CN107532147A - 干细胞除去方法、分化细胞保护方法、及培养基组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将未分化的干细胞确实可靠除去的干细胞除去方法。为此，将含有干细胞和由其经诱导分化得到的体细胞的细胞群用含有光敏剂的培养基组合物进行培养。向该细胞群照射特定波长的光，将干细胞选择性除去。干细胞为多能干细胞或成体干细胞。多能干细胞包含ES细胞(Embryonic Stem Cell)及iPS细胞(induced Pluripotent Stem Cell)中任一者。另外，成体干细胞包含生殖干细胞、生殖细胞、多分化潜能的干细胞、及单分化潜能的干细胞中任一者。

Description

干细胞除去方法、分化细胞保护方法、及培养基组合物
技术领域
本发明涉及干细胞除去方法、分化细胞保护方法、及培养基组合物，特别是涉及使多能干细胞分化时的干细胞除去方法、分化细胞保护方法、及培养基组合物。
背景技术
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells、ESCs)及人工多能干细胞(InducedPluripotent StemCells、iPSCs)是称为多能干细胞(PluripotentStem Cell)的细胞的一种，处于未分化状态，具有可以向三胚层全部的细胞诱导分化的能力。为此，潜在性期待将人的多能干细胞用于各种疾病的再生医疗。
在将多能干细胞用于再生医疗的情况下，有必要以已向特定的细胞、组织、或脏器等的细胞群诱导分化的状态移植到体内。
例如，参考专利文献1，其公开了如下的、具有由轴突延伸后的神经细胞形成的神经细胞层的神经细胞片的制造方法，该方法包括：在含有音猬因子(Sonic hedgehog)抑制剂及诱导分化剂的培养液中对具有由轴突延伸后的培养神经细胞形成的神经细胞层的神经细胞片、祖细胞进行培养，从该祖细胞诱导神经细胞；在含有SDF1(Stromal cells－derived factor－1：基质细胞衍生因子－1)及MCP－1(Monocyte chemoattractantpropein－1：单核细胞趋化蛋白－1)的至少一者的培养液中对神经细胞进行培养，诱导神经细胞的轴突延伸，得到由轴突延伸后的培养神经细胞形成的神经细胞层。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2014－23457号公报。
发明内容
发明要解决的问题
然而，如专利文献1的技术所述，如果在经诱导分化的细胞群中混入未分化状态的多能干细胞，则在活体内产生畸胎瘤(teratoma)，所以需要仅选择已分化的细胞。另外，在诱导具有向特定的细胞系列分化的能力的成体干细胞分化来制造体细胞的情况下，如果有未分化的成体干细胞残留，也会成为其他肿瘤等的原因(以下将包含多能干细胞和成体干细胞的各种干细胞简称为“干细胞”。)。
为此，迫切期待用于从经诱导分化的细胞群高效除去干细胞的技术。
本发明正是鉴于这样的状况而完成的，其目的在于消除上述的问题。
解决问题的方案
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，将含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群，用含有光敏剂的培养基组合物进行培养，向用上述含有光敏剂的培养基组合物培养后的上述细胞群照射特定波长的光，从上述细胞群中除去上述干细胞。
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，上述干细胞是多能干细胞或成体干细胞，上述多能干细胞包含ES细胞(胚胎干细胞，Embryonic Stem Cell)及iPS细胞(人工多能干细胞，induced Pluripotent Stem Cell)中任一者，上述成体干细胞包含生殖干细胞、生殖细胞、多分化潜能的干细胞、及单分化潜能的干细胞中任一者。
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，上述光敏剂是氨基乙酰丙酸(AminoLevulinic Acid)、其衍生物、或它们的盐。
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，上述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐的浓度为10μM～2000μM。
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，添加上述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐后至照射光的时间为4小时以上。
本发明的干细胞除去方法，其特征在于，上述特定波长的光的波长为400nm～750nm，照射照度为1mW/cm2～200mW/cm2，照射时间为1分钟～240分钟。
本发明的分化细胞保护方法，其特征在于，在利用上述干细胞除去方法除去时，对诱导分化得到的上述体细胞进行保护。
本发明的分化细胞保护方法，其特征在于，所保护的上述体细胞是中胚层细胞。
本发明的分化细胞保护方法，其特征在于，所保护的上述体细胞是外胚层细胞。
本发明的分化细胞保护方法，其特征在于，所保护的上述体细胞是内胚层细胞。
本发明的培养基组合物，其特征在于，含有：用于对含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群进行培养的培养基成分、和光敏剂。
本发明的培养基组合物，其特征在于，在照射特定波长的光的情况下，将上述干细胞除去。
本发明的培养基组合物，其特征在于，在照射上述特定波长的光的情况下，对诱导分化得到的上述体细胞进行保护。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述干细胞是多能干细胞或成体干细胞，上述多能干细胞包含ES细胞(胚胎干细胞，Embryonic Stem Cell)及iPS细胞(人工多能干细胞，induced Pluripotent Stem Cell)中任一者，上述成体干细胞是具有多能性和自我复制能力的细胞。
本发明的培养基组合物，其特征在于，由上述干细胞经诱导分化得到的上述体细胞包含由中胚层细胞、外胚层细胞、及内胚层细胞形成的组中的任意一种。
本发明的培养基组合物，其特征在于，还含有由上述干细胞诱导分化出上述体细胞的生长因子成分。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述培养基成分包含用于对细胞提供养分的营养成分。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述培养基成分包含用于将培养过程中的环境保持恒定的缓冲成分。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述培养基成分包含对所述体细胞的发育进行促进的生长促进成分。
本发明的培养基组合物，其特征在于，是氨基乙酰丙酸(Amino Levulinic Acid)、其衍生物、或它们的盐。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐的浓度为10μM～2000μM。
本发明的培养基组合物，其特征在于，添加上述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐后至照射光的时间为4小时以上。
本发明的培养基组合物，其特征在于，上述特定波长的光的波长为400nm～750nm，照射照度为1mW/cm2～200mW/cm2，照射时间为1分钟～240分钟。
