KR101449599B1 - 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도 - Google Patents

광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101449599B1
KR101449599B1 KR1020130066945A KR20130066945A KR101449599B1 KR 101449599 B1 KR101449599 B1 KR 101449599B1 KR 1020130066945 A KR1020130066945 A KR 1020130066945A KR 20130066945 A KR20130066945 A KR 20130066945A KR 101449599 B1 KR101449599 B1 KR 101449599B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
smscs
tumor
loaded
chlorin
Prior art date
Application number
KR1020130066945A
Other languages
English (en)
Inventor
강영선
고기남
박계신
박형순
조미연
김한나
Original Assignee
다이아텍코리아 주식회사
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이아텍코리아 주식회사, 건국대학교 산학협력단 filed Critical 다이아텍코리아 주식회사
Priority to KR1020130066945A priority Critical patent/KR101449599B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101449599B1 publication Critical patent/KR101449599B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C12N5/0692—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 이를 이용한 항암세포치료제에 관한 것이다.

Description

광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도{A Stem Cells comprising photosensitizer and use of the same}
본 발명은 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 이를 이용한 항암세포치료제에 관한 것이다.
외과적 수술요법이나 방사선요법 등 암 치료 방법은 많은 발전이 이루어지긴 했으나, 암은 여전히 선진국과 개발도상국에서 사망의 주요 원인으로 꼽히고 있음. 세계보건기구(WHO)의 보고를 따르면 세계적으로 인구의 고령화 및 암 유발 위험인자가 많은 선진국형 생활양식 때문에 암환자는 지난 30년에 비하여 최근에 더욱 빠른 증가율을 보이고 있으며 이는 한국도 마찬가지이다.
현재 항암치료는 대부분 항암제를 이용한 화학요법에 따라 이루어지고 있는데, 현재 일반적으로 사용되고 있는 고전적인 항암제는 암세포에만 작용하는 것이 아니고 골수세포, 소화관세포, 모낭세포와 같이 급속한 분열이 일어나는 다른 정상세포들도 공격하여 골수 및 면역억제, 메스꺼움, 구토, 점막염, 탈모 등의 심각한 부작용을 일으킨다. 또한, 항암제를 사용하는 경우 투여횟수가 늘어날수록 약제내성 때문에 치료 효과도 현저히 저하되는 단점이 있다.
따라서 최근 수십 년간 약물전달기술을 이용한 항암치료나 광역학치료(Photodynamic therapy, PDT)가 기존의 고전적인 항암치료를 대체할 수 있는 전망 있는 치료법으로 주목을 받기 시작하였다. 그러나 이러한 새로운 치료법도 아직은 약제의 암세포에 대한 선택성 및 그에 따른 효율성이 탁월하다고 볼 수 없으며 부작용 또한 완전히 배제할 수 없는 단계이며, 이러한 이유로 아직 기존의 항암제를 대체하지는 못하고 있다.
광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 빛과 광민감제 (photosensitizers, PS)의 조합을 이용한 의학적 치료로서, 작용기전은 크게 광민감제의 종양 선택적 축적에 대한 분자적 기전과 광민감제와 빛의 상호작용에 따른 종양 파괴 기전으로 나눌 수 있다. 각 인자는 그 자체로 해롭지 않으나, 산소와 결합하였을 때, 이들은 종양 세포를 비활성화하는 치사의 세포독성 작용제를 생산할 수 있다[Sternberg ED et al., Tetrahedron, 1998, 54:4151-4202; Kadish KM et al., The Porphyrin Handbook. 2000, Vol 6: 158-161].
광역학 치료는 이중 선택성을 나타내는데, 병든 조직에 의해서 광민감제가 우선적으로 흡수되고, 특정 영역의 빛을 조사함으로써 광민감제가 활성화된다. 광역학 치료는 세포 내 수많은 항산화 방어 메커니즘을 압도하고 세포의 거대분자에 산화적 손상을 야기하는 일중항 산소(singlet oxygen) 및 다른 반응 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생산을 통해 세포를 사멸시킨다[Weishaupt KR et al., Cancer Res., 1976, 36: 2326-2329].
