JP7465507B2 - Staple核酸を利用したタンパク質翻訳反応の抑制法 - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
(1)第一、第二、第三及び第四のグアニン繰り返し配列(それぞれ、第一G配列、第二G配列、第三G配列、第四G配列という)を含む標的RNAに対し、前記グアニン繰り返し配列の近傍にハイブリダイズするオリゴマーを用い、当該オリゴマーの折り返しにより前記グアニン繰り返し配列を近づけてグアニン四重鎖構造を形成させることによりタンパク質発現を抑制する方法であって、
前記オリゴマーの一端側の一部の領域(一端側領域)の核酸及び他端側の一部の領域(他端側領域)の核酸が、第一G配列と第二G配列との間であってそれぞれ第一G配列の近傍及び第二G配列の近傍、第二G配列と第三G配列との間であってそれぞれ第二G配列の近傍及び第三G配列の近傍、又は第三G配列と第四G配列との間であってそれぞれ第三G配列の近傍及び第四G配列の近傍にハイブリダイズする、前記方法。
(2)前記オリゴマーは、その折り返しの方向がグアニン四重鎖構造側を向いてハイブリダイズするように設計される、(1)に記載の方法。
(3)標的RNAがmRNA、TPM3又はMYD8である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)オリゴマーがDNA又はRNAである、(1)~(3)のいずれか1項に記載の方法。
(5)オリゴマーがダイマーである、(1)~(4)のいずれか1項に記載の方法。
(6)タンパク質発現が、逆転写反応又はタンパク質翻訳反応である、(1)~(5)のいずれか1項に記載の方法。
(7)第一、第二、第三及び第四のグアニン繰り返し配列(それぞれ、第一G配列、第二G配列、第三G配列、第四G配列という)を含む標的RNAに対し、前記グアニン繰り返し配列を近づけてグアニン四重鎖構造を形成させるオリゴマーであって、
前記オリゴマーの一端側の一部の領域(一端側領域)の核酸及び他端側の一部の領域(他端側領域)の核酸が、第一G配列と第二G配列との間であってそれぞれ第一G配列の近傍及び第二G配列の近傍、第二G配列と第三G配列との間であってそれぞれ第二G配列の近傍及び第三G配列の近傍、又は第三G配列と第四G配列との間であってそれぞれ第三G配列の近傍及び第四G配列の近傍にハイブリダイズして、その折り返しにより前記グアニン繰り返し配列を近づけるものである、
前記オリゴマー。
(8)前記折り返しの方向がグアニン四重鎖構造側を向いてハイブリダイズするように設計される、(7)に記載のオリゴマー。
(9)DNA又はRNAである、(7)又は(8)に記載のオリゴマー。
(10)ダイマーである、(7)~(9)のいずれか1項に記載のオリゴマー。
(11) (7)~(10)のいずれか1項に記載のオリゴマーの製造方法であって、
オリゴマーの一端側の一部の領域(一端側領域)の核酸及び他端側の一部の領域(他端側領域)の核酸が、第一G配列と第二G配列との間であってそれぞれ第一G配列の近傍及び第二G配列の近傍、第二G配列と第三G配列との間であってそれぞれ第二G配列の近傍及び第三G配列の近傍、又は第三G配列と第四G配列との間であってそれぞれ第三G配列の近傍及び第四G配列の近傍にハイブリダイズするように設計し合成することを特徴とする前記方法。
(12) (7)~(10)のいずれか1項に記載のオリゴマー、又は(11)に記載の方法により製造されたオリゴマーを含む、タンパク質発現抑制キット。
標的となるRNAに含まれるグアニン繰り返し配列は、4か所に限らず、5か所以上含まれていてもよい。また、第一、第二、第三及び第四のグアニン繰り返し配列は、4か所以上のグアニン繰り返し配列から任意に選択される4か所の配列を意味し、必ずしも、連続する4か所のグアニン繰り返し配列にG-quadruplex構造を形成させることを意味するものではない。例えば、あるRNAに6か所のグアニン繰り返し配列が存在すると仮定すると、5’側から順に第1、第2、第3及び第4番目のグアニン繰り返し配列によりG-quadruplex構造を形成させてもよく、第1、第2、第5及び第6番目のグアニン繰り返し配列によりG-quadruplex構造を形成させることもできる。要するに、G-quadruplex構造を形成してRNAのタンパク質発現が抑制される限り、4か所のグアニン繰り返し単位の位置は不問である。
ここで、本発明においてタンパク質発現の抑制とは、例えばmRNAからの逆転写反応の抑制、RNAからタンパク質への翻訳反応の抑制などが含まれる。
Staple核酸は、DNAであってもよく、RNAであってもよい。Staple核酸の長さは、26~40ヌクレオチド長である。Staple核酸がRNAにハイブリダイズする領域の長さは、前記一端側領域及び他端側領域の長さが同じであっても異なってもよく、限定されるものではない。Staple核酸は、市販の核酸合成装置を用いることにより容易に得ることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