发明效果
根据本发明，可以提供通过向用含有光敏剂的培养基组合物培养后的细胞群照射特定波长的光从而容易地将干细胞从含有干细胞和诱导分化得到的体细胞的细胞群中除去的技术。
附图简要说明
图1是表示在ALA对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中添加时(0小时)的iPS细胞的照片。
图2是表示在ALA对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中ALA添加4小时后的iPS细胞的照片。
图3是表示在ALA对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中ALA添加24小时后的iPS细胞的照片。
图4是表示在ALA对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中ALA添加48小时后的iPS细胞的照片。
图5是表示在ALA－PDT对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中ALA及/或SFC添加时(0小时)的iPS细胞的照片。
图6是表示在ALA－PDT对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中ALA及/或SFC添加后经过48小时时的iPS细胞的照片。
图7是表示在ALA－PDT对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的作用的评价中添加ALA及/或SFC并照射红色LED后24小时后的iPS细胞的照片。
图8是关于本发明的实施例1的图7的结果而示出用试剂盒研究ALP的显现时的照片。
图9是表示在针对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的、ALA－PDT的基于光照射的波长的作用的比较中，添加ALA并照射蓝色LED或红色LED后24小时后的iPS细胞的照片。
图10是关于本发明的实施例1的图9的结果而示出用试剂盒研究ALP的显现时的照片。
图11是表示在针对本发明的实施例1涉及的iPS细胞的、ALA－PDT的基于ALA的浓度的作用的比较中，存活的iPS细胞的基于CCK8的计数的结果的图形。
图12是表示在针对本发明的实施例1涉及的HDF的、ALA－PDT的基于ALA的浓度的作用的比较中，存活的HDF的基于CCK8的计数的结果的图形。
图13是表示在ALA－PDT对本发明的实施例1涉及的源自iPS细胞的神经细胞的作用的评价中由iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞的照片。
图14是对本发明的实施例1的图13的结果进行汇总后的图表。
图15是表示在ALA－PDT对本发明的实施例1涉及的源自iPS细胞的心肌细胞的作用的评价中由iPS细胞经诱导分化得到的心肌细胞的照片。
图16是表示使对本发明的实施例2涉及的iPS细胞的ALA添加后的时间改变时的ALA－PDT后的存活率的图形。
图17是表示在ALA－PDT对本发明的实施例2涉及的源自iPS细胞的肝细胞的作用的评价中由iPS细胞经诱导分化得到的肝细胞的照片。
图18是表示在ALA－PDT对本发明的实施例2涉及的源自iPS细胞的肝细胞的作用的评价中由iPS细胞经诱导分化得到的肝细胞的照片。
具体实施方式
＜实施的形态＞
本发明人等为了实现从含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群容易地除去未分化状态的干细胞的方法，进行了潜心研究。而且，在利用氨基乙酰丙酸(Amino Levulinic Acid，以下称为“ALA”。之类)那样的光敏剂的光动力学疗法(PhotoDynamic Therapy，以下称为“PDT”。另外，以下将使用了ALA的PDT称为“ALA－PDT”。)中，发现尽管干细胞具有感光性，但诱导分化得到的体细胞难以具有感光性。即，干细胞和诱导分化得到的体细胞在感光性的程度方面是不同的。本发明人等进一步进行试验研究，通过对该多能干细胞应用ALA－PDT，从经诱导分化的细胞群容易地除去未分化的干细胞，在此基础上确立保护诱导分化得到的体细胞的手段，从而完成了本发明的干细胞除去方法、细胞保护方法、及培养基组合物。
此外，在本实施方式中，干细胞的除去是通过诱导细胞死亡、剥离或分离、停止细胞分裂、不将细胞维持于未分化状态、抑制未分化的维持能力，向分化状态诱导、消除畸胎瘤形成能力等手段来实现。另外，在本实施方式中，感光性是指在使用光敏剂的PDT中照射特定波长的光时细胞死亡、剥离或分离、细胞的分裂停止、或细胞的能力等发生变化。该细胞的能力等的变化包括未分化的维持能力的抑制、向分化状态的诱导、畸胎瘤形成能力的变化等。
以下，利用实施方式对本发明的干细胞除去方法、细胞保护方法、及培养基组合物进行详细说明。
如果进行更具体的说明，本实施方式中除去的干细胞特别地包括多能干细胞和成体干细胞。
其中，本实施方式的多能干细胞包括在包括人的灵长类、灵长类以外的哺乳类、其他的脊椎动物等生物中能分化成各种细胞的、具有多分化潜能的干细胞(Stem Cell)。另外，本实施方式的多能干细胞优选具有如下的性质：可以传代，且即便传代也保持不进行分化的状态，核型等难以变化，或后生(epigenetic)表型难以变化。另外，本实施方式的多能干细胞与此相关联，优选在活体外或活体内具有足够的繁殖能力。作为这样的本实施方式的多能干细胞的具体例，可以例举出胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell、ES细胞)、人工多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell、iPS细胞)、其他的人工生成或选择的具有多能性的干细胞等。该人工制成的多能干细胞可以是通过含有特定基因的逆转录病毒、腺病毒、质粒等各种载体、RNA、低分子化合物等对体细胞重新编码而制成的多能干细胞。
此外，作为本实施方式的多能干细胞，尽管无需是具有接近全能性的多分化潜能的细胞，但也可以使用与通常相比多分化潜能较高的幼稚(Naive)细胞。另外，对于本实施方式的多能干细胞，可以进行染色体内的基因的追加修饰和删除、基于各种载体或人工染色体的基因等的附加、后生控制的变更、PNA等的人工遗传物质的附加、其他的基因重组。
另外，本实施方式的成体干细胞包含生殖干细胞、生殖细胞、多分化潜能的干细胞、及单分化潜能的干细胞中任一者。
作为这样的成体干细胞中的、多分化潜能的干细胞及单分化潜能的干细胞的具体例，包括造血干细胞、表皮干细胞、肠道干细胞、间充质干细胞、及神经干细胞。除此之外，是胚胎干细胞以外的体细胞且同时保持多能性和自我复制能力的细胞即可。另外，本实施方式的成体干细胞也可以是特定组织的干细胞等。
另外，本实施方式的成体干细胞是通过各种载体、RNA、低分子化合物等对体细胞进行体细胞直接重新编码而制成的干细胞。
另外，在本实施方式中，除去干细胞时所保护的体细胞是由干细胞经诱导分化得到的体细胞。
这样的体细胞包括：在特定的培养条件下向上述的多能干细胞、成体干细胞中添加作为特定的诱导分化用因子的生长因子成分(后述)而诱导分化至特定阶段得到的细胞、及到达分化的最终阶段的体细胞。
另外，本实施方式的体细胞也可以是能分化至特定系列的细胞的特定形质被固定的细胞。