광역학 치료 도중 형성되는 세포독성 작용제인 일중항 산소와 반응 산소종을 발생시키는 광화학적 반응은 변형된 야블론스키 다이아그램에 의해 나타내어진다. 요컨대, 빛의 흡수 이후에 광민감제는 반감기가 짧은 여기된 일중항 상태[S1, (~10
-6s)]를 통해 바닥 일중항 상태(S0)로부터 전기적으로 여기된 삼중항 상태[T1, (~10-2s)]로 변형된다. 광역학 치료에 관한 특별히 중요한 것은 반감기가 짧은 여기된 일중항 상태 광민감제가 계간교차(intersystem crossing, ISC)의 비-방사성 과정을 수행할 수 있다는 점이다. 이는 스핀 반전을 필요로 하여 이에 의하여 광민감제를 전자 스핀 평행을 가지는 상대적으로 반감기가 긴 여기된 삼중항 상태(T1)로 전환하기 때문에 스핀-금지(spin-forbidden) 과정이다. 어떠한 '금지' 경로도 '허용' 과정보다 가능성이 더 낮으나, 우수한 광민감제는 매우 높은 효율로 '금지' 계간교차 경로를 수행한다. 여기된 삼중항 상태 광민감제는 두 가지 종류의 반응을 수행할 수 있다[Macdonald JI et al., J. Porphyrins Phthalocyanines, 2001, 5: 105-129].
첫째, 이는 산소와 상호작용 이후에 슈퍼옥사이드 이온, O2 -과 같은 과산화 생성물을 생산할 수 있는 라디칼 및 라디칼 이온을 형성하기 위하여 생물학적 기질과 함께 전자-전달 과정에 참여할 수 있다[타입 I 반응]. 양자택일적으로, 이는 안정한 삼중항 산소(3O2)가 반감기는 짧으나 큰 반응성을 가지는 일중항 산소(1O2)로 전환하게 되는 타입 II 반응으로서 알려진 광화학적 과정을 수행할 수 있다.
더 나아가, 광역학 치료의 종양 세포 치사 효과는 암 덩어리 내의 빛 침투 깊이와 관련된다. 조직 내 빛의 영향은 거리에 대해 기하급수적으로 감소한다 [Moser JG. In Photodynamic Tumor Therapy - 2nd & 3rd Generation Photosensitizers. Harwood Academic Publishers, London, 1997, 3-8]. 조직의 약화는 최적의 흡수, 내인성 분자 및 약물 발색단 자체에 의한 산란에 의해 영향을 받는다. 피부 조직의 최대 투과율은 700-800 ㎚ 영역에 있고, 이 영역 내에서 최대 흡수를 나타내는 광민감제의 개발이 요구된다. 630 ㎚에서의 유효한 침투는 1 내지 3㎜ 사이인데 반하여, 700-850 ㎚에서는 최소한 6 ㎜의 빛 침투가 관찰되었다. 따라서, 이상적인 광민감제는 근적외선 영역에서 강한 흡수를 나타내야만 한다.
광민감제는 빛의 흡수 하에서 다른 화학종의 화학적 또는 물리적 변형을 유도하는 화학종으로서 정의된다. 임상의와 화학자는 이상적인 광민감제에 대해 다른 견해를 가진다[Kirchner C et al., Nano Lett., 2005, 5: 331].
예를 들어, 화학자는 높은 절멸 정도와 일중항 산소의 높은 양자 수율을 보다 더 강조할 수 있음에 반하여 임상의는 낮은 독성과 높은 선택성을 더욱 강조할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 양쪽 모두 임상적 광역학 치료와 이상적 광민감제가 임상적으로 적절하고 Allison 등[Zheng H. Technology in Cancer Research & Treatment,2005, 4: 283-293]과 Castano 등[Anna C et al., Photochem Photobiol, 2006, 82: 617-625]에 의해 보고된 하기 기준의 몇몇을 최소한 충족해야만 한다는 점에 동의한다.
1. 가시광선 스펙트럼의 적색 부분에서의 강한 흡수(>650 ㎚),
2. 94 kJ/mol보다 큰 삼중항 에너지를 가진 삼중항 형성의 높은 양자 수율,
3. 일중항 산소 생성의 높은 양자 수율(반감기가 긴 여기 상태),
4. 낮은 암흑(dark) 독성,
5. 종양 조직 대 건강한 조직, 특별히 피부에서의 농축 선택성을 나타내야만함; 일반적인 피부 감작은 피해야만함; 특정 치료 모달리티는 피부 감작을 필요로 하며, 이때 피부의 급속한 감작 및 탈감작이 바람직함,
6. 약물의 단순한 제형화; 제형화된 약물은 긴 저장 기간을 가져야만 함,
7. 체내로부터 급속하게 제거되는 약물 동력학적 프로파일,
8. 상기 특성들의 향상을 가능하게 하는 용이한 유도체화(측쇄)의 선택권,
9. 쉽게 입수가능한 출발 물질로부터의 용이한 합성, 다수-킬로그램 스케일로의 쉬운 변형,
10.1O2 양자 수율을 감소시키는 것으로 인한 체내에서의 자기-응집이 없음.
