KR20210050041A

KR20210050041A - 리보조절인자를 이용한 바이러스 진단을 위한 fet 통합 센서 및 이의 이용 방법

Info

Publication number: KR20210050041A
Application number: KR1020190133879A
Authority: KR
Inventors: 박대의; 백승화; 권오석; 김경호; 박선주; 서기완; 송현석; 김승일
Original assignee: 한국화학연구원; 한국기초과학지원연구원; 한국생명공학연구원
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2021-05-07
Also published as: KR102323107B1

Abstract

본 발명은 바이러스 (virus)의 효과적인 검출 또는 신속 진단을 위하여 바이러스에 특이적인 RNA에 대하여 반응할 수 있는 리보조절인자(Switch RNA)와 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET) 통합 센서 및 이의 이용 방법을 제공한다.

Description

리보조절인자를 이용한 바이러스 진단을 위한 FET 통합 센서 및 이의 이용 방법 {FET integrated Sensor using Switch RNA for diagnosis of virus and method of use thereof}

본 발명은 바이러스 (virus)의 효과적인 검출 또는 신속 진단을 위하여 리보조절인자(Switch RNA)와 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET)를 사용하는 융합 기술에 관한 것이다.

핵산 서열과 직접 반응하여 핵산 서열을 조절할 수 있는 일렬의 RNA서열을 리보조절인자(또는 '스위치(Switch) RNA'라 함)라고 한다. 특정 RNA 부위와 결합 (hybridization) 하여, 리포터 유전자 (Reporter gene)을 발현하거나, RNA 자체의 기능을 못하게 막기도 한다. 이와 같은 RNA 기반의 리보조절인자는 단백질 발현 제어, 대사 경로에서의 특정 대사 물질 조절 및 세포 사멸 유도등을 비롯한, 합성 생물학 분야에서 많은 적용을 위해 사용되어 왔다.

리보조절인자(Switch RNA)는 생체센서로써, 생물 분자인 RNA를 감지하여, 시료에서 해당 RNA의 존재유무를 판단할 수 있게 해준다. 이는 RNA 바이러스 진단 뿐 만 아니라 16S RNA를 통한 미생물 동정에도 사용될 수 있으며, 암 RNA를 진단 등 RNA를 검지하는 다양한 분야에 적용될 수 있다. 특히, 리보조절인자는 검지하고자 하는 RNA 서열을 알고 있을 경우, 진단 항체 또는 압타머에 비해 상당히 빠른 시간 내에 제작이 가능하다. 또한 리보조절인자는 플라스미드 벡터에 포함되어 제작되므로, 높은 품질로 대량 생산이 가능하다.

리보조절인자의 단점은 민감도가 떨어진다는 점이다. 메르스 바이러스 진단에 적용할 경우 10¹¹ copies/ml에서 대조군 대비 3배의 형광을 보이는 것으로 확인되었으며, 지카 바이러스의 경우 10⁹ copies/ml에서 대조군 대비 3배 형광을 보인다. 선행연구 (비특허문헌, Cell. (2016) 165;1255-1266, MIT의 Collins 그룹) 에서도 에볼라 바이러스 및 지카 바이러스를 진단하기 위해 리보조절인자를 단독으로 사용하지 않고, 시료안의 RNA를 증폭하는 RPA(Recombinase Polymerase Amplification) 또는 NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)과 같은 등온증폭 기술을 함께 사용하고 있다.

리보조절인자의 낮은 민감도를 해결하기 위해 본 발명에서는 생체분자를 검출하는데 높은 민감도를 보이는 전계 효과 트랜지스터 (FET)와 리보조절인자를 융합하는 기술을 사용하여, 등온증폭 또는 PCR 없이 5분 이내에 신속하게 바이러스를 검출하였다.

한편, 리보조절인자와 세포유리시스템 (Cell free system)을 이용하여 바이러스를 검출하는데 성공하였으나, 본 발명에서와 같이 리보조절인자와 전계 효과 트랜지스터 (FET)를 이용한 통합 센서 및 이의 이용방법에 대해서는 개시된 바가 없다.

Rapid, Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular components. Cell 165, 1255-1266

본 발명의 목적은, 바이러스를 민감도가 낮은 리보조절인자를 FET 융합기술을 사용하여 개선하고, 저비용 고효율 방법으로 실시간으로 신속하게 바이러스를 검출 또는 진단하는 센서 및 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,

바이러스 (virus) 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자 (Switch RNA) 및 상기 리보조절인자의 리포터 유전자 (Reporter gene)의 발현을 감지하고 적어도 하나의 전극이 형성되고 전류의 흐름 변화를 감지하는 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET)로 이루어진 바이러스 진단용 FET 통합 센서를 제공한다.