另外，本实施方式的诱导分化至特定阶段的体细胞，包括中胚层、外胚层、或内胚层的细胞。该中胚层、外胚层、或内胚层的细胞包括分化至显现特定的基因标记的细胞、各种祖细胞等。此时，本实施方式的体细胞也可以是通过各种标记、目视等以集落等的形式对诱导分化成特定种类的系列的细胞进行选择而得到的。另外，本实施方式的体细胞也可以是包含经诱导分化得到的各种体细胞的混合细胞集团、组织、脏器等(以下称为“组织等”。)。作为该组织等的具体例，也可以是脑组织、眼泡、眼杯、晶状体泡、肝小叶等三维结构的组织、经细胞融合得到的骨骼肌组织、各种细胞片、通过3D打印机使细胞重叠的组织、由载体把持的组织等。另外，这些组织等上也可以形成血管等结构。另外，如后所述，也可以根据感光性的有无或程度并利用ALA－PDT从组织等仅甄别出特定种类的体细胞。
另外，本实施方式中，作为中胚层细胞的具体例，例如可以例举出心肌细胞。然而，并不限于此，还可以是其他的间充质细胞(mesenchymal cell)。另外，作为其他的中胚层细胞的具体例，可以例举出骨、结缔组织、肌肉、血液、性腺等的细胞。
另外，本实施方式中，作为外胚层细胞的具体例，例如可以例举出神经细胞。另外，作为外胚层细胞的具体例，可以例举出中枢神经、末梢神经、神经细胞、轴突、髄鞘、皮肤、角膜、视网膜、内耳、外耳等的细胞。
另外，本实施方式中，作为内胚层细胞的具体例，例如可以例举出肝细胞。另外，作为内胚层细胞的具体例，可以例举出其他的消化系统、呼吸系统的细胞。
另外，本实施方式的光敏剂是吸收特定波长的光产生荧光或活性氧的、PDT用的光敏剂。
本实施方式中，作为这样的光敏剂的具体例，优选使用ALA。对于该ALA，可以使用ALA、其衍生物(以下称为“ALA类”。)、或它们的盐。ALA是氨基酸的一种，其自身在可见光的光照射下不会产生荧光和活性氧。然而，ALA在导入到细胞后代谢成作为光敏物质的原卟啉，作为光敏剂发挥作用。另外，ALA的细胞毒性少，安全性高。
ALA或其衍生物如下述式(I)所示。式(I)中，R1表示氢原子或酰基，R2表示氢原子、直链或支链状烃基、环烃基、芳基或芳烃基。
【化1】
作为本实施方式的ALA，可以优选示例式(I)的R1及R2均为氢原子的ALA或其盐。ALA是也称为δ－氨基乙酰丙酸的氨基酸的1种。
另外，作为ALA衍生物，可以例举出式(I)的R1是氢原子或酰基且式(I)的R2是氢原子、直链或支链状烃基、环烃基、芳基或芳烃基的、5－ALA以外的化合物。
作为式(I)中的酰基，可以例举出甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、特戊酰基、己酰基、辛酰基、苄基羰基等直链或支链状的碳数1～8的烷酰基、或苯甲酰基、1－萘甲酰基、2－萘甲酰基等碳数7～14的芳酰基。
作为式(I)中的烃基，可以例举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等直链或支链状的碳数1～8的烃基。
作为式(I)中的环烃基，可以例举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环十二烷基、1－环己烯基等饱和或可以存在一部分不饱和键的、碳数3～8的环烃基。
作为式(I)中的芳基，可以例举出苯基、萘基、蒽基、菲基等碳数6～14的芳基。
作为式(I)中的芳烃基，芳基部分可以示例与上述芳基相同的基团。另外，烃基部分可以示例与上述烃基相同的基团。更具体而言，可以例举出苄基、苯乙基、苯丙基、苯丁基、二苯甲基、三苯甲基、萘甲基、萘乙基等碳数7～15的芳烃基。
作为上述的ALA衍生物，优选R1为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等的化合物、或上述R2为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等的化合物。另外，可以优选示例上述R1和R2的组合为甲酰基和甲基、乙酰基和甲基、丙酰基和甲基、丁酰基和甲基、甲酰基和乙基、乙酰基和乙基、丙酰基和乙基、丁酰基和乙基的组合等。
对于ALA类，在活体内以式(I)的ALA或其衍生物的状态作为有效成分发挥作用即可，可以对应于投给的形态，作为用于提高溶解性的各种盐、酯、或可以被活体内的酶分解的前药(前体)进行投给。例如，作为ALA及其衍生物的盐，可以例举出药理学容许的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐等。作为酸加成盐，例如可以示例盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐等各无机酸盐，甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐等各有机酸加成盐。作为金属盐，可以示例锂盐、钠盐、钾盐等各碱金属盐，镁、钙盐等各碱土金属盐，铝、锌等各金属盐。作为铵盐，可以示例铵盐、四甲基铵盐等烷基铵盐等。作为有机胺盐，可以示例三乙基胺盐、哌啶盐、吗啉盐、甲苯胺盐等各盐。此外，这些盐在使用时也可以作为溶液使用。
以上的ALA类中优选的是ALA、及ALA甲酯、ALA乙酯、ALA丙酯、ALA丁酯、ALA戊酯等各种酯类、或它们的盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐。其中，尤其可以优选示例ALA盐酸盐及ALA磷酸盐。
另外，ALA类可以形成水合物或溶剂合物，另外，可以单独使用任一种或适当组合2种以上使用。另外，对于ALA类，也可以是通过化学合成、基于微生物的生产、基于酶的生产的任意方法制造的。
另外，在将ALA类制备成水溶液的情况下，为了防止ALA类的分解，需要注意水溶液不成为碱性。在成为碱性的情况下，可以通过除去氧来防止分解。
另外，作为本实施方式的光敏剂，除了ALA类或其盐之外，只要是能够吸收可见光而发出荧光且产生活性氧的光敏剂，就全部都可以使用。本实施方式中，尤其可以优选示例四吡咯系化合物。具体而言，可以例举出光卟啉、LASERPHYRIN(レザフリン)、原卟啉IX、PHOSCAN(フォスキャン)、二氢卟吩、尿卟啉I、尿卟啉III、七羧基卟啉I、七羧基卟啉III、六羧基卟啉I、六羧基卟啉III、五羧基卟啉I、五羧基卟啉III、粪卟啉I、粪卟啉III、异粪卟啉、赫尔德乐卟啉(Hull dello porphyrin)、异赫尔德乐卟啉、血卟啉、中卟啉、初卟啉、焦卟啉、次卟啉IX、PEMPTO卟啉(pemptoporphyrin)、ATXs－10等。另外，投给量优选使用与在ALA－PDT中有效果的量同等的量。
另外，作为本实施方式的光敏剂，也可以将柠檬酸亚铁钠(Sodium FerrousCitrate，以下称为“SFC”。)等提高ALA－PDT的效果的化合物添加到ALA中。
本实施方式中，作为光敏剂添加到后述的培养基组合物中且在干细胞除去方法或分化细胞保护方法中使用时的ALA类或它们的盐的浓度，优选为10μM～2000μM，更优选为100μM～1500μM。当ALA类或它们的盐的浓度低于10μM时，通过ALA－PDT除去多能干细胞或成体干细胞的除去率不够。另外，即便ALA的浓度为2000μM以上，通过ALA－PDT除去多能干细胞或成体干细胞的效果也无变化。
另外，本实施方式中，对于ALA类或它们的盐的浓度，可以根据多能干细胞或成体干细胞的种类、诱导分化得到的体细胞的种类、培养条件、特定波长的光的照射条件等进行适当调整。例如，如后述的实施例所示，关于包含由iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞的细胞群，在导入250μM～500μM的ALA类或它们的盐进行PDT的情况下，能够在用24小时除去多能干细胞或成体干细胞60％以上的同时，对诱导分化得到的神经细胞进行保护。相对于此，在包含由iPS细胞经诱导分化得到的心肌细胞的集落的情况下，当以ALA类或它们的盐的浓度为500μM进行PDT时，跳动丧失且集落崩塌。因此，例如优选导入100～400μM左右的浓度的ALA类或它们的盐来进行PDT。相反，利用针对特定浓度的ALA类或它们的盐的PDT的效果会因体细胞的种类而不同这一点，例如也可以为下述构成：从包含多能干细胞或成体干细胞、和神经细胞及肌细胞的混合细胞集团，以500μM～1500μM的ALA类或它们的盐的浓度通过ALA－PDT仅保护神经细胞而获取，除去除此以外的细胞。
