KR20150080615A - 미분화 세포 제거 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 표적 물질을 미분화 세포에 도입하기 위한 방법 및 그를 위한 캐리어를 제공하는 것을 목적으로 하고 있으며, rBC2LCN 렉틴과 표적 물질을 융합시킨 rBC2LCN-표적 물질 융합체로서 미분화 세포에 접촉시킴으로써, 미분화 세포 특이적으로 표적 물질을 미분화 세포 내에 도입할 수 있다. 특히, rBC2LCN 렉틴과 세포 내에서 작용하는 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인을 융합한 rBC2LCN-독소 융합체는, 미분화 줄기 세포 제거제로서 작용하여, 줄기 세포를 분화 유도한 후의 배지 중에 투여함으로써, 미분화 상태의 줄기 세포만을 확실하게 살상할 수 있다.

Description

미분화 세포 제거 방법{UNDIFFERENTIATED CELL ELIMINATION METHOD}

본 발명은 이식하는 세포원으로부터 종양화의 원인이 되는 줄기 세포를 제거하는 방법 및 그를 위한 미분화 세포 제거제에 관한 것이다. 당해 방법에 의해 안정성이 높은 세포원을 효율적으로 간편하게 제공할 수 있기 때문에, 줄기 세포를 사용한 재생 의료의 가속화로 이어진다.

또한, 본 발명은 독성 화합물 등의 표적 화합물을 미분화 세포 특이적으로 세포 내에 도입할 수 있는 미분화 세포 내 수송용 캐리어 및 미분화 세포 내 도입용 조성물에 관한 것이다.

다능성 줄기 세포는 몸을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 성질이나 그의 미분화성을 유지할 수 있는 성질에 의해 주목을 모으고, 창약 스크리닝이나 질환 메커니즘 해명으로의 응용뿐만 아니라, 재생 의료의 재료로서 전세계에서 연구가 진행되고 있다.

2010년에 세계에서 첫 인간 ES 세포를 사용한 제1상 임상 시험이 미국에서 급성 척수 손상에 대하여 시작되고, 또한 망막 변성 질환에 대한 인간 ES 세포를 사용한 제1/2상 임상 시험의 치료 시험 허가 신청(IND)이 FDA에 의해 승인되어, 인간 다능성 줄기 세포를 사용한 재생 의료 연구는 비약적인 발전을 계속하고 있다.

특히, 일본발의 새로운 인간 다능성 줄기 세포인 iPS 세포는, 수정배를 사용하지 않는 등의 이유로부터 윤리적인 장벽이 낮으면서, 또한 자가 조직으로부터도 수립할 수 있다는 매우 큰 장점이 있어, 재생 의료 현장으로부터도 큰 기대를 모으고 있다. 일본에서는, 이화학 연구소 발생·재생 과학 종합 연구 센터나 첨단 의료 센터 등이, 가령 황반 변성증의 환자를 대상으로, iPS 세포를 사용한 임상 연구를 2013년도부터 개시할 계획이며, 게이오 대학도 2016년에 척수 손상 환자에 대한 임상 연구를 시작할 방침이다.

이와 같이, ES 세포나 iPS 세포와 같은 인간 다능성 줄기 세포의 임상 응용이 개시되는 가운데, 품질과 안전성을 확보하여 세포를 공급하는 체제에 관해서는 충분히 정비가 이루어져 있지 않다.

세포 치료에는 다능성 줄기 세포를 그대로 사용하는 것이 아니고, 원하는 세포로 분화시키고 나서 이식에 사용하지만, 원하는 세포로 분화시킨 세포원에 미분화의 줄기 세포가 혼입되어 있는 경우, 그 미분화 줄기 세포가 종양 형성의 원인이 되는 것이 지적되고 있다. 따라서, 세포 치료에 사용하는 세포원으로부터 미분화 줄기 세포, 즉 종양 형성 세포를 제거하는 기술의 개발이 요구되고 있다.

종래는, 나노그(Nanog), Oct3/4, Stm1 등의 미분화 특이적 마커의 프로모터의 하류에 GFP 등의 형광 단백질의 유전자를 조합하고, 형광을 발한 미분화 세포를 플로우 사이토메트리 등으로 제거하는 방법이 제안되고 있었다(특허문헌 1). 그러나, 이 방법에서는 게놈을 개변하는 데 있어서 시간과 노동력이 걸려, 대량의 세포를 처리하는 것은 어려웠다. 또한, 지금까지의 보고에 의하면, 생체 염색이 가능한 단일의 미분화 세포 특이적 항체를 사용하여, 플로우 사이토메트리 등으로 제거하는 방법으로도 완전히 미분화 세포를 제거하는 것은 어렵다고도 한다(비특허문헌 2). 따라서, 이식하는 분화 세포로부터, 분화된 세포를 흠집을 입히지 않고, 종양화의 원인으로 되는 미분화 세포만을 확실하면서 또한 효율적으로 제거하기 위한 방법이 요구되고 있었다. 특히, 배지에 첨가하는 것만으로 미분화 세포만을 죽일 수 있는, 간편하면서 또한 효율적인 미분화 세포 제거제의 개발이 요망되고 있었다.

일본 특허 공개 제2005-95027호 공보

Tateno H, Toyota M, Saito S, Onuma Y, Ito Y, Hiemori K, Fukumura M, Matsushima A, Nakanishi M, Ohnuma K, Akutsu H, Umezawa A, Horimoto K, Hirabayashi J, Asashima M., J Biol Chem. 2011 Jun 10; 286(23):20345-53. Tang C, Lee AS, Volkmer JP, Sahoo D, Nag D, Mosley AR, Inlay MA, Ardehali R, Chavez SL, Pera RR, Behr B, Wu JC, Weissman IL, Drukker M., Nat Biotechnol. 2011 Aug 14; 29(9):829-34. Sulak O, Cioci G, Delia M, Lahmann M, Varrot A, Imberty A, Wi㎜erova M., Structure. 2010 Jan 13; 18(1):59-72. International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007 Jul; 25(7):803-16. Weldon JE, Pastan I. FEBS J. 2011 Dec; 278(23):4683-700. Review. Mancheno JM, Tateno H, Sher D, Goldstein IJ. Adv Exp Med Biol. 2010; 677:67-80. Review. Onuma, Y., et al, (2013) Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 431, 524-529. Tateno H., et.al, (2013) Stem Cells Transl. Med. 2, 265-273. Rumbaut RE, Sial AJ. Microcirculation. 1999 Sep; 6(3):205-13. Tateno H, et.al, Nakamura-Tsuruta S, Hirabayashi J. Nat Protoc. 2007; 2(10):2529-37. Liang YJ, et.al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 28; 107(52):22564-9. Hasehira K, et.al, Stem Cells Transl Med. 2013 Apr; 2(4):265-73.

본 발명의 과제는, 이식하는 분화 세포로부터 미분화 세포를 제거하기 위한, 간편하면서 또한 효율적인 방법을 제공하는 것이며, 구체적으로는 미분화 상태의 줄기 세포에만 선택적으로 반응하는 렉틴에, 독소 단백질 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인, RNAi 물질, 또는 저분자 독성 화합물 등의 세포 독성을 갖는 독성 화합물(독소)을 융합시킨 융합체를 사용하여, 미분화 상태의 줄기 세포만을 확실하게 제거하는 방법 및 그를 위한 미분화 세포 제거제를 제공하는 것이다.

또한, 동시에, 미분화 세포 특이적으로, 표적 화합물을 세포 내로 수송하기 위한 세포 내 수송용 캐리어(세포 도입제)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 이전 렉틴 마이크로어레이를 사용하여, 5종류의 상이한 체세포(피부, 태아폐, 자궁내막, 태반 동맥, 양막)로부터 제작한 인간 iPS 세포(114검체)와, 인간 ES 세포(9검체)의 당쇄 프로파일을 망라적으로 해석했다. 그 결과, 원래의 체세포가 조직마다 상이한 당쇄 프로파일을 가지고 있었음에도 불구하고, 제작된 iPS 세포는, 모두 거의 동일한 당쇄 프로파일을 나타내고, 초기화 유전자의 도입에 의해 균일하게 ES 세포와 유사한 당쇄 구조에 수렴화되는 것을 발견했다. 인간 ES·iPS 세포와 인간 체세포의 렉틴 어레이 데이터를 상세하게 해석한 결과에 의하면, 미분화의 인간 ES·iPS 세포에서는, 체세포와 비교하여 α2-6Sia, α1-2Fuc, 타입 1 LacNAc의 발현량이 현저하게 증가되고 있는 것이 추정되었기 때문에, 그 점을 또한 DNA 어레이를 사용한 당전이 효소 유전자의 발현 해석을 사용한 방법에 의해 당해 추정을 뒷받침했다(비특허문헌 1).

본 발명에 있어서 사용되는 rBC2LCN 렉틴은, 그램 음성 세균(Burkholderia cenocepacia) 유래의 BC2L-C 단백질의 N 말단 도메인에 대응한 BC2LCN 렉틴(YP_002232818)을 형질 전환 대장균에서 발현시킨 재조합체이며, 복합 당쇄의 비환원 말단의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」당을 인식하는 렉틴이다(비특허문헌 1, 3).

본 발명자들은, 상술한 렉틴 어레이를 사용한 실험에 있어서, 당해 rBC2LCN 렉틴이, 모든 인간 ES·iPS 세포와 반응하기는 하지만, 분화된 체세포와는 전혀 반응하지 않는 것을 발견했다. 당해 렉틴은, 인간 ES·iPS 세포에서 고발현되고 있고 분화된 체세포에서는 거의 발현이 없는 당쇄인 「α1-2Fuc」, 「타입 1 LacNAc」 및 「α2-6Sia」 중 2개(α1-2Fuc, 타입 1 LacNAc)를 갖는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(=H 타입 1구조)」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(=H 타입 3구조)」의 당쇄 구조와 특이적으로 반응하고 있다고 이해된다.

이것은, rBC2LCN 렉틴이 인식하는 당쇄 리간드는 미분화 줄기 세포를 특징짓는 신규 미분화 당쇄 마커인 것을 나타내는 것이면서, 또한, rBC2LCN 렉틴은, 당해 미분화 당쇄 마커 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(이하, 양자를 아울러 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」라고 하는 경우도 있음)에 특이적인 프로브로서 사용할 수 있는 것을 나타내고 있다.

그 후, 드러커(Drukker) 등의 팀에 의해, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」을 인식하는 항체가, 미분화 상태의 ES 세포 및 iPS 세포를 인식하는 것이 발견되어(비특허문헌 2), 본 발명자들의 상기 지견이 뒷받침되었다. 그러나, 드러커 등의 상기 항체는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(=H 타입 1구조)」에는 특이적으로 반응하기는 하지만, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」와는 반응하지 않는다. 이것은, rBC2LCN 렉틴과 비교하면, 미분화 줄기 세포 중 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc 함유 당쇄」를 검출할 수 없는 것이기 때문에, 미분화 줄기 세포 마커를 검출하기 위하여 사용한 경우에는 식별성의 관점에서는, rBC2LCN 렉틴에는 미치지 않는 것이 예측된다.