(1)DNAオリゴヌクレオチド
DNAオリゴヌクレオチドはユーロフィンジェノミクス株式会社、Integrated DNA Technologies株式会社、Thermo Fisher Scientific株式会社より購入した。すべてのサンプルはOPC精製または脱塩されており、RNA G-quadruplexの形成や存在位置の確認やin vitroにおけるタンパク質翻訳反応阻害効果を評価するために使用した。
(1)2+2_100nt RNA、2+2_100nt_Mut A RNAの準備とThioflavin Tを用いたRNA G-quadruplex形成の確認
下記ヌクレオチドを用いてアニールエクステンションを行った。
5’-TAATACGACTCACTATAGATTAGCATACGCTACTGCAGATGCGC-3’(配列番号1)
5’-GCTGAATAGCTTGCAAGTCATGGCATGCGCATCTGCAGTAGCGT-3’ (配列番号2)
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTA TAG-3’(配列番号3)
リバースprimer:5’- TCCAACTATGTATACCTGCTGAATAGCTTGCAAGTC-3’ (配列番号4)
フォワードprimer:5’-CTATAGTGAGTCGTATTAAATCGTCGAACGGCAGG-3’ (配列番号5)
リバースprimer:5’-CAGGTATA CATAGTTGGAAATCTCTGGAAGATCCG-3’ (配列番号6)
鋳型:
5’-ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGTTTGCACG CCTGCCGTTCGACGATTTAATACGACTCACTATAGATTAGCATACGCTACTGCAGTGGGTGGGTGTCGACCTAGATTAATGCAATTCGTACGAAGTTCATAGCATTTCCAGCACCCAATTGAAGCTTTGGGTGGGTGCATGCCATGACTTGCAAGCTATTCAGCAGGTATACATAGTTGGAAATCTCTGGAAGATCCGCGCGTACCGAGTTCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCA-3’ (配列番号7)
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTATAGAA-3’ (配列番号8)
リバースprimer:5’-TCCAACTATGTATAC CTG-3’ (配列番号9)
フォワードprimer:5’-CCTAGATTAATGCAATTC GTGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC-3’ (配列番号10)
リバースprimer:5’-TCAATTGGGTGCT GGAAATGAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG-3’ (配列番号11)
フォワードprimer:5’-CATTTCCA GCACCCAATTGAAGCTT-3’ (配列番号12)
リバースprimer:5’-ACGAATTGCATTAATCTAG GTCGAC-3’ (配列番号13)
フォワードprimer:5’- CTAGCCTCGAGAATTGATTAGCAT ACGCTACTGC-3’ (配列番号14)
リバースprimer:5’- CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTC AT-3’ (配列番号15)
(i) MutA-1
鋳型:5’-AGGGATTAGCATACGCTACTGCAGTAAAT AAATGTCGACCTAG-3’(配列番号16)
フォワードprimer:5’-CGGTACCCGGGGATCTAATACGACTCACTATAGGGAT TAGC-3’(配列番号17)
リバースprimer:5’-CACGAATTGCATTAATCTAGGTCGAC-3’(配列番号18)
(ii) MutA-2
鋳型:pMD19-2+2_100nt
フォワードprimer:5’-GTCGACCTAGATTAATGCAATTCGTG-3’(配列番号19)
リバースprimer:5’-AAGCTTCAATTGGGTGCTGGAA ATG-3’(配列番号20)
(iii) MutA-3
鋳型:5’-ATTGAAGCTTTAAATAAATGCATGCCATGACTTGCAAG-3’(配列番号21)
フォワードprimer:5’-CATTTCCAGCACCCAATTGAAGCTT-3’(配列番号22)