另外，本实施方式中，添加ALA类或它们的盐后至照射光的时间优选为4小时以上，更优选为24小时以上。
具体而言，在导入ALA类或它们的盐之后经过4小时以上之后进行PDT的情况下，与未导入ALA的情况相比，更有可能除去未分化的多能干细胞或成体干细胞。进而，在导入ALA类或它们的盐之后经过24小时以上之后进行PDT的情况下，能够在将多能干细胞或成体干细胞除去至7％左右的同时，对诱导分化得到的细胞进行保护。此时，如下述的实施例2所示，ALA类或它们的盐的浓度为250μM～1000μM时获得足够的效果。
另外，本实施方式中照射的特定波长的光的波长为400nm～750nm，照射照度为1mW/cm2～200mW/cm2，照射时间为1分钟～240分钟。更优选特定波长的光的照射照度为10mW/cm2～20mW/cm2，照射时间为5分钟～20分钟。
具体而言，本实施方式中，对于ALA－PDT中使用的特定波长的光，设为紫外光～可见光～近红外光的波长，可以使用波长400～750nm的光。这是因为，在波长低于400nm的紫外线区域，对诱导分化得到的体细胞的DNA等的损伤大，在波长750nm以上的红外线区域，不在ALA于细胞内代谢得到的原卟啉的光吸收区域。
另外，作为本实施方式的特定波长的光的波长，可见光线中的430nm～480nm的蓝色光、及580～600nm的红色光对诱导分化得到的体细胞进行保护的效果高，能够特别优选使用。
另外，作为本实施方式的特定波长的光的照射照度，优选为1mW/cm2～200mW/cm2左右。特定波长的光的照射照度更优选为10mW/cm2～20mW/cm2左右。此时，也可以使用通常的LED(Light Emitting Diode，发光二极管)的照射装置、或使用了激光等的照射装置(未图示)进行照射。
另外，本实施方式的特定波长的光的照射时间优选为1分钟～240分钟左右。特定波长的光的照射时间更优选为5分钟～30分钟左右，进一步优选为10分钟～20分钟左右。这是因为，如果照射时间比1分钟短，则无法从含有多能干细胞或成体干细胞、和诱导分化得到的体细胞的细胞群中充分除去多能干细胞或成体干细胞。另外，如果比240分钟长，则发生细胞死亡的体细胞增加。另外，根据本发明人的实验，多能干细胞或成体干细胞与癌细胞相比PDT的灵敏度较低这一点通过初步实验获知。为此，本实施方式中，用于除去通过添加光敏剂而具有感光性的干细胞的照射时间，优选是比针对各种癌细胞等的PDT长的时间，例如为10分钟以上。另外，为了抑制对体细胞照射光导致的损伤，根据细胞种选择合适的照射时间。此时，对于成纤维细胞，可以比30分钟长，相反对于神经细胞，优选不足30分钟，特别优选不足20分钟。由此，即便在诱导分化的过程中万一含有癌化的细胞，也可以将其除去，进而也能够在除去未分化的多能干细胞或成体干细胞的同时，对诱导分化得到的体细胞进行保护。
此外，关于在该PDT中照射的光的波长及照射时间，也可以根据多能干细胞或成体干细胞的种类、诱导分化得到的体细胞的种类、培养条件、ALA类或它们的盐的浓度等条件适当调整。
另外，本实施方式的培养基组合物含有：用于对含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群进行培养的培养基成分、和光敏剂。
关于本实施方式的培养基成分，作为干细胞或体细胞用的培养基，例如可以使用含有对干细胞或体细胞特化的特定成分的培养基等。
另外，本实施方式的培养基组合物的培养基成分包含：用于由干细胞诱导分化出体细胞的生长因子成分、用于将培养过程中的环境保持恒定的缓冲成分、及用于对细胞提供养分的营养成分、对诱导分化得到的体细胞的发育进行促进的生长促进成分。
其中，对于本实施方式的培养基成分所含的生长因子成分，例如可以使用低分子的KY02111(WNT通路抑制剂(pathway inhibitor)、CAS编号：1118807－13－8)、BIO(BIO(GSK―3抑制剂、CAS编号：667463―62―9))，作为用于诱导分化成心肌细胞的成分。另外，可以使用DAPT(γ－分泌酶抑制剂(Secretase Inhibitor)IX)、维甲酸、LIF(白血病抑制因子：leukemia inhibitory factor)、CNTF(睫状神经营养因子：ciliary neurotrophicfactor)、NOGGIN等，作为用于诱导分化成神经细胞的成分。另外，作为用于诱导分化成肝细胞的成分，可以添加Activin A(人激活素A)，也可以对应于各体细胞的种类含有SOX 17及HEX基因产物等。此外，对于该生长因子成分，为了诱导分化成目的体细胞，除了低分子的化合物之外，还可以含有各种肽、蛋白、微RNA、病毒载体、质粒载体等。在该病毒载体、质粒载体等的情况下，可以含有与要诱导分化的体细胞对应的基因的mRNA、核酶、RNAi等使用的序列。
另外，对于本实施方式的培养基成分所含的营养成分，也可以添加各种血清及血清替代物、氨基酸、维生素类、抗氧化剂、抗生素、胶原蛋白前体、微量金属离子或络合物、各种盐等来使用。其中，含有各种血清替代物的培养基，也可以在不含源自异种的成分的(Xeno－Free、XF、或Animal.Component－Free、ACF)的培养系统使用。此外，也可以在本实施方式的培养基成分中添加各种血清。
另外，关于本实施方式的培养基成分所含的缓冲成分，为了在CO2孵化器内保持培养基成分的pH，含有碳酸氢钠、磷酸盐、HEPES(N'－2羟乙基哌嗪(Hydroxyethylpiperazine)－N'－2乙基磺酸(ethanesulphonic acid))、MOPS(3－吗啉丙磺酸(Morpholinopropanesulfonic acid))、TRICINE(三羟甲基甲基甘氨酸)等。另外，为了目视观察缓冲剂的pH，可以添加酚红(Phenol Red)。另外，除此以外，还可以添加用于维持培养基成分的环境的成分。
另外，对于本实施方式的培养基成分所含的体细胞的生长促进成分，可以以与进行培养的干细胞和诱导分化得到的体细胞的种类等对应的浓度添加作为生长因子的FGF(纤维母细胞生长因子：Fibroblast growth factors)、EGF(表皮生长因子：EpidermalGrowth Factor)、HGF(肝细胞生长因子：hepatocyte growth factor)等成分。
此外，在本实施方式的培养基成分中，也可以添加其他必要的成分。
另外，关于本实施方式的培养基组合物，也可以在仅用培养基成分对干细胞进行培养，将该干细胞诱导分化成体细胞时，添加光敏剂。另外，相反，也可以在诱导分化干细胞之前，添加光敏剂。另外，关于何时添加该光敏剂，可以根据干细胞的种类、诱导分化成的体细胞的种类、诱导分化的规程、ALA类或它们的盐的添加时机、特定波长的光的照射时机等来适宜选择。
另外，在对本实施方式的多能干细胞或成体干细胞、和诱导分化得到的体细胞进行培养时，在是粘附性细胞的情况下，可以在饲养细胞上或涂有胶原蛋白等基底膜基质的细胞培养用板等上进行培养。另外，在这些细胞的传代培养时，可以在获得所培养的细胞并分离成单细胞后，添加培养基成分。另外，对于向单细胞的分离，可以使用含有蛋白酶、螯合剂等的干细胞分离用试剂。此外，根据粘附性的多能干细胞或体细胞的种类，或在是血液系统等的浮游性细胞的多能干细胞或体细胞的情况下，可以不进行细胞的分离处理而进行传代。
