시양태에 대해 도 5 참조). 줄기 도메인은 또한 taRNA 표적에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 RBS 상류의 ~9 bp 영역을 포함한다. taRNA 표적 결합은 crRNA 중 큰 (~21-nt) 루프 도메인을 통해 개시되고, crRNA 줄기 도메인의 5' 부위로 진행된다. 이러한 큰-루프-선형 상호작용을 통한 taRNA 표적 결합으로 crRNA의 나머지 부분의 언와인딩을 촉진시키는 기계력을 제공하는 강성 이중체가 생성된다. 언와인딩 후, 활성화된 crRNA의 출발 코돈 및 RBS 둘 모두 노출되고, 이로써 GOI의 번역이 이루어지게 된다. crRNA의 표적 결합 영역은 RBS 및 출발 코돈 둘 모두와 관계가 없기 때문에, 비콘 리보조절인자의 taRNA는 원칙적으로 임의 서열을 채용할 수 있다. 2차 구조를 거의 가지지 않는 taRNA는 더욱 우수한 반응 동역학적 성질을 제공할 것이다. 추가로, 표적 taRNA는 crRNA 줄기 도메인이 강제로 언와인딩될 수 있도록 하는데 충분한 정도로 길어야 한다.
토홀드 리보조절인자 장치에 대해 사용된 것과 동일한 조건을 사용하여 비콘 리보조절인자를 시험하였다. 도 6에는 6개의 비콘 리보조절인자에 대하여 수득된 온/오프 형광 강도 중간값의 비가 제시되어 있다. 장치 중 4개는 온/오프 비가 10을 초과하는 것으로 나타났고, 하나의 디자인은 200배를 초과하는 것으로 나타났다.
토홀드 리보조절인자의 변형은 도 8b에 제시되어 있다.
본원에 기술된 바와 같이, (본원에서는 또한 트리거 RNA로 지칭되는) 트랜스-활성화 RNA (taRNA)는 오직 토홀드 또는 비콘 리보조절인자의 결합 도메인 (제1 또는 제2, 또는 제1 및 제2 도메인)과 혼성화하는 서열만을 포함하는 소형 RNA 분자일 수 있거나, 보다 긴 RNA 분자, 예컨대 그의 서열 중 단지 일부만을 사용하여 토홀드 또는 비콘 리보조절인자의 결합 도메인에 혼성화하는 mRNA 분자일 수 있다. 추가로 다른 경우에서, crRNA의 활성화는 crRNA의 헤어핀 구조를 언와인딩하는데 함께 작용하는 2개 이상의 RNA 또는 다른 핵산 분자를 필요로 한다. taRNA의 길이는 다양할 수 있다. 일부 경우에서, taRNA 길이는 약 30-nt이다. 상기 taRNA는 실시예 7을 비롯한, 본원에 기술된 바와 같이, 12 nt 토홀드 도메인을 가지는 crRNA에 결합할 수 있다.
본 발명의 crRNA는 줄기 도메인 및 루프 도메인을 최소로 포함하는 헤어핀 구조를 포함한다. crRNA 및 그의 헤어핀은 전형적으로 (a) 분자내 상보적 서열이 염기쌍 형성 상호작용을 통해 서로 혼성화되었을 때, 이중체 (이중 나선, 부분적 또는 완전 이중 가닥) 영역 (본원에서 줄기 도메인으로 지칭) 및 (b) 이중체의 한쪽 단부에 단일 가닥 루프 도메인을 형성하기 위해 2차 구조를 채용하는 단일 핵산 분자 또는 그의 일부를 포함한다. 도 1, 5 및 8은 다양한 줄기-루프 구조를 보여주는 것이다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 줄기 도메인은 주로 이중 가닥이지만, 하나 이상의 미스매치, 벌지, 또는 내부 루프를 포함할 수 있다. 줄기 도메인의 길이는 상보적 뉴클레오티드의 첫번째 쌍으로부터 상보적 염기의 마지막 쌍까지로 측정될 수 있고, 이는 미스매치된 뉴클레오티드 (예컨대, AT, AU, GC 이외의 쌍), 벌지를 형성하는 뉴클레오티드, 또는 내부 루프를 형성하는 뉴클레오티드를 포함한다.
비록 헤어핀은 단일 핵산 분자로부터 형성되지만, 줄기 도메인을 형성하는 분자의 두 영역 또는 서열은 본원에서 "가닥"으로 지칭될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 줄기란 본원에서 부분적 또는 완전 이중 가닥인 것을 의미할 수 있다. 서로 상보적이고, 줄기 도메인을 형성할 수 있는 단일 분자 내의 핵산 서열은 "자가-상보적"인 것으로 또는 "자가-혼성화"인 것으로 또는 "자가-혼성화"할 수 있는 것으로 언급된다. 일반적으로, 본원에 기술된 헤어핀 및 줄기 도메인은 생리학적 조건, 예컨대 세포내 존재하는 조건 (예컨대, 대략적으로 생리학적 조건과 유사한 조건, 예컨대 pH, 온도, 및 염 농도)에서 형성되고, 그 조건하에서 안정적이다. 상기 조건으로는 pH 6.8 내지 7.6, 더욱 바람직하게는 대략 pH 7.4를 포함한다. 원핵 세포 및 일부 진핵 세포, 예컨대 진균 세포는 37℃ 미만 또는 37℃ 초과인 온도를 비롯한 보다 광범위한 온도 범위에서 성장할 수 있지만, 전형적인 온도는 대략 37℃이다.
본 발명의 다양한 핵산들은 본원에서 비-자연 발생, 인공, 조작, 또는 합성인 것을 지칭할 수 있다. 이는 핵산이 자연적으로 발견되지 않거나, 또는 자연 발생 비조작 공급원에서 발견되지 않는다는 것을 의미한다. 비-자연 발생, 인공, 조작, 또는 합성 핵산의 서열은 자연 발생 핵산과 유사할 수 있지만, 그의 자연 발생 대응물에서 발견되는 서열에 대해 상대적으로 1개 이상의 인공적으로 생성된 삽입, 결실, 역전, 또는 치환을 함유할 수 있다. 조작된 핵산을 함유하는 세포는 조작된 세포로 지칭될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태는 서로 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 서열은 바람직하게는 완전히 상보적이다 (즉, 100% 상보적). 그러나, 다른 경우에서, 서열은 단지 부분적으로 상보적이다. 부분적으로 상보적인 서열은 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 상보적일 수 있다. 단지 부분적으로만 상보적인 서열은 서로 혼성화되었을 때, 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함할 것이다. 단일 가닥 영역은 단일 미스매치, 루프 (예를 들어, 한 가닥 상의 일련의 연속되는 뉴클레오티드가 비혼성화된 경우), 벌지 (예를 들어, 서로 반대되는 두 가닥 모두의 일련의 연속되는 뉴클레오티드가 비혼성화된 경우)일 수 있다. 상보성은 전장의 두 서열과 관련하여, 또는 서열의 일부과 관련하여 측정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 핵산 및/또는 다른 모이어티는 단리될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단리된"이란 그가 자연 발생 공급원으로부터 유래되었는지, 또는 합성적으로 제조되었는지와는 상관없이, 보통 그와 함께 회합되어 있던 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 핵산 및/또는 다른 모이어티는 정제될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 정제된이란 대다수의 다른 화합물 또는 엔티티로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 화합물 또는 엔티티는 부분적으로 정제될 수 있거나, 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 순도는 중량/중량 척도에 의해 표시될 수 있고, 다양한 분석 기법, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 질량 분광측정법, HPLC 등을 사용하여 측정될 수 있다.
핵산이란 일반적으로 골격 연결, 예컨대 제한하는 것은 아니지만, 포스포디에스테르 결합을 통해 함께 결합된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 중합체를 의미한다. 핵산으로는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA), 예컨대 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA (tRNA) 등을 포함한다. 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥, 및 또한 삼중 가닥일 수도 있다.
자연 발생 뉴클레오티드는 뉴클레오시드, 즉, 오탄당에 연결된 질소계 염기, 및 일반적으로 뉴클레오시드의 오탄당의 C-5 (5'로 표시)에 부착된 히드록실 기에서 에스테르화된 하나 이상의 포스페이트 기로 구성된다. 상기 화합물은 뉴클레오시드 5'-포스페이트 또는 5'-뉴클레오티드로 명명된다. DNA에서 오탄당은 데옥시리보스인 반면, RNA에서 오탄당은 리보스이다. 질소계 염기는 퓨린, 예컨대 아데닌 또는 구아닌 (DNA 및 RNA에서 발견), 또는 피리미딘, 예컨대 시토신 (DNA 및 RNA에서 발견), 티민 (DNA에서 발견) 또는 우라실 (RNA에서 발견)일 수 있다. 따라서, DNA의 주요 뉴클레오티드는 데옥시아데노신 5'-트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 5'-트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 5'-트리포스페이트 (dCTP), 및 데옥시티미딘 5'-트리포스페이트 (dTTP)이다. RNA의 주요 뉴클레오티드는 아데노신 5'-트리포스페이트 (ATP), 구아노신 5'-트리포스페이트 (GTP), 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP) 및 우리딘 5'-트리포스페이트 (UTP)이다. 일반적으로, 안정적인 염기쌍 형성 상호작용은 아데닌과 티민 (AT) 사이, 아데닌과 우라실 (AU) 사이, 및 구아닌과 시토신 (GC) 사이에 일어난다. 따라서, 아데닌과 티미딘, 아데닌과 우라실, 및 구아닌과 시토신 (및 상응하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드)은 서로 상보적인 것으로 언급된다.
일반적으로, 핵산의 한쪽 단부는 5'-히드록실 기를 가지고, 핵산의 나머지 다른 한쪽 단부는 3'-히드록실 기를 가진다. 그 결과, 핵산은 극성을 띤다. 핵산내 서열 또는 모이어티 또는 도메인의 ~번 위치 또는 위치는 특정 마커의 상류 또는 5'로 언급될 수 있으며, 이는 그 위치가 상기 마커와 핵산의 5' 단부 사이임을 의미한다. 유사하게, 핵산내 서열 또는 모이어티 또는 도메인의 ~번 위치 또는 위치는 특정 마커의 하류 또는 3'으로 언급될 수 있으며, 이는 그 위치가 상기 마커와 핵산의 3' 단부 사이임을 의미한다.
핵산은 비-자연 발생 뉴클레오티드 유사체를 비롯한, 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 상기 유사체는 뉴클레오시드 유사체 (예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 3-메틸 아데노신, C5-프로피닐시티딘, C5-프로피닐우리딘, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-메틸시티딘, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘), 화학적으로 변형된 염기, 생물학적으로 변형된 염기 (예컨대, 메틸화된 염기), 삽입된 염기, 변형된 당 (예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스), 또는 변형된 포스페이트 기 (예컨대, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결부)를 포함한다.
crRNA 및 taRNA를 비롯한, 본 발명의 핵산은 더욱 큰 핵산에 제공되거나, 또는 존재할 수 있다. 더욱 큰 핵산은 예를 들어, 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, crRNA 및 taRNA의 전사 및 제조를 담당할 수 있다. 더욱 큰 핵산은 전사되어 본 발명의 crRNA 및 taRNA를 제조하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 편의상, 비록 실제로는 더 큰 핵산은 crRNA 및/또는 taRNA를 코딩하는 서열을 포함한다는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 하지만, 본 발명은 더 큰 핵산이란 crRNA 및/또는 taRNA를 포함하는 것으로서 의미할 수 있다. 상기 코딩 서열은 더 큰 핵산에서 다른 서열에, 예컨대 복제 기점에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이란, 핵산 서열 중 하나의 제조 또는 발현이 나머지 다른 한 핵산 서열에 의해 제어되거나, 조절되거나, 조정되는 등, 그러한 두 핵산 서열 사이의 관계를 의미한다. 예를 들어, 핵산 서열의 전사는 작동가능하게 연결된 프로모터 서열에 의해 지시되고; 핵산의 전사 후 프로세싱은 작동가능하게 연결된 프로세싱 서열에 의해 지시되고; 핵산 서열의 번역은 작동가능하게 연결된 번역 조절 서열에 의해 지시되고; 핵산 또는 폴리펩티드의 수송 또는 국재화는 작동가능하게 연결된 수송 또는 국재화 서열에 의해 지시되고; 폴리펩티드의 번역 후 프로세싱은 작동가능하게 연결된 프로세싱 서열에 의해 지시된다. 바람직하게, 제2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열은, 비록 임의의 효과적인 회합이 허용되기는 하지만, 상기 서열에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결된다.
본원에서 사용되는 바, 조절 서열 또는 요소란 그와 작동적으로 연결된 서열(들)의 발현 (예컨대, 전사, 번역, 프로세싱 등)을 지시하거나, 증강시키거나, 또는 억제시키는 핵산 서열의 영역을 의미한다. 상기 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 전사 및/또는 번역 제어 요소를 포함한다. 본 발명의 crRNA 및 taRNA 모이어티는 crRNA에 작동가능하게 연결된 관심 유전자의 번역을 제어하는 정도까지의 조절 서열 또는 요소로 간주될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 crRNA 및 taRNA가 구성적 또는 유도성 단백질 발현을 지시할 수 있다는 것을 고려한다. 유도성 단백질 발현은 일시적 또는 발생적 방식으로 제어될 수 있다.
벡터라는 용어는 제2 핵산 분자의 세포 내로의 유입, 예컨대 전달, 수송 등을 매개할 수 있는 핵산을 의미한다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산에 연결, 예컨대 그 핵산 내로 삽입된다. 벡터는 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA 내로의 통합을 허용하는데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터로는 예를 들어, 플라스미드 (비록 RNA 플라스미드 또한 알려져 있지만, 전형적으로는 DNA 분자), 코스미드, 및 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명과 관련하여, 리포터 단백질은 전형적으로 crRNA의 활성화를 시각화하는데 사용된다. 본 목적에 적합한 리포터 단백질로는 형광 또는 화학발광 리포터 (예컨대, GFP 변이체, 루시페라제, 예컨대 반딧불이 (포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)) 또는 바다 팬지 (레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis))로부터 유래된 루시페라제 및 그의 돌연변이체), 효소적 리포터 (예컨대, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, DHFR, CAT) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. eGFP는 65번 위치의 세린 (Ser65)의 다양한 치환 (예컨대, Thr, Ala, Gly)을 가지는 단백질 부류이다. 청색 형광 단백질 (BFP)은 방출 및 여기 특성을 변경시키는, 66번 위치에 돌연변이 (Tyr → His 돌연변이)를 가진다. BFP 중의 이러한 Y66H 돌연변이는 wtGFP와 비교하였을 때, 스펙트럼의 청색 이동을 일으킨다. 청록색 형광 단백질 (CFP)은 BFP의 것과와 eGFP의 것 사이의 여기 및 방출 스펙트럼 파장을 가지는 Y66W 돌연변이를 가진다. 사파이어는 495 nM에서 억제된 여기 피크를 가지지만, 395에서 여기 피크 및 511 nM에서 방출 피크를 여전히 유지하는 돌연변이체이다. 황색 FP (YFP) 돌연변이체는 203번 위치에 방향족 아미노산 (예컨대, Phe, Tyr 등)을 가지고, 적색 이동 방출 및 여기 스펙트럼을 가진다.