본 발명자들은 최근들어 rBC2LCN 렉틴이 미분화 상태를 유지한 인간 ES 세포나 iPS 세포를 매우 강하게 염색하는 것에 반하여, 피더 세포나, 분화시킨 세포에는 전혀 반응하지 않는 것을 밝혔다. 미분화 줄기 세포에 대한 염색성은 균일하고 안정적이면서, 또한 재현성 높고, 백그라운드는 거의 관찰되지 않고, 감도, 특이성, 세포 표면 마커인 점, 미분화 줄기 세포를 배지에서 배양한 상태에서 살아있는 상태에서 염색할 수 있고, 그 때에 미분화성을 상실시키지 않고 독성도 나타내지 않는 점, 등 실용적으로 사용하는 경우에 상정되는 모든 성능에 있어서, 종래 사용되어 온 미분화 마커(SSEA4, Tra-1-60, Tra-1-81, 나노그(Nanog), Oct3/4)에 대한 항체를 훨씬 능가하는 것인 점을 확인할 수 있고, 특허 출원하고 있다(일본 특허 출원 제2012-267679호, 비특허문헌 7). 본 발명자들은 그 후, rBC2LCN이 인식하는 미분화 줄기 세포 표면의 표적 당단백질로서 포도칼릭신을 동정했다(비특허문헌 12). 특히 rBC2LCN은 포도칼릭신 상의 O형 당쇄, 특히 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H 타입 3당쇄)」를 인식하고 있다고 생각되었다. 포도칼릭신은 무친 유사 도메인을 갖기 때문에, rBC2LCN이 인식하는 O형 당쇄는 포도칼릭신 상에서 무수한 클러스터를 형성하고 있다고 예측된다(비특허문헌 8). 미분화 세포에 있어서의 포도칼릭신 자체의 발현량도 많은 점에서, rBC2LCN이 인식하는 표적 분자는 미분화 세포 상에서 고밀도로 존재하고 있게 된다. 이 결과는, rBC2LCN이 렉틴으로서는 드물게, 미분화 줄기 세포에 대한 현저한 특이적 염색능을 갖고 있는 이유 중 하나로 되어 있다.

이러한 미분화 세포에의 특이성 및 친화성이 우수한 rBC2LCN 렉틴을 사용하면, 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인을 융합시켜 융합 단백질로서 미분화 세포를 포함하는 시료를 처리함으로써, 종양화의 원인이 되는 미분화 줄기 세포만을 특이적이면서 또한 효율적으로 제거할 수 있다고 생각되어진다.

그러나, 이전에 보고된 rBC2LCN 렉틴과 당쇄의 결합 상태의 X선 해석 결과로, rBC2LCN 렉틴이 삼량체를 형성하고, 2개의 서브 유닛간에서 당쇄를 끼우는 상태에서 인식하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 이것은, rBC2LCN 렉틴을 융합 단백질로서 사용하는 경우에, rBC2LCN 렉틴 본래의 미분화 줄기 세포에 대한 「선택성」, 「특이성」, 「친화성」을 유지하기 위하여, 그 「삼량체」라는 고차 구조를 유지하는 것이 필수적인 것을 의미한다. 그로 인해, rBC2LCN에 세포 살상 능력이 있는 도메인을 융합시킨 융합 단백질이, rBC2LCN 렉틴의 「삼량체」 구조를 유지하면서, 또한 미분화 줄기 세포에 대한 「선택성」, 「특이성」, 「친화성」을 유지한 채, 세포 살상 능력이 있는 도메인 본래의 세포 살상 기능을 발휘시키는 것은 매우 어려운 것임이 예상되었다. 하물며, 배지에 첨가하는 것만으로 미분화 세포만을 완전히 살상할 수 있을 정도의 높은 선택성, 친화성 및 살상 능력을 겸비한 rBC2LCN 융합 단백질을 개발할 수 있을 가능성은 거의 없는 것이 상정되었다. 게다가, rBC2LCN 융합 단백질의 제조 시에도, 대장균의 가용성 획분으로부터 제조하고자 한 경우에, rBC2LCN 자체의 분자의 크기나 고차 구조를 감안하면, rBC2LCN의 당쇄 결합 활성을 유지한 상태에서의 효율적인 제조법의 구축에는 큰 곤란이 예상되었다.

이러한 곤란이 다수 예측되는 가운데, 본 발명자들은, 먼저 rBC2LCN에 예상되는 고차 구조에의 영향을 가능한 한 적게 하면서, 또한 큰 세포 살상 효과를 기대할 수 있는 세포 살상 능력이 있는 도메인의 후보로서, 세포 표면에서 작용하여, 세포에 구멍을 형성하는 기능을 갖는 타입의 세포 살상 능력이 있는 도메인에 주목했다. 세포에 구멍을 형성하는 기능을 갖는 타입의 세포 살상 능력이 있는 도메인으로서는 예를 들어 아에롤리신(aerolysin)이 알려져 있지만(비특허문헌 6), 그 중에서도 LSLa 렉틴의 C 말단 도메인과의 융합 단백질(rBC2LCN-LSLC)을 제작했다(비특허문헌 6). LSLa 렉틴은, 버섯의 1종인 송이버섯(Laetiporus sulphureus) 유래의 렉틴이며, 세포 표면의 N-아세틸락토사민 당쇄를 인식하여 세포 표면에서 다량체화하여 세포막에 구멍을 뚫어, 세포를 살상하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6). 융합 단백질(rBC2LCN-LSLC)을 형질 전환 대장균으로 제조하고, 대장균 가용성 획분으로부터 1리터 배양당 수백 마이크로그램 정도를 정제할 수 있었다. 그러나, 고순도의 정제물은 얻을 수 없어, 다량체 형성능도, 미분화 세포 살상능도 없었던 점에서, 양쪽 도메인의 입체 구조가 무너져 버린 것을 생각할 수 있었다. 따라서, rBC2LCN과 LSLC 각각의 입체 구조를 손상시키지 않도록, 양자간에 충분한 거리를 형성하기 위해 Gly-Gly-Gly-Ser을 1 내지 3회 반복한 링커를 도입한 rBC2LCN-(GGGS)_1-3-LSLC의 제조를 행했다. rBC2LCN-(GGGS)_1-3-LSLC를 정제 후, 각종 농도로 미분화 줄기 세포에 반응시켰지만, 어느 융합 단백질이든 유감스럽게도 미분화 세포 살상능을 나타내지 않았다.

이 결과를 근거로 하여, 세포 표면에서 작용하는 세포 살상 능력이 있는 도메인 또는 독소에서는 미분화 세포에서 충분히 그 살상 능력을 작용시키지 못할 가능성이 높다고 결론짓고, 이어서, 세포 내에서 작용하는 타입의 세포 살상성 독소로, 세포의 단백질 합성 저해 활성을 갖는 독소를 시도하기로 했다. 결합 방식은 펩티드 결합을 선택하면서, 또한 양쪽 도메인 사이에는 충분한 거리를 형성하기로 했다. 독소 단백질로서는, 단백질 합성 저해 활성을 갖는 대표적인 세포 살상성 독소인, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)이 분비되는 외독소 엑소톡신(exotoxin) A(ETA) 유래의 세포 살상 능력이 있는 도메인 영역(이하, 당해 영역을 「ETA」라고 하는 경우도 있음)을 사용하여, 펩티드 결합에 의해 rBC2LCN과 결합시킨 융합 단백질을 제조했다. 그 때, Gly-Ser-Gly-Gly-Gly의 2회 반복하여 서열을 링커로서 사용하여 「rBC2LCN-(GSGGG)₂-ETA」를 합성하고, rBC2LCN과 ETA의 거리를 충분히 취한 rBC2LCN-ETA 융합 단백질로 했다. 형질 전환 대장균에서 발현시킨 후에 그 가용성 획분에 친화성 크로마토그래피를 적용한 바, 1회의 조작만으로, 균일한 상태의 「rBC2LCN-ETA」융합 단백질을 정제할 수 있었다.

한편, rBC2LCN의 다량체 형성에 대하여 겔 여과 크로마토그래피로 조사한 바, 이전 논문에서 보고되었던 삼량체가 아니고, 이량체를 형성하고 있는 것을 알 수 있었다. 다음에 rBC2LCN-ETA에 대해서도 조사한 바, 야생형의 rBC2LCN과 마찬가지로 이량체를 형성하고 있었다. 융합 단백질화했을 때에는 다량체 형성능이 파괴되는 것이 염려되었기 때문에, 이 결과는 놀라운 것이었다. rBC2LCN의 당쇄 리간드인 H 타입 1/3에 대한 해리 상수를 조사한 바, 융합 단백질화된 rBC2LCN-ETA(H 타입 1: 9.9μM, H 타입 3: 32.3μM)는, 야생형의 rBC2LCN(H 타입 1: 8.3μM, H 타입 3: 25.4μM)과 동일 정도인 것을 알 수 있었다. 또한, 인간 iPS 세포에 대한 결합성도, 야생형 rBC2LCN과 동일 정도이었다. 이상의 결과로부터, 융합 단백질화된 rBC2LCN-ETA는, 야생형의 rBC2LCN과 거의 동일한 결합 특성을 유지하고 있는 것을 알 수 있었다. 이 rBC2LCN-ETA를, 미분화 상태를 유지한 인간 ES 세포나 iPS 세포를 배양하고 있는 배지 중에 첨가한 바, 배지 중의 인간 ES 세포나 iPS 세포를 매우 효율적으로 살상하는 효과를 확인할 수 있었다. 게다가 그 작용이, 동일한 배지 중에 존재하는 피더 세포나, 분화시킨 세포에는 전혀 영향을 주지 않아, 미분화 세포에 대한 현저한 특이성을 유지한 작용인 것도 알 수 있었다. 그리고, 그대로 장기간 계속 배양해도 분화 세포 특성에는 변화가 보이지 않는 것도 확인할 수 있었다. 이들 결과는, rBC2LCN-ETA는, 미분화 세포 표면의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄 특이적으로 결합 후, 빠르게 미분화 세포 내에 침입하여, 미분화 세포 내에서는 「ETA」 도메인이 작용하여, 단백 합성에 필수적인 EF2 펩티드 신장 인자를 ADP-리보실화하여 미분화 세포에서의 단백질 합성을 모두 저해하여, 최종적으로 세포사를 유도한 것을 의미한다. 이러한 「rBC2LCN-ETA」의 미분화 세포 살상 작용은 매우 강력한 것은 놀랄 만한 일이며, 발명자들에 있어서도 기쁜 오산이었다.

여기서, 「rBC2LCN-ETA」가 미분화 세포 내에서 강한 세포 살상 작용을 나타냈다는 것은, 「rBC2LCN」과 「ETA」의 융합체가 빠르게 미분화 세포 내에 침입했기 때문에, 「ETA」에 의한 세포 내에서의 단백 합성 저해 작용을 충분히 발휘할 수 있었다고 이해되기 때문에, 「rBC2LCN-ETA」융합체에는 미분화 세포 내에 침입하는 능력이 있는 것을 의미하고 있다. 일반적으로 렉틴류는, 세포 표면의 특정한 당쇄를 인식하는 경우에는, 세포 표면의 당쇄에 특이적으로 결합한 상태에서 관찰되고 있기는 하지만, 인식한 당쇄를 통하여 세포 내에 침입하는 현상은 거의 알려져 있지 않은 것을 생각하면, ETA와 융합한 「rBC2LCN」이 미분화 세포 내에 침입하는 현상은 예상 밖이므로, 「rBC2LCN」의 특성으로서, 미분화 세포 표면의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄에 특이적으로 결합하는 작용과 함께, 결합 후에 당쇄를 통하여 미분화 세포 내에 침입시키는 작용도 갖고 있을 가능성을 생각할 수 있었다.

따라서, 「rBC2LCN」과 결합시켜 미분화 세포 살상 효과를 발휘시키는 독소로서는, 세포 내에서 작용하는 것이 명확한 독소가 적합하다고 생각하고, ETA와 마찬가지로 단백질 합성 저해 활성을 갖는 독소로부터 선택했다.