另外，本实施方式中，通过ALA－PDT被除去干细胞的体细胞，可以直接用于治疗等，进而也可以在利用各种基因标记等检测出是否未残留有干细胞之后用于治疗等。此时，对于该体细胞，可以培养特定期间，还可以多次传代培养。例如，通过将ALA－PDT处理后的细胞群培养12小时(过夜)～44小时左右，从而能够通过氧化应激等杀死干细胞，进而能够使体细胞从ALA－PDT所致的损伤中恢复。另外，随后可以进一步将体细胞诱导分化成最终分化的细胞。另外，也可以混合多种体细胞来制成组织、或脏器。
另外，作为可通过本实施方式的干细胞除去方法及体细胞保护方法实现的治疗等，例如，在是心肌细胞的情况下，可以注入到患病的心脏，用于心肌片、心肌组织的移植等治疗中。另外，在是神经细胞的情况下，可以用于帕金森氏症、阿尔茨海默氏病那样的脑的疾病、事故脑梗塞和肿瘤等所致的脑损伤、脊椎损伤、其他的中枢神经或末梢神经的再生等的治疗。另外，在是肝细胞的情况下，为了肝硬化或肝癌等的肝脏的功能改善的治疗，可以通过向脾脏或腹腔内注入、由载体把持的肝脏的移植等而使用。
另外，通过本实施方式的干细胞除去方法及体细胞保护方法使用体细胞而制造的脏器，例如也可以用于通过向裸鼠、基因重组猪等的异种移植手段使其生长而获得且然后以治疗目的向人移植的用途。
通过如上所述的构成，可以得到以下所示的效果。
近年来，不断开发从多能干细胞或成体干细胞诱导分化出各种体细胞，之后特别地用在再生医疗的技术，并需要确保安全性。
另外，以往，作为投入使癌细胞具有感光性的光敏剂而使恶性肿瘤内发生光化学反应从而使肿瘤组织坏死的方式，提倡PDT(例如，参照国际公开第2013/005379号等)。然而，尚不知晓出于除去多能干细胞或成体干细胞并在此时对诱导分化得到的体细胞进行保护的目的是否使用PDT。
对此，在本实施方式的干细胞除去方法中，用含有ALA类或它们的盐的培养基组合物对含有干细胞和诱导分化得到的体细胞的细胞群进行培养，对所培养的细胞群照射特定波长的光，从细胞群除去干细胞。由此，可以容易地从由干细胞经诱导分化得到的体细胞除去移植时不应该残留的干细胞，同时对作为目的的诱导分化得到的体细胞进行保护。
由此，本实施方式可以安全且有效地提供再生医疗可以使用的诱导分化得到的体细胞。另外，本实施方式中，仅仅是添加ALA类或它们的盐加以培养并进行光照射，就可以除去干细胞，所以也可以降低成本。另外，ALA是也可以使用于食品添加剂和医疗用途的氨基酸，因此，即便残留，安全性也高，可以容易地用于医疗用途。
此外，通过本实施方式的干细胞除去方法及体细胞保护方法获得的体细胞，可以用于再生医疗以外的用途、例如药物副作用的检查、生物反应器、人工脏器的制造、克隆个体的制成等各种用途。
实施例1
接着基于附图通过实施例进一步说明本发明，但以下的具体例并不限定本发明。
〔实验材料及方法〕
(多能干细胞的维持)
作为多能干细胞株，使用由REPROCELL公司建立并传代培养50代的人iPS细胞株(iPSC)。关于多能干细胞的细胞株，在饲养者上(On Feeder)培养的情况下，在用丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞(RCHEFC003、REPROCELL公司制)上，与以往的方法一样，通过多能干细胞用培养基(Primate ES cell medium(灵长类动物干细胞培养基)、RCHEMD001、REPROCELL公司)、涂有ReproCoat(REPROCELL公司制)的60mm聚苯乙烯板(盘)进行维持。将ReproCoat以0.2μg/cm2的浓度用于板，在4℃放置一晩，由此进行覆层。
(诱导分化得到的体细胞、其他体细胞)
关于由多能干细胞经诱导分化得到的体细胞，作为中胚层细胞的一例，按照附加的规程培养作为心肌细胞的ReproCardio 2(RCESD008、REPROCELL公司制)并使用，作为外胚层细胞的一例，按照附加的规程培养作为神经细胞的ReproNeuro(RCESDN001、REPROCELL公司制)并使用，作为内胚层细胞的一例，按照附加的规程培养作为肝细胞的ReproHepatoType 1(RCESDH001、REPROCELL公司制)并使用。此时，进行传代培养直至神经细胞中神经元充分延伸、心肌细胞成为跳动的心肌细胞块、肝细胞成为三维结构。
另外，比较例中使用市售的正常人皮肤成纤维细胞(CA106K05a、CellApplications Inc公司制、HDF)。
对于维持用的培养基成分，分别使用各细胞附带的培养基，按照各细胞附带的说明书的规程进行培养。
(ALA溶液、SFC溶液的制成方法)
称量ALA盐酸盐(M.W.＝167.6、SBI PHARMA株式会社制)34mg，添加PBS(－)(和光纯药工业制)1000μL。由此制成200mM的ALA溶液。制成的ALA盐酸盐的溶液(以下简称为“ALA溶液”。)在使用前保存在－20℃的冰箱里。
另外，关于SFC(关东化学株式会社制)，制成同样浓度的溶液并保存。
(ALA－PDT)
(以下表示60mm盘时的量)从冰箱取出ALA溶液(200mM)，在冰上溶解。准备多能干细胞或诱导分化得到的体细胞培养用的培养基4mL。添加ALA溶液(200mM)20μL。由此成为ALA是1mM的培养基。随后通过移液进行混合，从5％CO2孵化器取出细胞，通过吸引等除去培养基，添加含有ALA的培养基4mL。此外，对于添加的ALA溶液的量，根据培养基所含的ALA的浓度进行调整。使细胞返回到5％CO2孵化器，培养4小时～各实验中特定的时间。取出细胞，用LED光源照射特定波长的光10分钟。关于该LED光源，最大瓦特数：1.0W，1.0W时照射功率强度：35.4mW/cm2(距离50mm)，红色LED的峰值波长：635nm，蓝色LED的峰值波长：405nm，在比底面高约50mm的高度照射时可以大致均匀地照射盘底面。此时，关于红色LED或蓝色LED，以照射功率400mW(照射功率强度14.1mW/cm2)照射10分钟。随后除去含有ALA的培养基，添加干细胞或体细胞用的培养基4mL。24小时～各实验中特定的时间后用显微镜进行观察。此时，用Cell Counting Kit－8(细胞计数试剂盒)(同仁化学公司制、以下称为“CCK8。”)对存活的细胞数进行评价。另外，使用Vector(商标)公司制、Blue AlkalinePhosphatase Substrate Kit(蓝色碱性磷酸酶底物试剂盒)III(Cat.No.SK－5300)对基于Alkaline phosphatase(碱性磷酸酶，以下称为“ALP”。)的显现的未分化状态进行评价。
〔结果〕
(针对iPS细胞的、ALA的作用的评价)
首先，向iPS细胞添加ALA及/或SFC，在不进行光照射的情况下，评价是否有影响。
具体而言，传代播种iPS细胞，在60mm盘上播种并培养，更换成添加有ALA及/或SFC的培养基，更换成添加有ALA及/或SFC的培养基，对添加时(0小时)、4小时后、24小时后、48小时后的细胞形态进行观察。在该实验中不进行PDT。
关于培养条件，使用的细胞株是201B7，使用的培养基是Primate ES Cell Medium(灵长类动物干细胞培养基)，ALA的添加浓度是1000μM，SFC的添加浓度是500μM。
参照图1～图4来对结果进行说明。
图1示出添加ALA及/或SFC时(0小时)的细胞形态的照片。图中的各照片示出基于未添加ALA(－)或有添加(+)、未添加SFC(－)或有添加(+)的各组合的iPS细胞的集落的形态。另外，在各组合中，上面的照片中标度为500μm，下面的照片是将对应的上面的照片放大为2倍的照片。
图2同样示出ALA添加4小时后的iPS细胞的集落的形态。图3示出24小时后的iPS细胞的集落的形态。图4示出48小时后的iPS细胞的集落的形态。