비록 본 발명의 다양한 실시양태는 RNA와 관련하여 기술되었지만, 본 발명의 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 일반적으로, RNA 및 DNA는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 시험관내 시스템을 사용하여, 세포내에서, 또는 화학적 합성법에 의해서 제조될 수 있다. 오픈 리딩 프레임 (ORF) 상류의 crRNA 요소의 삽입은 ORF를 포함하는 핵산을 변형시킴으로써 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 crRNA 또는 taRNA의 전사를 위한 DNA 주형을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 DNA 주형을 포함하는 DNA 구축물 및 플라스미드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 crRNA 또는 taRNA의 전사를 위한 주형을 포함하는 구축물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (i) crRNA의 전사를 위한 주형; 및 (ii) 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 구축물 또는 플라스미드는 crRNA에 대한 주형으로서의 역할을 하는 구축물의 일부의 3' 단부 하류에 제한 부위를 포함하며, 이를 통해 최선의 ORF가 삽입될 수 있다. 구축물은 crRNA에 대한 주형으로서의 역할을 하는 일부분의 하류에 폴리링커 또는 다중 클로닝 부위 중 일부 또는 그들 모두를 포함할 수 있다. 구축물은 또한 crRNA 하류에 ORF를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (i) taRNA의 전사를 위한 주형; 및 (ii) 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다. 본 발명은 추가로 (i) crRNA의 전사를 위한 주형; (ii) crRNA의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터; (iii) taRNA의 전사를 위한 주형; 및 (iv) taRNA의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다. 프로모터는 동일하거나, 상이한 것일 수 있다.
구축물은 플라스미드, 예컨대 박테리아에서 복제가 가능한 플라스미드 내로 혼입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 플라스미드라는 용어는 관련 기술분야에서 이해되고, 공지되어 있는 바와 같이, 플라스미드는 고 카피수의 플라스미드 (예컨대, pUC 기반 또는 pBR322 기반 플라스미드)이고, 다른 실시양태에서, 플라스미드는 저 카피수 또는 중간 카피수의 플라스미드이다. 플라스미드는 상이한 카피수를 제공할 수 있는, 다양한 복제 기점 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기 중 임의의 것이 사용될 수 있다 (카피수는 괄호 안에 열거되어 있다): ColEl (50-70 (고)), pl5A (20-30 (중간)), pSClOl (10-12 (저)), pSOOl* (< 4 (최저)). 세포 또는 시스템 중에서 그의 상대적인 양을 변경시키기 위해서는 crRNA 및 taRNA의 전사를 위해 상이한 카피수를 가지는 플라스미드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 특정 실시양태에서, 조정가능한 카피수의 플라스미드가 사용된다.
본 발명은 상기 기술된 핵산, 구축물 (예컨대, DNA 구축물), 및 플라스미드를 포함하는 바이러스 및 세포를 추가로 제공한다. 다양한 실시양태에서, 세포는 원핵 세포이다. 다양한 실시양태에서, 세포는 진핵 세포 (예컨대, 진균 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등)이다. 재조합 핵산 기술을 사용하여 핵산 또는 구축물을 바이러스 게놈 내로 통합시킬 수 있고, 그의 전사를 위한 핵산 분자 및/또는 주형을 포함하는 감염성 바이러스 입자를 제조할 수 있다. 핵산 분자, DNA 구축물, 플라스미드, 또는 바이러스는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법들 중 임의의 것, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 매개 형질감염, 바이러스 감염 등을 사용하여 세포 내로 도입시킬 수 있다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 핵산 구축물은 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 상기 세포는 시험관내 (예컨대, 배양물 중) 또는 생체내 (예컨대, 유기체 중) 존재할 수 있다. 본 발명은 추가로 본 발명의 핵산, DNA 구축물, 및/또는 플라스미드를 포함하는 트랜스제닉 식물 및 비-인간 트랜스제닉 동물을 제공한다. 상기 트랜스제닉 유기체를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명은 추가로 다양한 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 플라스미드를 포함하고, 여기서 제1 플라스미드는 (i) crRNA의 전사를 위한 주형, 및 (ii) crRNA 요소의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하고, 임의로, (i) 동족 (상보적) taRNA 요소의 전사를 위한 주형, 및 (ii) taRNA 요소의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 키트를 제공한다. 프로모터는 동일한 것일 수 있거나, 또는 바람직하게는 상이한 것일 수 있다. 프로모터 중 하나 이상의 것은 유도성일 수 있다. 플라스미드는 동일하거나, 또는 상이한 카피수를 가질 수 있다. 본 발명은 추가로 crRNA 요소의 전사를 위한 주형 및 crRNA 요소의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터를 포함하고, 동족 taRNA 요소의 전사를 위한 주형 및 동족 taRNA 요소의 전사를 위한 주형 상류에 위치하는 프로모터를 추가로 포함하는 단일 플라스미드를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 플라스미드는 crRNA 요소의 전사를 위한 주형 상류 또는 하류에 하나 이상의 제한 부위를 포함한다. 하류에 존재할 경우, 제한 부위는 선택되는 오픈 리딩 프레임의의 삽입을 위해 사용될 수 있다. 키트는 하기 성분: (i) 하나 이상의 유도제; (ii) 숙주 세포 (예컨대, 원핵 또는 진핵 숙주 세포); (iii) 하나 이상의 완충제; (iv) 하나 이상의 효소, 예컨대 제한 효소; (v) 핵산 단리용 및/또는 정제용 시약; (vi) crRNA 또는 taRNA 서열을 포함하지 않는 대조군 플라스미드; (vii) crRNA 또는 taRNA 서열, 또는 그 둘 모두를 포함하는 대조군 플라스미드; (viii) 서열분석 프라이머; (ix) 사용 지침서 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다. 대조군 플라스미드는 리포터 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 본 발명의 리보조절인자는 컨센서스 원핵성 RBS를 포함한다. 그러나, 본 발명의 다양한 실시양태에서, 다양한 대체 서열 중 임의의 것이 RBS로서 사용될 수 있다. 다수의 박테리아 리보솜 결합 부위의 서열은 결정되어 있으며, 이들 서열의 중요한 특징은 공지되어 있다. 고수준의 번역을 위해 바람직한 RBS 서열은 AUG에 대해 상대적으로 -6번 내지 -11번 위치에 G가 풍부한 영역을 함유하고, 전형적으로는 -3번 위치에 A를 함유한다. 본 발명에서 사용하기 위한 RBS 서열의 예로는 AGAGGAGA (또는 상기 서열의 서브서열, 예컨대 6개 이상의 뉴클레오티드 길이인 서브서열, 예컨대 AGGAGG)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 짧은 서열, 예컨대 AGGA, AGGGAG, GAGGAG 등도 또한 허용가능하다. 다수의 합성 리보솜 결합 부위가 생성되었고, 그의 번역 개시 활성이 시험되었다. 다양한 실시양태에서, 임의의 자연 발생 RBS가 crRNA 구축물에서 사용될 수 있다. 임의의 적합한 방법을 사용하여 RBS로서 작용하는 임의의 후보 서열의 활성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 발현은 공개된 PCT 출원 WO 2004/046321의 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 또는 상기 공개된 PCT 출원의 참고문헌 53에 기술되어 있는 바와 같이, 예컨대 AUG 상류에 적절하게 위치하는 후보 RBS를 함유하는 mRNA에 의해 코딩된 리포터 단백질의 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 사용하기 위한 RBS 서열은 (예컨대, 리포터 단백질의 활성에 의해 측정된 바) 컨센서스 RBS가 번역을 지원하는 수준의 10% 이상인 수준으로 번역을 지원한다. 예를 들어, 후보 RBS가 컨센서스 RBS 대신 대조군 플라스미드 내로 삽입된다면, 측정되는 형광은 컨센서스 RBS를 사용하였을 때 측정된 값의 10% 이상이 될 것이다. 특정 실시양태에서, 컨센서스 RBS가 번역을 지원하는 수준과 비교하여 상대적으로 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 초과인 수준으로 번역을 지원하는 RBS가 사용된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 컨센서스 RBS보다 더 높은 수준으로 번역을 지원하는 RBS가 사용된다.
리보조절인자에 관한 추가의 일반 교시는 공개된 PCT 출원 WO 2004/046321에서 살펴볼 수 있으며, 상기 출원은 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
토홀드 및 비콘 리보조절인자의 장점
본 발명의 리보조절인자는 현 기법과 비교하여 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)은 고감도로 RNA 수준을 검출하고, 노던 블롯은 고도한 특이성을 나타내며, 마이크로어레이는 수천개의 표적을 동시에 검출할 수 있다. 그러나, 상기의 모든 기법에서, 정량화를 위해 RNA를 수득하기 위해서는 세포를 희생시켜야 하며, 따라서 RNA 수준을 실시간으로 측정하는 것은 도전 과제가 된다. 형광 계내 혼성화 (FISH) 및 형광 RNA 압타머 사용을 통해 세포내 RNA 국재화를 시각화할 수 있다. FISH를 위해서는 시각화하기 위해 세포를 고정화시켜야 하고, 혼성화는 고가의 프로브가 사용되며 많은 시간이 소요된다. RNA 압타머는 살아있는 세포에서 RNA를 영상화하는데 사용될 수 있지만; 그러나, 대개의 광학 현미경에서 검출되도록 하기 위해서는 형광 강도가 가장 높은 상기 압타머는 여전히 내인성 RNA의 것을 훨씬 초과하는 카피수를 필요로 한다. RNA 수준은 또한 RNA 표적과 동일한 프로모터로부터 구동된 형광 리포터 단백질을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 방법에서 리포터가 RNA 표적의 수준을 반영할 수는 있지만, 프로모터 영역으로부터 (예컨대, 다수의 킬로베이스만큼) 떨어져 있는 염색체 영역으로부터의 조절 거동은 요약하지 못한다. 추가로, 추가 카피의 프로모터 존재가 표적 유전자로부터 떨어져 RNA 폴리머라제 활성을 적정할 수 있다. 마지막으로, 단백질 결합 압타머로 태그부착된 RNA는 또한 형광 단백질 리포터와 결합 단백질의 융합물을 이용하여 세포내 RNA의 국재화 및 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 기법은 시각화하고자 하는 RNA에 상응하는 유전자를 태그부착하거나, 또는 녹아웃시키는 염색체 변형을 필요로 한다. 본 발명의 리보조절인자는 선행 기술 기법의 상기와 같은 다양한 한계에 의해 방해받지 않는다.
실시예
실시예 1. 토홀드 리보조절인자 및 리포터 단백질/ GOI
도 1의 예시적인 리보조절인자를 실험적으로 시험하였다. GOI는 EGFP 변이체 GFPmut3b였고, 이를 그의 반감기가 대략 110분이 되도록 설정된 ASV 분해 신호로 태그부착하였다. 소프트웨어 패키지 NUPACK을 사용하여 최소의 2차 구조 및 crRNA의 30-nt 길이의 표적 결합 부위에 완전한 상보성을 가지는, crRNA에 동족인 taRNA를 디자인하였다.
IPTG 유도성 lacUV5 프로모터의 제어하에 T7 RNA 폴리머라제를 보유하는 람다 파지 용원을 함유한 RNase E 결핍 균주인 이. 콜라이 BL21 DE3 스타에서 리보조절인자를 시험하였다. crRNA와 동족 및 비-동족 taRNA 서열 사이의 상호작용에 관하여 특징을 빠르게 규명할 수 있도록 하기 위해 별개의 플라스미드로부터 crRNA 및 taRNA 구축물을 발현시켰다. crRNA 및 taRNA 둘 모두의 경우, 전사는 T7 프로모터 상류로부터 개시되었고, 전사는 T7 RNA 폴리머라제 종결 신호를 사용하여 종결시켰다. crRNA-GFP 전사체는 colA 기점을 가지는 중간 카피수의 플라스미드로부터 생성한 반면, taRNA 전사체는 colE1 기점을 가지는 보다 고 카피수의 플라스미드로부터 생성하였다. 이러한 플라스미드 카피수의 변동으로 전체 유도된 세포 내의 crRNA와 비교하여 taRNA는 7배 과량인 것으로 예측되었다. 이러한 비는 이전 연구 및 안티센스 RNA 및 그의 표적에 대하여 관찰된 전형적인 카피수 차와 유사하다.
crRNA 및 그의 동족 taRNA 표적 (온 상태의 균주) 또는 crRNA 및 비-동족 taRNA (오프 상태의 균주)로 형질전환되고, 기체 투과성 실로 커버링된 딥 웰 96-웰 플레이트 중 1 mL의 선택 LB 배지에서 37℃에서 밤새도록 성장시킨 이. 콜라이에서 생체내 시험을 수행하였다. 온 및 오프 상태의 리보조절인자 조건 둘 모두에서 두 플라스미드로 이. 콜라이를 형질전환시킴으로써 두 균주 모두 적어도 전사되는 외인성 RNA의 개수와 관련해서는 유사한 대사량을 얻었다는 것을 확인할 수 있었다. 밤새도록 배양된 배양물을 100배 희석시키고, 딥 웰 플레이트 중 37℃에서 80분 동안 성장시켰다. 이어서, 조기 지수 증식기 세포를 0.1 mM의 IPTG로 유도하고, 유동 세포측정법을 통해 특징규명하기 위하여 1시간째되는 시점에 분취량을 채취하였다. 샘플 간의 GFP 형광 강도 비교를 위하여, 유동 세포측정법 데이터로부터 작성된 형광 강도 히스토그램으로부터 모드 GFP 강도를 계산하였다.
리보조절인자 성능에 대한 제1 척도로서, crRNA-GFP 구축물의 형광 강도를, 동일한 BL21 DE3 스타 이. 콜라이 균주에서 동일한 수준의 IPTG로 유도된 비-시스-억제된 GFP 구축물로부터의 형광과 비교하였다. 이러한 측정으로 극도로 높은 수준의 번역 억제가 입증되었는데, 시험된 6개의 리보조절인자 crRNA는 형광 출력을 99.5% 이상만큼 감소시켰다 (도 2 참조). 리보조절인자의 트랜스-활성화의 효율성을 계산하기 위해, crRNA-GFP의 동족 taRNA의 존재하에서의 crRNA-GFP의 모드 GFP 형광을 비-동족 taRNA의 존재하에서의 crRNA-GFP의 형광과 비교하였다. 상기 두 수치를 나눔으로써 시험된 모든 리보조절인자에 대한 온/오프 비를 계산하였다. 도 3에는 고성능 토홀드 리보조절인자에 대하여 1시간째 되는 시점에 측정된 온/오프 비가 제시되어 있다. 오차 막대는 생물학적 복제물 3개로부터 계산된 온/오프 비의 표준 오차이다. 상기 데이터로부터 볼 때, 형광은 유도 후 단지 2 내지 3시간 경과한 후에도 200배 이상만큼 증가함에 따라, 토홀드 리보조절인자는 표적 RNA에 의해 강력한 트랜스-활성화를 나타낼 수 있다는 것은 명백하다.
추가로 60개의 토홀드 리보조절인자 디자인에 대하여 생체내에서 동일한 측정을 수행하였고, 온/오프 비는 도 4에 제시되어 있다. 시험된 리보조절인자 중 대략 ⅓ 정도가 그의 동족 표적의 존재하에서 50배 이상만큼 GFP 출력을 증가시킨다.
실시예 2. 비콘 리보조절인자
토홀드 리보조절인자에 대해 사용된 것과 동일한 조건을 사용하여 비콘 리보조절인자, 예컨대 도 5에 제시된 구조를 가지는 것을 시험하였다. 도 6에는 6개의 비콘 리보조절인자에 대해 수득된 온/오프 형광 강도 중간값의 비가 제시되어 있다. 장치 중 4개는 온/오프 비가 10을 초과하는 것으로 나타났고, 하나의 디자인은 200배를 초과하는 것으로 나타났다.