상기 바이러스 진단용 FET 통합 센서는

기판:

상기 기판에 배치되는 그래핀 채널층;

상기 그래핀 채널층의 양단에 이격되어 배치되는 한쌍의 금속(소스 전극과 드레인 전극); 및

상기 그래핀 채널층 상에 배치되고 링커층 상에 리포터 유전자 항체가 결합된 바이오 탐침부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 리보조절인자는 재조합 벡터에 포합되고, 상기 재조합 벡터는 리포터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 재조합 벡터는 리포터 유전자와 T7 promotor 사이에 상보적으로 결합하는 리보조절인자가 포함되는 벡터인 것을 특징으로 한다.

상기 리포터 유전자는 Luc, GFP eGFP, Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, YFP, eYFP, SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, CFP, eCFP, TagCFP, PS-CFP2, RFP, Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, BFP, mTag BFP, mNeongreen, Scarlet-i, mplum, mcherry, PAmcherry, mStrawberry, mOrange, PSmOrange, mRasberry, mKate, mKate2 mTFP, mNeptune, mRubby, mRubby2, mBanana, DSRed, mCitrine, Emerald, T-Sapphire, mApple, mgrape, Venus, Topaz, J-Red, tdTomato, mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. IFP1.4, mEos2, mEOS4,mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede , KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow, Cerulean, LacZ, BLA, GUS, Alkaline phosphatase, CAT 및 Peroxidase에서 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 eGFP 또는 LacZ 이다.

또한 본 발명에서의 바이러스 진단은 세포외에서 반응 및 종이, 금속기판 또는 플라스틱 기판 위에서 검체와 반응시켜 수행하는 것일 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 센서를 포함하는 바이러스 진단 장치를 제공한다.

상기 바이러스 진단 장치는 리포터 유전자 항체 활성 검출 값을 측정하는 단계를 포함하고, 형광 측정, 발광 측정, 컬러 측정 또는 눈으로 직접 확인 가능한 것일 수 있다.

또한 본 발명은 센서를 사용하여 바이러스를 포함하는 검체에서 바이러스 존재 유무에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 검체는 객담, 폐포 세척액, 분변, 소변 및 혈액 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 다양한 검체에서 리보조절인자와 FET (Field effect transistor) 통합 융합 기술을 사용한 바이러스 검출 또는 진단 관련 기술을 제공한다.

본 발명은 저비용 고효율 방법으로 바이러스를 효과적으로 실시간 신속 진단을 위하여, 리보조절인자(Switch RNA)와 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET)를 사용하는 융합 기술에 관한 것이다. 이 기술은 FET를 사용하여, 민감도가 낮은 리보조절인자 진단 기술을 개선시켰으며, 리포터 유전자가 도입되어, 바이러스에 노출되면, 리포터 유전자가 단백질로 발현되고, 항체 반응을 통하여, 바이러스 유무 진단 및 정량을 신속하고 간편하게 분석할 수 있으므로, 바이러스 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도1은 본 발명의 실시예에 따른 리보조절인자 (Switch RNA)를 이용한 전계 효과 트랜지스터 (FET) 통합 센서의 원리를 보여주는 개략도이다.
도2는 실시예에서 검출 대상체 (Zika virus)를 위한 리보조절인자 재조합 벡터구조를 나타낸 플라스미드 지도로, A는 27B 센서 벡터이고(ZIKV_Sensor_27B_LacZ, addgene number: Plasmid #75006) B는 32B 센서 벡터 (ZIKV_Sensor_32B_LacZ, addgene number: Plasmid #75007)를 나타낸 것이다.
도3은 본 발명의 실시예를 통한 리포터 유전자가 들어간 리보조절인자 발현을 확인한 결과로, A는 리포터 유전자 발현을 Microplate reader기의 흡광도를 통하여 정량적으로 확인한 결과이고, B는 리포터 유전자 발현을 종이결과로 육안으로 확인한 결과이다.
도4는 본 발명의 실시예에 제조한 리보조절인자를 이용한 바이러스 검출결과로, Microplate reader기의 흡광도를 통하여 정량적으로 확인한 결과이다.
도5는 본 발명의 실시예를 통한 바이러스 진단용 FET 통합 센서의 고정 항체 (Antibody)로 확인하기 위한, 리포터 유전자 항체 활성 확인용 웨스턴 블롯 (Western blot) 실험결과이다.
도6은 본 발명의 실시예를 통한 리보조절인자를 이용한 바이러스 진단용 FET 통합 센서를 이용하여 바이러스를 측정한 리포터 유전자 항체 실시간 검출 곡선이다.
도7은 본 발명의 실시예를 통한 리보조절인자 생성물 샘플링 시간에 대한 리보조절인자를 이용한 바이러스 진단용 FET 통합 센서 기반 실시간 검출 곡선 결과로, A는 리보조절인자 생성물의 샘플 시간을 화살표로 나타낸 것이고, B는 리보조절인자 생성물 샘플링 시간에 따른 바이러스 진단용 FET 통합 센서의 바이러스 검출 곡선 결과이다.