단백질 합성 저해 활성을 갖는 세포 살상성 독소로서는, 식물 종자에서 유래하는 맹독의 리신이나 사포린, 세균 유래의 외독소 등이 알려지지만, 그 중에서도 스트렙트아비딘과의 융합 단백질로서 구입이 가능한 사포린을 검토했다. 사포린은, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis)의 종자에 포함되는 단백질성 독소로, 직접 리보솜을 불활성화하여, 매우 저농도로 세포사를 야기할 수 있는 단백질이며, 스트렙트아비딘을 융합시킨 스트렙트아비딘(Streptavidin)-ZAP(어드밴스드 타게팅 시스템즈(Advanced Targeting Systems))으로서 시판되고 있다. rBC2LCN을 비오틴화시킨 후, 스트렙트아비딘-ZAP에 대하여 비오틴 아비딘 결합시켜 rBC2LCN-ZAP를 제조하고, 미분화 줄기 세포에 대하여 반응시켰다. 당초의 실험에서는, 미분화 줄기 세포에 대한 rBC2LCN-ZAP 융합체(스트렙트아비딘 융합 사포린+비오틴화 rBC2LCN)를, 스트렙트아비딘-ZAP 농도로서 1ng, 10ng, 100ng/2ml의 3단계로 작용시켰음에도 불구하고, 전혀 미분화 세포 살상 활성을 확인할 수 없었다. 당초는 그 결과를, 비오틴 아비딘계에서 rBC2LCN에 독소를 융합시키면, 다수의 독소가 랜덤하게 결합되어 버리기 때문에, rBC2LCN의 당 결합 활성을 크게 손상시켰기 때문이라고 해석했지만, 그 후, 당초의 어세이에서 사용한 rBC2LCN 및 독소의 양으로는, 미분화 세포 살상 활성을 일으키기 위한 양으로서 불충분할 가능성이 있는 것을 알아차렸다. 따라서, 다시 미분화 줄기 세포에 대한 rBC2LCN-ZAP 융합체를 당초 100배 이상이나 되는 농도로 작용시킨 바, 미분화 줄기 세포만을 살상할 수 있었다. 즉, rBC2LCN-독소 융합체에 있어서, 독소의 종류는 ETA에 한정되지 않고, rBC2LCN과의 결합 양식도 공유 결합뿐만 아니라, 스트렙트아비딘-비오틴 결합 양식으로도, 실질적으로 살상에 충분한 양의 독소를 포함하는 rBC2LCN-독소 융합체를 작용시키면, 미분화 줄기 세포를 효율적으로 살상할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, rBC2LCN에 저분자 독소를 연결한 경우의 미분화 줄기 세포의 살상 효과에 대해서도 검토했다. 저분자 독소로서는, 광세포 독성의 효과가 알려져 있는 FITC(비특허문헌 9)를 사용했다. 미분화 상태를 유지한 인간 iPS 세포를 배양하고 있는 배지 중에 FITC 표지 rBC2LCN을 첨가하고, 1시간 후에 여기광을 통상의 조사 시간보다도 오래 조사한 바, 인간 iPS 세포를 매우 효율적으로 살상하는 효과를 확인할 수 있던 점에서, 단백질 독소뿐만 아니라, 저분자 화합물 독소도 적용 가능한 것을 알 수 있었다. 또한, FITC는 세포 표면 항원을 표지하기 위하여 사용되는 경우는 있지만, 세포 내에 침입하는 성질에 관한 보고는 없어, FITC가 광세포 독성을 야기하는 메커니즘도 불분명하다. 그리고, 본 발명에서는, FITC의 rBC2LCN 융합체가 rBC2LCN의 인식 당쇄를 세포 표면에 갖지 않는 분화 세포에 대해서는, FITC가 전혀 세포 독성을 나타내지 않는 실험 결과가 얻어지고 있는 점에서, FITC가 융합한 것으로 「rBC2LCN」이 세포 내로의 침입능을 획득했다고는 생각하기 어렵다. 이것으로부터 보아, FITC-rBC2LCN 융합체의 세포 내 침입능은, 「rBC2LCN」 본래의 특성인 것이 강하게 시사되었다. 따라서, FITC 및 독성이 낮은 Cy3으로 표지한「rBC2LCN」을 미분화 세포에 대하여 작용시켜, 시간의 경과에 따라 관찰한 바, 어떤 경우든 처음에는 미분화 세포 표면의 당쇄에 결합되어 있지만, 시간이 경과될 때마다 세포 내로 모이는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 본 발명에서 사용한 야생형의 「rBC2LCN」 자신에 미분화 세포 표면의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄를 인식하여 결합할 뿐만 아니라, 당해 당쇄 또는 당쇄가 결합되어 있는 복합 당질을 통하여 세포 내에 침입하는 효과가 있는 것을 실증할 수 있었다. 이것은, 미분화 세포를 특이적으로 살상하려고 할 때에는, 세포 살상 능력이 있는 독소 성분이면 어떠한 독소이든, rBC2LCN에 결합시켜 「rBC2LCN-독소」융합체로서 미분화 세포에 작용시킴으로써, 빠르게 미분화 세포 내에 침입할 수 있기 때문에, 세포 내에서 독소 본래의 세포 독성을 발휘할 수 있는 것이다. 특히, 독소로서 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 타입의 독소, 예를 들어 단백 합성 저해 작용을 갖는 단백질 독소, 또는 저분자 화합물의 독소를 선택하면, 미분화 세포 내에서 효율적으로 세포 살상능을 발휘할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 분화 세포에 대해서는 배지 중에 rBC2LCN-독소 융합 단백질을 첨가한 상태에서 장기간 계속 배양해도, 분화 세포의 특성에는 전혀 변화가 보이지 않고, 분화 세포에 대해서는 전혀 독성이 없는 것을 확인할 수 있었기 때문에, 그대로 재생 의료용의 세포 이식 재료로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 rBC2LCN-독소 융합 단백질은, 배지 중에 첨가하는 것만으로, 인간 ES 세포·iPS 세포를 분화시킨 세포원으로부터, 잔존되어 있는 미분화 세포를 효율적으로 살상 제거할 수 있어, 이식 세포 재료의 종양화의 리스크를 감소시킬 수 있다.

또한, 본 발명자들의 최근의 연구(비특허문헌 7)에 의해, 미분화 세포를 rBC2LCN 존재 하에서 장기에 걸쳐 계속 배양해도 그 증식성에 영향을 주지 않는 것, 즉 rBC2LCN 자신에는 미분화 세포에 대한 독성이 없는 것이 확인되고 있다. 금회, 독성이 적은 표지용 색소 화합물인 Cy3을 rBC2LCN에 결합시킨 「Cy3-rBC2LCN」의 존재 하에서 미분화 세포를 장시간 배양하면, 미분화 세포 표면으로부터 시간이 경과될 때마다 세포 내부로 이행하는 것이 형광 관찰되었다. 즉, 「Cy3」이 rBC2LCN에 의해 미분화 세포의 세포 내부로까지 운반되어, 세포 내에서 「Cy3」 본래의 기능을 발휘할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 수십초 조사하면 독성을 발휘해 버리는 표지용 색소 화합물인 FITC의 경우에도, 통상의 형광 관찰용의 수초 이내의 단시간 조사이면, 미분화 세포를 살상시키지 않고, 세포의 내재화만을 관찰할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

그렇게 해 보면, 독소나 표지용 색소 화합물 이외의, 예를 들어 핵산이나 생리 활성 단백질 등이어도, rBC2LCN과 융합시켜 미분화 세포에 작용시킴으로써, 미분화 세포의 생존을 위협하지 않고 미분화 세포 내에 효율적으로 수송할 수 있어, 각각의 본래의 기능을 발휘할 수 있는 것이 명확해졌다.

이것은, rBC2LCN이, 다양한 화합물을 미분화 세포 특이적으로 세포 내로 수송하기 위한 캐리어(세포 내 도입제)로서 작용한 것이기 때문에, rBC2LCN을 캐리어로서 사용하는 미분화 세포 특이적인 세포 내 수송 시스템을 제공할 수 있었다고 할 수도 있다.

이상의 지견을 얻음으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

〔1〕 표적 물질을 미분화 세포 내에 도입하기 위한 방법이며,

표적 물질을, rBC2LCN과 화학적 또는 전기적으로 융합시켜, rBC2LCN-표적 물질 융합체로서 미분화 세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 미분화 세포 내 도입 방법.

〔2〕 표적 물질과 rBC2LCN이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕에 기재된 미분화 세포 내 도입 방법.

〔3〕 표적 물질과 rBC2LCN이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕에 기재된 미분화 세포 내 도입 방법.

〔4〕 rBC2LCN-표적 물질 융합체는, 형광 물질 또는 발광 효소에 의해 표지되어 있고, 형광 또는 발광을 발하는 위치를 관찰함으로써, 표적 물질이 미분화 세포 내에 도입된 것을 판정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 미분화 세포 내 도입 방법.

〔5〕 rBC2LCN을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 미분화 세포 내 도입용 캐리어.

〔6〕 상기 미분화 세포 내 도입용 캐리어는, 유효 성분으로서 포함되는 rBC2LCN을 표적 물질에 대하여 화학적 또는 전기적인 융합체를 형성시켜, rBC2LCN-표적 물질 융합체로서 미분화 세포 내에 침입시키는 것인, 상기 〔5〕에 기재된 미분화 세포 내 도입용 캐리어.

〔7〕 표적 물질과 rBC2LCN이 화학적 또는 전기적으로 융합하고 있는 rBC2LCN-표적 물질 융합체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 미분화 세포 도입용 조성물.

〔8〕 rBC2LCN-표적 물질 융합체가 형광 물질 또는 발광 효소에 의해 표지 되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔7〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔9〕 표적 물질과 rBC2LCN이, 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔7〕 또는 〔8〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔10〕 표적 물질이 단백질이며, rBC2LCN과 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합된 rBC2LCN-표적 물질 융합체가, 각각의 유전자를 결합시킨 융합 유전자를 사용하여 얻어진 발현 산물인 것을 특징으로 하는, 상기 〔9〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔11〕 표적 물질과 rBC2LCN이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔7〕 또는 〔8〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔12〕 표적 물질이, 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독성 화합물인, 상기 〔7〕 내지 〔11〕 중 어느 하나에 기재된 독성 화합물의 미분화 세포 도입용 조성물.

〔13〕 독성 화합물이, 단백질 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인, 세포 독성을 갖는 저분자 화합물, 또는 핵산인, 상기 〔12〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔14〕 독성 화합물과 rBC2LCN이, 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔12〕 또는 〔13〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔15〕 독성 화합물이 단백질 독소이며, rBC2LCN과 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합된 rBC2LCN-단백질 독소 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔14〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔16〕 상기 rBC2LCN-단백질 독소 융합체가, rBC2LCN 유전자 및 단백질 독소 유전자가 스페이서 서열을 개재하거나 또는 개재하지 않고 결합된 융합 유전자를 사용하여 얻어진 발현 산물인 것을 특징으로 하는, 상기 〔15〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔17〕 단백질 독소가, 녹농균의 외독소 A 유래 살상성 도메인(ETA)인 것을 특징으로 하는, 상기 〔15〕 또는 〔16〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔18〕 독성 화합물과 rBC2LCN이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합된 rBC2LCN-단백질 독소 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔14〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔19〕 독성 화합물이 저분자 독성 화합물이며, rBC2LCN과 저분자 독성 화합물이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 융합된 rBC2LCN-저분자 독성 화합물 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔14〕에 기재된 미분화 세포 도입용 조성물.

〔20〕 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독성 화합물과 rBC2LCN이 화학적 또는 전기적으로 융합하고 있는 rBC2LCN-독성 화합물 융합체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 미분화 줄기 세포 제거제.