실시예 3. 내인성 RNA 감지
내인성 RNA 검출을 위해 본원에 기술된 신규한 리보조절인자가 사용될 수 있다. 개념 증명으로서, 이. 콜라이에서 소형 RNA ryhB에 의해 유발될 수 있는 비콘 리보조절인자를 디자인하고, 생성하였다. RyhB는 이. 콜라이에서 철 수준이 낮을 때에 상향조절되는 90-nt 길이의 비-코딩 RNA이다. 상기 RNA는 철 킬레이터 2,2'-디피리딜을 배양 배지에 첨가함으로써 유도될 수 있다.
이러한 내인성 센서를 시험하기 위해, GFP 리포터 상류에 비콘 리보조절인자를 함유한 플라스미드를 구축하였다. IPTG-유도성 PllacO-1 프로모터를 사용하여 crRNA 전사체의 발현을 제어하였다. 리보조절인자 센서 플라스미드로 형질전환된 MG1655 이. 콜라이 세포를 조기 지수 증식기에 1 mM IPTG로 유도하였다. 동시에, ryhB 발현은 철 킬레이터를 첨가함으로써 유도하였다. 2시간 후 수거된 세포로부터 측정된 유동 세포측정법 측정결과, 2,2'-디피리딜로 유도되지 않은 대조군 집단과 비교하였을 때, ryhB 함유 세포에 대한 GFP 형광 강도는 5배 증가된 것으로 입증되었다 (도 7). 추가로, PllacO-1 프로모터 하의 비-시스-억제된 GFP 리포터를 함유하는 대조군 세포는 IPTG 및 2,2'-디피리딜 둘 모두로 유도되었을 때, IPTG 단독으로 유도되었을 때에 비하여 형광 강도가 감소된 것으로 나타났다. 이러한 추가의 대조군은 센서로부터의 GFP 출력이 철 킬레이터 첨가에 의해 유발된 전사 수준 증가에 의해 유발된 것이 아니라는 것을 입증한다.
실시예 4. 리보조절인자를 사용한 복합 OR 논리 연산의 유전적 코딩
본 발명자들은 리보조절인자 라이브러리의 구성원을 사용하여 생체내 다중 논리 OR 연산을 성공적으로 수행하였다. 가장 간단한 OR 연산은 입력값 중 하나가 존재할 경우, 논리 게이트를 활성화시키는 두 입력값, A 및 B를 포함한다. 본 발명자들은 간단히 두 고성능 리보조절인자를 취하고, 이를 GFP에 대한 코딩 서열 상류의 동일한 mRNA에 따라 교대로 배치시킴으로써 생체내에서 상기 시스템을 실행하였다 (도 11a). 생체내에서의 상기 게이트의 의도된 연산은 도 11b에 제시되어 있다. 입력값 RNA 분자 중 어느 하나가 세포에 존재할 때, 이는 그에 상응하는 crRNA 모듈에 결합하여 그의 줄기를 언와인딩함으로써 모듈을 탈억제시킬 것이다. 단백질 번역에 관여하는 리보솜은 강력한 RNA 헬리카제 활성을 가지고 있기 때문에, 번역은 방해 없이 계속해서 진행하면서, 그의 경로에서 하류 crRNA를 언와인딩할 수 있다. 2-입력값 OR 게이트의 유동 세포측정법은, 프로그램화된 taRNA 입력값 중 어느 하나가 전사되었을 때, GFP 발현의 활성화가 강력하게 일어난 것으로 나타났다 (도 11c). 추가로, crRNA의 위치를 교체한 병행 실험에서 유사한 시스템 성능이 나타났다.
2-입력값 게이트의 성공적인 실행이 동기가 되어, 본 발명자들은 GFP 상류에 6개의 crRNA 모듈이 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 6-입력값 OR 논리 시스템을 추구하였다 (도 12). OR 논리 시스템에서 모 crRNA 중 3개는 종결 코돈을 함유하였는 바, 본 발명자들은 이들 원치않는 코돈을 제거하기 위해 그의 서열을 변형시키고, 그를 개별적으로 시험하여 종결 코돈 무함유 변이체가 확실히 그의 모의 활성을 유지하도록 하였다. 상기 시험 후, 유전자 조립을 사용하여 474-bp의 6-crRNA 구축물을 합성하고, 상이한 taRNA 요소를 발현하는 플라스미드와 함께 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 유도제 IPTG를 함유하는 플레이트 상에서 측정하였을 때, 6-입력값 OR mRNA 둘 모두 및 동족 taRNA 중 하나를 발현하는 세포가 강력한 GFP 형광을 보였다. 그러나, 4개의 비-동족 taRNA로 이루어진 한 세트는 GFP 발현을 유의적으로 활성화시키지 못했으며, 이는 본 발명자들의 생체내 논리 골격의 인상적인 직교성을 강조하는 것이다. 4개의 비-동족 taRNA로 이루어진 한 세트와 비교하였을 때, 6개의 입력값 모두 5배 이상 더 높은 GFP 출력을 제공하였는 바, 이들 형질전환체로부터의 유동 세포측정법 측정결과를 통해 성공적인 OR 게이트 연산 또한 확인하였다.
실시예 5. 리보조절인자를 사용한 복합 AND 논리 연산의 유전적 코딩
본 발명자들은 토홀드 리보조절인자를 사용하여 AND 논리 연산을 수행하기 위해 범용가능한 시스템을 개발하였다. 도 9에는 GFP 리포터 서열 상류의 crRNA 서열을 특징으로 하는 2개의 입력값 AND 게이트가 도시되어 있다. 시스템에서 2개의 입력값은 crRNA 게이트의 동족 taRNA 서열의 절반부를 함유하는 두 RNA 서열 A 및 B이다 (도 9a). 두 입력값 RNA는 또한 그가 세포 내부에 존재할 때에는 두 RNA 모두가 서로 결합할 수 있도록 하는 혼성화 도메인 (u-u*)을 포함한다. 이러한 혼성화 이벤트가 발생하게 되면, taRNA의 두 절반부는 인접하게 위치함으로써 게이트 crRNA를 언와인딩할 수 있는 서열을 제공하여 GFP가 번역되도록 유발한다. 각각의 입력값 RNA는 그가 자립으로 발현되었을 때에는 (1) 입력값 B인 경우에는 crRNA 줄기의 충분히 긴 영역을 언와인딩할 수 없거나, 또는 (2) 입력값 A인 경우에는 crRNA에 결합하는 것이 동역학적으로 및 열역학적으로 바람직하지 못한 것으로 여겨지는 바, 이러한 이유 중 하나로 인해 crRNA를 억제시킬 수 없다. 2-입력값 AND 논리 시스템에 대한 유동 세포측정법 측정결과로 이. 콜라이에서의 그의 연산이 입증되었다 (도 9b). 다른 다른 경우에서는 GFP 출력이 낮지만, 시스템에서 3개의 RNA 모두가 세포 내부에서 발현되면, GFP 출력은 활성화된다.
토홀드 리보조절인자에 기반한 AND 게이트를 6-비트 연산으로 성공적으로 확장시켰다. 도 13a에 제시되어 있는 바와 같이, 상기 시스템 중의 게이트는 6개의 입증된 토홀드 리보조절인자 crRNA 및 맨 아래의 crRNA로부터의 토홀드 서열로 구성된 연장된 줄기를 포함하는 헤어핀으로 구성된다. 따라서, 입력값 RNA는 상응하는 taRNA 서열을 함유하고, 그에 이웃하는 입력값 가닥에 대한 혼성화 서열 또한 포함한다. 주어진 입력값의 혼성화 서열은 다음 입력값 RNA의 토홀드 결합 도메인에 대해 상보적이다. 예를 들어, 입력값 A는 입력값 B가 결합하는 12- 내지 15-nt 서열을 함유하고, 이 서열은 입력값 B의 동족 crRNA에 대해 토홀드이다. 결과적으로, 입력값 A가 게이트에 결합하면, 그의 줄기의 하단 염기는 언와인딩되고, 또는 입력값 B의 결합을 위한 새 토홀드가 제공된다. 이러한 줄기 언와인딩/토홀드 제시 과정은 입력값 모두가 게이트에 결합할 때까지 반복된다. 입력값 모두가 결합하였을 때, RBS 및 출발 코돈은 탈억제되고, 이로써 GFP 또는 또 다른 관심 단백질의 제조가 유발된다. 본 발명자들은 게이트 mRNA 또한 발현하는 이. 콜라이에서 상이한 조합의 입력값 RNA를 발혐시킴으로써 상기 게이트를 입증하였다. 도 13b는 LB 플레이트 상에서 유도된 콜로니로부터 측정된 GFP 강도를 보여주는 것이다. 6개의 입력값 모두가 세포에서 발현되었을 때에만 오직 강력한 GFP 형광이 육안으로 관찰되었다. 입력값 RNA 중 하나를 제외한 남은 모두가 발현된 엄격한 시험을 비롯한 6개의 다른 입력 조합에서는 GFP 발현이 낮았다.
실시예 6. 리보조절인자 토홀드 억제인자
본 발명자들은 44개의 토홀드 억제인자 (장치/시스템)로 이루어진 라이브러리를 구축하고, 그의 기능을 이. 콜라이 BL21 스타 DE3에서 시험하였다. 본 발명자들은 시스템의 성능을 시험하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 그가 오프 상태일 때 (즉, 그의 동족 트리거가 존재할 때); 및 그의 온 상태일 때 (즉, 그의 동족 트리거가 부재할 때) 스위치로부터의 모드 GFP 형광을 계산하였다. 이어서, 본 발명자들은 하기 방정식을 사용하여 % 억제 수준을 계산하였다:
% 억제 = 1 - [오프 상태 모드 형광 ÷ 온 상태 모드 형광].
도 15b는 라이브러리 중 44개의 억제인자에 대하여 수득된 % 억제 수준을 보여주는 것이다. 억제인자 40 내지 44는 고도로 가변적인 성능을 가졌다. 그의 거동은, 심지어 트리거 RNA가 존재하지 않는 경우에도 스위치 RNA의 온 및 오프 상태 배열 사이의 변동을 유발하는, 스위치 RNA의 폴딩의 불안정성에 기인하는 것이라고 본 발명자들은 가정하였다. 나머지 장치/시스템들은 대체로 매우 우수한 성능을 보였다. 전체 라이브러리 중 73%는 80% 이상의 억제 수준을 가졌다. 또한, 라이브러리 중 50%는 90% 초과의 억제를 보였다. 이러한 인상적인 90%의 억제 수준은 이전 보고되었던 거의 모든 번역 억제인자들의 성능을 능가하였다 ([Mutalik et al., Nat. Chem. Biol. 8:447-454, 2012] 참조). 추가 측정 결과, 최고 성능을 가지는 토홀드 스위치는 1시간 이내에 95% 초과의 번역 억제를 달성할 수 있으며, 그 수준을 후속 시점에 99% 초과로 증가시킬 수 있다는 것 또한 입증되었다 (도 16).
실시예 7. 토홀드 스위치
본원에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명은 공지된 천연 대응물이 없는, 소위 토홀드 스위치라 불리는 것에서 새로운 부류의, 유전자 발현의 전사 후 리보조절인자를 제공한다. 토홀드 스위치는 트랜스-작용 트리거 RNA에 대한 반응으로 조절되는 유전자의 발현을 활성화시킨다. 살아있는 세포에서의 이러한 작용은 신규한 두 메카니즘: 시험관내 연구에서 개척된 토홀드 기반 선형-선형 RNA 상호작용 및 개시 코돈 주변의 영역 중 염기쌍 형성을 통한 효율적인 번역 억제에 의해 촉진된다. 본 발명자들은 토홀드 스위치가 통상 단백질 발현을 100배 초과만큼 조절할 수 있고, 최고 스위치는 단백질 기반 조절인자의 역학적 범위에 필적한다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 2% 미만의 시스템 크로스토크 수준을 보이는 18개의 토홀드 스위치로 이루어진 라이브러리를 비롯한, 직교 성분으로 이루어진 큰 세트를 입증하였고, 이는 지금까지 보고되었던, 단백질 또는 RNA 기반의 직교 조절성 요소로 이루어진 패밀리 중 가장 크고, 가장 엄격한 것을 구성한다. 이어서, 본 발명자들은 평균 온/오프 형광 비가 406인 13개의 토홀드 스위치로 이루어진 세트를 정방향 조작을 수행하였다. 본 발명자들은 시스템 성능 변동을 예측하기 위해 열역학적 분석을 추가로 적용시켰다. 추가로, 본 발명자들은 토홀드 스위치 세트가 기능성 mRNA 분자로부터 효과적으로 유발할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 토홀드 스위치의 고도한 역학적 범위, 직교성, 프로그램가능성, 및 다기능성은 토홀드 스위치가 합성 생물학 분야에서 유력한 새 도구가 될 것이라는 것을 시사한다.
방법
균주, 플라스미드, 및 성장 조건. 본 연구에서 하기 이. 콜라이 균주를 사용하였다: BL21 스타 DE3 (F- ompT hsdS B (rB -mB -) gal dcm rne131 (DE3); 인비트로젠(Invitrogen)), BL21 DE3 (F- ompT hsdS B (rB -mB -) gal dcm (DE3); 인비트로젠), MG1655Pro (F-λ- ilvG - rfb -50 rph -1 Sp R lacR tetR), 및 DH5α (endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17(rK -mK +)λ-). 적절한 항생제를 포함하는 LB 배지 중에서 모든 균주를 성장시켰다. 항생제를 하기 농도로 사용하였다: 암피실린 (50 ㎍ mL-1), 카나마이신 (30 ㎍ mL-1), 및 클로람페니콜 (34 ㎍ mL-1).
토홀드 스위치의 특징을 규명하기 위해, 화학적으로 수행 능력이 있는 이. 콜라이를 토홀드 스위치와 트리거 플라스미드의 원하는 조합으로 형질전환시키고, 적절한 항생제 쌍을 함유하는 LB/한천 플레이트 상에 도포하였다. 콜로니 GFP 형광 측정을 위해, LB/한천 플레이트를 RNA 발현을 유도하기 위해 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)로 보충하였다. 유동 세포측정법 측정결과를 위해, 개별 콜로니로부터 채취된 세포를 항생제를 함유하는 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕시키면서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 새 선택 LB 배지로 100배 희석시키고, 다시 96웰 플레이트 중 37℃에서 진탕시켰다. BL21 스타 DE3 및 BL21 DE3에서의 T7 RNA 폴리머라제 구동 발현을 위해, 세포를 80분 동안 성장시킨 후 0.2-0.3 OD600일 때 0.1 mM IPTG로 유도하였다. 달리 언급되지 않는 한, IPTG 첨가 후 3시간째에 세포 배양물을 측정하였다. 구성적 PN25 프로모터를 사용하였을 때의 발현을 위해, 밤새도록 배양된 배양물을 선택 LB 배지로 100배 희석시켰다. 후속 측정을 위해 상기 희석 수행 시점을 t = 0이라고 정의하였다.