본 발명은 바이러스 진단용 리보조절인자(Switch RNA)와 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET)를 사용하는 융합기술 기술을 제공함에 있다.

본 발명에서는 세포유리시스템(Cell free system)을 적용하여, 살아있는 병원체나 화학 촉매를 사용한 생물학적 반응을 일어나게 하여, 종이 위에서 반응 시킬 수 있게 하고 휴대가 가능하도록 하였다. 세포유리시스템 (Cell free system)이란, 세포 (Cell) 에서 일어나는 생물학적 반응을 Cell을 사용하지 않고 In-vitro 환경에서 구축한 것을 말하며, 많은 다른 세포 소기관 없이 반응 가능하도록 세포 내 분자기계 (molecular machinery)를 초원심분리(ultra-centrifugation)를 통해 얻어낸 용액을 의미한다. 다양한 정제된 효소와 조효소의 혼합물(mixture)을 이용한 Cell-free system은 미생물 발효시스템과 비교해 비용을 절감할 수 있는 생물학적 제조방법으로 여겨지고 있으며, 단백질 합성을 E.coli를 키우지 않고 빠르게 수행할 수 있는 새로운 대체 수단으로 평가되고 있다. 세포-유리 시스템은 일반적으로 다음 단계를 통해 바이러스의 존재여부를 확인할 수 있다. 1단계: 바이러스를 검출하기 위한 리보조절인자와 리포터 유전자를 넣어 플라스미드 제작; 2단계 : 바이러스 유무 및 정량적 확인을 위해 리포터 유전자를 사용; 3단계: 세포가 아닌 마이크로튜브에 세포-유리전사 및 번역 시약과 제작한 플라스미드를 혼합; 4단계: 만들어진 혼합물을 종이 위에 떨어트려 동결건조 시킨 후 감염된 바이러스 등 표적 RNA를 넣어주면 리보조절인자와 반응해 리포터 유전자 (reporter gene)가 발현되어 바이러스 유무를 확인할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 방법에 있어서, 리포터 유전자로 베타-갈락토시다아제 (Beta-galactosidase, LacZ)를 사용하였으나, 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, eGFP)도 바람직하다.

베타-갈락토시다아제 (Beta-galactosidase, LacZ)는 발현되었을 경우, 눈으로 직접 관찰이 가능하다. 사이즈가 eGFP보다 크며 CPRG (Chlorophenol red - β-D- galactopyranoside) 기질을 분해하여, 노란색에서 최종적으로 보라색으로 변하는 것을 볼 수 있고, 지카바이러스 (Zika virus) 검출에 사용하는 것이 바람직하다.

eGFP는 720bp 크기를 가지며, sensor vector에 사용되어 시각적으로 확인을 위한 리포터 유전자 역할을 한다. 리보보절인자 바로 다음에 연결되어 전사 과정을 거쳐 발현되면 형광현미경으로 녹색의 형광을 관찰이 가능하여 정량적으로 발현여부 확인이 가능하다. 또한 상기 eGFP는 중동호흡기증후군 바이러스 (Middle East respiratory syndrome virus, MERS virus) 검출에 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용된 세포-유리 시스템 용액은 PURExpress®In Vitro Protein Synthesis Kit(NEB, NEB Solution)로 빠르게 유전자 발현 분석이 가능하며 E.Coli translation에 필수적인 정제된 구성성분을 대체할 세포-유리 전사/번역 시스템이다. PURExpress platform은 nuclease, protease가 없어 완전한 형태의 DNA, RNA templates 상태로 유지하고 결과적으로 단백질의 변형과 분해가 자연스럽게 일어난다. 전사와 번역은 단지 2개의 tube만을 이용해 원스텝으로 반응이 수행된다.