从形态iPS细胞均示出保持未分化的正常状态。即，未观察到对iPS细胞的影响。由此，对于ALA，认为在仅添加而不进行光照射的情况下，对iPS没有毒性等。
(针对iPS细胞的、ALA－PDT的作用的评价)
接着，通过向iPS细胞添加ALA及/或SFC并进行光照射，进行是否有iPS细胞的除去作用的评价。
具体而言，传代播种iPS细胞，在60mm盘上播种并培养，更换成添加有ALA及/或SFC的培养基，保持原样培养48小时。随后照射蓝色LED(波长405nm)10分钟，在24小时后观察细胞形态。
关于培养条件，使用的细胞株是201B7，使用的培养基是Primate ES Cell Medium(灵长类动物干细胞培养基)，ALA的添加浓度是1000μM，SFC的添加浓度是500μM。
参照图5～图8来对结果进行说明。
图5是添加ALA及/或SFC时(0小时)的细胞形态的照片。各照片与图1的情况一样，从形态iPS细胞示出保持未分化的正常状态。
图6示出添加ALA及/或SFC后48小时后的iPS细胞的细胞形态的照片。在该时间点，也与图4一样，未特别观察到ALA及/或SFC添加48小时所致的影响。
图7示出ALA及/或SFC添加48小时后照射蓝色LED 10分钟并在其24小时后拍摄的照片。在添加有ALA的iPS细胞(ALA(+)/SFC(－)、ALA(+)/SFC(+))中，可知iPS细胞的集落崩塌而部分剥离。
图8示出对图7的各集落根据ALP的显现进行未分化状态的评价的结果。可知，添加有ALA的iPS细胞(ALA(+)/SFC(－))、添加有ALA和SFC的iPS细胞(ALA(+)/SFC(+))，与未添加的iPS细胞(ALA(－)/SFC(－))相比，颜色较浅，ALP为阴性。这表示无法保持未分化状态。另外，在单独添加SFC(ALA(－)/SFC(+))时，与未添加一样颜色较深，保持了未分化状态。
作为结论，在添加ALA并照射了特定波长的光之后，未观察到未分化的iPS细胞。即，未分化的iPS细胞已被除去。
(针对iPS细胞的、ALA－PDT的基于光照射的波长的作用的比较)
接着，进行针对人iPS细胞的、ALA－PDT的基于光照射的波长的差的作用的比较。
与上述的“针对iPS细胞的、ALA－PDT的作用的评价”一样，传代播种iPS细胞，在60mm盘上播种并培养，更换成添加有ALA(100μM或1000μM)的培养基，保持原样培养4小时。随后，对培养后的iPS细胞照射红色LED(波长635nm)或蓝色LED(波长405nm)10分钟，在24小时后观察细胞形态。
关于培养条件，使用的细胞株是201B7，使用的培养基是Primate ES Cell Medium(灵长类动物干细胞培养基)。
参照图9～图10来对结果进行说明。
图9示出对ALA添加4小时后进行10分钟的蓝色LED或红色LED的光照射的结果进行拍摄的照片。图中的各照片分别示出基于ALA的添加量(100μM或1000μM)、红色LED(红LED)、蓝色LED(蓝LED)的各组合的iPS细胞集落的形态。另外，各组合中，上面的照片中标度是500μm，下面的照片是将其放大为2倍的照片。就蓝色LED而言，与图7的红色LED大致一样，观察到ALA－PDT导致的集落崩塌的作用。
图10示出对于图9的结果用试剂盒研究ALP的显现时的照片。各图中，上示出显微镜照片，下示出盘的ALP显现。分别地，蓝色变浅，无法保持未分化状态。蓝色LED的光照射所致的ALA－PDT的作用与红色LED大致一样。
(针对iPS细胞的、ALA－PDT的基于ALA浓度的作用的比较)
接着，进行在针对人iPS细胞的ALA－PDT中使ALA的浓度改变时的作用的比较。
将与上述的处理一样进行了传代处理的iPS细胞，以2～4分钟、37℃使用CTK(胶原酶-胰蛋白酶KSR)进行孵化，随后通过移液操作进行分离。将该分离后的iPS细胞播种于96孔板上，每1孔15000个细胞，然后向第3天的细胞添加ALA盐酸盐进行培养，4小时后进行10分钟的红色LED照射，添加CCK8的溶液，在其24小时后用读板器测定450nm的吸光度，对存活的细胞数进行计数。
参照图11对其结果进行说明。
图11是表示在上述的实验中存活的iPS细胞的基于CCK8的计数的结果的图形。纵轴表示ALA的浓度(0μM、125μM、250μM、500μM、1000μM)，横轴表示各细胞种中将ALA浓度为0μM的值设为1.0(100％)时的细胞数的比例(变化率)(n＝3)。
另外，根据未图示的实验，在大致100μM以上的浓度下，观察到ALA－PDT所致的10％以上的iPS细胞的细胞死亡诱导。另外，在250μM以上的浓度下，诱导60％的比例以上的iPS细胞的细胞死亡。基于本发明人的实验等的结果(未图示)，在引起10％左右的iPS细胞的细胞死亡这样的培养状态下，iPS细胞的未分化能力丧失。另外，特别是在引起60％的iPS细胞的细胞死亡这样的培养状态下，iPS细胞的未分化能力自身确实丧失。因此，可以通过ALA－PDT确实可靠地除去iPS细胞。
(针对H DF的、ALA－PDT的基于ALA浓度的作用的比较)
接着，使用多能干细胞或成体干细胞以外的体细胞，进行ALA－PDT的作用的比较。
关于正常人皮肤成纤维细胞(HDF)，进行与上述的“针对iPS细胞的、基于ALA盐酸盐的浓度和ALA－PDT的光照射的作用的比较”一样的条件下的、ALA的浓度和ALA－PDT的作用的比较。
参照图12对其结果进行说明。
图12是表示在上述的实验中存活的HDF的基于CCK8的计数的结果的图形。纵轴表示ALA的浓度，横轴表示各细胞种中将ALA浓度为0μM的值设为1.0(100％)时的细胞数的比例(变化率)(n＝3)。
根据图12，在HDF中，未观察到ALA－PDT引起的细胞死亡诱导。即，结合上述的结果可知，通过ALA－PDT，能够不使HDF发生细胞死亡，而仅除去iPS细胞。
(针对源自iPS细胞的神经细胞的、ALA－PDT的作用的评价)
接着，对针对由人iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞(源自iPS细胞的神经细胞)的、ALA－PDT的作用进行评价。该神经细胞使用了ReproNeuro。将由iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞播种于60mm盘上并培养，更换成添加有ALA(0μM、250μM、500μM)的培养基，保持原样培养4小时。随后观察细胞形态。然后，向培养后的神经细胞进行10分钟的红色LED(波长635nm)照射，经过12小时(过夜)后，观察细胞形态。随后将培养基更换成不含ALA的培养基，在7天边更换培养基边进行培养之后，观察细胞形态。
参照图13～图14对其结果进行说明。
图13的各照片分别示出ALA的浓度(0μM、250μM、500μM)、上是ALA添加前、下是ALA－PDT后培养7天的细胞照片。
对于由iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞，通过ALA添加和LED照射而使神经突起暂时缩短(未图示)。然而，继续培养7天，其结果并未杀死而继续存活，恢复成与ALA添加前一样。
图14是对上述结果的总结的图。由iPS细胞经诱导分化得到的神经细胞由于ALA－PDT而发生神经突起的缩短，但会继续存活。即，与iPS细胞不同，即便通过ALA－PDT，神经细胞也不会除去而被保护。
另外，使ALA的浓度为250μM、500μM而进行添加的7天后，可以确认细胞粘附，均是神经突起伸长。即，源自人iPS细胞的神经细胞虽通过ALA－PDT可见神经突起的缩短，但通过继续培养观察到神经突起的再伸长，而继续存活。
(针对源自iPS细胞的心肌细胞的、ALA－PDT的作用的评价)