플라스미드 구축. 모든 DNA 올리고뉴클레오티드는 인터그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.)로부터 구입하였다. 이중 가닥 트리거 및 스위치 DNA는 범용 프라이머를 사용하여 증폭된 단일 > 100-nt 올리고뉴클레오티드로부터, 또는 진2올리고(gene2oligo)를 사용하여 절편화된 단쇄 < 50-nt 올리고뉴클레오티드로부터 유전자 조립을 사용하여 제조하였다 (Rouillard et al., Nucleic Acids Res 32:W176-180, 2004). 이어서, 30-bp 중첩 영역과 함께 깁슨(Gibson) 조립 (Gibson et al., Nat. Methods 6:343-345, 2009)을 사용하여 벡터 골격 내로 상기 PCR 생성물을 삽입하였다. 범용 골격 프라이머를 사용하여 벡터 골격을 PCR 증폭시키고, 조립 이전에 DpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인크.(New England Biolabs, Inc.))를 사용하여 분해하였다. T7 기반 발현 플라스미드 pET15b, pCOLADuet, 및 pACYCDuet (EMD 밀리포어(EMD Millipore))로부터 골격을 생성하였다. pET15b, pCOLADuet, 및 pACYCDuet 플라스미드 모두 구성적으로 발현된 lacI 유전자, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 종결 쌍, 및 하기의 각각의 저항성 마커/복제 기점: 암피실린/ColE1, 카나마이신/ColA, 및 클로람페니콜/P15A를 함유하였다. 본원에서 제시된 모든 트리거 RNA는 pET15b 골격을 사용하여 발현시켰고, 스위치 mRNA는 pCOLADuet 또는 pACYCDuet 골격을 사용하여 발현시켰다. 골격에 대한 역방향 프라이머는 T7 프로모터의 상류 영역에 결합하도록 디자인하였다. 트리거 골격에 대한 정방향 프라이머는 T7 프로모터의 시작점으로부터 증폭되었다. 스위치 골격에 대한 정방향 프라이머는 GFPmut3b-ASV 또는 mCherry의 5' 단부를 프라이밍 오프하고, 깁슨 조립을 위한 링커를 함유하는 30-nt 서열을 부가하도록 디자인하였다. DH5α 내부에서 구축물을 클로닝하고, 서열분석하여 확실히 모든 토홀드 스위치 성분이 올바르게 합성되도록 하였다. 확립된 화학적 형질전환 프로토콜을 사용하여 모든 형질전환을 수행하였다 (Inoue et al., Gene, 96:23-28, 1990).
유동 세포측정법 측정결과 및 분석. 고처리량 샘플러가 장착된 BD LSR포르테사(BD LSRFortessa) 세포 분석기를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하였다. 488 nm 여기 레이저 및 530/30 nm 필터를 사용하여 GFP 형광 강도를 측정하였다. 561 nm 레이저 및 610/20 nm 방출 필터를 사용하여 mCherry 형광 강도를 측정하였다. 전형적인 실험에서, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 내로 ~65배만큼 희석시키고, 96웰 플레이트로부터 샘플링하였다. 트리거에 대해 전방 산란 (FSC)을 사용하고, ~30,000개의 개별 세포를 분석하였다.
3개 이상의 생물학적 복제물로부터의 측정에 대한 표준 편차로부터 온 상태 및 오프 상태에서의 세포의 형광 측정에 대한 오차 수준을 계산하였다. 이어서, 구적법으로 온 및 오프 상태의 형광에 대한 상대 오차를 가산함으로써 온/오프 형광 비에 대한 상대적인 오차 수준을 측정하였다. 생체내 시스템 크로스토크 측정을 위해, 유동 세포측정법을 사용하여 676개의 형질전환된 세포 균주 각각의 단일 콜로니를 측정하였다. 상기 균주에 대한 GFP 출력에 있어서 콜로니-대-콜로니의 편차를 예측하기 위하여, 본 발명자들은 무작위로 선택된 18개의 형질전환체로 이루어진 서브세트를 측정하고, 그를 6회에 걸쳐 중복 측정하였다. 이들 측정에 대한 상대 불확도는 평균적으로 12%였으며, 이는 라이브러리 성분의 온/오프 형광 비를 측정하는데 사용된 유동 세포측정법 실험에 대해 수득된 불확도와 유사한 것이었다.
콜로니 형광 영상화. 타이푼(Typhoon) FLA 9000 생체 분자 영상화 시스템을 사용하여 이. 콜라이 콜로니로부터 형광 영상을 수득하였다. 모든 영상은 같은 PMT 전압, 0.1 mm의 영상화 해상도, 473 nm 레이저 여기, 및 GFP 검출용 LPB (>510 nm 길이의 통로) 필터를 사용하여 수득하였다. 유도된 세포를 플레이팅 후 ~18시간째에 영상화하였다. IPTG는 GFP와 동일한 채널에서는 낮은 수준의 형광을 나타내기 때문에, 플레이트 중 LB/한천의 두께의 편차가 배경 형광 수준의 편차를 초래한다. 이러한 효과를 보상하기 위해, 전체 플레이트의 강도 수준으로부터 각 플레이트 상에서 측정된 최소 GFP 강도를 감산하여 대부분의 배경 IPTG 형광을 삭제하였다.
결과
본원에서는 단백질 번역의 전사 후 활성화를 수행할 수 있는 새로운 리보조절인자 시스템을 제공한다. 종래 리보조절인자와 달리, 본 발명의 합성 리보조절인자는 토홀드-매개 선형-선형 상호작용을 이용하여 RNA-RNA 가닥 치환 상호작용을 개시한다. 추가로, 상기 리보조절인자는 단백질 번역을 억제시키기 위해 출발 코돈 주변의 영역을 격리시키는 것에 의존하며, 이로써 임의의 염기쌍 형성은 RBS 또는 출발 코돈 그 자체를 피하여 이루어지고, 번역은 좌절된다. 그 결과, 이러한 리보조절인자는 가상의 임의 서열을 포함하는 트리거 RNA에 대한 반응으로 단백질 번역을 활성화시키도록 디자인될 수 있고, 이는 성분 직교성을 상당 수준 개선시킬 수 있다. 또한, RBS에의 결합 부재 및 열역학적으로 바람직한 선형-선형 상호작용의 사용으로 RBS 조작을 통해 번역 효율을 쉽게 조정할 수 있다. 결과적으로, 이러한 시스템을 통해서는 통상 단백질 발현을 100배(two orders of magnitude) 초과로 조절할 수 있다. 그의 상호작용 메카니즘 근-디지털 신호 프로세싱 거동에 기초하여, 본원에서 이러한 리보조절인자 시스템은 토홀드 스위치로 지칭된다.
본 개시내용은 이. 콜라이 중 수십 개의 번역 활성인자가 지정된 트리거 RNA에 대한 반응으로 단백질 제조를 100배 초과만큼 증가시킨다는 것을 입증함으로써 토홀드 스위치의 유용성을 추가로 입증한다. 추가로, 본 발명자들은 전체 세트 간에 12% 미만의 크로스토크를 보이는 26개의 시스템으로 이루어진 한 세트를 비롯한, 전례없는 일부 직교성을 가진 성분으로 이루어진 라이브러리로서, 크기가 모든 이전 직교 조절인자 라이브러리의 3배 넘게 초과하는 것인 라이브러리를 구축하기 위해 신규한 리보조절인자 디자인에 의해 제공받은 연장된 RNA 서열 공간을 이용하였다. 토홀드 스위치의 서열 및 열역학적 분석을 통해 새 리보조절인자를 정방향으로 조작하는데 사용될 수 있는 디자인 요소로 이루어진 한 세트를 수득할 수 있었다. 이러한 정방향 조작된 부분은 평균적으로, 전형적으로 순수하게 합리적인 디자인 골격으로부터 구축된 성분을 이용한 단백질 기반 유전적 네트워크에 대해 보유되는 역학적 범위인 400을 초과하는 온/오프 비를 보였다.
토홀드 스위치 디자인. 토홀드 스위치 시스템은 스위치 및 트리거로 지칭되는 2개의 프로그램화된 RNA 가닥으로 구성된다 (도 17b). 스위치 mRNA는 조절되는 유전자의 코딩 서열을 함유한다. 이러한 코딩 서열 상류에 강력한 리보솜 결합 부위 및 출발 코돈 둘 모두를 함유하는 헤어핀 기반 프로세싱 모듈, 이어서 관심 유전자의 N-말단에 부가된 아미노산을 코딩하는 짧은 링커 서열이 이어진다. 헤어핀 모듈의 5' 단부에 있는 단일 가닥 토홀드 서열이 트리거 RNA 가닥에 대한 초기 결합 부위를 제공한다. 이러한 트리거 분자는 RBS 및 개시 코돈을 노출시키는 헤어핀과 함께 분지 이동 프로세스를 완료하여 관심의 유전자의 번역을 활성화시키는 단일 가닥 RNA이다.
헤어핀 프로세싱 단위는 트리거 가닥의 존재하에서는 번역의 억제인자로서의 기능을 한다. 이전 리보조절인자와 달리, RBS 서열은 헤어핀의 11-nt 루프 내에 완전히 쌍을 이루진 않은 상태 그대로 남겨진다. 대신, 개시 코돈 바로 앞뒤의 염기는 각각 길이가 6 및 9개의 염기쌍인 RNA 이중체 내에서 격리되어 있다. 출발 코돈 그 자체는 본 발명자들이 시험하는 위치에서 쌍을 이루진 않은 상태 그대로 남겨져 있고, 이로써 18-nt 헤어핀 줄기의 거의 중간 지점이 되는 부분에 3-nt 벌지로 남게 된다. 억제 도메인 b (도 17b)는 출발 코돈에 대한 상보적 염기를 포함하지 않고, 결국 동족 트리거 가닥은 상응하는 출발 코돈 염기를 함유할 필요 없으며, 이로써 잠재적 트리거 서열의 개수는 증가하게 된다. 종결 코돈은 리보조절인자가 활성화되었을 때, 관심 유전자의 번역을 조기에 종결시킬 수 있는 바, 출발 코돈 뒤에 부가된 헤어핀 서열의 서열은 또한 종결 코돈의 존재에 대해 스크리닝될 수 있다. 억제된 토홀드 스위치 mRNA로부터의 GFP 발현에 관한 연구를 통해 전형적인 억제 수준은 억제되지 않은 GFP mRNA와 비교하여 98% 이상인 것으로 밝혀졌다. 이러한 디자인을 사용하였을 때의 성공적인 번역 억제를 확인한 후, 본 발명자들은 헤어핀의 5' 단부에 12-nt 토홀드 도메인을 사용하여 동족 트리거 가닥과 그의 상호작용을 개시시켰다. 트리거 가닥은 스위치 mRNA 중 조기 염기에 완벽하게 상보적인 30-nt 단일 가닥 RNA 서열을 보유한다.
이러한 염기 토홀드 스위치 디자인으로부터, 본 발명자들은 NUPACK 핵산 서열 디자인 패키지 (Zadeh et al., J. Comput. Chem. 32:170-173, 2011)를 사용하여 번역 활성인자의 라이브러리를 생성하였다. 일반 21-nt 서열을 사용하여 스위치 mRNA의 헤어핀 모듈을 관심 유전자의 코딩 서열에 연결시켰다. 이러한 링커 서열은 그가 관심 유전자, 이 경우에서는 GFP 리포터인 것으로 선택되는 관심 유전자의 폴딩에 미치는 영향을 최소화하기 위해 저분자량 아미노산을 코딩하는 것으로 프로그램화하였다. 계산상 부하를 감소시키기 위해, 오직 GFP의 처음 29-nt만을 2차 구조 분석을 위한 것으로 간주하였다. 그러나, 디자인 프로세스 동안 완전한 트리거 전사체를 시뮬레이션하였다. 이러한 전사체는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터로부터의 효율적인 전사를 촉진시키는 GGG 리더 서열, RNA 안정성을 증가시키는 5' 헤어핀 도메인, 및 전사체의 3' 단부에 47-nt T7 RNA 폴리머라제 종결인자를 포함하였다. NUPACK을 사용하여 지정된 2차 구조를 충족시키고, 명시된 RBS 및 종결인자 서열을 가지는 토홀드 스위치 디자인을 생성하였다. 디자인 중 명시되지 않은 염기는 무작위적인 것이며, 이로써 4개의 RNA 염기 중 임의의 것이 될 수 있었으며, 여기서 같은 염기의 연장 실행을 막기 위해 일부 서열 제약이 NUPACK에 적용되었다. 본 발명자들은 생체내 성능을 측정하기 위해 먼저 24개의 토홀드 스위치로 이루어진 한 세트를 디자인하고, 방법 섹션에 기술되어 있는 바와 같이 그를 구축하였다. 다수의 이들 스위치가 고도한 역학적 범위를 보였다는 것을 확인한 후, 본 발명자들은 라이브러리 중 남은 것을 이용하여 크로스토크가 낮은 것으로 선택된 요소를 함유하는 토홀드 스위치로 이루어진 확장된 라이브러리를 디자인하기 시작하였다.
이러한 라이브러리를 생성하기 위해, NUPACK을 사용하여 무작위화된 서열을 포함하는 총 672개의 토홀드 스위치 디자인을 생성하였다. 생성된 디자인 중 25개가 출발 코돈 뒤의, 헤어핀 영역 중의 종결 코돈을 코딩하는 것으로 나타났다. 남은 시스템에서, 하나의 이중 디자인을 발견하게 되었고, 이로써 라이브러리 중에는 646개의 유일의 리보조절인자 디자인이 남게 되었다.
이어서, 본 발명자들은 이. 콜라이에서의 실험을 위해 의도하지 않은 리보조절인자-트리거 크로스토크를 가장 낮은 수준으로 보인, 상기 토홀드 스위치 디자인 중 144개로 이루어진 서브세트를 선택하였다. 인실리코 크로스토크 스크리닝은 2가지 목적에 도움이 되었다. 첫째, 직교 조절인자의 생성된 라이브러리는 큰 성분 세트를 제공하여 생체내에서 번역을 독립적으로 조절할 수 있다. 둘째, 직교성에 대해 스크리닝된 시스템은 필연적으로 가능한 토홀드 스위치의 서열 공간의 대부분을 포괄하며, 추후 시스템 디자인에 정보를 제공할 것이다. 본 발명자들은 417,316개의 RNA-RNA 상호작용에 상응하는 646개의 완전한 세트에 대한 리보조절인자와 트리거 가닥 사이의 쌍별 상호작용을 시뮬레이션하였다. 이러한 시뮬레이션을 통해 임의의 생성된 리보조절인자-트리거 복합체의 농도 및 그의 2차 구조를 측정하였다. 출발 코돈 인근의 이중체 영역의 파괴로 관심 유전자의 번역이 일어날 수 있기 때문에, 상기 리보조절인자-트리거 복합체 중 토홀드 스위치 줄기의 완전성을 사용하여 의도하지 않은 트리거 활성화의 가능도를 측정하였다. 이러한 줄기 완전성 메트릭을 통해 본 발명자들은 몬테 카를로(Monte Carlo) 알고리즘을 사용하여 순 시스템 크로스토크가 최저인 것으로 예측되는 144개의 토홀드 스위치 디자인을 선택하였다. 이 결과, 같은 2차 구조 제약을 받는 무작위 서열을 포함하는 168개의 상이한 성분으로 구성된 토홀드 스위치 라이브러리를 얻었다.
성분 입증. 토홀드 스위치를 중간 카피의 플라스미드 (ColA 기점)로부터 발현된 스위치 mRNA 및 고 카피의 플라스미드 (ColE1 기점)로부터 발현된 트리거 RNA를 포함하는 이. 콜라이 BL21 스타 DE3에서 시험하였다. IPTG를 사용하여 두 가닥 모두의 발현을 유도하고, 이로써 T7 RNA 폴리머라제를 통해 두 RNA 종 모두의 제조가 유발되었다. 스위치 성능을 정량적으로 평가할 수 있도록 하기 위해, 본 발명자들은 형광 리포터로서, 반감기가 110 min인 것으로 보고되어 있는 (Andersen et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2240-2246, 1998) ASV-태그부착된 GFPmut3b를 사용하였다. 각 플라스미드로부터 따로따로 발현된 GFPmut3b-ASV의 형광 측정에 의해 측정된 바, 본 실험 조건에서, 스위치 및 트리거 RNA를 발현하는 프라스미드의 카피수의 차이가 스위치 분자와 비교하여 트리거를 6-8배 과량으로 만들었다.