본 발명에서 사용된 전계효과 트랜지스터 (FET) 센서는 기판, 그래핀채널층 한쌍의 금속 및 링커층을 포함한다. 상기 기판은 센서의 구성들이 지지되는 지지대로서의 역할을 하는 구성으로 절연성 무기물 기판, 금속 기판 또는 플라스틱 기판 등을 사용할 수 있으며, 절연성 기판을 사용하는 경우 그래핀 채널층과 친화력이 우수하여, 실리카 (SIO₂) 기판인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용된 전계효과 트랜지스터 (FET) 센서를 구성하는 한쌍의 금속은 그래핀 채널층에 전압을 인가하기 위해 상기 그래핀 채널층 상에서 서로 이격되어 형성되는 소스 전극과 드레인 전극일 수 있으며, 상기 소스 및 드레인 전극들과 접촉하며 기판 상에 형성되는 게이트를 포함한다.

또한 본 발명에 사용된 전계효과 트랜지스터 (FET) 센서는, 전기장 효과에 의해 소스 및 드레인 전극 사이의 그래핀 채널층을 흐르는 전류가 변하는 반도체 특성을 이용한 것이다. 구체적으로, 그래핀 채널층의 표면에 형성된 바이오 탐침부에 포함되는 프로브인 리포터 유전자 항체가 표적물과 반응하면, 주변의 전기장에 변화가 일어나며, 이로 인해 소스 전극과 드레인 전극 사이의 그래핀 채널 영역에 흐르는 전류 값이 함께 변하고, 이러한 전류의 변화를 측정하는 방식으로 표적물을 검출한다. 이러한 센서는, 전술한 바와 같은 구성을 통해 민감도, 특이성, 신속성 및 휴대성이 우수하며, 특히, 그래핀을 채널층으로 사용함으로써 그래핀의 높은 전하 캐리어 이동도와 전도도 특성으로 인하여 우수한 민감도와 실시간 감지 성능을 가진다. 전술한 바와 같이 링커층을 센서 내의 그래핀 채널층에 형성시키고 이에 결합하는 바이오 탐침부를 센서의 채널 영역에 존재시킴으로써 센서의 민감도가 더욱 향상될 뿐만 아니라, 상기 링커층이 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 카벤기와 그래핀 채널층의 자가 결합을 통한, 공유 결합에 의해 형성되고, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물은 말단 부위가 아자이드기 또는 프탈리마이드기로 기능화되어 도핑 처리와 바이오 탐침의 부착을 동시에 실시할 수 있게 되어 공정이 간소화되고 비용이 절감되는 효과가 있다. 또한 그래핀 채널층 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 링커층 도입으로, 바이오 물질이 그래핀에 집적접으로 붙어 검출 신호를 보이는 비특이적 결합을 막아주는 역할을 하여, 센서의 미감도 및 선택성이 우수한 효과가 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 하기 실시예에 한정하는 것은 아니다.

실시예1. 리보조절인자 디자인 및 제작

바이러스를 검출하기 위한 리보조절인자는 선행연구 (비특허문헌, Cell. 2016 May 19;165(5):1255-1266)에서 개발하고 사용한 27B와 32B 서열을 가진 플라스미드를 (ZIKV_Sensor_27B_LacZ, addgene number: Plasmid #75006 및 ZIKV_Sensor_32B_LacZ, addgene number: Plasmid #75007) 사용하였다. 해당 플라스미드에는 바이러스의 E 유전자를 검출하는 리보조절인자 (27B 서열, 바이러스의 E, envelope에 상보적인 sequence)와 리포터 유전자로는 LacZ 단백질(3075 bp)이 cloning 되어있고 도2와 같다. LacZ 유전자가 발현되면 Beta-galactosidase(EC 3.2.1.23) 단백질이 발현되며, 이 효소는 CPRG(Chlorophenol red -β-D-galactopyranoside) 기질을 분해하여 노란색에서 최종적으로 보라색으로 변하는 것을 현미경 없이 눈으로 직접 관찰이 가능하다. 선행연구에서 사용한 27B, 32B 센서 벡터 (sensor vector)를 제작 한 다음, 이를 trigger할 수 있는 바이러스의 서열(Sensor의 switch RNA 서열과 상보적)을 지닌 Trigger vector도 제작하였다.

리보조절인자 서열 (Sensor)은 하기(서열번호 1과 2)와 같다.