接着，对针对由人iPS细胞经诱导分化得到的心肌细胞(源自iPS细胞的心肌细胞)的、ALA－PDT的作用进行评价。在这里，获得由iPS细胞经诱导分化得到的心肌细胞的集落，在60mm盘上播种并培养，更换成添加有ALA(500μM)的培养基，培养4小时，在该时间点观察细胞形态。随后进行10分钟的红色LED照射，经过12小时(过夜)后，再一次观察细胞形态。
参照图15对其结果进行说明。
图15的(a)是ALA－PDT前(暴露ALA前)的心肌细胞的集落的状态的照片，(b)是ALA－PDT后(暴露ALA后，10分钟照射后)的心肌细胞的集落的照片。ALA－PDT后，原本跳动的心肌停止，心肌集落的形态崩塌。由此可知，如果是ALA浓度为500μM的ALA－PDT，心肌细胞不能被保护。
相对于此，在未图示的初步试验中，如果是ALA浓度为250μM左右的ALA－PDT，心肌细胞在ALA－PDT后通过培养数日左右，与神经细胞一样恢复并跳动。即，在250μM以下的浓度的ALA－PDT中，可以保护心肌细胞，同时根据上述的结果可以说能除去iPS细胞。相反，在500μM以上的ALA－PDT中，能够在保护HDF和神经细胞的同时除去心肌细胞和iPS细胞，即，能够根据细胞种类选择性地除去。
另外，根据初步实验，关于由iPS细胞经诱导分化得到的肝细胞(源自iPS细胞的肝细胞)，与上述的神经细胞一样，即便添加250μM浓度的ALA也能被保护，可以选择性地除去iPS细胞。
实施例2
(针对其他的iPS细胞株及添加后时间的、ALA－PDT的作用的评价)
作为多能干细胞株，另外，关于与上述的实施例1相同的201B7细胞株、REPROCELL公司制的RC001、RC010，在进行与上述的实施例1同样的维持之后，进行ALA作用的评价。RC001是源自Fibroblast(成纤维细胞)，与上述的201B7细胞株同样地通过逆转录病毒载体被iPS细胞化的。另外，RC010是源自Endothelial progenitor cell(内皮祖细胞：EPC)，通过RNA的导入被iPS细胞化的。
关于这些细胞株，播种于96孔板，每1孔20000个细胞，然后培养3～4天。随后用以各浓度(0、125、250、500、1000μM)添加有ALA盐酸盐的培养基进行培养。在上述培养基中培养4小时后或培养24小时后进行10分钟的红色LED照射。红色LED以照射功率400mW(照射功率强度14.1mW/cm2)照射10分钟。添加CCK8的溶液，在其24小时后用读板器测定450nm的吸光度，对存活的细胞数进行计数，计算24小时后的细胞存活率。
结果如下述的表1所示。
[表1]
在任何细胞株中，与上述的实施例1同样，通过ALA－PDT抑制了各细胞株的存活、繁殖。即，可知ALA－PDT在多种细胞株中共同地对iPS细胞有伤害作用。由此，即便在其他的iPS细胞中，通常也可以期待ALA－PDT的效果。
接着，对向iPS细胞添加ALA后至光照射的时间(添加后时间)的不同所致的作用进行比较。即，对在向iPS细胞添加ALA后要光照射时的等待时间进行研究。
图16是将上述的201B7细胞株播种于96孔板且每1孔20000个细胞后，向第3天的细胞添加ALA盐酸盐后在4小时或24小时后使红色LED作用10分钟，在第4天用CCK8进行评价的结果。就各浓度而言，条形图示出各细胞种中将ALA添加0μM(对照)的值设为100时的变化率(％)。误差条表示标准偏差(n＝96)。
作为结果，ALA添加后时间为4小时，与对照相比，iPS细胞的细胞存活率减少。实际上，如图16中(a)所示，在添加250μM的ALA进行光照射的情况下，如果添加后时间为4小时，与未进行光照射的对照相比，为65％的细胞存活率。
另外，如果以ALA添加后时间为更长的24小时进行光照射，则可以以更低的浓度抑制iPS细胞的细胞存活、繁殖。如图中16(b)所示，如果添加后时间为24小时，与对照相比，为7％的细胞存活率。
此外，在初步实验中，即便将ALA添加后时间增加而长于24小时，与24小时相比，细胞存活率无变化。
(针对源自iPS细胞的肝细胞的、ALA－PDT的作用的评价)
关于与上述的实施例1同样的源自人iPS细胞的肝细胞，对ALA－PDT的作用进行评价。本实施例中，培养条件是向24孔板播种细胞且每1孔为500000个细胞后，以各浓度(0、250、500μM)向第7天的细胞添加ALA盐酸盐之后，在24小时后利用红色LED进行10分钟的光照射，翌日以后进行形态观察。红色LED的照射功率与上述相同。
将其结果示于图17及图18。
图17是添加250μM的ALA盐酸盐(a)经过24小时后且进行光照射前(LED照射前)、(b)进行光照射后经过24小时后(LED照射后24小时)、(c)进行光照射后经过48小时后(LED照射后48小时)的源自人iPS细胞的肝细胞的板的照片。在图17的(a)中，可以明确确认到肝细胞特异的铺路石状的形态和核。图17的(b)中即便进行光照射后经过24小时，仍残留有铺路石状的形态和核清晰的细胞。另外，图17的(c)中即便进行光照射后经过48小时，铺路石状的形态和核清晰的细胞继续存活。由此，可以确认分化后的源自人iPS细胞的肝细胞残留。
另外，图18是以0μM、250μM、500μM改变ALA盐酸盐的浓度时的、光照射前(LED照射前)、进行光照射后经过24小时后(LED照射后24小时)、(c)进行光照射后经过60小时后(LED照射后60小时)的源自人iPS细胞的肝细胞的板的照片。其中，250μM的照片示出与图17不同的板的照片。可知，在ALA－PDT的各条件下，存活的源自人iPS细胞的肝细胞是存在的。另外，如果通过目视，则250μM的条件下与500μM相比存活的细胞的状态更好。
作为结果，关于源自iPS细胞的肝细胞，与实施例1的神经细胞同样，即便添加250μM浓度的ALA，也能使正常细胞残留，能够选择性地除去除此以外的iPS细胞。
此外，上述实施方式的构成及动作是例子，当然可以在不脱离本发明的宗旨的范围内适当变更进行实施。
产业上的可利用性
本发明的干细胞除去方法，可以用于在活体外培养干细胞并在诱导分化成体细胞后容易地除去干细胞，随后仅将诱导分化得到的体细胞导入到体内等的再生医疗等，可以在产业上利用。

Claims (23)

1.一种干细胞除去方法，其特征在于，
将含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群，用含有光敏剂的培养基组合物进行培养，
向用所述含有光敏剂的培养基组合物培养后的所述细胞群照射特定波长的光，
从所述细胞群中除去所述干细胞。
2.如权利要求1所述的干细胞除去方法，其特征在于，
所述干细胞是多能干细胞或成体干细胞，
所述多能干细胞包含ES细胞及iPS细胞中任一者，所述ES细胞也称为胚胎干细胞，所述iPS细胞也称为人工多能干细胞，
所述成体干细胞包含生殖干细胞、生殖细胞、多分化潜能的干细胞、及单分化潜能的干细胞中任一者。
3.如权利要求1或2所述的干细胞除去方法，其特征在于，
所述光敏剂是氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐。
4.如权利要求3所述的干细胞除去方法，其特征在于，
所述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐的浓度为10μM～2000μM。
5.如权利要求3或4所述的干细胞除去方法，其特征在于，
添加所述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐后至照射光的时间为4小时以上。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的干细胞除去方法，其特征在于，
所述特定波长的光的波长为400nm～750nm，照射照度为1mW/cm2～200mW/cm2，照射时间为1分钟～240分钟。
7.一种分化细胞保护方法，其特征在于，
