JP2017118881A - リボレギュレーター組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、DARPAにより授与された助成金番号635−67116−XXXX−167832−435548−0002.66625および米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与された助成金番号1DP2OD007292のもと、米国政府の資金提供を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本出願は、2012年11月6日に出願された米国仮特許出願第61/722825号および2013年7月9日に出願された米国仮特許出願第61/843934号の利益を主張し、それぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
リボレギュレーターは、核酸配列に応答して細胞の変化をもたらすRNAの配列である。典型的には、タンパク質翻訳を調節し、またはmRNA分解をトリガーするこれらのRNAベースデバイスは、合成生物学における多数の用途、例として、遺伝子発現の感受性制御、様々な代謝経路を通しての代謝フラックスの分流、および細胞死の合成制御に使用されている。
本発明は、部分的には、RNA、例として内因性RNAにより活性化することができるプログラマブルリボレギュレーターを目的細胞または試料に提供する。このようなプログラマブルリボレギュレーターは、従来、部分的には、厳しい制約、例として、本明細書に概説される配列制約に起因して考えられなかった。本発明の新規リボレギュレーターは、例えば、RNA、例えば、限定されるものではないが、内因性RNAによる活性化を可能とするための、taRNA(トリガーRNA)(およびtaRNAがハイブリダイズするcrRNAの対応する領域(例えば、スイッチRNA))の配列における十分な自由を提供する。タンパク質レポーター、例えば、蛍光レポーターに結合している場合、そのようなリボレギュレーターは、生細胞または他のタイプのRNA含有試料中のRNAレベルをリアルタイムで調査するためのセンサーとして作用する。本発明は、RNAを細胞(または試料)から回収する必要なく内因性RNAをリアルタイムで検出および定量するために使用することができる。本方法は、生理学的コピー数において存在するRNAを検出するために十分に感受性である。
(1)リボソーム結合部位を含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、ループドメインとを含むビーコンcrRNAリボレギュレーターと、(2)コードドメインと、(3)ステムドメインとコードドメインとの間に存在する開始コドンと
を含むシステムを提供する。
本発明は、2つの一般クラスのリボレギュレーター:トーホールドレギュレーターおよびビーコンリボレギュレーターを提供する。両方とも、種々のシステム、例として、細胞、例えば、原核細胞中のタンパク質産生(または翻訳)を活性化するために使用することができる。遺伝子発現の従来のエンジニアリング型リボレギュレーターとは異なり、それらの「デバイス」は、実質的に任意の配列の別個のRNAを使用してトランス活性化することができる。活性化RNAの配列は、リボソーム結合部位(RBS)配列に関連する必要がない。
リボレギュレーターは、オープンリーディングフレームの翻訳およびしたがってタンパク質の産生を抑制または活性化するために使用することができるRNA分子である。抑制は、mRNA分子の5’非翻訳領域(5’UTR)内の調節核酸エレメント(シス抑制RNAまたはcrRNA)の存在を通して達成される。この核酸エレメントは、相補的塩基対形成を通してステムドメインおよびループドメインを含むヘアピン構造を形成する。ヘアピン構造は、リボソームによるmRNA転写物への接近を遮断し、それにより翻訳を妨害する。一部の実施形態、例として、例えば、原核細胞を含む実施形態において、ヘアピン構造のステムドメインは、リボソーム結合部位(RBS)を封鎖する。一部の実施形態、例として、例えば、真核細胞を含む実施形態において、ヘアピン構造のステムドメインは、mRNAの5’UTR内のスタート(または開始)コドンの上流に位置している。発現され、トランスで作用するRNA(したがって、トランス活性化RNA、またはtaRNAと称される)は、crRNAと相互作用し、ヘアピン構造を変える。この変更は、スタートコドンの上流の転写領域へのリボソームの接近を可能とし、それによりRNAをその抑制状態から解放し、転写物からのタンパク質翻訳を促進する。crRNAは、典型的には、エンジニアリング型RNA分子である。taRNAは、本明細書に記載の一部の例においてエンジニアリング分子であり得るが、それらはシステム、例えば、細胞内の内因性の天然存在RNAの領域であり得る。