27B Sensor (서열번호1):

UUUCGCUCUAUUCUCAUCAGUUUCAUGUCCUGUGUCGGACUUUAGAACAGAGGAGAUAAAGAUGGACACAGGACACAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

32B Sensor(서열번호2)

CUGGGAUCAAGUACAUGUAGUGCGCCACGAGCAAAAGGACUUUAGAACAGAGGAGAUAAAGAUGUUUUGCUCGUGUAACCUGGCGGCAGCGCAAAAG

실시예2. 리보조절인자 발현 확인 (리보조절인자 벡터 테스트)

[2-1] 리보조절인자 발현 정량 분석

리보조절인자, Sensor 27B, 32B vector와 trigger vector를 세포 유리 시스템 용액 (NEB solution) 에 넣고 37℃에서 4시간 동안 570nm 파장으로 흡광도를 측정하였음. 흡광도는 최대 4까지 측정 가능하며, 1 이상이 되면 노란색의 CPRG가 보라색으로 변하는 것이 관찰되기 시작함. Trigger vector는 RNA transcription kit를 사용하여 transcription 된 RNA (nanodrop으로 농도 확인함)를 사용하였으며, sensor vector는 NEB의 제한효소(Nru I)를 처리해 선형으로 만들어 37℃에서 4시간동안 반응시켰다.

실험 결과, 도3A의 결과와 같이, 리보조절인자 sensor 27B이 검출 효율이 우수한 것으로 확인되며, 80분이 지나면 육안으로 검출이 가능할 것으로 보여, 하기 실시예 [2-2]와 같이 종이를 통한 육안관찰 검출을 확인하였다. Sensor와 trigger vector를 교차실험 했을 때, sensor 27B은 trigger 27만을 검출하여, sensor 32B보다 민감도 (specificity)가 좋은 것으로 확인되며 sensor 32B는 흡광도도 낮게 나올 뿐만 아니라 trigger 27과도 반응하고, 추가적인 실험에서는 trigger가 없이도 translation까지 진행되어 리포터 유전자가 발현 (expression)되는 것을 확인하여, sensor 27B를 바이러스 진단용 리보조절인자로 선정하였다.

[2-2] 육안관찰 검출결과 (종이결과)

실시예 [2-1]에서 실시한 실험을 토대로 종이 (paper) 위에 적용한 후 확인하였다. 하얀색 종이를 사용했을 때, D.W (Distilled water)는 투명하기 때문에 색깔 변화 없이 하얗게 보이며 NEB+CPRG는 NEB solution(세포유리시스템 용액)과 CPRG(Chlorophenol red -β-D-galactopyranoside) 의 Mixture로 CPRG의 색인 노란색으로 보임. Sensor 27B과 32B에 각각 Trigger vector 27과 32를 circular 형태로 처리하였으며, 추가적으로 지카바이러스 (Zika virus) RNA를 리보조절인자 sensor vector에 각각 넣어 92℃에서 2분간 처리해 색깔 변화를 관찰하였다. 결과적으로 sensor vector의 리포터 유전자(reporter gene)인 LacZ가 발현 (expression)되어 CPRG와 반응해 보라색으로 변한 것이 관찰되었다. 결과는 도 3B과 같다.

실시예3. 리보조절인자를 이용한 바이러스 검출

리보조절인자 발현 확인 및 벡터 테스트에서 sensor 32 vector 벡터보다 민감도가 좋았던 Sensor 27B vector와 지카 RNA (10¹¹ copies/ml)를 세포유리시스템 용액 (NEB solution)에 넣고 37℃에서 2시간 동안 5분에 한번씩 570nm 파장으로 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 최대 4까지 측정 가능하며, 1 이상이 되면 노란색의 CPRG가 보라색으로 변하는 것이 눈으로도 관찰되기 시작한다. Trigger로 만든 지카 RNA는 RNA transcription kit를 사용하여 transcription 된 RNA를 사용하였으며, sensor vector는 제한효소(Nru I)를 처리해 선형으로 만들어 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.

도4와 같이 리보조절인자에서 대조군 대비 3배 증가 하는 시간은 65 분으로 확인되었으며 2시간 후에는 흡광도 최대값이 3.5로 관찰되었다.