유동 세포측정법을 사용하여 토홀드 스위치의 성능에 대해 특징을 규명하였다. IPTG로 유도한 후 1시간 간격으로 세포를 측정하였다. 온 형광은 리보조절인자 및 그의 동족 트리거로 형질전환된 세포에 대해 측정한 반면, 오프 형광은 리보조절인자 및 무작위로 선택된 비-동족 트리거를 함유하는 세포로부터 측정하였다. 활성화된 토홀드 스위치 및 억제된 토홀드 스위치 둘 모두로부터 얻은 형광 히스토그램은 거의 전적으로 단일 모드였고, 이는 세포 디지털 논리에서 그의 잠재적인 사용을 강조한다 (데이터는 나타내지 않음). 히스토그램으로부터의 모드 형광 값을 사용하여 각 리보조절인자 디자인의 온/오프 비를 계산하였다. 도 17c는 3개의 토홀드 스위치 (2, 3 및 5번)가 온 및 오프 상태일 때 그로부터 측정된 모드 GFP 형광을 보여주는 것이다 (오직 스위치만 단독인 것은 첫번째 막대이고, 스위치 및 트리거인 것은 두번째 막대이고, 양성 대조군은 세번째 막대이다). 비교를 위해, GFP 리포터에 대해 같은 서열을 함유하는, 억제되지 않은 버전의 각 스위치 mRNA 또한 양성 대조군으로서 평가하였다. 스위치의 오프 상태 형광은 GFP를 발현하지 않는 유도된 세포에 대해 측정된 배경 형광 수준에 가까웠다. 활성화된 토홀드 스위치에 대한 온 상태 형광은 양성 대조군과 유사하였으며, 이는 거의 모든 스위치 mRNA가 그의 트리거 RNA와 결합되었음을 나타낸다.
유도 후 1시간 이내에 시스템의 활성화가 관찰되었고, 이는 시간이 경과함에 따라 GFP 축적에 따라 증가하였다 (도 17d, 삽도). 도 17d는 무작위 서열 라이브러리 중 168개의 모든 스위치에 대해, 유도 후 3시간째에 측정된 온/오프 모드 GFP 형광 비를 보여주는 것이다. 시험된 시스템 중 20개는 100을 초과하는 온/오프 비를 보였고, 거의 ⅔에 가까운 시스템은 적어도 10 초과의 온/오프를 보였다. 비교시, 본 발명자들은 또한 (문헌 [Isaacs et al., Nat. Biotechnol. 22:841-847, 2004]에 기술된) 널리 사용되는 조작된 리보조절인자 crRNA 10 및 12를 동일한 조건에서 특징규명하였다. 이들 기존 리보조절 시스템은 유의적으로 더 낮은 역학적 범위를 보였으며, crRNA 시스템 10 및 12에 대한 온/오프 값은 각각 11 ± 2 및 13 ± 4였다.
토홀드 스위치 직교성 평가. 번역 활성인자의 직교성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 144개의 직교 성분 라이브러리로부터 상위 35개의 리보조절인자를 선택하고, 추가의 인실리코 스크리닝을 수행하여 줄기 완전성 및 비-동족 트리거와 스위치 가닥 사이의 원치 않는 결합, 이 두가지 면 모두에서 극도로 낮은 수준의 크로스토크를 보인 26개로 이루어진 서브세트를 분리시켰다. 이어서, 리보조절인자와 트리거 플라스미드의 676개의 모든 조합으로 세포를 형질전환시킴으로써 26개의 리보조절인자 사이의 쌍별 상호작용을 검정하였다. 도 18a는 LB 플레이트 상에서 유도된 이. 콜라이 콜로니로부터의 GFP 형광 영상을 보여주는 것이다. 직교 스위치 세트를 도 17d에서 측정된 온/오프 형광 비를 감소하는 순서로 제시하였다. 그리드의 대각선을 따라 동족 스위치와 트리거의 쌍으로부터의 강력한 방출이 뚜렷이 보였으며, 인덱스 26의 최종 스위치는 그의 낮은 온/오프 비의 결과로서 더 낮은 형광을 보였다. 대조적으로, 낮은 형광 수준은 비-동족 트리거/스위치 RNA 쌍을 특징으로 하는 대각선 밖의 요소에 대해 관찰되었다.
정량적 정보를 획득하기 위해, 본 발명자들은 유동 세포측정법을 사용하여 모든 쌍별 트리거-스위치 상호작용으로부터의 GFP 출력을 측정하였다. 비-동족 트리거 및 주어진 스위치 mRNA로부터 수득된 GFP 형광을 그의 유발된 상태에서의 스위치의 형광으로 나눔으로써 크로스토크를 계산하였다. 크로스토크 상호작용에 대핸 생성된 매트릭스는 도 18b에 제시되어 있다. 정의상, 대각선을 따른 크로스토크 수준은 100%이며, 대각선 밖의 크로스토크 수준은 콜로니 영상으로부터의 정량적 출력 수준과 일치한다. 상기 데이터에 기초하여, 토홀드 스위치는 전례없는 정도의 직교성을 보였고, 시험된 26개의 조절인자로 된 전체 세트는 12% 미만의 크로스토크를 보였다. 직교 세트 중 조절인자의 개수가 그의 임계 크로스토크 수준에 의해 정의되는 바, 본 발명자들은 다양한 다른 크로스토크 임계에 대한 직교 서스세트를 확인하였다. 예를 들어, 18개의 토홀드 스위치로 이루어진 서브세트는 서브서트 전 범위에 걸쳐 2% 미만의 크로스토크를 보였다.
주어진 적용을 위해 토홀드 스위치를 선택할 때, 그의 성능을 평가하는데 있어 잠재적으로 더욱 큰 관련성을 가지는 메트릭은 임계 크로스토크 수준의 역수이다. 번역 활성인자의 경우, 이러한 파라미터는 본 발명자들의 GFPmut3b-ASV 리포터와 유사한 출력을 특징을 가지는 단백질을 조절하기 위해 스위치 세트를 사용할 때 그 사이에 예상되는 최소 변화 배수를 나타낸다. 도 18c는 토홀드 스위치에 대한 최대 직교 서브세트 크기 뿐만 아니라, 다수의 다른 RNA 기반 조절인자에 대하여 상기 라이브러리 역학적 범위 메트릭을 플롯팅한 것이다. 앞서 보고된 것 중 가장 큰 직교 리보조절인자 세트는 20% 크로스토크를 보이는 7개의 전사 감쇠인자로 구성되었다 (Takahashi et al., Nucleic Acids Res., 2013). 상기 라이브러리의 경우, 20% 크로스토크를 통해 그의 전반적인 역학적 범위에서 5인 상계를 얻었다 (도 18c). 종래 직교 번역 활성인자 및 억제인자는 20% 크로스토크에서 각각 4개 (Callura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 5850-5855, 2012) 및 5개 (Mutalik et al., Nat. Chem. Biol. 8: 447-454, 2012)로 이루어진 세트로 한정되었었다. 단백질의 경우, 5개의 직교 진핵 전사 인자 크로스토크가 ~30%인 조작된 라이브러리 또한 보고되었다 (Khalil et al., Cell 150:647-658, 2012). 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 본원에서 제공된 스위치는 지금까지 보고되었던, RNA 또는 단백질 기반의 직교 조절성 요소로 이루어진 세트 중 가장 큰 것을 구성한다. 추가로, 앞서 보고된 라이브러리와 크기가 유사한 직교 토홀드 스위치의 서브세트는 앞서 보고된 시스템보다 10배(an order of magnitude) 초과로 더 큰 최소 역학적 범위를 보인다.
성분 분석 및 정방향 조작. 토홀드 스위치로부터의 유동 세포측정법 데이터는 리보조절인자 성능에 있어서 서열-의존성 편차를 측정하는데 이용되는 실질적인 데이터세트를 제공하였다. 서열-의존성 효과에 대한 거친 스크린으로서, 본 발명자들은 리보조절인자 가닥 줄기의 상위 및 하위에 있는 염기쌍 형성의 함수로서 토홀드 스위치 출력을 조사하기 시작하였다 (도 19a). 본 발명자들은 출발 코돈을 격리시키는 것이 필수적인 바, 상기 영역내 염기쌍 형성 강도가 헤어핀의 억제 강도에 강력한 영향을 미칠 수 있고, 이는 일단 리보조절인자가 활성화되고 나면, RBS 및 mRNA 영역의 2차 구조에도 영향을 미칠 수 있으며, 결국에는 번역 효율에 영향을 준다는 가설을 세웠다 (Kudla et al., Science 324:255-258, 2009). 헤어핀 모듈에서 상위 및 하위 3개의 염기쌍 분석을 통해 이들 영역내 G-C 염기쌍 함류의 함수로서 리보조절인자의 온/오프 비의 유의적인 편차가 밝혀졌다. 도 19b는 두 줄기 영액내 G-C 함량에 관한 16개의 가능한 모든 순열에 대해 수득된 평균 온/오프 형광 뿐만 아니라, 명시된 G-C 조건을 충족시킨 각 토홀드 스위치에 대해 수득된 온/오프 값을 보여주는 것이다. 라이브러리의 크기 및 인실리코 디자인 동안 부과된 2차 구조 제약에 기초하여, 다수의 G-C 순열은 단 하나 또는 2개의 대표적인 토홀드 스위치만을 가졌다. 줄기의 상위 및 하위 영역에 각각 0 및 2개의 G-C 염기쌍을 함유하는 토홀드 스위치는 그 다음 최고 순열보다 3배 초과로 더 높은, 154인 평균 온/오프 형광 비를 보였다. 평균 온/오프 수준은 또한 G-C 조합이 상기 조합으로부터 추가로 벗어남에 따라 계속해서 꾸준히 감소되는 경향을 보였다.
리보조절인자 줄기 상위에서 G-C 함량이 낮은 쪽으로 편향되어있다는 점은 활성화된 리보조절인자-트리거 복합체에서 인근의 RNA 이중체와 결합된 리보솜 사이의 잠재적인 상호작용을 시사하였다. 특히, RNA 이중체 단부의 약한 염기쌍 형성은 이중체를 개방형인 상태로 나타낼 수 있으며, RBS 상류의 염기를 자발적으로 유리시켜 리보솜 결합을 촉진시킬 수 있다. 이러한 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 RBS 서열의 출발점과 RNA 이중체 사이의 뉴클레오티드로서 정의되는 프리-RBS 영역 (도 19a)의 크기를 조정하기 위해 헤어핀 루프 크기가 다른 일련의 리보조절인자를 연구하였다. A가 풍부한 서열 부가를 통해 프리-RBS 영역의 크기를 3-nt에서 19-nt로 증가시킴에 따라, 루프 변이체 리보조절인자 측정 결과, 온 상태 형광 출력이 꾸준히 계속해서 증가한 것으로 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음). 특히, 프리-RBS 서열의 길이가 13-nt가 되어 루프가 21-nt가 될 때까지는 상기와 같은 온 상태 발현 증가가 상응하는 시스템 오프 상태 증가를 일으키지는 않았다. 이러한 관찰 결과는 RBS 바로 앞인 상류에 배치된 A/U 염기를 통해 번역이 증강되었다는 것을 입증한 이전 연구와 일치하는 것이다 (Vimberg et al., BMC Mol. Biol. 8:1-13, 2007). 추가로, 그의 헤어핀 루프의 길이를 증가시킴으로써 토홀드 스위치 역학적 범위를 증가시키는 간단한 수단도 제공하였다. 트리거 RNA 길이의 함수로서 토홀드 스위치 거동에 관한 체계적인 연구 또한 수행하였다. 본 연구를 통해 시스템 온/오프 비와 토홀드 도메인 길이 사이에는 강력한 양의 상관관계가 있다는 것이 밝혀졌고 (데이터는 나타내지 않음), 스위치의 줄기를 단지 부분적으로만 언와인딩시킴으로써 스위치 출력을 증가시킬 수 있다는 것이 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음).
이전 리보조절인자는 사례별로 그에 기초하여 디자인되었고 (Isaacs et al., Nat. Biotechnol. 22:841-847, 2004; 및 Callura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:5850-5855, 2012), 컴퓨터 지원 디자인을 이용한 것은 일관되게 높은 온/오프 수준을 입증하지 못했다 (Rodrigo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:15271-15276, 2012). 생체내에서 고성능을 나타내도록 정방향 조작된 인실리코 디자인된 리보조절인자는 새 유전적 회로를 생성하는데 소요되는 시간을 유의적으로 단축시킬 수 있는 잠재능을 가지는 바, 이에 최종적으로는 더욱 복잡한 세포 논리를 실현시킬 수 있다. 결과적으로, 본 발명자들은 고도한 역학적 범위를 위해 정방향 조작된 토홀드 스위치 세트를 위한 디자인으로 상기 연구 결과들을 통합시켰다. 본 발명자들의 정방향 조작된 시스템은 168개의 토홀드 스위치로 이루어진 라이브러리의 동일한 일반 2차 구조 및 상호작용 메카니즘을 유지하지만, 그의 역학적 범위를 유의적으로 개선시키기 위해 상기 기술된 수개의 식견 내용을 채용한다. 첫번째로, 본 발명자들은 도 19b에서 밝혀진 스위치 mRNA 서열 제약의 조합을 도입하였다. 구체적으로, 헤어핀 줄기의 상위 3개의 염기는 약한 A-U 염기쌍으로 제한되었다. 줄기의 하위 3개의 염기쌍은 2개의 강력한 G-C 염기쌍 및 1개의 A-U 염기쌍을 함유하는 것으로 명시되었다. 두번째로, 본 발명자들은 스위치 토홀드의 길이를 12-nt에서 15-nt로 증가시켰다. 이러한 변화는 트리거와 스위치 사이의 초기 결합을 강화시켰다. 세번째로, 본 발명자들은 헤어핀 루프의 크기를 11-nt에서 15-nt로 증가시켜 스위치 활성화시 출력 단백질의 번역을 증강시켰다. 본 발명자들은 그가 오프 상태일 때 시스템으로부터의 누설이 확실히 낮은 상태 그대로 유지될 수 있도록 하기 위해 15-nt의 매우 보존적인 루프 크기를 선택하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 스위치 줄기에서 18개의 염기 중 처음 15개의 염기만을 언와인딩하는 동족 트리거를 이용하였다. 이러한 디자인 변화를 통해 다수의 이익을 얻었다. 이를 통해 트리거 RNA는 모두가 A 및 U 염기인 것으로 명시된, 헤어핀 줄기내 상위 3개의 염기에의 결합을 피할 수 있게 되었고, 이로써 트리거에 대해 상응하는 서열 제약을 제거할 수 있었으며, 그의 길이는 변함없이 30-nt로 그대로 유지될 수 있었다. 추가로, 줄기의 상위 3개의 약한 염기쌍 파괴를 피함으로써 줄기내 더 아래에 있는 염기가 언와인딩된 후에도 자발적으로 개방형인 상태로 나타낼 수 있었다. 이러한 디자인 변화는 부수적으로 오프 상태 누설을 증가시키지 않으면서 3-nt A/U 인핸서 요소를 부가함으로써 프리-RBS 영역의 크기를 효과적으로 증가시켰다.