〔21〕 독성 화합물이, 단백질 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인, 세포 독성을 갖는 저분자 화합물, 또는 핵산인, 상기 〔20〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔21〕 독성 화합물과 rBC2LCN이, 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합 또는 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합되어 있는 것을 특징으로 하는, 상기 〔20〕 또는 〔21〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔22〕 독성 화합물이 단백질 독소이며, rBC2LCN과 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 공유 결합된 rBC2LCN-단백질 독소 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔21〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔23〕 상기 rBC2LCN-단백질 독소 융합체가, rBC2LCN 유전자 및 단백질 독소 유전자가 스페이서 서열을 개재하거나 또는 개재하지 않고 결합된 융합 유전자를 사용하여 얻어진 발현 산물인 것을 특징으로 하는, 상기 〔22〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔24〕 단백질 독소가, 녹농균의 외독소 A 유래 살상성 도메인(ETA)인 것을 특징으로 하는, 상기 〔22〕 또는 〔23〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔25〕 독성 화합물과 rBC2LCN이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 비오틴-스트렙트아비딘 결합에 의해 융합된 rBC2LCN-단백질 독소 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔21〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔26〕 독성 화합물이 저분자 독성 화합물이며, rBC2LCN과 저분자 독성 화합물이 링커 또는 스페이서를 개재하거나, 또는 개재하지 않고 융합된 rBC2LCN-저분자 독성 화합물 융합체인 것을 특징으로 하는, 상기 〔21〕에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제.

〔27〕 줄기 세포를 분화 유도한 후의 배지 중에, rBC2LCN과 세포 독성을 발휘할 수 있는 상기 〔20〕 내지 〔26〕 중 어느 하나에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 줄기 세포의 살상 방법.

〔28〕 줄기 세포로부터 분화 유도된 분화 유도 후의 세포에 대하여, 상기 〔20〕 내지 〔26〕 중 어느 하나에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제를 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재생 치료용 이식 재료의 제조 방법.

〔29〕 줄기 세포를 비즈상, 중공사상 또는 평판상의 기재 위에서 배양하고, 계속하여 분화 유도 처리를 실시한 후에, 기재가 존재하는 배지 중에 상기 미분화 줄기 세포 제거제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔28〕에 기재된 제조 방법.

〔30〕 줄기 세포를 배양액 중에서 부유 배양하고, 계속하여 분화 유도 처리를 실시한 후에, 기재가 존재하는 배양액 중에 상기 미분화 줄기 세포 제거제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔28〕에 기재된 제조 방법.

본 발명에 의해, 처음으로 rBC2LCN이 미분화 세포 특이적으로 다양한 물질을 세포 내로 수송하는 캐리어(세포 내 도입제)로서 기능하는 것이 발견되어, 미분화 세포 특이적인 세포 내 수송 시스템을 제공할 수 있었다.

본 발명에 의해 제공된 rBC2LCN과 다양한 표적 물질의 융합체를 함유하는 조성물은, 미분화 세포가 존재하고 있는 세포군에 작용시키면, 미분화 세포 특이적으로 세포 내부에 침입하여, 표적 물질을 미분화 세포 내에 효율적으로 수송하여 당해 표적 물질 본래의 기능을 미분화 세포 내에서 발휘시킬 수 있으므로, 표적 물질에 대한 「미분화 세포 도입용 조성물」이라고 할 수 있다.

예를 들어, rBC2LCN-독소 융합체의 경우에는, 배지 중에 첨가하는 것만으로 미분화 줄기 세포를 특이적으로 살상 가능한, 우수한 「미분화 세포 제거제」로 된다. 본 발명의 「미분화 세포 제거제」를 피검 세포의 배지에 직접 첨가함으로써, 미분화 상태의 줄기 세포는 살상할 수 있는 것에 대하여, 당해 「미분화 세포 제거제」 존재 하에서 장기간 배양해도 분화 세포에는 독성이 없다.

따라서, 본 발명의 「미분화 세포 제거제」는, 이식에 사용하는 세포원으로부터 종양 형성 세포인 인간 iPS·ES 세포를 간편하면서 또한 효율적으로 제거할 수 있고, 안정성이 높은 이식 세포를 제조할 수 있기 때문에, 인간 ES·iPS 세포를 사용한 재생 의료에의 응용이 기대된다.

도 1은 rBC2LCN-ETA 서브 유닛의 구조
도 2는 rBC2LCN-ETA 정제 과정의 전기 영동상
도 3은 정제 BC2LCN-ETA의 전기 영동상
도 4는 rBC2LCN과 rBC2LCN-ETA의 겔 여과 크로마토그래피 해석
도 5는 rBC2LCN과 rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에의 결합
도 6은 인간 ES 세포에 대한 rBC2LCN-ETA의 살상 효과
도 7은 인간 iPS 세포에 대한 rBC2LCN-ETA의 살상 효과
도 8은 분화 세포에 대한 rBC2LCN-ETA의 살상 효과
도 9는 rBC2LCN-ETA의 살상 효과
도 10은 인간 iPS 세포에 대한 rBC2LCN-사포린(Saporin)의 살상 효과
도 11은 인간 iPS 세포에 대한 FITC 표지 rBC2LCN의 살상 효과
도 12는 인간 iPS 세포에의 FITC 표지 rBC2LCN 및 rBC2LCN-ETA의 내재화
도 13은 인간 iPS 세포에의 Cy3 표지 rBC2LCN 및 rBC2LCN-ETA의 내재화

1.rBC2LCN 렉틴에 대하여

(1-1) 「rBC2LCN 렉틴」의 당쇄 인식능에 대하여

본 발명에서 사용하는 「rBC2LCN 렉틴」 또는 그의 개변체는, 세포 표면의 미분화 당쇄 마커인 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(식 1)」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(식 2)」의 미분화 당쇄 마커와 특이적으로 결합한다.

「BC2LCN 렉틴」은, 그램 음성 세균(부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia))으로부터 찾은 렉틴이며, BC2L-C라고 불리는 단백질의 N 말단 도메인(GenBank/NCBI-GI 등록 번호: YP_002232818)에 상당한다(비특허문헌 3). BC2LCN은 TNF 유사 단백질에 구조 유사성을 나타내고, 용액 중에서는 삼량체를 형성하고, 2개의 서브 유닛간에서 당쇄를 끼우는 상태에서 인식하는 것이 알려져 있다. 당쇄 어레이를 사용한 해석으로부터, 이 렉틴은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H 타입　1당쇄)」, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H 타입　3당쇄)」와 함께, H 타입 1 또는 H 타입 3당쇄를 함유하는 당쇄 구조인, 「루이스(Lewis) b당쇄(Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc)」, 「글로보(Globo) H당쇄(Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc)」에 대해서도 결합 특이성을 나타내는 것이 명백해졌다.

「BC2LCN 렉틴」은, 당쇄를 포함하지 않으므로, 형질 전환 세균에 의해서도 대량 생산 가능하다. 구체적으로는, GenBank/NCBI-GI 등록 번호: YP_002232818(게놈(Genome) ID:206562055)의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 코드하는 BC2LCN 유전자를 사용하여, 적절히 숙주에 대하여 최적화한 후, 형질 전환한 대장균 등으로부터 발현시켜, 통상의 단백질 정제 수단에 의해 정제할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서도 재조합형 BC2LCN(rBC2LCN)을 사용하고 있으므로, 이하, 「rBC2LCN」이라고도 한다.

그 때, rBC2LCN 렉틴으로서는, 서열 번호 1에 대응하는 전체 길이는 필요로 하지 않고, 또한 서열 번호 1에 있어서 부분적으로 1부의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가되어 있는 경우에도, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」, 즉 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 특성을 유지하고 있으면 된다.

본 발명의 「미분화 세포 제거제」를 포함하고, 표적 물질의 미분화 세포 내 수송용 캐리어로서 사용할 수 있는 rBC2LCN 렉틴 또는 그의 개변체는, 이하와 같이 표현할 수 있다.

「서열 번호 1에 표시되는 아미노산 서열 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질.」이라고 표현할 수 있다.

또한, 여기서, 수개란 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 자연수를 나타낸다. 또한, 본 발명에서는, 이하, 이들 rBC2LCN 렉틴 또는 그의 개변체를 아울러, 간단히 「rBC2LCN」이라고 한다.

(1-2) 「rBC2LCN 렉틴」의 미분화 세포 내 침입능에 대하여

본 발명에서 사용하는 「rBC2LCN」에는 인식 당쇄인 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」을 개재하거나, 또는 당해 당쇄에 결합한 단백질 또는 지질을 개재하여 미분화 세포 내에 침입하는 특성이 있다. 또한, 「rBC2LCN」 자신에 세포 독성은 없기 때문에, 그 침입 특성을 이용하여, 「rBC2LCN」에 다양한 단백질이나 저분자 화합물로 대표되는 각종 화합물을 융합시켜 미분화 세포에 작용시킴으로써, 미분화 세포 내에 효율적으로 각종 화합물(수송 대상의 화합물을 「표적 화합물」이라고 하는 경우도 있음)을 수송할 수 있어, 세포 내에서 수송한 화합물 본래의 기능을 발휘시킬 수 있다. 수송된 화합물이 세포 내에서 독성을 발휘할 수 있는 화합물이면, 그 세포 독성을 발휘시킬 수 있다.

「rBC2LCN」과 각종 화합물의 융합체가, 「rBC2LCN」의 인식 당쇄인 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」에 결합 후의 미분화 세포 내에 침입하는 경로 등 상세한 침입 메커니즘까지는 불분명하다. 미분화 세포, 특히 전능성을 갖는 ES 세포 또는 iPS 세포 표면에서는, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H 타입 3당쇄)」를 포함하는 복합 당쇄로 수식된 포도칼릭신이, 무수한 클러스터를 형성하고 있는 것(비특허문헌 8)으로부터 보아, 미분화 세포 표면에 존재하는 포도칼릭신을 통하여 침입할 가능성이 있고, 「rBC2LCN」이 미분화 세포 내에 침입하는 능력을 발휘할 수 있기 위해서는, 당해 포도칼릭신이 형성하는 클러스터 구조가 필요할 가능성도 있다. 그러나, 당해 당쇄를 구성 당에 포함하는 글로보 H 함유 당지질도 미분화 세포 표면 특이적으로 존재하고 있는 것이 확인되어 있고(비특허문헌 11), 글로보 H 함유 당지질이 세포 표면 전체를 덮도록 존재하고 있을 가능성이 있는 점에서, 당지질을 통하여 미분화 세포 내에 침입하고 있을 가능성도 부정할 수 없다.

어떤 경우든, 미분화 세포, 특히 다능성 줄기 세포인 iPS/ES 세포의 세포 표면은, 분화 세포 표면에는 존재하지 않는 다수의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 당쇄 함유 복합 당질에 덮여 있고, 각종 화합물과의 융합체를 형성한 「rBC2LCN」이, 미분화 세포 표면의 당해 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄에 결합한 후에, 당해 당쇄를 통하거나, 또는 당해 당쇄 함유 복합 당질을 통하여 미분화 세포 내에 침입하는 능력을 갖고 있는 것은 확실하다.

즉, 「rBC2LCN」에는, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 함유 복합 당질을 세포 표면에 갖고 있는 미분화 세포에 대해서만, 융합시킨 다양한 화합물(표적 화합물)을 세포 내로 수송한다는, 미분화 세포 특이적인 「세포 내 수송 작용」을 갖고 있는 「세포 내 수송용 캐리어(세포 내 도입제)」라고 할 수 있다.

본 발명에 있어서는, 본 발명의 미분화 세포용의 「세포 내 수송용 캐리어」로 되는 rBC2LCN에 대하여, 수송 대상으로 되는 표적 물질을, 화학적 또는 전기적으로 융합시킨 상태의 융합체이면서, 또한 미분화 세포 내에 도입하기 위한 융합체를, 간단히 「rBC2LCN 융합체」라고 표현하는 경우가 있다.