특히, FET로 각 시간별 생성되는 LacZ 생성물을 확인하기 위해 단백질 합성을 억제시키기 위해 kanamycin을 사용하였다. Kanamycin은 단백질 합성 시 사용되는 리보솜 30S에 결합하여 단백질 합성을 저해하기 위해 사용되었다. 이에 따른 단백질 합성 억제 활성을 확인하기 위해 흡광도 증가가 되기 전 40분에 리보조절인자와 지카 바이러스 RNA를 NEB solution 함께 넣고 반응하는 샘플에 처리하여 40분 이후 단백질 합성을 억제 시켰으며, 따라서 흡광도의 변화가 일어나지 않음이 확인되었다.

실시예 4. 리포터 유전자 LacZ 발현 산물, Beta-galactosidase 발현 분석

리포터 유전자, LacZ 유전자의 발현 산물인 beta-galactosidase를 바이러스 진단용 FET 센서 고정 항체(antibody)로 사용하기 위하여 웨스턴 블롯 (Western blot)을 하였다. 도5와 같이 농도별 로딩하여 최소로 확인되는 농도를 확인하였다. 사용된 antibody는 abchem(anti-beta galactosidase antibody, ab221199) 제품을 사용하였고. 항체 (antibody)로 확인 가능한 beta-galactosidase 양의 LOD(limit of detection, 검출한계)는 0.25 μg으로 확인되었다.

실시예5. 전계효과 트랜지스터 (FET) 센서 제조

본 발명에 따른 리보조절인자를 이용한 전계효과 트랜지스터 (FET) 센서의 제조방법은 기판 상에 탄화수소 가스를 탄소 공급원으로 하여 화학 기상 증착법으로 그래핀을 성장시켜 그래핀 채널층을 형성하는 단계, 상기 그래핀 채널층에 한 쌍의 금속을 형성하는 단계 및 상기 그래핀 채널층의 외부로 노출되는 표면 상에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 포함하는 표면처리제를 이용하여 링커층을 형성하는 단계를 포함한다.

[5-1] 기판 상에 그래핀 채널층의 형성

기판 상에 그래핀 채널층의 형성구리 호일을 챔버 내에 위치시키고, 이를 1000℃까지 가열하고, 이를 H2 9034mTorr 및 8 sccm 으로 30분(20분의 프리 어닐링과 10분의 안정화)이를 유지한 후, CH4를 20 sccm으로 40분 동안 총 압력이 560 mTorr인 상태로 가한 다음, 이를 35℃로 200°C까지 냉각시키고, 로(furnace)를 상온까지 냉각하여 상기 구리 호일상에 단일의 그래핀층을 형성하였다.

다음으로, 상기 구리 호일 상에 형성된 그래핀층 상에 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA, MicroChem Corp, 950 PMMA A4, 4% in anisole) 용액을 분당 6000rpm의 속도로 스핀 코팅하고, 에천트를 이용하여 상기 PMMA가 코팅된 그래핀층을 상기 구리 호일로부터 분리하였고, 상기와 같이 구리 호일로부터 분리된 그래핀층을 10분 동안 탈이온 증류수에 침지하여 상기 그래핀 층에 남아 있는 잔여 에천트 이온들을 제거하였다.

상기와 같이 세척된 그래핀층을 기판인 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 필름으로 전사한 다음, 상기 그래핀층 상에 PMMA 용액을 투하하여 상기 그래핀층을 코팅하고 있던 PMMA를 제거함으로써, 기판 상에 그래핀 채널층을 형성하였다. 이때 투명성은 97.8%로 유지되었다.

[5-2] 마이크로 패턴 전극 형성

상기 실시예 [5-1]을 통해 기판 상에 형성된 그래핀 채널층에, 포지티브 포토레지스트(AZ5214, Clariant Corp)를 스핀 코팅한 다음, UV 노광, 베이킹 및 현상 과정을 거쳐 통해 그래핀 채널층을 패턴화하였다.

상기와 같이 패턴화되어 정렬된 그래핀 채널층의 양 말단에 RIE(oxygen plasma treatment) 방법을 통해 패턴 전극(폭/길이=W/L=1, L=100 μm 채널 길이)을 형성한 다음, 이미지 반전, 열 증착 및 리프트-오프(Lift-off)의 공정을 통해 상기 그래핀 채널층 상에 마이크로 패턴 전극(W/L=5, L=100 μm 채널 길이)이 형성된 그래핀 트랜지스터를 제조하였다.