在利用权利要求1～6中任意一项所述的干细胞除去方法除去时，对诱导分化得到的所述体细胞进行保护。
8.如权利要求7所述的分化细胞保护方法，其特征在于，
所保护的所述体细胞是中胚层细胞。
9.如权利要求7所述的分化细胞保护方法，其特征在于，
所保护的所述体细胞是外胚层细胞。
10.如权利要求7所述的分化细胞保护方法，其特征在于，
所保护的所述体细胞是内胚层细胞。
11.一种培养基组合物，其特征在于，含有：
用于对含有干细胞和由干细胞经诱导分化得到的体细胞的细胞群进行培养的培养基成分、和
光敏剂。
12.如权利要求11所述的培养基组合物，其特征在于，
在照射特定波长的光的情况下，将所述干细胞除去。
13.如权利要求12所述的培养基组合物，其特征在于，
在照射所述特定波长的光的情况下，对诱导分化得到的所述体细胞进行保护。
14.如权利要求11～13中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述干细胞是多能干细胞或成体干细胞，所述多能干细胞包含ES细胞及iPS细胞中任一者，所述ES细胞也称为胚胎干细胞，所述iPS细胞也称为人工多能干细胞，
所述成体干细胞是具有多能性和自我复制能力的细胞。
15.如权利要求11～14中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
由所述干细胞经诱导分化得到的所述体细胞，包含由中胚层细胞、外胚层细胞、及内胚层细胞形成的组中的任意一种。
16.如权利要求11～15中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
还含有由所述干细胞诱导分化出所述体细胞的生长因子成分。
17.如权利要求11～16中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述培养基成分包含用于对细胞提供养分的营养成分。
18.如权利要求11～17中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述培养基成分包含用于将培养过程中的环境保持恒定的缓冲成分。
19.如权利要求11～18中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述培养基成分包含对所述体细胞的发育进行促进的生长促进成分。
20.如权利要求11～19中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述光敏剂是氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐。
21.如权利要求20所述的培养基组合物，其特征在于，
所述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐的浓度为10μM～2000μM。
22.如权利要求20或21所述的培养基组合物，其特征在于，
添加所述氨基乙酰丙酸、其衍生物、或它们的盐后至照射光的时间为4小时以上。
23.如权利要求12～22中任意一项所述的培养基组合物，其特征在于，
所述特定波长的光的波长为400nm～750nm，照射照度为1mW/cm2～200mW/cm2，照射时间为1分钟～240分钟。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11058389B2 (en) 2017-09-25 2021-07-13 Shanghai United Imaging Healthcare Co., Ltd. System and method for locating a target subject

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174478A (zh) * 2011-01-05 2011-09-07 复旦大学 一种光敏剂结合蛋白/多肽及其在光动力基因治疗中的应用
CN103405769A (zh) * 2013-03-07 2013-11-27 北京亿仁赛博医疗科技研发中心有限公司 光敏剂在制备治疗疾病的病毒灭活药物中的应用
WO2014126146A1 (ja) * 2013-02-14 2014-08-21 独立行政法人産業技術総合研究所 未分化細胞除去方法
WO2014157257A1 (ja) * 2013-03-25 2014-10-02 公益財団法人先端医療振興財団 細胞の選別方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9345904B2 (en) 2011-07-01 2016-05-24 Sbi Pharmaceuticals Co., Ltd. Photodynamic therapy using photosensitizing agent or 5-aminolevulinic acid
JP2014023457A (ja) 2012-07-25 2014-02-06 St Marianna Univ School Of Medicine 神経細胞シート及びその製造方法
KR101449599B1 (ko) 2013-06-12 2014-10-13 다이아텍코리아 주식회사 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174478A (zh) * 2011-01-05 2011-09-07 复旦大学 一种光敏剂结合蛋白/多肽及其在光动力基因治疗中的应用
WO2014126146A1 (ja) * 2013-02-14 2014-08-21 独立行政法人産業技術総合研究所 未分化細胞除去方法
CN103405769A (zh) * 2013-03-07 2013-11-27 北京亿仁赛博医疗科技研发中心有限公司 光敏剂在制备治疗疾病的病毒灭活药物中的应用
WO2014157257A1 (ja) * 2013-03-25 2014-10-02 公益財団法人先端医療振興財団 細胞の選別方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUAN-HANG YU等: "Photodynamic Therapy with 5-Aminolevulinic acid (ALA) Impairs Tumor Initiating and Chemo-Resistance Property in Head and Neck Cancer-Derived Cancer Stem Cells", 《PLOS ONE》 *
施东雯等: "光动力学疗法净化造血干细胞的研究现状", 《中国激光医学杂志》 *
龚业莉: "《走近神奇的干细胞移植》", 31 May 2014 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11058389B2 (en) 2017-09-25 2021-07-13 Shanghai United Imaging Healthcare Co., Ltd. System and method for locating a target subject
US11071512B2 (en) 2017-09-25 2021-07-27 Shanghai United Imaging Healthcare Co., Ltd. System and method for locating a target subject

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