トーホールドリボレギュレーターシステムにおいて、crRNA種とトランスRNA種との間の相互作用は、crRNAステムの5’末端に局在している一本鎖RNAドメインを通して媒介される。このドメインは、トーホールドドメインと称され、トランスRNAにそれがcrRNAステムを巻き戻すことを可能とするための十分な結合親和性を提供する。トランスRNAとトーホールドドメインとの間の相補性の程度は、変動し得る。一部の実施形態において、それは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。最適なリボレギュレーターキネティクスのため、トランスRNAは、最小の二次構造およびcrRNAのトーホールドドメインに対して完全な相補性(すなわち、100%)を有するべきである。本明細書において使用される二次構造は、非直鎖構造、例として、例えば、ヘアピン構造、ステムループ構造などを指す。したがって、トランスRNAは、その使用条件下で二次構造を形成する可能性が全くなく、またはほとんどない配列からなることが好ましい。当業者は、手作業で、または当技術分野において利用可能なコンピュータプログラムの使用を通してそのような配列を決定することができる。
(A AND B)OR(C AND D)OR(E AND F AND G)、
またはシンクRNAを添加して:
NOT(A AND B)OR(C AND(NOT D))OR(E AND F AND G)
における式に分解することにより任意の論理演算の評価を可能とする。
ビーコンリボレギュレーターシステムにおいて、crRNAは、RBSおよび一部の場合においてスタートコドンを含有する変動長のステムドメインを含む(例示的実施形態については図5参照)。ステムドメインは、taRNA標的に相補的なヌクレオチドを含有するRBSの上流の約9bp領域も含む。taRNA標的の結合は、crRNA中の大型(約21nt)ループドメインを通して開始され、crRNAステムドメインの5’部分中に進行する。この大型ループ−直鎖相互作用を通してのtaRNA標的の結合は、crRNAの残部の巻き戻しを促す機械力を提供するリジッドな二本鎖をもたらす。巻き戻し後、活性化されたcrRNAのRBSおよびスタートコドンの両方が露出され、GOIの翻訳が可能となる。crRNAの標的結合領域がRBSおよびスタートコドンの両方から独立しているため、ビーコンリボレギュレーターのtaRNAは、原則として、任意の配列を採用し得る。二次構造をほとんど有さないtaRNAは、より良好な反応キネティクスを提供する。さらに標的taRNAは、crRNAステムドメインの巻き戻しを強制するために十分長くなければならない。
本発明のリボレギュレーターは、既存の技術と比較して多数の利益を提供する。例えば、定量リアルタイムPCR(qRT−PCR)は、RNAレベルの高度に感受性の検出を提供し、ノザンブロットは、高特異性を示し、マイクロアレイは、数千の標的の同時検出を可能とする。しかしながら、これら全ての技術において、細胞を犠牲にして定量のためにRNAを得なければならず、したがって、リアルタイムでRNAレベルを計測することが困難である。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)および蛍光RNAアプタマーの使用は、細胞内部のRNA局在化の可視化を可能とする。FISHは、可視化のために細胞の固定を要求し、ハイブリダイゼーションは、高価なプローブを使用して多くの時間を要する。RNAアプタマーを使用して生細胞中のRNAをイメージングすることができ;しかしながら、最大蛍光強度を有するそれらのアプタマーは、ほとんどの光学顕微鏡における検出のために内因性RNAのコピー数をかなり超過するコピー数を依然として要求する。RNAレベルは、RNA標的と同一のプロモーターから推進される蛍光レポータータンパク質を使用して計測することもできる。この方法におけるレポーターは、RNA標的のレベルを反映し得るが、それはプロモーター領域から遠い(例えば、数キロベース)染色体領域からの調節挙動を反復発生し得ない。さらに、プロモーターの追加のコピーの存在は、標的遺伝子から離れたRNAポリメラーゼ活性をタイトレートし得る。最後に、結合タンパク質と蛍光タンパク質レポーターとの融合物を使用して細胞内部のRNAの局在化およびレベルを計測するために、タンパク質結合アプタマーによりタグ化されたRNAも使用されている。しかしながら、この技術は、可視化すべきRNAに対応する遺伝子のタグ化またはノックアウトのいずれかの染色体改変を要求する。本発明のリボレギュレーターは、先行技術のこれらの種々の限定により阻害されない。
トーホールドリボレギュレーターおよびレポータータンパク質/GOI
図1の例示的リボレギュレーターを実験的に試験した。GOIは、半減期を約110分に設定するASV分解シグナルによりタグ化されたEGFPバリアントGFPmut3bであった。crRNAにコグネートのtaRNAは、最小の二次構造およびcrRNAの30nt長の標的結合部位に対して完全な相補性を有するようにソフトウェアパッケージNUPACKを使用して設計した。
ビーコンリボレギュレーター
トーホールドリボレギュレーターに使用されたものと同一の条件を使用してビーコンリボレギュレーター、例えば、図5に示される構造を有するものを試験した。図6は、6つのビーコンリボレギュレーターについて得られたオン/オフ蛍光強度比中央値を示す。デバイスの4つは、10を超過するオン/オフ比を示し、1つの設計は200倍を超過する。
内因性RNAセンシング
本明細書に記載の新規リボレギュレーターは、内因性RNAの検出に使用することができる。概念実証として、大腸菌(E.coli)中で小型RNA ryhBによりトリガーすることができるビーコンリボレギュレーターを設計および生成した。ryhBは、大腸菌(E.coli)中で鉄レベルが低い場合に上方調節される90nt長の非コードRNAである。このRNAは、培養培地への鉄キレーター2,2’−ジピリジルの添加を通して誘導することができる。
リボレギュレーターを使用する複合OR論理演算の遺伝子コード化