그리고, 융합시키는 화합물로서 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독소 단백질이나 독성 저분자 화합물을 선택하면, 미분화 세포 내에서만 세포 독성을 발휘하여, 분화된 정상 세포에는 영향을 주지 않고, 미분화 세포만을 특이적으로 살상할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 「독성 화합물」 또는 「독소」라고 할 때, 독소 단백질이나 독성 저분자 화합물 및 RNAi 물질, 안티센스 핵산, 리보자임 등의 세포 장해성의 핵산 등, 세포에 대하여 독성을 발휘하는 물질의 총칭으로서 사용하고 있다. 독소 단백질은, 세포 독성을 갖는 단백질, 당단백질, 펩티드 등을 나타내고, 「독성 저분자 화합물」이라고 할 때, 항생 물질, 색소 등, 독소 단백질 및 핵산 이외의 독성 화합물의 모두를 포함한다. 이 「독성 화합물」 중, 본 발명에서는, 세포의 내부에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독성 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.

여기서, 미분화 세포 중에서도, 중간엽 줄기 세포 등 체성 줄기 세포의 경우에는 iPS/ES 세포와 비교하면 세포 표면에 존재하는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄의 총량이 적기 때문에, 생리 활성 물질, 영양 물질 등 미분화 세포에 대하여 플러스의 효과를 초래하는 물질이며, 미량이라도 확실하게 송달할 수 있으면 되는 경우에는 세포 내 도입제로서 iPS/ES 세포의 경우와 마찬가지로 유효성이 있다. 그러나, 완전히 살상하는 것이 요구되는 독소와의 융합체의 경우에는, 세포 표면에 rBC2LCN의 인식 및 세포 내로의 수송을 위하여 필수적인 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄 총량이 적은 것에 의해, 세포 내로 수송할 수 있는 독소량도 적어, 결과적으로 세포에의 대미지가 적기 때문에, 확실한 살상 효과는 바랄 수 없다. 따라서, 본 발명의 「rBC2LCN-독소」융합체를 미분화 세포 제거제로서 사용하는 경우의 대상 세포는, iPS/ES 세포 등 전능성이 높은 줄기 세포가 바람직하다.

2. rBC2LCN과 융합시키는 대상으로 되는 화합물(표적 화합물)에 대하여

「rBC2LCN」에는, 미분화 세포 내로 수송하고 싶은 화합물이면, 어떤 종류의 화합물이어도, 미분화 세포 특이적인 「세포 내 수송 작용」에 의해, 융합시킨 화합물을 세포 내로 수송할 수 있다. 구체적으로는, 독소 단백질, 표지 단백질, 생리 활성 단백질 등의 단백질 또는 당단백질, 지질 또는 당지질, DNA, RNA 등의 핵산, 플루오레세인 유도체 등의 표지용 색소, 그 밖의 저분자 화합물을 들 수 있다. 또한, 그 때의 융합 방법은, 후술하는 바와 같이, 유전자 공학적인 결합일 수도 있고, 화학적인 결합 방법일 수도 있다.

본 발명의 「rBC2LCN」에 독소를 융합시킨 「rBC2LCN-독소 융합체」에 의해, 미분화 세포 내에서 세포 독성을 발휘시키려고 하는 경우, 어떤 독소이든 융합시킴으로써 미분화 세포 내로 수송할 수는 있다. 그러나, 독소의 종류로서, 세포벽을 파괴하는 타입의 독소 등, 세포 밖에서 세포 독성을 발휘하는 독소인 경우에는, 오히려 세포 내로 수송되어 버림으로써 본래의 세포 독성을 발휘할 수 없어 부적절하다. 따라서, 본 발명에 있어서 rBC2LCN과 융합시키는 독소로서는, 세포 내에서 세포 장해·살상 기능을 발휘할 수 있는 독소, 특히 세포 내에서의 단백질 합성 저해 작용을 갖는 단백질 독소, RNAi 물질 등의 핵산류, 또는 저분자 화합물 독소가 바람직하다. 또한 일반적으로, 단백질 합성 저해 작용을 갖는 독소는, 세포 표면에 특이적 리셉터를 갖고 있기 때문에, 야생형의 전체 길이 독소 단백질을 사용하면, rBC2LCN과의 융합체로서도 무차별적으로 세포 독성을 발휘할 가능성이 있어, 분화 세포에 대한 세포 독성을 무시할 수 없다. 즉, 「rBC2LCN-독소」 융합체를, 미분화 세포 제거제로서 생체 내에서 사용하는 경우에는, 특히 큰 부작용이 예측되기 때문에, 미리 독소 단백질로부터 리셉터 결합 도메인을 삭제하거나, 또는 단백질로의 변이 도입 등, 독소 단백질 세포 표면의 특이적 리셉터에의 결합성을 상실시키는 고안을 하는 것이 바람직하다. 이러한 개변 방법은, 당업자에 있어서 주지이다. 예를 들어, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)이 생산하는 외독소인 녹농균 독소(PE)의 경우, PE 수용체에의 결합 부위를 갖고, 정상 세포와 결합 활성이 있는 도메인 I 영역을 유전자 레벨로 제거한 PE 개변체가 알려져 있다(Kondo, T., et al, J.Biol.Chem., 263, 9470-9475(1988)). 본 발명의 실시예에서 사용한 녹농균의 외독소 A 유래 독소(ETA)인 경우에는, 녹농균 외독소 A 중 세포 살상 도메인 영역(서열 번호 2)만을 사용하고 있다.

본 발명에서 사용하는 「rBC2LCN」과 융합시키는 각종 화합물, 예를 들어 각종 독소 단백질의 염기 서열, 아미노산 서열은 상용 데이터베이스로부터 취득할 수 있다. 구체적으로는, 녹농균의 외독소의 외독소 A(PDB 등록 번호: 1XK9) 외에, 디프테리아 톡신(PDB 등록 번호: 1MDT), 리신(PDB 등록 번호: 2AAI), 사포린(PDB 등록 번호: 3HIS), 콜레라 톡신(PDB 등록 번호: 1XTC), 엔테로 톡신(PDB 등록 번호: 1LTH), 백일해 독소(PDB 등록 번호: 1PRT) 등이 있다. 이들 독소 단백질 전체 길이가 아니어도, 그 세포 살상 능력이 있는 도메인 영역을 포함하고 있으면 된다. 또한, 단백질 독소가 아닌 경우에도, 링커 또는 스페이서를 결합할 수 있는 독소 화합물이면, 마찬가지로 사용할 수 있다.

예를 들어, 녹농균의 외독소 A(PDB 등록 번호: 1XK9) 중 살상 능력이 있는 도메인 영역(「ETA」)에 대응하는 아미노산 서열(서열 번호 2)을 코드하는 유전자를 적절히 대장균 등의 숙주에 대하여 최적화하여 사용하여, 형질 전환한 숙주로부터 대량 생산할 수 있다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그램 음성 호기성 간균에 속하는 진정 세균의 1종이다. 녹농균이 분비하는 외독소의 대표가 엑소톡신 A(외독소 A)이며, 펩티드 신장 인자인 EF2를 ADP-리보실화함으로써 동물 세포의 모든 단백질 합성을 불가역적으로 저해하기 때문에, 최종적으로 세포는 죽음에 이른다.

3. rBC2LCN과 수송 대상의 표적 물질의 결합 방법

이하, 미분화 세포 내로 수송하는 물질로서 전형적인, 독소 단백질을 rBC2LCN에 결합시키는 경우에 대하여 주로 상세하게 설명하지만, 당해 물질이 독소 단백질에만 한정되는 것은 아니다.

(3-1) 융합 방법

rBC2LCN과 미분화 세포 내로 수송하려고 하는 표적 물질을 융합시키는 방법으로서는, 화학적인 방법과 유전자 레벨로 연결하는 방법이 있고, 화학적인 방법의 경우에는 공유 결합 이외에 비오틴-스트렙트아비딘 결합 등이 있다. 또한, FITC 등의 저분자 화합물의 경우에는, rBC2LCN과의 통상의 화학 반응에 의해, rBC2LCN의 표면의 관능기(수산기, 아미노기 등)에 대하여 랜덤하게 공유 결합, 수소 결합 등의 결합 양식에 의해 결합되어, rBC2LCN 융합체를 형성할 수 있다.

예를 들어, 「rBC2LCN」과 「독소」라는 융합법은, 공유 결합에 의한 융합체화가 바람직하고, 저분자 화합물도 포함하여 일반적인 방법으로서 2가성 가교제 등의 화학적인 결합 방법을 사용할 수 있고, siRNA 등 RNAi 물질을 결합시키는 경우에는 비오틴-스트렙트아비딘 결합, 또는 rBC2LCN과 양전하를 띤 DNA 결합성 펩티드(예를 들어, 프로타민 유래의 Arg 풍부한 클러스터 서열; Winkler J, et al, Mol Cancer Ther. 2009 Sep; 8(9):2674-83)의 융합 단백질 등을 사용한다.

한편, RNAi 등의 핵산은, 통상 마이너스 전하를 띠고 있기 때문에, 마찬가지로 마이너스로 하전하고 있는 미분화 세포 표면에 직접 접하지 않도록, rBC2LCN과 양전하를 띤 DNA 결합 펩티드를 포함하는 융합 단백질과 핵산 사이에서 미리 컴플렉스를 형성시키는 등의 고안을 행하는 것이 바람직하다.

독소가 단백질 독소인 경우에는 유전자 레벨로 결합하는 것이 바람직하고, 그 때에는 양쪽 유전자를, 직접 또는 일반적인 DNA 링커를 사용하여, 주지의 방법에 의해 연결할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, rBC2LCN을 독소와 스페이서 서열을 통하여 융합 단백질화했을 때에도 rBC2LCN의 다량체 형성능이나 결합 특성이 변화하지 않는 것을 처음으로 밝혔다. 유전자 레벨로 결합시킨 독소 융합 단백질은, 로트간 차가 없는, 균일한 단백질로서 제조하는 것이 가능하기 때문에, 안정 공급 가능한 미분화 줄기 세포 제거제로서 특히 기대된다. 콘쥬게이트법으로서, 비오틴-스트렙트아비딘계 등을 사용하여 후에 rBC2LCN에 독소를 연결시킬 수도 있지만, 수고스러운데다가 rBC2LCN에 랜덤하게 독소가 도입되는 것이기 때문에, 로트간 차도 발생하여, 균일한 단백질로서의 제조가 곤란하다는 과제도 있다. 따라서, 화학적 결합의 경우도, 유전자 레벨로 결합시킨 독소 융합 단백질과 같이, rBC2LCN과 독소의 공유 결합에 의한 융합체 형성이 바람직하다.

이하에는, 주로 전형적인 단백질 독소를 rBC2LCN에 공유 결합시키는 경우에 대하여 상세하게 설명하지만, 당해 방법에 한정되는 것은 아니다.

(3-2) 링커 또는 스페이서

본 발명에서는, rBC2LCN에 대하여 세포 내로 수송하여 작용시키려는 화합물을 융합할 때에 링커(크로스 링커) 또는 스페이서(스페이서 서열)를 사용할 수 있다. 「rBC2LCN」 본래의 미분화 세포 특이적인 결합 기능 및 침입 기능과, 수송 대상 화합물 본래의 기능의 각각을 최대한 발휘하기 위하여, 양자간에는 일정한 거리를 유지하는 것이 바람직하기 때문에, 적당한 길이의 링커/스페이서를 개재하여 결합시키는 것이 바람직하다. 적당한 길이의 링커/스페이서는 당업자에게는 주지이며, 적절히 합성할 수 있고, 각종 시판도 되어 있다.