リバースprimer:5’-CGACTCTAGAGGATCCTGAATAGCTT GCAAGTCAT-3’(配列番号23)
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTATAGG GCTAGCCTCGAG-3’ (配列番号24)
リバースprimer:5’-CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTCAT-3’ (配列番号25)
または
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ (配列番号26)
リバースprimer: 5’-CGACTCTAGAGGATCCTGAATAG CTTGCAAGTCAT-3’ (配列番号27)
human genomic DNA(Novagen)を鋳型にし、以下のプライマーを用いてTPM3-5’UTRとMYD88-5’UTRの PCR増幅を行った。
フォワードprimer:5’-GTCACATCC GGGCGGGTTGGTGAGT-3’(配列番号28)
リバースprimer:5’-GGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3’(配列番号29)
または
フォワードprimer:5’-AGATTCCTACTTCTTACGCCCCCCA-3’(配列番号30)
リバースprimer:5’-TGTCTGCCAGCGCTTCCTCTTTCTC-3’(配列番号31)
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTATAGGTCACATCCGG GCGGGTTGGTGAGT-3’(配列番号32)
リバースprimer:5’-TCCAACTATGTATACCTGGGTGCCCACCCAGCTACT GCTCGCG-3’(配列番号33)
または
フォワードprimer:5’-TAATACGACTCACTATAGAGATTCCTACTTCTTACGCCCCC CA-3’(配列番号34)
リバースprimer:5’-TCCAACTATGTATACCTGTGTCTGCCAGCGCTTCCTCTTTCTC-3’(配列番号35)
フォワードprimer:5’-ACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAG-3’(配列番号36)
リバースprimer:5’-TGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3’(配列番号37)
RNA(0.3 μM)と5’-FAM-labeled 3’-DNA primer(0.1 μM)、Staples(1 μM)を含む溶液を80℃で3分間インキュベートし、30分かけて30℃まで温度を下げた。この溶液にReverTra Ace reverse transcriptase(TOYOBO)、MgCl2、dNTPsを加えて30分間逆転写反応を行い、得られた逆転写産物をABI3500キャピラリーDNAシーケンサー(ライフテクノロジーズジャパン)によりフラグメント解析を行った。
psiCHECK-2 vector(タカラバイオ.)を鋳型とし、以下のプライマーを用いてFirefly luciferase(F.L.)のPCR増幅を行い、得られたPCR産物をpIRES vector(タカラバイオ.)のEcoR Iサイトにクローニングした(pIRES-F.L.)。
フォワードprimer:5’-CTAGCCTCGAGAATT CGCCACCATGGCCGATGCTAAGAAC-3’(配列番号38)
リバースprimer: 5’- CTCGACGCGTGAATTTT ACACGGCGATCTTGCC-3’(配列番号39)
フォワードprimer:5’-CTAGCCTCGAGAATTGAT TAGCATACGCTACTGC-3’ (配列番号40)
リバースprimer:5’-CCATGGTGGCGAATTCTGAATAGCTTGCAAGTC AT-3’ (配列番号41)
または
フォワードprimer:
5’-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3’ (配列番号42)若しくは
5’-CTAGCCT CGAGAATTAGATTCCTACTTCTTACGCC-3’ (配列番号43)
リバースprimer:5’-CCATGGTGGCGAATTGTTTTCCC AGTCACGACG-3’ (配列番号44)
フォワードprimer:
5’-TAATACGACTCACTATAGGGCTAGCCT CGAG-3’ (配列番号45)
5’-TAATACGACTCACTATAGGGTCACATCCGGG-3’ (配列番号46)または
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCTAC-3’ (配列番号47)