本発明者らは、リボレギュレーターライブラリーのメンバーを使用して複数の論理OR演算をインビボで良好に実施した。最も単純なOR演算は、入力のいずれかが存在する場合に論理ゲートを活性化する2つの入力AおよびBを含む。本発明者らは、2つの高性能リボレギュレーターを選び、それらをGFPのためのコード配列の上流に同一のmRNAに沿って順次配置することにより、このシステムをインビボで簡単に実行した(図11a)。インビボでのこのゲートの意図される演算を図11bに示す。いずれかの入力RNA分子が細胞中に存在する場合、それはその対応するcrRNAモジュールに結合し、そのステムを巻き戻すことによりモジュールを脱抑制する。タンパク質翻訳に関与するリボソームは強力RNAヘリカーゼ活性を有するため、それは下流crRNAをそのパスで巻き戻し得、翻訳は妨げられないままである。2入力ORゲートのフローサイトメトリーにより、いずれかのプログラミングされたtaRNA入力が転写された場合にGFP発現の強力な活性化が明らかになった(図11c)。さらに、crRNAの位置を交換した並行実験は、類似のシステム性能を示した。
リボレギュレーターを使用する複合AND論理演算の遺伝子コード化
本発明者らは、トーホールドリボレギュレーターを使用するAND論理演算を実施するための一般化可能なシステムを開発した。図9は、GFPレポーター配列の上流のcrRNA配列を特徴とする2入力ANDゲートを示す。システム中の2つの入力は、crRNAゲートのコグネートtaRNA配列の半分を含有する2つのRNA配列AおよびBである(図9A)。2つの入力RNAは、それらが細胞内部に存在する場合に両方のRNAの互いの結合を可能とするハイブリダイゼーションドメイン(u−u*)も有する。このハイブリダイゼーションイベントが生じる場合、2つのtaRNAの半分が近接し、ゲートcrRNAを巻き戻してGFPの翻訳をトリガーし得る配列を提供する。入力RNAのそれぞれは、そのままで発現される場合、そのcrRNAを脱抑制し得ない。それというのも、それらは、(1)crRNAステムの十分に長い領域を巻き戻し得ないため(入力Bについてのケースである)、または(2)それらは、動力学的および熱力学的にcrRNAへの結合が損なわれるためである(入力Aについてのケースである)。2入力AND論理システムについてのフローサイトメトリー計測は、大腸菌(E.coli)中のその演算を検証する(図9B)。GFP出力は、システム中の3つ全てのRNAが細胞内部で発現される場合にのみ活性化される一方、それは全ての他のケースにおいて低い。
リボレギュレータートーホールドリプレッサー
本発明者らは、44個のトーホールドリプレッサー(デバイス/システム)のライブラリーを構築し、それらの機能を大腸菌(E.coli)BL21 Star DE3中で試験した。本発明者らは、フローサイトメトリーを使用してシステムの性能を試験し、オフ状態(すなわち、コグネートトリガーの存在下);およびオン状態(すなわち、コグネートトリガーの不存在下)のスイッチからモードGFP蛍光を計算した。次いで、本発明者らは、式:
%抑制=1−[オフ状態モード蛍光÷オン状態モード蛍光]
を使用して抑制レベルパーセントを計算した。
トーホールドスイッチ
本明細書に記載のとおり、本発明は、新たなクラスの、公知の天然相当物を有さないいわゆるトーホールドスイッチにおける遺伝子発現の転写後リボレギュレーターを提供する。トーホールドスイッチは、トランス作用トリガーRNAに応答して調節される遺伝子を活性化する。生細胞中のこれらの演算は、2つの新規機序により促進される:インビトロ試験において開発されたトーホールドベース直鎖−直鎖RNA相互作用および開始コドンを包囲する領域中の塩基対形成を介する効率的な翻訳抑制。本発明者らは、トーホールドスイッチが100倍超だけタンパク質発現のモジュレーションを定型的に可能とすることを実証し、最良のスイッチは、タンパク質ベースレギュレーターのダイナミックレンジに匹敵する。本発明者らは、オルソゴナルコンポーネントの大型セット、例として、2%未満のシステムクロストークレベルを示し、これまで報告されたタンパク質またはRNAベースのオルソゴナル調節エレメントの最大および最もストリンジェントなファミリーを構成する18個のトーホールドスイッチのライブラリーを検証した。次いで、本発明者らは、406の平均オン/オフ蛍光比を有する13個のトーホールドスイッチのセットをフォワードエンジニアリングした。本発明者らは、熱力学的分析をさらに適用してシステム性能の変動を予測した。さらに、本発明者らは、機能mRNA分子から効率的にトリガーし得るトーホールドスイッチのセットを実証する。これらのトーホールドスイッチの高いダイナミックレンジ、オルソゴナル性、プログラマブル性、および多用途性は、それらが合成生物学のための強力な新ツールであることを示唆する。
株、プラスミド、および増殖条件。以下の大腸菌(E.coli)株を本試験において使用した:BL21 Star DE3(F−ompT hsdSB(rB −mB −)gal dcm rne131(DE3);Invitrogen)、BL21 DE3(F−ompT hsdSB(rB −mB −)gal dcm(DE3);Invitrogen)、MG1655Pro(F−λ−ilvG−rfb−50 rph−1 SpR lacR tetR)、およびDH5α(endA1 recA1 gyrA96 thi−1 glnV44 relA1 hsdR17(rK −mK +)λ−)。全ての株を、適切な抗生物質を有するLB培地中で増殖させた。抗生物質は、以下の濃度において使用した:アンピシリン(50μg mL−1)、カナマイシン(30μg mL−1)、およびクロラムフェニコール(34μg mL−1)。