본 발명에서 사용되는 펩티드 결합을 위한 스페이서 서열로서는, 펩티드 결합 가능한 아미노산 잔기수 4 내지 10의 아미노산 서열을 포함하는 주지의 스페이서 서열이 사용되고, 1 내지 3회의 반복 서열로서 사용한다. 전형적으로는, 「GSGGG(서열 번호 3)」, 「GGGS(서열 번호 4)」 등의 고차 구조를 형성하지 않는 글리신 및/또는 세린으로 구성되는 아미노산 서열이 바람직하게 사용된다. 예를 들어, 미분화 세포 내에 독소 단백질을 수송할 때에 rBC2LCN 및 그것과 융합하는 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인을, 이들 스페이서 서열을 개재하여 펩티드 결합시킴으로써, 양자간에 충분한 거리를 유지할 수 있어, 각각의 당쇄 결합 능력 및 세포 살상 능력을 최대한 발휘시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서 화학 결합에 의해 콘쥬게이트할 때에도 상기 펩티드 링커를 사용할 수도 있지만, 바람직한 링커로서는, 폴리에틸렌글리콜, 특히 바람직하게는 환원제로 절단이 가능한 티올기를 도입한 티올 링커 등이 있다.

저분자 화합물을 결합시키기 위해서는 2가성 가교제 등의 화학적인 결합제가 사용되는 경우가 많으므로, 이들 결합제 유래의 링커에 의해 rBC2LCN과 표적 물질이 연결되게 된다.

본 발명의 rBC2LCN을, siRNA, miRNA 등의 RNAi 물질 또는 각종 mRNA 또는 DNA 등 핵산을 세포 내에 도입하기 위하여 사용하는 경우에는, rBC2LCN과 직접적으로 결합되는 것은, 핵산이 아니고 양전하를 띤 DNA 결합 펩티드 등의 핵산 캐리어인 것이 일반적이지만, rBC2LCN과 핵산 캐리어 사이의 적절한 거리를 유지하기 위해서도 적절히 링커/스페이서를 사용하는 경우가 있다.

또한, 융합체를 형성할 때에, 수송 대상 화합물(표적 물질)의 측에 세포 내에서의 수송하고 싶은 소기관으로의 수송 시그널을 결합시켜 둠으로써, 더욱 효과적으로 원하는 소기관으로 유도할 수 있다(예를 들어, 도 1의 C 말단측의 소포체 보류 시그널에 상당하는 「KDEL(서열 번호 6)」 서열 등). RNAi 물질 등 수송 대상 물질을 핵 내까지 수송할 필요가 있는 경우에는 「PPKKKRKV(서열 번호　7)」 등의 핵 이행 시그널을 사용하는 것이 유효하다.

또한, rBC2LCN과의 융합체의 상태에서도 충분히 그 기능을 발휘할 수 있는 경우는 불필요하지만, 수송 대상 화합물을 수송처에서 분리하고 싶은 경우에는, 세포 내 프로테아제에 의한 절단 부위를 넣어 둠으로써, 융합체로서 수송하고 있던 화합물을 세포 내에서 적절히 분리할 수 있다. 절단 부위의 도입법은 당업자에게는 주지이다. 예를 들어, 염기성 아미노산 표적 서열(표준적으로는, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)을 넣어 두면, 푸린(furin)이라는 Ca2+ 의존적 막 관통 세린 엔도 프로테아제에 의해 절단된다(Weldon JE, et al., FEBS J. 2011 Dec; 278(23):4683-700). DNA 또는 RNAi 물질 등의 핵산을 미분화 세포 내에 도입하는 경우에는 rBC2LCN에 결합된 Arg 클러스터 등의 양전하 물질과의 전하 전하 상호 작용으로 형성된 복합체의 상태에서, 미분화 세포의 세포 내에 도달 후에는 빠르게 분리한다.

(3-3) 독소 융합 rBC2LCN 단백질의 제조 방법

BC2LCN 함유 발현 벡터의 BC2LCN 유전자의 5' 또는 3' 말단측에 ETA 등의 독소 유전자를, 필요에 따라 스페이서를 개재하여 도입함으로써 독소 융합 rBC2LCN 단백질 발현 벡터를 구축한다. 이어서, 발현 벡터를 컴피턴트 셀로 형질 전환한다. 그리고, 형질 전환한 대장균 등의 숙주를 통상의 방법에 의해 액체 배양하여, 독소 융합 rBC2LCN 단백질을 발현 유도한다.

(3-4) 독소 융합 rBC2LCN 단백질의 정제 방법 및 확인 방법

대장균 내에서 발현 유도한 독소 융합 rBC2LCN 단백질은, 통상의 단백질 정제 방법을 적용하여 정제할 수 있지만, 푸코오스 고정화 칼럼에 제공하여, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하는 것이 바람직하다. 얻어진 독소 융합 rBC2LCN 단백질의 정제도는 전기 영동이나 겔 여과 등으로 확인할 수 있다.

4. 본 발명의 미분화 세포용의 「세포 내 수송용 캐리어(세포 내 도입제)」

(4-1) 본 발명에서 표적 물질을 수송하는 대상으로 되는 미분화 줄기 세포

본 명세서에 있어서, 세포 내로의 수송 대상으로 되는 미분화 줄기 세포는, 분화 세포 표면에는 거의 존재하지 않는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 함유 복합 당질을 다수 세포 표면에 갖고 있는 미분화 상태에 있는 다능성 줄기 세포를 의미한다. 구체적으로는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 체세포에 줄기 세포 특이적 발현 유전자 등을 도입하여 탈분화시킨 줄기 세포(iPS 세포 등) 외에, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 조직 줄기 세포 등의 다양한 체성 줄기 세포도 포함된다. 특히, 전능성을 갖는 ES 세포 또는 iPS 세포의 경우에는 세포 표면을 rBC2LCN이 인식하는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 함유 복합 당질이 빽빽하게 덮고 있는 상태이기 때문에, 본 발명의 세포 내 수송용 캐리어인 rBC2LCN에 의한 당해 당쇄 함유 복합 지방질을 통한 세포 내 수송 효과를 마음껏 발휘할 수 있다.

또한, ES 세포를 비롯한 줄기 세포는 인간에 한하지 않고 포유 동물에서는 상당한 부분에서 공통된 구조로 제어되고 있다고 생각되어지므로, 본 발명의 대상 줄기 세포로서는 인간 이외의 포유 동물, 예를 들어 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양, 마우스, 래트 유래의 줄기 세포를 사용하는 경우에도 적용할 수 있다.

(4-2) 본 발명의 「미분화 세포 제거제」에 의한 살상의 대상으로 되는 미분화 줄기 세포

본 발명의 「미분화 세포 제거제」에 의해, 미분화 줄기 세포를 살상하려는 전형적인 경우란, 줄기 세포를 분화 유도하여 다양한 조직 특이적으로 분화시켰을 때에 혼입되어 있는 미분화 상태에 있는 줄기 세포를 완전히 제거하고자 하는 경우이다. 따라서, 그 때의 미분화 세포 살상 효과는, 단순히 세포 내로 수송할 수 있으면 된다는 것에 머물지 않고, 확실하게 살상할 수 있을 정도의 충분한 양의 세포 독성 성분을, 세포 내로 수송할 수 있을 필요가 있다.

그렇게 해 보면, 미분화 줄기 세포 중에서도 세포 표면이 rBC2LCN이 인식하는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 함유 복합 당질에 의해 빽빽하게 덮여 있는 상태인 것이 이미 확인되어 있는, 전능성 줄기 세포의 ES/iPS 세포가 가장 유효성이 높기 때문에, 적은 rBC2LCN-독소 융합체 투여량으로도 충분한 살상 효과를 기대할 수 있다.

그러나, 본 발명자들이 이전에 행한 렉틴 어레이 해석(비특허문헌 1)에 의하면, 섬유아세포 등의 분화 세포에서는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄가 거의 전혀 세포 표면에 존재하고 있지 않은 것에 대하여, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포에서는 당해 당쇄가 확실히 일정량 존재하는 것이 확인되고 있다. 분화 세포에 대해서는, rBC2LCN-독소 융합체가 전혀 독성을 미치지 않는 점에서, 당해 rBC2LCN-독소 융합체를 체성 줄기 세포를 살상할 수 있을 정도로 대량으로 투여할 수 있기 때문에, 이들 체성 줄기 세포에 대해서도 「미분화 세포 제거제」로서 작용하는 것을 기대할 수 있다.

5. 본 발명의 「rBC2LCN 융합체」의 이용 방법

본 발명의 「rBC2LCN 융합체」, 또는 주지의 약리학적으로 허용되는 담체, 완충액 등을 더 포함하는 「미분화 세포 도입용 조성물」은, 미분화 세포를 함유하는 계(배양 세포계 또는 생체 내 조직)에 적용함으로써, 미분화 세포 특이적으로 표적 물질을 수송할 수 있다. 가장 전형적인 예가, 미분화 세포 내에 특이적으로 독소 화합물을 수송하는 경우, 즉 「rBC2LCN 융합체」를 포함하는 「미분화 세포 도입용 조성물」을 「미분화 세포 제거제」로서 사용하는 경우이므로, 이하, 「미분화 세포 제거제」에 대하여 설명하지만, 거기에 한정되는 것은 아니다. 다른 표적 물질을 수송하는 경우의 「미분화 세포 도입용 조성물」에 대해서도 이하의 방법을 적절히 변경하여 적용할 수 있다.

<본 발명의 「미분화 세포 제거제」에 의한 미분화 세포 함유 분화 세포 처리 방법>

(5-1) 기재에 접착된 분화 세포에 적용하는 경우

본 발명의 「미분화 세포 제거제」는, 비즈상, 중공사상 또는 평판상의 기재 위에서 배양한 분화 유도 후의 세포로부터 혼입된 미분화 세포를 제거하는 경우에 적용할 수 있다.

그 경우는, 각종 목적 세포가 분화를 종료한 타이밍에, 기재가 존재하는 용액 중에 미분화 세포 제거제를 최종 농도 10 내지 100㎍/ml 정도로 첨가하여 24 내지 48시간 정도 추가 배양한다(또한, 구체적인 투여 농도는, 어디까지나 전형적인 미분화 세포인 ES/iPS 세포에 적용하는 경우의 예를 나타내는 것이며, 대상의 줄기 세포 표면의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」당쇄의 총량에 따라 적절히 증량할 수 있음).

그리고 나서, 본 발명자들이 출원한 미분화 세포 검출법(일본 특허 출원 제2011-239919, PCT/JP2012/006983, 일본 특허 출원 제2012-267679)에 기초한 방법에 의해, 아직 미분화 세포가 남아 있을 가능성이 있으면, 새롭게 미분화 세포 제거제를 첨가하는 것도 가능하다. 여기에서 말하는 「용액」이란, 배양액 또는 배지 성분을 제거한 후의 완충액이나 생리 식염수 등일 수도 있다. 미분화 세포 표면에서 특이적으로 발현하는 당쇄와 결합되어, 세포 내에 도입되어, 세포를 살상한다.

이러한 제거 처리를 얻은 세포 샘플은, 이미 미분화 세포가 혼입되어 있지 않은 분화 세포만을 포함하는 세포군이라고 평가할 수 있기 때문에, 마찬가지의 분화 유도 처리를 행함으로써 미분화 세포의 혼입의 우려가 없는 분화 세포를 대량이면서 또한 신속하게 취득할 수 있다.