본 발명자들은 상기 상세하게 설명된 바와 같이 4개의 시스템 변형을 포함하는 13개의 정방향 조작된 토홀드 스위치를 디자인하는데 NUPACK을 사용하였다. 도 19c에는 유도 3시간 후 GFP를 조절하는 정방향 조작된 번역 활성인자에 대한 온/오프 모드 형광 비가 제시되어 있다. 시험된 거의 모든 시스템의 경우, 온/오프 형광이 현저히 증가하였으며, 13개 중 12개가 초기 라이브러리로부터의 토홀드 스위치의 최고 성능과 유사하거나, 또는 그보다 높은 역학적 범위를 보였다. 이러한 정방향 조작된 시스템은 초기 토홀드 스위치 디자인의 경우 43인 것과 비교하여 평균 온/오프 비가 406인 것으로 나타났다. 이는 온/오프 비가, 고도로 프로그램가능 시스템 디자인을 사용하고, 어떤 진화 또는 대규모 스크리닝 실험도 필요로 하지 않는 단백질 기반 조절 시스템의 역학적 범위에 필적한다는 것을 의미한다. 추가로, 심지어 성능이 가장 낮은 최적화된 토홀드 스위치 조차도 33 ± 4인 온/오프 비를 보였으며, 이는 여전히 다수의 세포 의사 결정 논리에 충분하다. 시간 경과에 따라 매 시간마다 측정한 결과, 유도 1 또는 2시간 후, 정방향 조작된 스위치의 활성화가 나타났다 (도 19c, 삽도). 추가로, 온 상태 형광은 4시간에 걸쳐 꾸준하게 증가하였으며, 이로써 두 스위치 모두에 대해 600을 초과하는 우수한 온/오프 수준을 얻었다.
본 발명자들은 온/오프 비가 주어진 최소 수준을 초과하는 정방향 조작된 디자인의 백분율을 계산하고, 무작위 서열을 포함하는 168개의 토홀드 스위치로 이루어진 라이브러리에 대해 동일한 수행된 계산으로부터 얻은 값을 비교함으로써 본 발명자들의 정방향 조작 전략법의 효과를 정량화하였다 (도 19d). 고성능 스위치의 수율이 시험된 모든 온/오프 비에 있어서 정방향 조작된 스위치에 대한 것보다 높았다. 예를 들어, 168개의 무작위 서열 라이브러리 중 단일 스위치와 비교하여 정방향 조작된 디자인 중 92%의 온/오프 GFP 형광이 287 이상이었다.
시스템 성능에 대한 열역학적 분석. 본 발명자들의 정방향 조작을 통해 높은 역학적 범위의 가능도가 92%인 리보조절인자를 수득하였다. 리보조절인자 활성의 예측 모델을 개발하기 위해, 6개의 상이한 카테고리로 나뉘는 다수의 열역학적 파라미터에 관하여 무작위 서열을 포함하는 168개의 초기 스위치의 온/오프 비를 분석하였다 (도 20a). 형광 오프 상태는 라이브러리에 걸쳐 상대적으로 거의 변함이 없고, 온/오프 비가 그대로 본질적으로 온 상태 형광의 척도가 되는 바, 단독의 온 및 오프 상태에서의 형광 출력이 아닌 온/오프 비를 정량 분석을 위해 사용하였다. 문헌 (Salis et al., Nat. Biotechnol. 27: 946-950, 2009)에 의한 처리를 수행한 후, 발현된 단백질 p의 양을 방정식 p ∝ exp(-kΔG) (여기서, k는 피팅 파라미터임)에 따라 열역학적 자유 에너지와 연관시킬 수 있다. 결과적으로, 열역학적 파라미터와 리보조절인자 온/오프 값 사이의 관계는 자유 에너지 대 온/오프 비의 반-로그 플롯에 적용되는 선형 회귀의 결정 계수 R2에 의해 평가할 수 있다. 그러나, 각각의 열역학적 파라미터는 전체 성분 라이브러리에 적용되었을 때에는 리보조절인자 출력 특징과의 어떤 유의적인 상관관계도 입증하지 못했다.
도 19b에서 관찰된 서열-의존성 효과에 기초하여, 본 발명자들은 유사한 서열 특징을 공유하는 토홀드 스위치의 서브세트와 열역학적 파라미터 사이의 관계에 대하여 조사하기 시작하였다 (도 20a, 데이터는 나타내지 않음). 다수의 스위치 서브세트에 대한 R2 값을 프로빙함으로써 본 발명자들은 시스템 출력과 명백한 상관관계를 보인 단일 파라미터 ΔGRBS-링커를 확인하였다. ΔGRBS-링커는 리보조절인자-트리거의 RNA 이중체 바로 뒤인 하류에서 시작하여 헤어핀 모듈 뒤에 부가된 일반 21-nt 링커 단부까지로 전개되는 영역의 2차 구조와 관련된 자유 에너지이다 (도 20b). 리보솜이 출력 유전자에 결합하여 그의 번역을 시작하기 때문에, 상기 에너지는 리보솜이 RBS/조기-mRNA 영역을 언와인딩하는데 필요한 에너지 양을 반영한다. 번역 효율의 편차는 앞서 조기의 mRNA의 2차 구조와 연관되어진 바 있으며, 유사한 열역학적 인자가 원핵성 RBS의 강도를 계산하는데 사용되어 왔다 (Salis et al., Nat. Biotechnol. 27: 946-950, 2009). 도 20c는 각각이 그의 줄기 상부에 약한 A-U 염기쌍을 함유하는 68개의 리보조절인자로 이루어진 서브세트에 대한 온/오프 비와 ΔGRBS-링커 사이의 관계에 대한 예를 제공하는 것이다. ΔGRBS-링커와의 상관관계가 R2 ≥ 0.4인 것으로 확인된 라이브러리로부터의 상기 리보조절인자 세트가 가장 큰 것이었다. 대조적으로, 그의 줄기 상위에 강력한 GC 염기쌍을 함유하는 100개의 리보조절인자로 이루어진 상보적 서브세트는 R2 = 0.024로, ΔGRBS-링커와 어떤 상관관계도 보이지 않았으며, 이는 가능하게는 그의 예비 부위의 리보솜과의 서열 의존적 상호작용의 결과일 수 있다.
ΔGRBS-링커의 중요성을 확인함에 따라, 본 발명자들은 정방향 조작된 시스템으로부터의 온/오프 수준과 그의 관계에 대해 계속해서 조사하였다. 본 발명자들은 ΔGRBS-링커가 R2= 0.79로 온/오프 수준과 훨씬 더 강력한 상관관계를 보였다는 것을 발견하게 되었다 (도 20d). 가장 중요하게, 본 발명자들은 이러한 단일의 열역학적 용어가 단일의 낮은 성능의 정방향 조작된 토홀드 스위치를 설명하는데 충분하다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 특정 토홀드 스위치는 활성화된 스위치 mRNA의 번역 효율을 유의적으로 감소시킨 상대적으로 고도한 2차 구조를 RBS-링커 영역 내에 포함하였다.
다중화 조절. 토홀드 스위치의 직교성을 통해 세포 내에서 다중의 단백질을 동시에 독립적으로 조절할 수 있다. 이러한 능력을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 각각 A* 및 B*로 표시된, 스펙트럼상 뚜렷이 다른 형광 단백질 GFP 및 mCherry를 발현하는 2개의 직교 토홀드 스위치 mRNA를 발현하는 플라스미드로 세포를 형질전환시켰다 (도 21a). 이어서, 상기 토홀드 스위치의 동족 트리거 RNA를 모든 가능한 4개의 조합으로 발현시키고, 유동 세포측정법을 사용하여 리포터 발현을 정량화하였다 (도 21b). A 또는 B 트리거 중 어느 하나가 단독으로 전사되었을 때, GFP 및 mCherry 형광은 각각 10배 초과만큼 증가한 반면, 직교 채널에서 형광 수준은 실제로는 변함이 없었다. A 및 B 트리거 RNA 둘 모두가 공동으로 발현되었을 때에는 두 토홀드 스위치에 대해 예측된 바와 같이, 두 형광단의 발현이 강력하게 증가한 것으로 나타났다.
기능성 mRNA에 의해 유발된 토홀드 스위치. 토홀드 스위치 디자인에 의해 제공된 서열 공간을 통해 기능성 mRNA에 의해 토홀드 스위치 디자인을 유발시킬 수 있다 (도 21c). 그러나, 이들 mRNA 트리거의 고정 서열은 효과적인 시스템 활성화를 위해 유의적인 도전 과제를 제공한다. 완전한 단일 가닥으로 디자인된 합성 트리거 RNA와 달리, 강력한 2차 구조가 mRNA 내에 풍부하게 존재하는 바, 토홀드 결합은 좌절되고, 분지 이동 프로세스를 구동시키는 열역학적 성질은 감소하게 된다. 트리거 mRNA에 의해 정의되는 토홀드 서열은 또한 내부적으로 및 헤어핀 모듈 하류의 서열과 이루어지는 염기쌍 형성 둘 모두를 나타낼 수 있으며, 이로써 스위치 활성화와 유사한 도전 과제를 제기할 수 있다. 이러한 효과에 대응하기 위해, 본 발명자들은 mRNA 반응성 스위치의 토홀드 도메인 길이를 12-nt에서 ≥24-nt로 증가시켰다. 이러한 변형은 결합 개시를 위한 단일 가닥 영역의 중요성을 트리거 mRNA로부터, 스위치에서 오직 하류 서열만이 결합 영역과 혼성화할 수 있는 것인 토홀드 스위치 그 자체로 이동시키는데 도움을 주었다. 추가로, 본 발명자들은 168개의 시스템 라이브러리로부터 최고 성능을 보인 토홀드 스위치에 대한 상세한 연구 동안 확인된 다수의 디자인 특징을 이용하였다. 토홀드 스위치 1번은 그의 완전한 30-nt의 동족 트리거 RNA와 쌍을 형성하였을 때, 온/오프 비가 290 ± 20이었다. 본 발명자들은 온/오프 비가 그의 5' 단부로부터 말단절단된 단축 트리거 RNA를 사용함으로써 급격하게 증가하였다는 것을 발견하게 되었다. 특히, 본 발명자들은 토홀드 스위치 1번이 오직 그의 줄기의 하위 5개의 염기만을 언와인딩하도록 의도된 트리거 RNA에 대한 반응으로 1900 ± 200개의 온/오프 형광을 제공할 수 있다는 것으로 관찰하였다. 토홀드 스위치 1번 시스템의 2차 구조 및 열역학적 분석 결과, 그의 극단 역학적 범위는 2가지 인자에 기인하였다는 것으로 나타났다. 첫번째로, 스위치 1번의 줄기는 상대적으로 높은 비율로 약한 A-U 염기쌍을 함유하였고, 줄기내 G-C 염기쌍은 줄기 하위쪽으로 집중되어 있었다. 결과적으로, 트리거가 하위 5개의 염기쌍을 파괴시켰을 때, 줄기내 G-C 염기쌍 중 절반이 제거되었고, 리보솜 결합에 이용가능한 A-U 염기쌍을 주로 함유하는 약한 줄기가 남게 되었다. 추가로, 줄기에서 오직 하위 염기에만 결합하는 트리거는 활성화된 스위치의 프리-RBS 영역을 증가시켰고, 번역을 추가로 증강시켰다. 두번째로, 트리거 결합시 줄기로부터 유리된 염기는 스위치 링커 영역 중의 하류 염기와 상호작용하여 약한 줄기 루프를 형성하는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 리폴딩 메카니즘으로 줄기의 추가 염기는 파괴되었고, 이는 그의 억제 강도를 추가로 약화시켰고, 트리거 결합을 막는 에너지 장벽을 감소시켰다.
본 발명자들은 mRNA에 반응성인 토홀드 스위치를 생성하기 위해 상기 논의된 디자인 특징들 모두를 도입하였다. 토홀드 스위치 1번 서열로부터 스위치 헤어핀 모듈을 유도하였다. 구체적으로, 스위치 1번 줄기의 상위 12-염기 및 루프를 모든 mRNA 센서에서 사용하였다 (도 21c). 추가로, 센서 루프의 크기를 11-nt에서 18-nt로 증가시켜 리포터 발현을 증가시켰다. 센서 줄기의 토홀드 및 하위 6개의 염기쌍은 트리거 mRNA와 상호작용하도록 프로그램화된 가변성인 염기를 가졌다. 초기 mRNA 결합을 위해 24-nt 및 30-nt 토홀드를 사용하였고, 하위 6개의 염기쌍은 트리거에 의해 언와인딩되도록 지정하였다. 트리거 mRNA에 의한 줄기 언와인딩을 막는 에너지 장벽을 감소시키기 위해, 본 발명자들은 또한 상기 논의된 하류 RNA 리폴딩 메카니즘을 센서로 명확하게 코딩하였다. 이러한 RNA 리폴딩 요소는 스위치 줄기의 하위 4개의 염기쌍의 파괴 후, 6-bp 줄기 루프의 형성을 유도하였고, 결국 스위치 줄기내 추가 2개의 염기를 강제로 파괴시켰다. 상기 염기 토홀드 스위치 mRNA 센서 디자인을 사용하여, 본 발명자들은 전장의 트리거 mRNA를 따라 가능한 모든 센서의 2차 구조 및 열역학적 성질을 시뮬레이션하였다. 이어서, 본 발명자들은 인실리코 스크리닝을 사용하여 센서 2차 구조와 mRNA 결합 부위 이용가능성에 대해 최상의 조합을 제공하는 토홀드 스위치를 확인하였다.
생성된 mRNA 센서를 이전 실험과 동일한 방식으로 시험하였으며, 여기서 트리거 mRNA는 고 카피의 ColE1 기점 벡터로부터 발현되는 것이었고, GFP를 조절하는 토홀드 스위치는 중간 카피의 ColA 기점 벡터로부터 발현되는 것이었다. 본 발명자들은 내인성 RNA에 의한 스위치 활성화의 가능도를 최소화하기 위한 감지 실험을 위해서 외인성 mRNA 트리거인 mCherry, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (cat, 클로람페니콜 저항성 부여), 및 aadA (스펙티노마이신 저항성 부여)로 이루어진 트리오를 선택하였다. mCherry 트리거 RNA는 효율적으로 번역을 수행할 수 있는 RBS 영역을 특징으로 하는 반면, 리보솜에 의한 번역이 토홀드 스위치의 인식 및 결합을 방해할 수 있기 때문에, 두 항생제 저항성 부여 mRNA는 RBS를 포함하지 않았다. 도 21d는 5개의 토홀드 스위치로부터 측정된 온/오프 GFP 형광을 제시하는 것이다. 번역가능한 mCherry mRNA에 의해 유발된 3개의 센서는 가장 강력한 활성화를 제공하였으며, 디자인 A는 57 ± 10인 가장 우수한 온/오프 비를 보였다. 비-번역가능한 mRNA에 의해 유발된 토홀드 스위치는 훨씬 일반적인 ~7배 정도의 활성화 수준을 보였다.
토홀드 스위치 결합이 트리거 mRNA로부터의 번역에 미치는 효과를 확립하기 위하여, 본 발명자들은 또한 mCherry 센서의 존재 또는 부재하에서 mCherry 출력을 측정하는 실험을 수행하였다. 도 21e는 활성화된 세포로부터 측정된 mCherry 형광 이외에도, 그의 활성 상태 및 억제된 상태에서 3개의 mCherry-반응성 스위치에 대해 측정된 GFP 형광을 포함한다. 비교를 위해, 유도되지 않은 세포로부터 측정된 배경 GFP 형광 뿐만 아니라, 각각 ColA 및 ColE1 기점 벡터로부터의 GFP 및 mCherry의 비조절된 발현으로부터 측정된 형광을 보여주는 대조군 실험으로부터 수득된 형광 측정 결과 또한 제시되어 있다. mCherry의 발현은 토홀드 스위치 RNA 전사에 의해 강력한 영향을 받지 않았다. 비록 스위치와 비교하여 몰 과량의 트리거 RNA가 본 발명자들의 실험에서의 상기 효과의 강도를 약화시키기는 하지만, 상기 결과는 트리거와 스위치 사이의 결합이 리보솜에 의한 번역을 억제시키지 않는다는 것을 시사한다. 활성화된 스위치로부터의 GFP 발현 수준은 단지 2.5배 범위 내로 다양한 반면, 억제된 스위치로부터의 누설은 약 5배만큼 다양하였다. 누설에 있어 이러한 편차는 mCherry 센서의 온/오프 수준에 있어서의 편차를 설명하는 결정 인자가 되며, mRNA 센서에 대한 모 디자인으로서 고감도 모 토홀드 스위치를 사용하는 것에 기인한다.