本明細書において、タンパク質翻訳の転写後活性化を可能とする新たなリボレギュレーターのシステムが提供される。従来のリボレギュレーターとは異なり、本発明の合成リボレギュレーターは、トーホールド媒介直鎖−直鎖相互作用を利用してRNA−RNA鎖置換相互作用を開始させる。さらに、これらはスタートコドン周囲の領域の封鎖に依存してタンパク質翻訳を抑制し、翻訳を妨害するRBSまたはスタートコドン自体へのいかなる塩基対形成も回避される。結果として、これらのリボレギュレーターは、実質的に任意の配列を有するトリガーRNAに応答してタンパク質翻訳を活性化するように設計することができ、コンポーネントオルソゴナル性のかなりの改善を可能とする。RBSへの結合の不存在および熱力学的に好ましい直鎖−直鎖相互作用の使用は、RBSエンジニアリングを介する翻訳効率の容易な調整も可能とする。結果的に、これらのシステムは、2桁を超えるタンパク質発現のモジュレーションを定型的に可能とする。これらの相互作用機序の準デジタルシグナルプロセシング挙動に基づき、それらのリボレギュレーターシステムは本明細書においてトーホールドスイッチと称される。
トーホールドスイッチは、転写後レベルにおいて翻訳を調節するための多用途および強力な新たなプラットフォームを表す。これらは、前例のないコンポーネントオルソゴナル性の程度と、広く使用されるタンパク質ベース調節エレメント22と同等のシステムダイナミックレンジとを組み合わせる。インビボスイッチ−トリガーペアワイズ相互作用の包括的評価は、12%未満のクロストークレベルを有する26個のトーホールドスイッチのセットをもたらした。本発明者らの認識によれば、このことは、これまで報告されたオルソゴナル調節エレメントの最大ライブラリーを表し、従来のライブラリーをサイズにおいて3倍超だけ超過する(Takahashi et al.,Nucleic Acids Res.,2013)。現時点において、トーホールドスイッチのオルソゴナルセットの最終的なサイズは、本発明者らのクロストークアッセイのスループットにより限定され、リボレギュレーター固有の設計特徴によっては限定されない。さらに、13個のトーホールドスイッチシステムのフォワードエンジニアリングは、406の平均オン/オフ蛍光比を示す12個の新たな高性能コンポーネントのサブセットを生じさせ、完全セットの性能は2パラメータ熱力学的モデルにより予測される。
いくつかの本発明の実施形態を本明細書に記載および説明したが、当業者はその機能を実施し、および/または本明細書に記載の結果および/または1つ以上の利点を得るための種々の他の手段および/または構造の構想を容易に想定し、そのような変形または改変のそれぞれが、本明細書に記載の本発明の実施形態の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成が本発明の教示が使用される1つまたは複数の特定の出願に依存することを容易に認識する。当業者は、定型実験を超えないものを使用して、本明細書に記載の特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。したがって、上記の実施形態が例示によってのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載され、特許請求された以外に実施することができることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法に指向される。さらに、2つ以上のこのような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の任意の組合せも、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法が相互に不一致でない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
Claims (63)
- 一本鎖トーホールドドメインと、
開始コドンを含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、
リボソーム結合部位を含むループドメインと、
コードドメインと
を含むRNA
を含むトーホールドリボレギュレーター。 - スペーサードメインをさらに含む、請求項1に記載のリボレギュレーター。
- 前記スペーサードメインが、低分子量アミノ酸を含み、コードする、請求項2に記載のリボレギュレーター。
- 前記スペーサーが、約9〜33ヌクレオチド長である、請求項2または3に記載のリボレギュレーター。
- 前記スペーサーが、約21ヌクレオチド長である、請求項2または3に記載のリボレギュレーター。
- 前記スペーサードメインが、前記ステムドメインと前記コードドメインとの間に位置している、請求項2〜5のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記ステムドメインが、前記開始コドンの上流(5’)および/または下流(3’)配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記開始コドンの前記上流配列が、約6ヌクレオチドである、請求項7に記載のリボレギュレーター。