リバースprimer:5’-CTCGACGCGTGAAT TTTACACGGCGATCTTGCC-3’ (配列番号48)
nLuc vector(タカラバイオ.)またはpsiCHECK-2 vector(タカラバイオ.)を鋳型とし、以下のプライマーを用いてNanoLuc luciferase(nLuc)およびrenilla luciferase(renilla)のPCR増幅を行い、得られたPCR産物をそれぞれpIRES vector(タカラバイオ.)のEcoR I、Not Iサイトにクローニングした(pIRES-nLuc-renilla)。
フォワードprimer:5’-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3’(配列番号49)
リバースprimer: 5’-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3’(配列番号50)
または
フォワードprimer:5’-TCGACCCGGGCGGCCATGGCTTCCAAGGTGTACG-3’(配列番号51)
リバースprimer:5’-TAAAGGGAAGCGGCCTTACTGCTCGTTCTTCAGC-3’(配列番号52)
フォワードprimer:5’-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3’(配列番号53)または5’-CTAGCC TCGAGAATTAGATTCCTACTTCTTACGCC-3’(配列番号54)
リバースprimer: 5’-CCATGGTGGCGAATT GTTTTCCCAGTCACGACG-3’(配列番号55)
(i)プライマーSTM1
フォワードprimer:5’-GATCCCCTACCGGAACTCACCA GCTACTGCTCGCGCTTTTTTA-3’ (配列番号56)
リバースprimer:5’-AGCTTAAAAAAGCGCGAGCAGTAGCTGGT GAGTTCCGGTAGGG-3’ (配列番号57)
フォワードprimer:5’-GATCCCCCCGGAACTCACCAGCTACTGCTCGCG TTTTTA-3’ (配列番号58)
リバースprimer:5’-AGCTTAAAAACGCGAGCAGTAGCTGGTGAGTTCCGGGGG-3’ (配列番号59)
フォワードprimer:5’-GATCCCCTCTATCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCCCTTTTTA-3’ (配列番号60)
リバースprimer:5’-AGCT TAAAAAGGGGCTCCAGATTGTGCCGCAGGAGATAGAGGG-3’ (配列番号61)
フォワードprimer:5’-GATCCCCTATCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCTTTTTA-3’ (配列番号62)
リバースprimer:5’-AGCTTAAAAAGG CTCCAGATTGTGCCGCAGGAGATAGGG-3’ (配列番号63)
ThT実験に用いたStaple(40nt) 2+2_100nt:
insideloop TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(配列番号64)
Stop assayに用いたStaple 2+2_100nt:
insideloop 40nt TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(配列番号65)
2+2_100nt:
insideloop_逆連結 40nt AAGCTTCAATTGGGTGCTGGTTGCATTAATCTAGGTCGAC(配列番号66)
TPM3:DNA Staple insideloop 40nt GAAATACCGGAACTCACCAAAGCTACTGCTCGCGCTCCGG(配列番号67)
MYD88:DNA Staple outsideloop 40nt TTCCTCTTTCTCCTGCGGCATACAATCTGGAGCCCCGAGC(配列番号68)
2+2_100nt:RNA Staple insideloop 30nt UUAAUCUAGGUCGACAAGCUUCAAUUGGGU(配列番号69)
2+2_100nt:RNA Staple insideloop 26nt AAUCUAGGUCGACAAGCUUCAAUUGG(配列番号70)
2+2_100nt:insideloop TTGCATTAATCTAGGTCGACAAGCTTCAATTGGGTGCTGG(配列番号71)
2+2_100nt:insideloop_逆連結AAGCTTCAATTGGGTGCTGGTTGCATTAATCTAGGTCGAC(配列番号72)