논의
토홀드 스위치는 번역을 전사 후 수준으로 조절하기 위한, 다기능성이고 유력한 새 플랫폼을 나타낸다. 이는 널리 사용된 단백질 기반 조절성 요소 22와 유사한 시스템 역학적 범위와 전례없는 정도의 성분 직교성을 조합한 것이다. 생체내 스위치-트리거 쌍별 상호작용에 대한 종합 평가 결과, 크로스토크 수준이 12% 미만인 26개의 토홀드 스위치로 이루어진 세트를 얻었다. 본 발명자들이 아는 바에 따르면, 이는 지금까지 보고되었던, 직교 조절성 요소로 이루어진 라이브러리 중 가장 큰 것을 나타내고, 크기에 있어서 이전 라이브러리를 3배 넘게 초과한다 (Takahashi et al., Nucleic Acids Res., 2013). 이점에서, 토홀드 스위치로 이루어진 직교 세트의 궁극적 크기는 리보조절인자에 고유한 디자인 특징에 의해서가 아니라, 본 발명자들의 크로스토크 검정의 처리량에 의해 한정된다. 추가로, 13개의 토홀드 스위치 시스템의 정방향 조작으로, 406인 평균 온/오프 형광 비를 보이고, 두 파라미터 열역학적 모델에 의해 예측되는 완전 세트의 성능을 가진, 12개의 새로운 고성능 성분으로 이루어진 서브세트를 얻었다.
생체내의 번역 억제 및 RNA-RNA 상호작용 개시를 위해 새로운 메카니즘을 채용하는 것이 이러한 진보에 중요하였다. RBS 및 일부 경우에서는 출발 코돈에의 접근을 차단시킴으로써 억제시키는 이전 리보조절인자와 달리 (Isaacs et al., Nat. Biotechnol. 22:841-847, 2004; Rodrigo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:15271-15276, 2012; 및 Mutalik et al., Nat. Chem. Biol. 8:447-454, 2012), 토홀드 스위치는 RNA 이중체 내의 조절된 유전자의 개시 코돈 인근의 서열을 격리시킴으로써 그의 오프 상태로 번역을 강력하게 억제시킨다. 기존의 리보조절인자는 루프-선형 (Isaacs et al., Nat. Biotechnol. 22:841-847, 2004; 및 Mutalik et al., Nat. Chem. Biol. 8:447-454, 2012) 및 루프-루프 (Lucks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:8617-8622, 2011; Rodrigo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:15271-15276, 2012; 및 Takahashi et al., Nucleic Acids Res. 2013) 상호작용에 의존해온 반면, 토홀드 스위치는 리보조절인자 mRNA와 트리거 RNA 사이의 결합을 개시하기 위해 토홀드-매개 선형-선형 RNA 상호작용을 이용한다. 종합해 보면, 이러한 작동 메카니즘을 통해 토홀드 스위치는 인근의 임의 서열과 함께 트리거 RNA를 수용할 수 있으며, 동시에 직교 작동을 위해 서열 공간을 크게 확장시킬 수 있고, 길이가 12-nt 내지 15-nt인 연장된 토홀드 도메인을 사용함으로써 높은 반응 동역학적 성질로 RNA-RNA 상호작용을 촉진시킨다. 종래 보고와 대조적으로, 토홀드 스위치 성능의 열역학적 분석 결과, 리보조절인자 온/오프 수준과 리보조절인자-트리거 상호작용의 자유 에너지 사이의 유의적인 상관관계는 나타나지 않았고, 그와 토홀드-트리거 결합의 자유 에너지 사이의 유의적인 상관관계도 나타나지 않았다 (Mutalik et al., Nat. Chem. Biol. 8:447-454, 2012). 이러한 관찰 결과는 토홀드 스위치에 대한 RNA-RNA 상호작용이 열역학적으로 및 동역학적으로 강하게 바람직하다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 본 발명자들의 토홀드 스위치의 역학적 범위 증가는 3가지 주요 인자에 기인하는 것으로 간주하였다. 첫째, 트리거-스위치 상호작용을 구동시키는 동역학적 성질 및 열역학적 자유 에너지의 증가가 출력 생성물을 제조하도록 유발되는, 세포내 존재하는 전체 스위치 mRNA를 더 높은 비율로 증가시킨다. 본 발명자들은 억제되지 않은 버전의 스위치 mRNA와 비교 측정 결과에 기초하였을 때, 활성화된 스위치 mRNA의 분율이 약 100%였다는 것을 발견하였다 (도 17c). 둘째로, RBS 중 어떤 염기도 줄기 내에 둘러싸여 있지 않는, 토홀드 스위치의 디자인은 조절된 유전자를 최적으로 발현시키기 위해 RBS 및 그 주변의 염기를 조작할 수 있게 하는 더욱더 우수한 플랫폼을 제공한다. 토홀드 스위치 mRNA의 루프 크기를 달리한 실험을 통해 스위치의 온 상태 형광과 RBS 상류의 더욱 긴 A가 풍부한 영역의 존재 사이에는 매우 강력한 의존성이 존재한다는 것이 입증되었다 (데이터는 나타내지 않음). 중요하게, 이러한 RBS 증강은 오직 루프 영역에 부가되는 추가의 염기만을 필요로 하였고, 트리거 RNA 서열에 있어서의 상응하는 변화를 필요로 하지는 않았다. 대조적으로, 이전의 많은 리보조절인자 시스템의 경우, 유사한 RBS 조작은 리보조절인자 RNA의 쌍 둘 모두에 대한 변형을 필요로 하였으며, 이로 인해 디자인은 복잡해졌고, 결과를 적절히 해석하기 위해서는 RBS 및 RNA-RNA 상호작용으로부터 얻은 효과에 대한 디컨볼루션이 필요하였다. 마지막으로, 조절된 유전자의 효율적인 번역을 촉진시키기 위해 2차 구조가 거의 없는 조기 mRNA 영역 및 RBS를 제공하도록 인실리코로 토홀드 스위치를 디자인하였다. 이는 비록 출력 유전자의 N-말단에 추가 염기 및 링커를 부가함으로써 달성되었지만, mRNA 2차 구조와 관련하여 최적의 코돈을 선택하는 알고리즘을 사용하여 N-말단 염기를 부가하지 않도록 토홀드 스위치를 제조할 수 있다. 같은 의미를 가진 코돈 또한 상기 N-말단이 제한된 스위치로 이루어진 큰 직교 세트를 구축할 수 있어야 한다.
본원에 기술된 다양한 리보조절인자에 대한 서열:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
등가물
본원에서 본 발명의 수개의 실시양태가 기술되고, 예시되었지만, 통상의 기술자는 본원에 기술된 기능을 수행하기 위한, 및/또는 본원에 기술된 결과 및/또는 이점들 중 하나 이상의 것을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 수 있을 것이며, 상기 변형 및/또는 수정들은 각각 본원에 기술된 본 발명의 실시양태 범주 내에 포함되는 것으로 간주된다. 더욱 일반적으로, 통상의 기술자는 본원에 기술된 파라미터, 치수, 물질, 및 입체형태는 예시적인 것을 의미하며, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 입체형태는 본 발명의 교시(들)가 사용되는 구체적인 적용 또는 적용들에 의존할 것이라는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 통상의 기술자는 단지 통상의 실험만을 사용하는 경우에도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 실시양태는 단지 일례로 제시된 것이며, 본 발명의 실시양태는 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서 구체적으로 기술되고, 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 대한 것이다. 추가로, 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 상호 상반되지 않는다면, 둘 이상의 상기 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 개시내용의 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에서 정의되고, 사용되는 바와 같은 모든 정의가 사전상의 정의, 참조로 포함된 문헌 중의 정의, 및/또는 정의된 용어의 통상의 의미를 통제한다는 것을 이해하여야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에서는 그 문헌의 전문을 포함할 수 있다.
본원에서 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바, 부정 관사 "하나"는 명백하게 반대로 명시되지 않는 한, "1개 이상"을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
본원에서 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바, "및/또는"이라는 어구는 그렇게 결합된 요소 "중 하나 또는 그 둘 모두"를 의미하는 것으로, 즉, 일부 경우에서는 요소가 결합하여 존재하는 것으로, 및 다른 경우에는 요소가 분리되어 존재하는 것으로 이해하여야 한다. "및/또는"과 함께 연결된 다중 요소는 같은 방식으로, 즉, 그렇게 결합된 요소들 중 "하나 이상의 것"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있든 또는 관련이 없든 간에, "및/또는"에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적인 일례로서, 예컨대 "포함하는"이라는 것과 같은 제한을 두지 않는 개방형 표현과 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"라고 언급하는 것은 한 실시양태에서는 오직 A만을 (임의로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시양태에서는 오직 B만을 (임의로 A 이외의 요소 포함); 추가로 또 다른 실시양태에서는 A 및 B 둘 모두 (임의로 다른 요소 포함) 등인 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 본 명세서 및 청구범위에서, "또는"은 상기에서 정의된 "및/또는"과 같은 의미를 가지는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포함하는 것으로, 즉, 1개 초과인 것을 비롯하여, 1개 이상의 요소의 개수 또는 목록, 및 임의로 열거되지 않은 추가 항목도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 반대되는 의미를 명확하게 나타내는 것인 ~만이라는 용어, 예컨대 "~중 단 하나만" 또는 "~중 정확하게 하나만" 또는 청구범위에서 사용될 경우, "~으로 구성된"이라는 것은 다수의 요소들 또는 요소 목록 중 정확하게 1개의 요소를 포함한다는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바, "또는"이라는 용어는 유일하게 예컨대, "~중 어느 하나," "~중 하나," "~중 단 하나만," 또는 "~중 정확하게 하나만"이라는 것과 같은, 배타성 용어가 앞에 있을 때에는 배타적 대안을 명시하는 것 (즉, "그 둘 모두가 아닌, 하나 또는 나머지 다른 하나")으로 해석되어야만 한다. 청구범위에서 사용될 경우, "본질적으로 ~으로 구성된"이라는 것은 특허법 분야에서 사용되는 그의 일반적인 의미를 가져야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에서 사용되는 바, 하나 이상의 요소 목록과 관련하여 "1개 이상"이란, 요소 목록 내에 구체적으로 열거되어 있는 각각의 모든 요소들 중 1개 이상을 반드시 포함할 필요가 없고, 요소 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제시키지 않으면서, 요소 목록에서 요소 중 임의의 하나 이상의 것으로부터 선택되는 1개 이상의 요소를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 또는 없든 상관 없이, "1개 이상"이라는 어구가 지칭하는 요소 목록 내의 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적인 일례로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 등가적으로, "A 또는 B 중 적어도 하나," 또는 등가적으로, "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 한 실시양태에서, B는 존재하지 않으면서, 임의로 1개 초과인 것을 포함하는, 1개 이상의 A (및 임의로 B 이외의 다른 요소 포함)를 의미할 수 있고; 또 다른 실시양태에서, A는 존재하지 않으면서, 임의로 1개 초과인 것을 포함하는, 1개 이상의 B (및 임의로 A 이외의 다른 요소 포함)를 의미할 수 있고; 추가로 또 다른 실시양태에서, 임의로 1개 초과인 것을 포함하는, 1개 이상의 A, 및 임의로 1개 초과인 것을 포함하는, 1개 이상의 B (및 임의로 다른 요소 포함)를 의미하는 것 등일 수 있다.
반대되는 의미를 명확하게 나타내지 않는 한, 1개 초과의 단계 또는 조치를 포함하는 본원에서 청구하는 임의의 방법에서, 상기 방법의 단계 또는 조치의 순서는 본 방법의 단계 또는 조치가 언급된 순서로 반드시 한정될 필요는 없다는 것 또한 이해하여야 한다.