여기서, 줄기 세포를 신경 세포, 소화기계 세포 등에 「분화 유도」하는 방법으로서는, 어떠한 방법이어도 좋으며, 예를 들어 줄기 세포를 레티노산 존재 하에서 배양하여 신경계 세포로 분화되는 방법, 노긴(noggin) 등의 액성 인자를 사용하여, 줄기 세포로부터 심근 세포를 형성시키는 방법 등 다양한 공지의 방법을 적용할 수 있다. 본 발명의 세포 표면 미분화 당쇄 마커의 분화된 세포 표면에서의 발현량은 무시할 수 있을 정도이기 때문에, 분화 유도 조건 하에서도 노이즈가 매우 적은 것이 예상된다.

(5-2) 용액 중에 현탁된 분화 세포에 적용하는 경우

본 발명의 「미분화 세포 제거제」는, 용액 중의 분화된 세포에 혼입된 미분화 세포를 제거하는 경우에 적용할 수 있다.

그 경우는, 각종 목적 세포가 분화를 마친 타이밍에, 용액 중에 미분화 세포 제거제를 최종 농도 10 내지 100㎍/ml 정도로 첨가하여 24 내지 48시간 정도 추가 배양한다. 그리고 나서, 본 발명자들이 출원한 미분화 세포 검출법(WO2013/065302, 일본 특허 출원 제2012-267679)에 기초한 방법에 의해, 아직 미분화 세포가 남아 있을 가능성이 있으면, 새롭게 본 발명의 미분화 세포 제거제를 첨가하는 것도 가능하다. 여기에서 말하는 「용액」이란, 배양액 또는 배지 성분을 제거한 후의 완충액이나 생리 식염수 등일 수도 있다.

본 발명의 「미분화 세포 제거제」는 미분화 상태의 줄기 세포만을 직접 인식하여, 세포 내에 도입되어, 세포를 살상한다. 또한, 배양액 중에 미분화 세포가 조금 남아 있을 가능성이 있으면, 필요에 따라, 표지한 rBC2LCN을 처리 후의 배양액에 첨가하여, 플로우 사이토메트리 등으로 완전히 제거할 수 있다.

(5-3) 재생 치료용의 이식 세포 재료의 제조

본 발명에 따르면, 미분화 상태의 줄기 세포의 혼입이 없는 원하는 분화 유도 세포를 대미지 없이 취득할 수 있다. 죽은 줄기 세포나 피더 세포 등을 완전히 제거하기 위하여, 처리 후의 세포를 수회 심어 잇거나, PBS 등의 완충액으로 수회 세정하는 것만으로, 그대로 재생 치료용의 이식 세포로서 사용할 수 있다. 부유 세포에 작용시키는 경우에는 죽은 줄기 세포는 밀도 구배 매체 중을 침강시키는 방법 등에 의해 제거할 수 있다.

<실시예>

이하에 실시예를 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서의 그 밖의 용어나 개념은, 당해 분야에 있어서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것이고, 본 발명을 실시하기 위하여 사용하는 다양한 기술은, 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는, 공지의 문헌 등에 기초하여 당업자이면 용이하면서도 확실하게 실시 가능하다. 또한, 각종 분석 등은, 사용한 분석 기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 준용하여 행했다.

또한, 본 명세서 중에 인용한 기술 문헌, 특허 공보 및 특허 출원 명세서 중의 기재 내용은, 본 발명의 기재 내용으로서 참조되는 것으로 한다.

(실시예 1) rBC2LCN-ETA의 대장균 재조합체의 발현

도 1에 기재된 단백질을 설계하고, pET27b(스트라타진(Stratagene)사)에 조합하여, 대장균 BL21 코돈플러스(Escherichia coli BL21 CodonPlus)(DE3)-RIL주(스트라타진사, #230245)에 도입했다. 형질 전환체를 10㎍/mL의 카나마이신을 첨가한 5mL의 LB 배지에 현탁하여 밤새 배양했다. 전 배양한 배양액 5mL을 1L의 LB 배지에 첨가하여 배양을 행하고, 2-3시간 후에 (OD600)가 0.4 전후로 되었을 때에 1M IPTG(퍼멘터스(Fermentus)사, #R-0392) 1mL을 최종 농도 1mM으로 되도록 첨가했다. 20℃에서 24시간, 진탕 배양한 후, 원심 분리로 균체를 회수하고, 버퍼에 현탁하여 초음파 처리를 행하여, 단백질 가용성 획분을 추출했다. 대장균의 단백질 가용성 획분에 대하여, 마츠모토(Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N.(1979) J Biochem. Apr; 85(4): 1091-8) 등의 방법에 의해 시판 세파로스(GE 헬스케어(GE Healthcare)사제)에 푸코오스를 공유 결합시킴으로써 제작한 푸코오스 세파로스 컬럼에 의한 친화성 정제를 행하여, 0.2M 푸코오스로 용출했다.

정제도를 확인하기 위하여, 단순 통과(T), 세정 1회째(W1), 세정 2회째(W2), 세정 3회째(W3), 푸코오스 용출 1회째(E1), 푸코오스 용출 2회째(E2), 푸코오스 용출 3회째(E3)의 각 획분을 SDSPAGE 전기 영동법으로 확인했다(도 2). 용출 1회째의 획분에 있어서, 약 42kDa 부근에 단일 밴드를 확인할 수 있었지만, 이 분자량은, 「rBC2LCN-(GSGGG)₂-ETA」의 구조를 갖는 정제 rBC2LCN-ETA 단량체에 상당한다. 정제한 rBC2LCN-ETA를 2-머캅토에탄올(2-ME) 존재/비존재 하에서 95℃ 5분 처리 있음/없음으로 샘플 제조하고, SDS-PAGE를 행하여, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 행했다(도 3). 그 결과, 어느 조건에서든 약 42kDa의 단일 밴드로서 정제 rBC2LCN-ETA를 확인할 수 있었다. 비변성 조건에 있어서의 분자량을 겔 여과 크로마토그래피에 의해 해석했다(도 4). 그 결과, rBC2LCN-ETA는, 야생형의 rBC2LCN과 마찬가지로, 이량체를 형성하고 있는 것을 알 수 있었다.

(실시예 2) rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에 대한 결합

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다.

rBC2LCN-ETA 및 야생형의 rBC2LCN에 대하여, rBC2LCN의 당쇄 리간드인 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H 타입 1)」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H 타입 3)」각각에 대한 결합 친화성을 프론트 친화성 크로마토그래피(비특허문헌 8)로 조사했다. 그 결과를 하기(표 1)에 나타낸다. 융합 단백질화된 rBC2LCN-ETA의 해리 상수(K_d값)는 H 타입 1: 9.9μM, H 타입 3: 32.3μM이며, 야생형의 rBC2LCN의 해리 상수(H 타입 1: 8.3μM, H 타입 3: 25.4μM)와 동일 정도인 것을 알 수 있었다.

다음에 인간 iPS 세포(201B7주)에 대한 결합을 형광 염색으로 관찰했다. 24웰 플레이트에서 배양한 인간 iPS 세포(201B7주)를 4％ 파라포름알데히드로 실온 20분 고정한 후, 10㎍/mL의 Cy3 표지 rBC2LCN, 또는 Cy3 표지 rBC2LCN-ETA를 실온 1시간 반응시켜, 형광 현미경으로 관찰했다(도 5 좌측). 그 결과, rBC2LCN-ETA는, rBC2LCN과 동일 정도로 인간 iPS 세포(201B7주)를 염색할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 인간 iPS 세포(201B7주)에 대한 결합을 플로우 사이토메트리로 조사했다. 10⁵개의 인간 iPS 세포에 5㎍/mL의 농도로 Cy3 표지 rBC2LCN, 또는 Cy3 표지 rBC2LCN-ETA를 4도 1시간 반응 후, 플로우 사이토메트리로 해석했다(도 5 우측). rBC2LCN-ETA는, rBC2LCN과 동일 정도로 인간 iPS 세포(201B7주)를 염색할 수 있는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터, rBC2LCN-ETA는, 융합 단백질화되어 있음에도 불구하고, 결합 특이성이나 결합 친화성의 면에서, rBC2LCN과 거의 동일한 성질을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.

(실시예 3) rBC2LCN-ETA의 인간 ES 세포에 대한 살상 효과

본 실시예에서 사용한 인간 ES 세포(H7주(WA07주))는 위스콘신 인터내셔널 줄기 세포 은행(Wisconsin International Stem Cell(WISC) Bank)로부터 분양을 받았다. 배양 방법은, 위셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)의 프로토콜에 따랐다.

실시예 1에서 얻은 rBC2LCN-ETA의 희석 계열 용액(5, 50㎍/ml)을 제작하고, 배양 중인 인간 ES 세포(H7주(WA07주))와 반응시켰다. rBC2LCN-ETA 첨가의 24시간 후에, 라이브/데드 셀 이미징 키트(LIVE/DEAD Cell Imaging Kit)(488/570)(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)사)를 사용하여, ES 세포의 생사 판정을 행했다(도 6). rBC2LCN-ETA를 5, 50㎍/ml의 농도로 첨가하고, 24시간 후에 위상차상을 관찰한 바, ES 세포의 콜로니에 축퇴가 보였다(도 6의 A, D, G). 또한, 농도 의존적으로 생세포가 줄어들어(도 6의 C, F, I. 또한, 도면 중, 적색 형광으로 있는 것은 사세포 특이적인 표지이며, 녹색 형광으로 있는 것은 생세포 특이적인 표지임. 이하 마찬가지), 50㎍/ml의 rBC2LCN-ETA로 처리를 한 군에서는, 거의 모든 ES 세포가 사멸하였다(도 6의 G, H, I). 이것으로부터, rBC2LCN-ETA는 인간 ES 세포를 살상하는 능력을 갖는 것이 확인되었다.

(실시예 4) rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에 대한 살상 효과

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. 다테노 등의 방법(Tateno H, et al., (2011) J Biol Chem. 286, 20345-20353)에 의해 배양했다. rBC2LCN-ETA의 희석 계열 용액(5, 50㎍/ml)을 제작하고, 배양 중인 인간 iPS 세포(201B7주)와 반응시켰다. rBC2LCN-ETA 첨가의 24시간 후에, 라이브/데드 셀 이미징 키트(488/570)(라이프 테크놀로지스사)를 사용하여, iPS 세포의 생사 판정을 행했다(도 7). rBC2LCN-ETA를 5, 50㎍/ml의 농도로 첨가하고, 24시간 후에 위상차상을 관찰한 바, iPS 세포의 콜로니에 축퇴가 보였다(도 7의 A, D, G). 또한, 농도 의존적으로 생세포가 줄어들어(도 7의 C, F, I), 50㎍/ml의 rBC2LCN-ETA로 처리를 한 군에서는, 거의 모든 ES 세포가 사멸하였다(도 7의 G, H, I). 한편, 주위에 있는 마우스 섬유 아세포 유래의 피더 세포는, 전혀 살상되어 있지 않았다. 이것으로부터, rBC2LCN-ETA는 인간 iPS 세포를 살상하는 능력을 갖는 것이 확인되었다.

(실시예 5) rBC2LCN-ETA의 분화 세포에 대한 작용

드래퍼 등의 방법(Draper JS, et al., (2000) J Anat. 200:249-58)에 따라, 최종 농도 10^-5M으로 되도록 레티노산을 첨가하여 배양함으로써 인간 iPS 세포(201B7주)의 분화 유도를 행했다. 8일간 배양하여 세포의 형태로부터 분화가 개시하고 있는 것을 확인하여, rBC2LCN-ETA의 희석 계열 용액(5, 50㎍/ml)을 제작하고, 배양 중인 분화시킨 세포와 반응시켰다. rBC2LCN-ETA 첨가의 24시간 후에, 라이브/데드 셀 이미징 키트(488/570)(라이프 테크놀로지스사)를 사용하여, 분화 세포의 생사 판정을 행했다(도 8). rBC2LCN-ETA를 0.005, 0.05㎎/ml의 농도로 첨가하고, 24시간 후에 위상차상을 관찰한 바, rBC2LCN-ETA 첨가에 의한 영향은 보이지 않았다(도 8의 A, D, G). 또한, 라이브/데드 셀 이미징 키트(488/570)를 사용해도 컨트롤과 비교하여 사세포는 증가하지 않았다(도 8의 B, C, E, F, H, I). 이것으로부터, rBC2LCN-ETA는 인간 분화 세포에 대해서는, 전혀 살상 능력은 없는 것이 확인되었다.