[5-3] 담금법(dipping)을 이용한 그래핀 채널층과 '카벤'의 결합

벤조[d]이미다졸-3-리움의 요오드화물 또는 브롬화물 0.25mmol이 포함되어있는 무수 THF(5ml)을 상온에서 아르곤의 존재 하에 저어주면서 바탕 용액으로서 1M HMDS이 포함되어 있는 THF(0.25mmol)를 상기 벤조[d]이미다졸-3-리움 용액에 적가한 후, 15분 동안 교반하여 혼합 용액을 제조하였다. 이때, 고체 침전물(KI또는 KBr)이 즉각적으로 형성되는 것을 관찰할 수 있었다. 이어서, 상기 혼합 용액을 0.25μm PTFE 실린지 필터로 여과하고, 농도가 0.05mM인 제조예 1의 카벤 화합물로 희석시켜 카벤이 포함된 용액을 준비하였다. 여과가 종료된 후, 상기 실시예 [5-2]에서 준비한 그래핀 트랜지스터를 상기 용액에 상온에서 아르곤 존재 하에 20분 동안 침지한 후 THF, 탈이온(DI)수 및 IPA로 세정하고, 진공 상태에서 건조시킴으로써 그래핀 채널층 상에 카벤이 부착된 센서를 제조하였다.

[5-4] 카벤 기능화 그래핀 채널층의 리포터 유전자 항체 고정화

상기 [5-3]이 수행된 센서를 테트라하이드로퓨란 (5~10 mL) 용매 하에서 트리페닐포스핀(1 mg)을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후 물(100 μL)을 첨가하고 상온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 후에 테트라하이드로퓨란(20~100 mL)으로 부산물을 제거한 후에 진공 건조한 후,4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM)10 wt% 용액 100 μL와 리포터 유전자 항체를 첨가함으로써, 고정화를 시켜 최종적으로 바이러스 진단용 FET 통합 센서를 제조하였다.

실시예 6. 리보조절인자를 이용한 바이러스 진단을 위한 FET 통합 센서에서 리포터 유전자 항체 검출 민감도 확인

리보조절인자를 이용한 바이러스 진단을 위한 FET 통합센서에서 리포터 유전자 항체 검출 민감도를 확인하기 위하여 실시예5에서 제조된, 리포터 유전자 항체인 Beta-galactosidase(LacZ mAb)가 고정화된 FET 센서를 이용하여 낮은 농도의 Beta-galactosidase(LacZ mAb)부터 적용시켜 농도를 10 배 단위로 증가시키며 그에 따른 신호를 측정하였다. PBS 용액을 사용하여 Beta-galactosidase를 희석시켜 제조된 농도 1 fg/ml - 100 pg/ml인 항원 용액을 사용한 경우의 검출 실험 결과를 도7에 나타내었다. 도7에서 나타낸 바와 같이, Beta-galactosidase 검출은 10 fg/ml의 매우 낮은 농도에서도 감지가 가능하며, 100 pg/ml 정도의 농도에서 감지 신호가 포화되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 센서를 통해서 약 10 fg/ml의 매우 낮은 농도의 Beta-galactosidase를 감지할 수 있음을 실험적으로 보여준다.

실시예 7. 리보조절인자 생성물 샘플링 시간에 따른 FET 통합 센서 기반 실시간 바이러스 검출

본 발명에서는 리보조절인자의 단점인 민감도 문제를 해결하기 위해 민감도가 높은 FET를 적용하였다. 실시예 5와 같이 제조된, 리포터 유전자 항체가 고정된 FET 통합 센서를 이용하여 낮은 샘플링 시간의 리보조절인자 생성물부터 적용시켜 샘플링 시간을 적절한 간격으로 증가시키며 그에 따른 신호를 실시간으로 측정하였다. 실시예 3에서와 같이, CPRG 기질을 이용한 리포터 유전자 항체 활성 확인은 65분 이후부터 3배 증가분이 확인되며, 시간이 지날수록 증가되는 것이 관찰되었기에 65분 이전 시간인 5분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분에 각각 kanamycin을 처리하여 단백질 합성을 억제 시킨 시간별 반응 샘플을 준비하였으며, 실시예 5와 같이 리포터 유전자 항체(antibody)가 결합된 FET 센서를 이용하여, 바이러스를 검출하였다. 그 결과 도7과 같이, 5분의 샘플링 시간을 가진 시료부터 감지가 가능하며, 샘플링 시간에 따라 시간이 증가하다가 샘플링 시간이 40분인 시료에서 감지신호가 포화 되어가는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 본 FET 통합 센서를 이용하여 5분의 샘플링 시간을 가진 시료에서부터 바이러스를 검출하는 것을 확인할 수 있었다. 기존 방법으로는 65분에서 검출할 수 있었던 바이러스를 5분만 검출할 수 있게 되어 진단시간을 13배나 줄이는 결과를 보였다.