TPM3:insideloop TGAAATACCGGAACTCACCAGCTACTGCTCGCGCTCCGGT(配列番号73)
MYD88:outsideloop CTTCCTCTTTCTCCTGCGGCACAATCTGGAGCCCCGAGCA(配列番号74)
RNA Staple insideloop 30nt UACCGGAACUCACCAGCUACUGCUCGCGCU(配列番号75)
TPM3:RNA Staple insideloop 26nt CCGGAACUCACCAGCUACUGCUCGCG(配列番号76)
MUD88:RNA Staple UAU outsideloop 30nt UCUAUCUCCUGCGGCACAAUCUGGAGCCCC(配列番号77)
MYD88:RNA Staple UAU outsideloop 26nt UAUCUCCUGCGGCACAAUCUGGAGCC(配列番号78)
6時間後、細胞をPBSで洗浄しPassive Lysis Bufferを用いて細胞溶解液を回収した。この細胞溶解液を4℃、3000 rpmで1分間遠心した後、その上澄み液とLuciferase Assay kit(Promega)、POWERSCAN・H1 microplate reader(BioTek)を用いてルシフェラーゼ活性を評価した。
Staple核酸によるG-quadruplex構造の構築は、G-quadruplex構造に結合すると蛍光シグナルを発することが知られているThioflavin Tを指示薬として用いて評価した(図 3(a))9。この実験では、100塩基のループ配列の両末端に近接したグアニン連続配列が2つ存在するモデルDNA配列(2+2 100nt型)を設計・使用した。また、コントロールとして、グアニン連続配列のグアニンをアデニンに変異させたDNA(2+2 100nt mutA型)を用いた(図3(b)(c))。
これらのDNA配列に対してStaple核酸を加えた結果、2+2 100nt型のDNAはStaple核酸の存在下でのみThioflavin Tの蛍光シグナルが増大した。一方で、2+2 100nt mutA型ではStaple核酸の有無にかかわらず、顕著な蛍光シグナル増大を確認することはできなかった。この結果は、Staple核酸が2+2 100nt型上にG-quadruplex構造を誘起したことを示すものである。
その結果、KClを含むトリス緩衝液中においてのみ強い蛍光シグナルが観察された(図 3(d))。これらの結果は、2+2 100nt型モデルDNAがStaple核酸により折りたたまれ、G-quadruplex構造を形成したことを示すものである。
その結果、無細胞タンパク質翻訳システムを用いたレポーターアッセイで、どちらの5’UTRを配置したモデルmRNAからのタンパク質翻訳もStaple核酸存在下で約60%抑制された(図6(c))。この結果は、Staple核酸が天然の標的mRNAからのタンパク質発現を抑制することを強く示す。
(1)DNAオリゴヌクレオチド
DNAオリゴヌクレオチドはユーロフィンジェノミクス株式会社、Integrated DNA Technologies株式会社、Thermo Fisher Scientific株式会社より購入した。すべてのサンプルはOPC精製または脱塩されており、RNA G-quadruplexの形成や存在位置の確認やin vitroにおけるタンパク質翻訳反応阻害効果を評価するために使用した。
天然遺伝子(TPM3、MYD88)の5’UTR配列を用いたin cell translation (Staple_TPM3_26nt_逆連結)
nLuc vector(タカラバイオ.)またはpsiCHECK-2 vector(タカラバイオ.)を鋳型とし、以下のプライマー1のセット又はプライマー2のセットを用いてNanoLuc luciferase(nLuc)およびrenilla luciferase(renilla)のPCR増幅を行い、得られたPCR産物をそれぞれpIRES vector(タカラバイオ.)のEcoR I、Not Iサイトにクローニングした(pIRES-nLuc-renilla)。
フォワードプライマー1:
fw. primer[5’-CTAGCCTCGAGAATTCGCCACCATGGTCTTCACACTCGAAG-3’](配列番号79)
リバースプライマー1:
rv. primer[5’-CTCGACGCGTGAATTTTACGCCAGAATGCGTTCG-3’](配列番号80)
(ii) プライマー2
フォワードプライマー2:
fw. primer[5’-TCGACCCGGGCGGCCATGGCTTCCAAGGTGTACG-3’](配列番号81)
リバースプライマー:
rv. primer[5’-TAAAGGGAA GCGGCCTTACTGCTCGTTCTTCAGC-3’](配列番号82)