(실시예 6) rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에 대한 살상 효과

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. rBC2LCN-ETA의 희석 계열 용액(0 내지 100㎍/mL)을 제조하고, 인간 iPS 세포(201B7주)의 배양액에 첨가했다. rBC2LCN-ETA 첨가의 24시간 후에, 셀 카운팅 키트(Cell Counting Kit)-8(도진도(Dojindo))를 사용하여, iPS 세포의 생사 판정을 행했다(도 9). 그 결과, 농도 의존적으로 생세포수가 줄어들고, 10㎍/mL 이상에서 반응시킨 경우에는 24시간 후에는 거의 모든 iPS 세포가 사멸하고 있었다. 한편, 세포 표면에 rBC2LCN이 인식하는 당쇄(「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」를 전혀 갖지 않는, 분화 세포인 인간 피부 섬유아세포의 경우에는 100㎍/mL이라는 고농도에 있어서도, 세포 살상 능력을 전혀 나타내지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, 줄기 세포 중에서도 rBC2LCN의 인식 당쇄량이 얼마 안되는 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포에 있어서는, 100㎍/mL이라는 고농도 투여에 의해 처음으로 세포 살상 능력이 10％ 정도 발휘할 수 있는 것을 알 수 있었다.

(실시예 7) rBC2LCN-사포린의 인간 iPS 세포에 대한 작용

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. PBS만, 스트렙트아비딘-사포린(SA-Saporin, 최종 농도 0.6μM), 비오틴화 rBC2LCN(최종 농도, 0.6μM), 스트렙트아비딘-사포린(SA-Saporin, 최종 농도 0.6μM)과 비오틴화 rBC2LCN(최종 농도, 0.6μM)의 복합체를 인간 iPS 세포(201B7주)를 배양하고 있는 배양액 중에 첨가하고, 0, 1, 2일 후에 현미경으로 위상차 관찰했다(도 10). 그 결과, PBS만, 스트렙트아비딘-사포린만, 비오틴화 rBC2LCN만으로는 인간 iPS 세포에 대하여 거의 영향이 보이지 않은 것에 대하여, 스트렙트아비딘-사포린과 비오틴화 rBC2LCN의 복합체는 24시간 후에는 인간 iPS 세포의 콜로니에 축퇴가 보였다. 48시간 후에는 거의 모든 세포가 사멸하였다. 이것으로부터, rBC2LCN과 사포린의 스트렙트아비딘-비오틴 결합에 의한 융합체의 경우에도 인간 iPS 세포를 살상하는 능력을 갖는 것이 확인되었다.

(실시예 8) FITC 표지 rBC2LCN의 인간 iPS 세포에 대한 작용

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. 10㎍/mL의 FITC 표지 rBC2LCN을, 인간 iPS 세포를 배양하고 있는 배양액 중에 첨가하고, 1시간 결합 반응 후에, 60초간 여기광을 조사했다(도 11). 1, 3, 5시간 후에 현미경으로 위상차 관찰했다. 6시간 후에는 인간 iPS 세포의 콜로니에 축퇴가 보여 많은 세포가 사멸하였다. 컨트롤로서 사용한 FITC 표지체 소 혈청 알부민(FITC-BSA)에서는 세포 살상 효과가 확인되지 않은 점에서, rBC2LCN이 인간 iPS 세포에 결합하는 활성이 인간 iPS 세포 살상에 있어서 중요한 것을 알 수 있었다. 이것으로부터 FITC 표지 rBC2LCN은 인간 iPS 세포를 살상하는 능력을 갖는 것이 확인되었다.

(실시예 9) FITC 표지 rBC2LCN 및 rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에의 내재화

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. 인간 iPS 세포(201B7주)의 배양액 중에, FITC 표지 rBC2LCN 또는 FITC 표지 rBC2LCN-ETA를 1㎍/mL의 농도로 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켜, 반응 직후(2시간) 및 24시간 후에, 여기광을 조사하여, 현미경으로 공초점 현미경 관찰했다(도 12). 또한, 본 실시예는 세포의 내재화 관찰을 위한 실험이므로, 여기광을 장시간 조사하는 것에 의한 FITC의 미분화 세포 살상능을 피하기 위하여, 조사 조건은 촬영 가능한 최저한의 레벨(스캔 스피드 12.5μs/pixel, 레이저 출력 1％)에 머물러 있다.

FITC 표지 rBC2LCN을 포함하지 않는 새로운 배지로 교환한 직후에는 세포 표면이 선명하게 염색되어 있다(좌측 상단). 또한 2시간 후에는 세포 표면의 염색이 옅어지고, 24시간 후에는 세포 내에 도트상의 염색이 관찰되어, FITC 표지 rBC2LCN이 세포 내에 도입되어 있는 것을 알 수 있었다(좌측 하방). 한편, 컨트롤로서 사용한 FITC 표지 BSA에서는, 인간 iPS 세포에의 결합은 확인할 수 없었다(우측). 아울러, ETA를 융합한 rBC2LCN-ETA를 FITC 표지한 경우를 (중앙)에 나타낸다. FITC 표지 rBC2LCN-ETA도 빠르게 세포 내에 도입되는 모습과 함께, 내재화된 ETA에 의한 세포 살상 효과에 의해 24시간 후에는 iPS 세포의 사멸이 진행되고 있는 것이 간파되었다.

(실시예 10) Cy3 표지 rBC2LCN 및 rBC2LCN-ETA의 인간 iPS 세포에의 내재화

본 실시예에서 사용한 인간 iPS 세포(201B7주)는 이화학 연구소 바이오 리소스 센터로부터 분양을 받았다. 인간 iPS 세포(201B7주)의 배양액 중에 Cy3 표지 rBC2LCN을 1㎍/mL의 농도로 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켜, 반응 직후(2시간), 4시간 후 및 24시간 후에, 여기광을 조사하여, 현미경으로 위상차 관찰했다(도 13). Cy3 표지 rBC2LCN을 포함하지 않는 새로운 배지로 교환한 직후에는 세포 표면이 선명하게 염색되어 있다(좌측). 또한 2시간 후에는 세포 내에 도트상의 염색을 확인할 수 있다(중앙). 24시간 후에는 세포 내에 명확하게 도트상의 염색이 관찰되어, CCy3 표지 rBC2LCN이 세포 내에 도입되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 마찬가지로 Cy3 표지 rBC2LCN-ETA도 세포 내에 내재화되는 것을 알 수 있었다. FITC와 Cy3이라는 상이한 형광 표지체라도 rBC2LCN의 세포 내에의 내재화가 확인된 점에서, 인간 iPS 세포에의 내재화는 rBC2LCN과 융합하는 화합물의 종류에 의한 것이 아니고, rBC2LCN의 효과인 것이 명확해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) <120> Stem cell eliminator <130> 2014000023 <150> 2013-026946 <151> 2013-02-14 <150> 2013-228611 <151> 2013-11-01 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> BC2LCN <400> 1 Met Pro Leu Leu Ser Ala Ser Ile Val Ser Ala Pro Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu Thr Tyr Val Asp Ile Pro Gly Leu Tyr Leu Asp Val Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Ile Arg Asp Gly Lys Leu Gln Val Ile Leu Asn Val Pro Thr Pro 35 40 45 Tyr Ala Thr Gly Asn Asn Phe Pro Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Ala Thr 50 55 60 Asn Gln Gly Val Val Ala Asp Gly Cys Phe Thr Tyr Ser Ser Lys Val 65 70 75 80 Pro Glu Ser Thr Gly Arg Met Pro Phe Thr Leu Val Ala Thr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Ser Gly Val Thr Phe Val Lys Gly Gln Trp Lys Ser Val Arg 100 105 110 Gly Ser Ala Met His Ile Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Ser Ala Ile Trp 115 120 125 Gly Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ser Gly Asn Gln Gly Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Ile Gly Gly Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 227 <212> PRT <213> ETA <400> 2 Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr 1 5 10 15 Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu 20 25 30 Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala 35 40 45 Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu 50 55 60 Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg 85 90 95 Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly 100 105 110 Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile 130 135 140 Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp 145 150 155 160 Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp 165 170 175 Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys 180 185 190 Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys 195 200 205 Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys Pro Pro His His His His His His Lys 210 215 220 Asp Glu Leu 225 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> spacer1 <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> spacer2 <400> 4 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 5 <211> 396 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rBC2LCN-(GSGGG)2-ETA <400> 5 Met Pro Leu Leu Ser Ala Ser Ile Val Ser Ala Pro Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu Thr Tyr Val Asp Ile Pro Gly Leu Tyr Leu Asp Val Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Ile Arg Asp Gly Lys Leu Gln Val Ile Leu Asn Val Pro Thr Pro 35 40 45 Tyr Ala Thr Gly Asn Asn Phe Pro Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Ala Thr 50 55 60 Asn Gln Gly Val Val Ala Asp Gly Cys Phe Thr Tyr Ser Ser Lys Val 65 70 75 80 Pro Glu Ser Thr Gly Arg Met Pro Phe Thr Leu Val Ala Thr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Ser Gly Val Thr Phe Val Lys Gly Gln Trp Lys Ser Val Arg 100 105 110 Gly Ser Ala Met His Ile Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Ser Ala Ile Trp 115 120 125 Gly Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ser Gly Asn Gln Gly Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Ile Gly Gly Gly Ala Leu Glu Gly 145 150 155 160 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly 165 170 175 Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg 180 185 190 Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val 195 200 205 Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly 210 215 220 Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe 225 230 235 240 Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln 245 250 255 Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val 260 265 270 Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr 275 280 285 Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His 290 295 300 Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val 325 330 335 Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp 340 345 350 Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu 355 360 365 Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys 370 375 380 Pro Pro His His His His His His Lys Asp Glu Leu 385 390 395 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ER retention signal <400> 6 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Nuclear localization signal?NLS? <400> 7 Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5

Claims (8)

1. 표적 물질을 미분화 세포 내에 도입하기 위한 방법이며,
   표적 물질을, rBC2LCN과 화학적 또는 전기적으로 융합시켜, rBC2LCN-표적 물질 융합체로서 미분화 세포와 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 미분화 세포 내 도입 방법.
2. rBC2LCN을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 미분화 세포 내 도입용 캐리어.
3. 표적 물질과 rBC2LCN이 화학적 또는 전기적으로 융합하고 있는 rBC2LCN-표적 물질 융합체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 미분화 세포 도입용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 표적 물질이, 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독성 화합물인, 독성 화합물의 미분화 세포 도입용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 독성 화합물이 단백질 독소 또는 그의 세포 살상 능력이 있는 도메인, 세포 독성을 갖는 저분자 화합물 또는 핵산인, 미분화 세포 도입용 조성물.
6. 세포 내에서 세포 독성을 발휘할 수 있는 독성 화합물과 rBC2LCN이 화학적 또는 전기적으로 융합하고 있는 rBC2LCN-독성 화합물 융합체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 미분화 줄기 세포 제거제.
7. 줄기 세포를 분화 유도한 후의 배지 중에, 제6항에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 미분화 상태의 줄기 세포의 살상 방법.
8. 줄기 세포로부터 분화 유도된 분화 유도 세포에 대하여, 제6항에 기재된 미분화 줄기 세포 제거제를 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재생 치료용 이식 재료의 제조 방법.

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