- 前記開始コドンの前記下流配列が、約9ヌクレオチドである、請求項7または8に記載のリボレギュレーター。
- 前記開始コドンの前記下流配列が、ストップコドンをコードしない、請求項7〜9のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記コードドメインが、レポータータンパク質をコードする、請求項1〜10のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項11に記載のリボレギュレーター。
- 前記コードドメインが、非レポータータンパク質をコードする、請求項1〜10のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記トーホールドドメインが、天然存在RNAに配列において相補的である、請求項1〜13のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記トーホールドドメインが、非天然存在RNAに配列において相補的である、請求項1〜13のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のリボレギュレーターのトーホールドドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まないか、または最小の二次構造を含む第1のドメインと、
前記トーホールドドメインの下流(3’)配列にハイブリダイズする第2のドメインと
を含むトランス活性化RNA(taRNA)。 - 前記第1のドメインが、前記トーホールドドメインに100%相補的である、請求項16に記載のトランス活性化RNA。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のリボレギュレーターと、
請求項16または17に記載のトランス活性化RNA(taRNA)と
を含むシステム。 - 細胞である、請求項18に記載のシステム。
- 前記細胞が、原核細胞である、請求項19に記載のシステム。
- 無細胞インビトロシステムである、請求項18に記載のシステム。
- 前記リボレギュレーターおよび前記taRNAが、互いにハイブリダイズされる、請求項18〜21のいずれか一項に記載のシステム。
- リボレギュレーターとtaRNAとの比が、1未満、0.5未満、または0.1未満である、請求項18〜22のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記リボレギュレーターが、第1の核酸中に含まれ、前記taRNAが、第2の核酸中に含まれる、請求項18〜23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の核酸が、第1のプラスミドであり、前記第2の核酸が、第2のプラスミドである、請求項24に記載のシステム。
- 前記第1のプラスミドが、中コピー複製起点を含み、前記第2のプラスミドが、高コピー複製起点を含む、請求項24に記載のシステム。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載のリボレギュレーターを含む核酸。
- 請求項27に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項16または17に記載のトランス活性化RNA(taRNA)を含む核酸。
- 請求項29に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 試料中のRNAの存在を検出する方法であって、
請求項1に記載のリボレギュレーターと試料とを、前記内因性RNAの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記内因性RNAの不存在下で可能としない条件下で合わせること、前ここで、記リボレギュレーターは、内因性RNAに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む;そして
前記レポータータンパク質を前記内因性RNAの指標として検出すること、
を含む方法。 - 細胞中のRNAの存在を検出する方法であって、
細胞中に請求項1に記載のリボレギュレーターを導入すること、ここで、前記リボレギュレーターは、前記細胞中の内因性RNAに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む;そして
前記レポータータンパク質を前記内因性RNAの指標として検出すること、
を含む方法。 - 前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項31または32に記載の方法。
- レポータータンパク質の量が、内因性RNAの量の指標である、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質翻訳を制御する方法であって、
請求項1に記載のリボレギュレーターと請求項16に記載のtaRNAとを、前記taRNAの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記taRNAの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含み、こ前記リボレギュレーターは、前記taRNAに相補的なトーホールドドメインを含み、前記リボレギュレーターは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む、方法。 - リボソーム結合部位を含む完全または部分二本鎖ステムドメインと、