human genomic DNA(Novagen)を鋳型にし、以下のプライマーを用いてTPM3-5’UTRの PCR増幅を行った。
fw. primer[5’-GTCACATCC GGGCGGGTTGGTGAGT-3’](配列番号83)
rv. primer[5’-GGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3’](配列番号84)
得られたPCR産物を鋳型にして以下のプライマーを用いてさらにPCR増幅を行い、得られたPCR産物をpMD19 vector(タカラバイオ.)にクローニングした(pMD19-TPM3)。
fw. primer[5’-TAATACGACTCACTATAGGTCACATCCGG GCGGGTTGGTGAGT-3’](配列番号85)
rv. primer[5’-TCCAACTATGTATACCTGGGTGCCCACCCAGCTACTGCTCGCG-3’](配列番号86)
fw. Primer:[5’-CTAGCCTCGAGAATTTCACATCCGGGCGGGTTG-3’](配列番号87))
rv. primer:[5’-CCATGGTGGCGAATT GTTTTCCCAGTCACGACG-3’](配列番号88)
また、以下のプライマーを用いてアニーリングを行い、Staple insert(TPM3_26nt_逆連結)を作製した。これをpSuper neo. A(oligoengine)のBgl II-Hind IIIサイト間にクローニングした(pSuper neo. A-Staple(Staple:TPM3_26nt_逆連結))。
fw. primer[5’- GATCCCCGCTACTGCTCGCGCCGGAACTCACCAT TTTTA -3’](配列番号89)
rv. primer[5’- AGCTTAAAAATGGTGAGTTCCGGCGCGAGCAGTAGCGGG -3’](配列番号90)
HEK293T細胞は培地A( 100 units/mlペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、10 %(v/v) fetal bovine serumを含むDulbecco’s modified Eagle medium)を用いて37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で培養した。96-well plateに1 well当たり2×104 cellsのHEK293T細胞をまいた。24 時間後、Transfection試薬(FuGENE、Promega)を用いてpSuper neo. A-Staple(Staple:TPM3_26nt_逆連結)またはmilliQ(control)をHEK293T細胞に導入しインキュベートした。
結果を図7に示す。TPM3をStaple核酸として使用(結合)しなかった場合は、発現の抑制は観察されなかった(図7)。
(1) Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C. Nature 1998, 391, 806.
(2)Ambros, V. Nature 2004, 431, 350.
(3)Jackson, A. L.; Linsley, P. S. Nature reviews. Drug discovery 2010, 9, 57.
(4)Jackson, A. L.; Burchard, J.; Leake, D.; Reynolds, A.; Schelter, J.; Guo, J.; Johnson, J. M.; Lim, L.; Karpilow, J.; Nichols, K.; Marshall, W.; Khvorova, A.; Linsley, P. S. Rna 2006, 12, 1197.
(5)Huppert, J. L.; Balasubramanian, S. Nucleic acids research 2007, 35, 406.
(6)Kumari, S.; Bugaut, A.; Huppert, J. L.; Balasubramanian, S. Nature chemical biology 2007, 3, 218.
(7)Katsuda, Y.; Sato, S.; Asano, L.; Morimura, Y.; Furuta, T.; Sugiyama, H.; Hagihara, M.; Uesugi, M. Journal of the American Chemical Society 2016, 138, 9037.
(8)Rothemund, P. W. Nature 2006, 440, 297.
(9)Fujita, H.; Kataoka, Y.; Tobita, S.; Kuwahara, M.; Sugimoto, N. Analytical chemistry 2016, 88, 7137.