상기 명세서 뿐만 아니라, 청구범위에서, 예컨대 "포함하는(comprising)," "비롯한," "보유하는," "가지는," "함유하는," "포함하는(involving)," "수반하는," "구성된" 등의 모든 번역상의 어구는 제한을 두지 않는 개방형인 것으로, 즉, ~을 포함하나, 이에 한정되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. "~으로 구성된" 및 "본질적으로 ~으로 구성된"이라는 번역상 어구만이 오직 미국 특허청 심사지침서 섹션 2111.03(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03)에 기술된 바와 같이, 각각 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 번역상의 어구여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College Trustees of Boston University <120> RIBOREGULATOR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE <130> H0498.70460WO00 <140> TBD <141> 2013-11-06 <150> US 61/722,825 <151> 2012-11-06 <150> US 61/843,934 <151> 2013-07-09 <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 gggaauugau auugugauua ugugaugauu guaaacagag gagauacaau augcacauaa 60 ucaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 2 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 2 gggacauacg gacucacgug uccguauguc aauacaauca ucacauaauc acaauaucaa 60 uuacu 65 <210> 3 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 3 gggaauugau auuguucguu ucguaugauc uaagacagag gagauuagau augacgaaac 60 gaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 4 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 4 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polynucleotide <400> 30 gggacugagg uaccucgaag uaccucagua gauaacgaca cgcagaacga caaaguauaa 60 cgaaa 65 <210> 31 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 31 ggguaagaau gauaaaggua aguagugagu ugaaacagag gagaucaacu auguacuuac 60 cuaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 32 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 32 gggccaugac uccuaauucg gagucaugga aaucaacuca cuacuuaccu uuaucauucu 60 uacuu 65 <210> 33 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 33 gggcgauaaa gacugaggcu ggguaugguu agaaacagag gagaucuaac augacccagc 60 cuaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 34 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 34 gggccucgac guucgugaua acgucgaggc aaucuaacca uacccagccu cagucuuuau 60 cgcaa 65 <210> 35 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 35 gggauagaug auugugcuua guuuaugauu cugaacagag gagacagaau augaaacuaa 60 gcaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 36 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 36 gggacauccu aaguugacuc uuaggaugua aacagaauca uaaacuaagc acaaucaucu 60 auaca 65 <210> 37 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 37 gggauaauga ugaugaguau guugaaggug uaagacagag gagauuacac augcaacaua 60 cuaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 38 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 38 gggucgugug augcuaucuc aucacacgac aauuacaccu ucaacauacu caucaucauu 60 aucac 65 <210> 39 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 39 gggcguuaau cucuggcuug cuuuaugucu guaaacagag gagauacaga augaaagcaa 60 gcaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 40 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 40 gggucaugac ugggacacgc cagucaugag aauacagaca uaaagcaagc cagagauuaa 60 cgaag 65 <210> 41 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 41 ggguaaagau gaaacgcgug aaugauagua uugaacagag gagacaauac augcauucac 60 gcaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 42 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 42 gggucaccuc caggcacgac uggaggugaa uacaauacua ucauucacgc guuucaucuu 60 uacuu 65 <210> 43 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 43 gggcauuaag auuguacuug uaagaucgug ucgaacagag gagacgacac augcuuacaa 60 guaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 44 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 44 gggaccuagc ggagcgcagu ccgcuaggua aacgacacga ucuuacaagu acaaucuuaa 60 ugaaa 65 <210> 45 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 45 ggguaugaau ugaugucgau uguuaugucu ugagacagag gagaucaaga augaacaauc 60 gaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 46 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 46 gggacccgac cgcguccugg cggucgggua aaucaagaca uaacaaucga caucaauuca 60 uacua 65 <210> 47 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 47 ggguaaagau gagaacgcuu gugaaugaug ugaaacagag gagaucacau augucacaag 60 cgaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 48 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 48 gggucgggac acgggcauac gugucccgac aaucacauca uucacaagcg uucucaucuu 60 uacuu 65 <210> 49 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 49 gggugauaga ugaaggcagg cguuauaguu uagaacagag gagacuaaac augaacgccu 60 gcaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 50 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 50 gggucguggg ccugccuaaa ggcccacgag aacuaaacua uaacgccugc cuucaucuau 60 caaac 65 <210> 51 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 51 ggguaaguaa ugaagucuaa guguaucgug ucggacagag gagacgacac augacacuua 60 gaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 52 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 52 gggacgaacu ugaucaaauu caaguucgua aacgacacga uacacuuaga cuucauuacu 60 uacau 65 <210> 53 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 53 gggauagaau uagaaaugaa auagaugguu acgaacagag gagacguaac augcuauuuc 60 auaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 54 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 54 gggucgcuug uacucuugcg uacaagcgaa agcguaacca ucuauuucau uucuaauucu 60 aucua 65 <210> 55 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 55 gggauagaaa uugaucguua guuuauguug ccggacagag gagacggcaa augaaacuaa 60 cgaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 56 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 56 ggguaucuac ucgacuucgc gaguagauaa agcggcaaca uaaacuaacg aucaauuucu 60 auaac 65 <210> 57 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 57 gggaguuuga auauggcgaa augaaugcuu ugaaacagag gagaucaaag augucauuuc 60 gcaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 58 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 58 gggacgagag cuccuagcag agcucucgua uaucaaagca uucauuucgc cauauucaaa 60 cuaac 65 <210> 59 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 59 ggguaaagau gauaagaugu gaguaaggua guaaacagag gagauacuac augacucaca 60 ucaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 60 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 60 gggcacgacu agaaaccgau cuagucgugc aauacuaccu uacucacauc uuaucaucuu 60 uacuu 65 <210> 61 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 61 gggaucuaaa uguauucguu cguuauggua uugaacagag gagacaauac augaacgaac 60 gaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 62 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 62 gggcgucgcu guucggguaa acagcgacgg aacaauacca uaacgaacga auacauuuag 60 auacu 65 <210> 63 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 63 gggucaauuu cguauuagua uguuaugguu cugaacagag gagacagaac augaacauac 60 uaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 64 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 64 gggacucggu cucuaugucg agaccgagua aacagaacca uaacauacua auacgaaauu 60 gaagc 65 <210> 65 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 65 gggaauuugg aaguagagua guagauaguu augaacagag gagacauaac augcuacuac 60 ucaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 66 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 66 gggcagagcg gucuguuucg accgcucuga aacauaacua ucuacuacuc uacuuccaaa 60 uucua 65 <210> 67 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 67 gggaguaaug augauauagu uugaauguag ugaaacagag gagaucacua augucaaacu 60 auaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 68 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 68 gggaccguca cccuacaucg ggugacggua aaucacuaca uucaaacuau aucaucauua 60 cuaac 65 <210> 69 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 69 gggauaaugg agauggagua ggguaugauu guagacagag gagauacaau augacccuac 60 ucaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 70 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 70 gggccuagaa acuguacgaa guuucuaggc auuacaauca uacccuacuc caucuccauu 60 aucuu 65 <210> 71 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 71 gggaugaaua uggacaguug aguagugaug ugaaacagag gagaucacau auguacucaa 60 cuaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 72 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 72 gggagucagg accgcaucag guccugacua aaucacauca cuacucaacu guccauauuc 60 aucuu 65 <210> 73 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 73 gggauggaga uugauuauga uuggaugugc uuaaacagag gagauaagca augccaauca 60 uaaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 74 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 74 gggucgaccg cuccugcucg agcggucgac aauaagcaca uccaaucaua aucaaucucc 60 auaac 65 <210> 75 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 75 gggaguaaga auugugauaa aguaaugugc gugaacagag gagacacgca auguacuuua 60 ucaaccuggc ggcagcgcaa aagaugcgua aa 92 <210> 76 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 76 gggucacgga gcggauuugc gcuccgugag aacacgcaca uuacuuuauc acaauucuua 60 cuuca 65 <210> 77 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 77 gggucuuauc uuaucuaucu cguuuauccc ugcauacaga aacagaggag auaugcaaug 60 auaaacgaga accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 78 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 78 gggacugacu auucugugca auagucagua aagcagggau aaacgagaua gauaagauaa 60 gauag 65 <210> 79 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 79 gggaguuuga uuacauuguc guuuaguuua gugauacaua aacagaggag auaucacaug 60 acuaaacgaa accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 80 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 80 gggacagauc cacugaggcg uggaucugug aacacuaaac uaaacgacaa uguaaucaaa 60 cuaac 65 <210> 81 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 81 gggaucuauu acuacuuacc auugucuugc ucuauacaga aacagaggag auauagaaug 60 agacaaugga accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 82 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 82 gggugauggg acauuccgau gucccaucaa uaagagcaag acaaugguaa guaguaauag 60 auaag 65 <210> 83 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 83 gggcgauuau ggauuagagc uccguuuacu gucauacaag aacagaggag auaugacaug 60 aaacggagca accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 84 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 84 gggacgaauu cacccuaaug ugaauucgua aagacaguaa acggagcucu aauccauaau 60 cgaac 65 <210> 85 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 85 ggguauguaa uugauuuggc uucuguuagu uucauacaag aacagaggag auaugaaaug 60 aacagaagca accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 86 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 86 ggguccauuc uaggugauac uagaauggag cagaaacuaa cagaagccaa aucaauuaca 60 uacua 65 <210> 87 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 87 gggcuuaauc uuaccuucgc uuguucuguu ccgauacaga aacagaggag auaucggaug 60 agaacaagca accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 88 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 88 gggacaaucg ggacgacacu cccgauugug aacggaacag aacaagcgaa gguaagauua 60 aggua 65 <210> 89 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 89 gggucacuua aucauuuguc gucguuucua ucuauacaag aacagaggag auauagaaug 60 aaacgacgaa accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 90 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 90 gggucgagua gacagagcug ucuacucgaa uaagauagaa acgacgacaa augauuaagu 60 gagaa 65 <210> 91 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 91 gggaccucua cuuacucuca cucuuacuuc ugcauaguag aacagaggag auaugcaaug 60 guaagaguga accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 92 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 92 gggacugagc ugcuaucacg cagcucagua gagcagaagu aagagugaga guaaguagag 60 guaga 65 <210> 93 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 93 gggcuuacua cuuugacacc ugauucugac acgauaacag aacagaggag auaucguaug 60 agaaucagga accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 94 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 94 gggucaauua cccgugguag gguaauugaa agcgugucag aaucaggugu caaaguagua 60 aguag 65 <210> 95 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 95 gggaauggaa ugaaugaacu gcuugucuua uguauacaga aacagaggag auauacaaug 60 gacaagcaga accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 96 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 96 gggcgaagug uccguaugag gacacuucga cgacauaaga caagcaguuc auucauucca 60 uuuag 65 <210> 97 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 97 gggcgaauag aaaugaaggc uagugucguu gucauacaga aacagaggag auaugacaug 60 gacacuagca accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 98 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 98 gggacuccac gccgaccgug gcguggagua aagacaacga cacuagccuu cauuucuauu 60 cgauu 65 <210> 99 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 99 gggcaauuuc guauauguuc gucuuugcug uucauacaag aacagaggag auaugaaaug 60 caaagacgaa accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 100 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 100 gggcgacgau gccagguaug gcaucgucgg acgaacagca aagacgaaca uauacgaaau 60 ugaaa 65 <210> 101 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 101 gggauggaau ugagaugggc uuucgcgaga uugauacaga aacagaggag auaucaaaug 60 cgcgaaagca accuggcggc agcgcaaaag augcguaaa 99 <210> 102 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 102 gggugcggua guagguuccu acuaccgcaa uacaaucucg cgaaagccca ucucaauucc 60 auacu 65

Claims (63)

  1. 단일 가닥 토홀드 도메인,
    개시 코돈을 포함하는 완전 또는 부분적 이중 가닥 줄기 도메인,
    리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인, 및
    코딩 도메인
    을 포함하는 RNA를 포함하는 토홀드 리보조절인자.
  2. 제1항에 있어서, 스페이서 도메인을 추가로 포함하는 리보조절인자.
  3. 제2항에 있어서, 스페이서 도메인이 저분자량 아미노산을 코딩하는 것으로 구성된 것인 리보조절인자.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 스페이서가 약 9-33개의 뉴클레오티드 길이인 리보조절인자.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 스페이서가 약 21개의 뉴클레오티드 길이인 리보조절인자.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 도메인이 줄기 도메인과 코딩 도메인 사이에 위치되어 있는 것인 리보조절인자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 도메인이 개시 코돈의 상류 (5') 및/또는 하류 (3')에 서열을 포함하는 것인 리보조절인자.
  8. 제7항에 있어서, 개시 코돈 상류의 서열이 약 6개의 뉴클레오티드인 리보조절인자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 개시 코돈 하류의 서열이 약 9개의 뉴클레오티드인 리보조절인자.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 개시 코돈 하류의 서열이 종결 코돈을 코딩하지 않는 것인 리보조절인자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 도메인이 리포터 단백질을 코딩하는 것인 리보조절인자.
  12. 제11항에 있어서, 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)인 리보조절인자.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 도메인이 비-리포터 단백질을 코딩하는 것인 리보조절인자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 토홀드 도메인의 서열이 자연 발생 RNA에 상보적인 리보조절인자.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 토홀드 도메인의 서열이 비-자연 발생 RNA에 상보적인 리보조절인자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 리보조절인자의 토홀드 도메인에 혼성화하고, 2차 구조를 포함하지 않거나 최소의 2차 구조를 포함하는 제1 도메인, 및
    토홀드 도메인의 하류 (3')에 있는 서열에 혼성화하는 제2 도메인
    을 포함하는 트랜스-활성화 RNA (taRNA).
  17. 제16항에 있어서, 제1 도메인이 토홀드 도메인에 대해 100% 상보적인 트랜스-활성화 RNA.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 리보조절인자, 및
    제16항 또는 제17항의 트랜스-활성화 RNA (taRNA)
    를 포함하는 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 세포인 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 원핵 세포인 시스템.
  21. 제18항에 있어서, 무세포 시험관내 시스템인 시스템.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 리보조절인자 및 taRNA가 서로 혼성화되는 것인 시스템.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, taRNA에 대한 리보조절인자의 비가 1 미만, 0.5 미만, 또는 0.1 미만인 시스템.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 리보조절인자가 제1 핵산에 포함되어 있고, taRNA가 제2 핵산에 포함되어 있는 것인 시스템.
  25. 제24항에 있어서, 제1 핵산이 제1 플라스미드이고, 제2 핵산이 제2 플라스미드인 시스템.
  26. 제24항에 있어서, 제1 플라스미드가 중간 카피의 복제 기점을 포함하고, 제2 플라스미드가 고 카피의 복제 기점을 포함하는 것인 시스템.
  27. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 리보조절인자를 포함하는 핵산.
  28. 제27항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  29. 제16항 또는 제17항의 트랜스-활성화 RNA (taRNA)를 포함하는 핵산.
  30. 제29항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  31. 제1항의 리보조절인자를 샘플과 조합하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 내인성 RNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 내인성 RNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 내인성 RNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계, 및
    내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 중 RNA의 존재를 검출하는 방법.
  32. 제1항의 리보조절인자를 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 세포내 내인성 RNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하는 것인 단계, 및
    내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하는, 세포 중 RNA의 존재를 검출하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 단백질의 양이 내인성 RNA의 양의 지표인 방법.
  35. 제1항의 리보조절인자를 제B1항의 taRNA와 조합하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 taRNA에 상보적인 토홀드 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 비-리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 taRNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 taRNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계를 포함하는, 단백질 번역을 제어하는 방법.
  36. 리보솜 결합 부위를 포함하는 완전 또는 부분적 이중 가닥 줄기 도메인,
    루프 도메인, 및
    코딩 도메인
    을 포함하며, 여기서 개시 코돈은 줄기 도메인과 코딩 도메인 사이에 존재하는 것인 RNA를 포함하는 비콘 리보조절인자.
  37. 제36항에 있어서, 줄기 도메인이 개시 코돈의 상류 (5')에 서열을 포함하는 것인 리보조절인자.
  38. 제37항에 있어서, 개시 코돈 상류의 서열이 약 6개의 뉴클레오티드인 리보조절인자.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 도메인이 리포터 단백질을 코딩하는 것인 리보조절인자.
  40. 제39항에 있어서, 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)인 리보조절인자.
  41. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 도메인이 비-리포터 단백질을 코딩하는 것인 리보조절인자.
  42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 루프 도메인의 서열이 자연 발생 RNA에 상보적인 리보조절인자.
  43. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 루프 도메인의 서열이 비-자연 발생 RNA에 상보적인 리보조절인자.
  44. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항의 리보조절인자의 루프 도메인에 혼성화하고, 2차 구조를 포함하지 않거나 최소의 2차 구조를 포함하는 제1 도메인, 및
    줄기 도메인 중에 존재하며 루프 도메인의 상류 (3')에 있는 서열에 혼성화하는 제2 도메인
    을 포함하는 트랜스-활성화 RNA (taRNA).
  45. 제44항에 있어서, 제1 도메인이 루프 도메인에 대해 100% 상보적인 트랜스-활성화 RNA.
  46. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항의 리보조절인자, 및
    제44항 또는 제45항의 트랜스-활성화 RNA (taRNA)
    를 포함하는 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 세포인 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 세포가 원핵 세포인 시스템.
  49. 제46항에 있어서, 무세포 시험관내 시스템인 시스템.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 리보조절인자 및 taRNA가 서로 혼성화되는 것인 시스템.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, taRNA에 대한 리보조절인자의 비가 1 미만, 0.5 미만, 또는 0.1 미만인 시스템.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 리보조절인자가 제1 핵산에 포함되어 있고, taRNA가 제2 핵산에 포함되어 있는 것인 시스템.
  53. 제52항에 있어서, 제1 핵산이 제1 플라스미드이고, 제2 핵산이 제2 플라스미드인 시스템.
  54. 제52항에 있어서, 제1 플라스미드가 중간 카피의 복제 기점을 포함하고, 제2 플라스미드가 고 카피의 복제 기점을 포함하는 것인 시스템.
  55. 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항의 리보조절인자를 포함하는 핵산.
  56. 제55항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  57. 제44항 또는 제45항의 트랜스-활성화 RNA (taRNA)를 포함하는 핵산.
  58. 제57항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  59. 제36항의 리보조절인자를 샘플과 조합하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 내인성 RNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 내인성 RNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 내인성 RNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계, 및
    내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하는, 샘플 중 RNA의 존재를 검출하는 방법.
  60. 제36항의 리보조절인자를 세포 내로 도입하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 세포내 내인성 RNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하는 것인 단계, 및
    내인성 RNA의 지표로서 리포터 단백질을 검출하는 단계
    를 포함하는, 세포 중 RNA의 존재를 검출하는 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 리포터 단백질이 녹색 형광 단백질 (GFP)인 방법.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 단백질의 양이 내인성 RNA의 양의 지표인 방법.
  63. 제36항의 리보조절인자를 제BB1항의 taRNA와 조합하는 단계로서, 여기서 리보조절인자는 taRNA에 상보적인 루프 도메인을 포함하고, 리보조절인자는 비-리포터 단백질을 코딩하는 코딩 도메인을 포함하며, 상기 조합은 taRNA의 존재하에서는 코딩 도메인의 번역을 허용하지만 taRNA의 부재하에서는 그러하지 않은 조건하에서 이루어지는 것인 단계를 포함하는, 단백질 번역을 제어하는 방법.
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