ループドメインと、
コードドメインと
を含むRNA
を含み、
開始コドンは、前記ステムドメインと前記コードドメインとの間に存在する、
ビーコンリボレギュレーター。 - 前記ステムドメインが、前記開始コドンの上流(5’)配列を含む、請求項36に記載のリボレギュレーター。
- 前記開始コドンの上流配列は、約6ヌクレオチドである、請求項37に記載のリボレギュレーター。
- 前記コードドメインが、レポータータンパク質をコードする、請求項36〜38のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項39に記載のリボレギュレーター。
- 前記コードドメインが、非レポータータンパク質をコードする、請求項36〜38のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記ループドメインが、天然存在RNAに配列において相補的である、請求項36〜41のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 前記ループドメインが、非天然存在RNAに配列において相補的である、請求項36〜41のいずれか一項に記載のリボレギュレーター。
- 請求項36〜43のいずれか一項に記載のリボレギュレーターのループドメインにハイブリダイズし、二次構造を含まないか、または最小の二次構造を含む第1のドメインと、
前記ループドメインの上流(3’)配列にハイブリダイズし、前記ステムドメイン中に存在する第2のドメインと
を含むトランス活性化RNA(taRNA)。 - 前記第1のドメインが、前記ループドメインに100%相補的である、請求項44に記載のトランス活性化RNA。
- 請求項36〜43のいずれか一項に記載のリボレギュレーターと、
請求項44または45に記載のトランス活性化RNA(taRNA)と
を含むシステム。 - 細胞である、請求項46に記載のシステム。
- 前記細胞が、原核細胞である、請求項47に記載のシステム。
- 無細胞インビトロシステムである、請求項46に記載のシステム。
- 前記リボレギュレーターおよび前記taRNAが、互いにハイブリダイズされる、請求項46〜49のいずれか一項に記載のシステム。
- リボレギュレーターとtaRNAとの比が、1未満、0.5未満、または0.1未満である、請求項46〜50のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記リボレギュレーターが、第1の核酸中に含まれ、前記taRNAが、第2の核酸中に含まれる、請求項46〜51のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の核酸が、第1のプラスミドであり、前記第2の核酸が、第2のプラスミドである、請求項52に記載のシステム。
- 前記第1のプラスミドが、中コピー複製起点を含み、前記第2のプラスミドが、高コピー複製起点を含む、請求項52に記載のシステム。
- 請求項36〜43のいずれか一項に記載のリボレギュレーター
を含む核酸。 - 請求項55に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項44または45に記載のトランス活性化RNA(taRNA)
を含む核酸。 - 請求項57に記載の核酸を含む宿主細胞。
- 試料中のRNAの存在を検出する方法であって、
請求項36に記載のリボレギュレーターと試料とを、前記内因性RNAの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記内因性RNAの不存在下で可能としない条件下で合わせること、ここで、前記リボレギュレーターは、内因性RNAに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む;そして
前記レポータータンパク質を前記内因性RNAの指標として検出すること、
を含む方法。 - 細胞中のRNAの存在を検出する方法であって、
細胞中に請求項36に記載のリボレギュレーターを導入すること、ここで、前記リボレギュレーターは、前記細胞中の内因性RNAに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む;そして
前記レポータータンパク質を前記内因性RNAの指標として検出すること、
を含む方法。 - 前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項59または60に記載の方法。
- レポータータンパク質の量が、内因性RNAの量の指標である、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質翻訳を制御する方法であって、
請求項36に記載のリボレギュレーターと、請求項44に記載のtaRNAとを、前記taRNAの存在下で前記コードドメインの翻訳を可能とするが、前記taRNAの不存在下で可能としない条件下で合わせることを含み、前記リボレギュレーターは、前記taRNAに相補的なループドメインを含み、前記リボレギュレーターは、非レポータータンパク質をコードするコードドメインを含む、
方法。
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