(10)Bugaut, A.; Murat, P.; Balasubramanian, S. Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 19953.
(11)Hagihara, M.; Yoneda, K.; Yabuuchi, H.; Okuno, Y.; Nakatani, K. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2010, 20, 2350.
(12)Jang, S. K.; Davies, M. V.; Kaufman, R. J.; Wimmer, E. Journal of virology 1989, 63, 1651.
配列番号69、70、75-78:合成RNA
Claims (14)
- 第一、第二、第三及び第四のグアニン繰り返し配列(それぞれ、第一G配列、第二G配列、第三G配列、第四G配列という)を含む標的RNAに対し、前記グアニン繰り返し配列を近づけてグアニン四重鎖構造を形成させるオリゴヌクレオチドであって、
(i)前記オリゴヌクレオチドの一端側の一部の領域(一端側領域)の核酸が前記第一G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側の一部の領域(他端側領域)の核酸が前記第二G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(ii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側領域の核酸が前記第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、又は
(iii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側領域の核酸が前記第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズする、
前記オリゴヌクレオチド。 - (i)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第一G配列と第二G配列との間の領域の配列であって前記第一G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第二G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(ii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第一G配列と第二G配列との間の領域の配列であって前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(iii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第二G配列と第三G配列との間の領域の配列であって前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(iv)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第二G配列と第三G配列との間の領域の配列であって前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(v)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第三G配列と第四G配列との間の領域の配列であって前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、又は
(vi)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第三G配列と第四G配列との間の領域の配列であって前記第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズする、
請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。 - オリゴヌクレオチドの折り返しの方向がグアニン四重鎖構造側を向いてハイブリダイズするように設計される、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 標的RNAがTPM3又はMYD88のmRNAである、請求項1~3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- DNA、RNA又は人工核酸である、請求項1~4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- ダイマーである、請求項1~5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
(i)前記オリゴヌクレオチドの一端側の一部の領域(一端側領域)の核酸が前記第一G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側の一部の領域(他端側領域)の核酸が前記第二G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(ii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側領域の核酸が前記第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、又は
(iii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、他端側領域の核酸が前記第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズするように
設計し合成することを特徴とする前記オリゴヌクレオチドの製造方法。 - (i)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第一G配列と第二G配列との間の領域の配列であって前記第一G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第二G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(ii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第一G配列と第二G配列との間の領域の配列であって前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(iii)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第二G配列と第三G配列との間の領域の配列であって前記第二G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第三G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(iv)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第二G配列と第三G配列との間の領域の配列であって前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、
(v)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第三G配列と第四G配列との間の領域の配列であって前記第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、又は
(vi)前記オリゴヌクレオチドの一端側領域の核酸が、前記第三G配列と第四G配列との間の領域の配列であって前記第四G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズし、前記他端側領域の核酸が、前記第一G配列、第二G配列若しくは第三G配列の近傍の領域の配列とハイブリダイズする、
請求項7に記載の方法。 - 請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項7若しくは8に記載の方法により製造されたオリゴヌクレオチドを含む、タンパク質発現又はRNAの逆転写反応抑制キット。
- タンパク質発現が、タンパク質翻訳反応である、請求項9に記載のキット。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、又は請求項7若しくは8に記載の方法により製造されたオリゴヌクレオチドを含む、タンパク質発現又はRNAの逆転写反応抑制剤。
- タンパク質発現が、タンパク質翻訳反応である、請求項11に記載の抑制剤。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項7若しくは8に記載の方法により製造されたオリゴヌクレオチド、又は請求項11若しくは12に記載の抑制剤を含む、医薬組成物。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項7若しくは8に記載の方法により製造されたオリゴヌクレオチド、請求項9若しくは10に記載のキット、又は請求項11若しくは12に記載の抑制剤を使用することを特徴とするタンパク質発現又はRNAの逆転写反応を抑制する方法(ヒト体内での抑制を除く)。
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