이상, 본 발명을 바람직한 실시예들을 들어 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.

Claims

바이러스 (virus) 특이적인 RNA를 인식할 수 있는 리보조절인자 (Switch RNA) 및 상기 리보조절인자의 리포터 유전자 (Reporter gene)의 발현을 감지하고 적어도 하나의 전극이 형성되고 전류의 흐름 변화를 감지하는 전계 효과 트랜지스터(Field effect transistor, FET)를 포함하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 1항에 있어서, 상기 바이러스 진단용 FET 통합 센서는 기판:
상기 기판에 배치되는 그래핀 채널층;
상기 그래핀 채널층의 양단에 이격되어 배치되어 소스 전극과 드레인 전극한쌍의 금속; 및
상기 그래핀 채널층 상에 배치되고 링커층 상에 리포터 유전자 항체가 결합된 바이오 탐침부를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 2항에 있어서, 상기 항체는 리포터 유전자에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체 (mAb)인 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 2항에 있어서, 상기 링커층은 하나 이상의 항체 또는 압타머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 1항에 있어서, 상기 리보조절인자는 재조합 벡터에 포함되고, 상기 재조합 벡터는 리포터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 5항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 리포터 유전자와 T7 promoter 사이에 상보적으로 결합하는 리보조절인자가 포함되는 벡터인 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제 (Luciferase, Luc), 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein, GFP), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, eGFP), Tag GFP, Superfolder GFP, PA GFP, AcGFP, PS-GFP2, 노랑 형광 단백질 (Yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 노랑 형광 단백질 (enhanced Yellow fluorescent protein, eYFP), SYFP, TagYFP, PhiYFP, Azurite, mKalamal, 청색 형광 단백질 (Cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질 (enhanced Cyan fluorescent protein, eCFP), TagCFP, PS-CFP2, 빨강 형광 단백질 (Red fluorescent protein, RFP), Tag RFP, Tag RFP657, mRFP1, PaTagRFP, Turbo RFP, RFP693, tdRFP, 파랑 형광 단백질 (Blue fluorescent protein, BFP), mTag BFP, 노랑 녹색 형광 단백질(Yellow-green fluorescent protein, mNeongreen), 밝은 형광단백질 (Bright monomeric fluorescent protein, Scarlet-i), 엠플럼 (mplum), 엠체리 (monomeric cherry fluorescent protein, mcherry), PAmcherry, 엠스트로베리 (monomeric strawberry fluorescent proteins, mStrawberry), 엠오렌지 (monomeric orange fluorescent protein, mOrange), PSmOrange, 엠라지베리 (mRasberry), 엠케이트 (mKate), mKate2, 엠티에프피 (monomeric teal fluorescent protein, mTFP), 엠넵튠 (mNeptune), 엠루비 (mRubby), mRubby2, 엠바나나(mBanana), 디에스레드(Discosoma sp, red fluorescent protein, DSRed), 엠시트린 (mCitrine), 에메랄드 (Emerald), 티-사파이어 (T-Sapphire), 엠에플 (mApple), 엠그레이프 (mgrape), 비너스 (Venus), 토페즈 (Topaz), 제이-레드 (J-Red), 티디토마토 (tdTomato), mTurquoise, mTurquosie2, mKO, mKO2, mUKG. IFP1.4, mEos2, mEOS4, mHoneydew, Dronpa, katushka, Ypet, CyPet, Clover, kaede , KikGR, mTangerine, Zsgreen, ZsYellow, 세루리안 (Cerulean), 베타-갈락토시다아제 (Beta-galactosidase, LacZ), 베타-람타메이즈 (Beta-lactamase, BLA), 베타-글루쿠로니데이즈(Beta-glucuronidase, GUS), 알카라인 포스파타아제 (Alkaline phosphatase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (Chloramphenicol acetyltransferase, CAT) 및 퍼록시다아제 (Peroxidase)으로 이루어진 군에서 어느 하나로 선택되는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 FET 통합 센서.
제 1항에 따른 센서를 포함하는 바이러스 진단장치.
제 8항에 있어서, 상기 장치는 형광 측정, 발광측정, 컬러 측정 또는 눈으로 직접 확인 가능한 진단장치.
제 1항에 따른 센서를 사용하여, 바이러스를 포함하는 검체에서 바이러스 존재 유무에 대한 정보를 제공하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 검체는 객담, 폐포 세척액, 분변, 소변 및 혈액으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 포함하는 것인 방법.