광역학 치료 분야에서, 테트라피롤 거대 고리가 광민감제로서 종종 사용된다. 가시광선 스펙트럼의 적색 영역에서의 강한 흡수는 이것이 더 두꺼운 종양의 치료를 가능하게 하기 때문에 효과적인 광민감제를 위한 매우 바람직한 특징이다[Johnson CK et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39: 4619-4622]. 이러한 이유 때문에, 포르피린,클로린, 박테리오클로린, 포피신, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 그리고 확장된 포르피린과 같은 테트라피롤이 합성되어졌고, 이들에 대한 광역학 치료 효능이 평가되어 왔다. 광민감제는 이들의 화학적 구조와 유래에 의하여 분류될 수 있다. 일반적으로 이들은 3 개의 넓은 부류로 나뉠 수 있다: (i) 포르피린-기초(예를 들어 포토프린, ALA/PpIX 및 BPDMA), (ii) 클로린-기초(예를 들어 퍼푸린 및 박테리오클로린) 및 (iii) 염료(예를 들어 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌).
이들 중 클로린- 및 박테리오클로린-기초 광민감제는 단량체 화합물로서, 효과적으로 일중항 산소를 발생시키며(φ = 45-60 %), 그들의 긴 흡수파장 때문에 넓고(넓거나) 깊게 자리 잡은 종양을 치료하는데 효과적이다[Zheng, X. et al., J. Med. Chem. 2009, 52: 4306-4318].
[관련 선행 특허]
대한민국특허공개번호 10-2011-0085935
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 항암세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 항암세포치료방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 광민감제 탑재 성체 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 광민감제는 포르피린-기초 광민감제, (ii) 클로린-기초 광민감제 및 (iii) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 광민감제인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 클로린 기초 광민감제는 포토디타진, 라다클로린(Radachlorin), 2-(1-헥실에틸)-2-디비닐피로페오포르비드-α(HPPH)[2-(1-hexylethyl)-2-devinylpyropheophorbide-α(HPPH)], 또는 모노-L-아스파르틸클로린 e6 (NPe6)[mono-L-aspartylchlorin e6 (NPe6)]인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고 본 발명에서는 클로린 e6의 tromethamin(tris) 염(DK-AC101)을 사용하였다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 광민감제 탑재 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군 중에서 선택 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 광민감제 탑재 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 생체 이미징(bio-imaging)용 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 광민감제 탑재 성체 줄기세포를 종양부위 또는 정맥 내 주사하여 종양에 타겟하게한 후 빛을 조사하는 단계를 포함하는 종양 치료 방법을 제공한다.
상기 암 치료용 조성물은 650 ㎚ 내지 800 ㎚ 범위의 광선에 대하여 생체 외 또는 생체 내에서 광활성화되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 암 치료용 조성물은 정맥주사, 복강내주사, 근육내주사, 두개내주사, 종양내주사, 상피내주사, 피부관통전달, 식도투여, 복부투여, 동맥주사, 관절내주사 및 구강내투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 수용액, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼 또는 유제 등의 형태의 비경구 투여를 위한 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우 보통 사용하는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 조성물은 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 성체 줄기세포를 광민감제의 전달체로 이용하여 암을 치료 하는 기술은 약물전달 및 약물 표적화는 물론 성체 줄기세포와 광역학치료의 장점을 아우르는 신개념의 치료법이라 할 수 있다. 즉, 광민감제는 성체 줄기세포에 탑재된 형태로 성체 줄기세포와 함께 이동되므로 광민감제 역시 암세포 주변에만 축적되며 빛을 조사하여 이차적으로 광역학치료의 효과를 볼 수 있다.
본 발명의 성체 줄기세포를 광민감제의 전달체로 이용하여 암을 치료 하는 기술은 약물전달 및 약물 표적화는 물론 성체 줄기세포와 광역학치료의 장점을 아우르는 신개념의 치료법이라 할 수 있다. 즉, 광민감제는 성체 줄기세포에 탑재된 형태로 성체 줄기세포와 함께 이동되므로 광민감제 역시 암세포 주변에만 축적되며 빛을 조사하여 이차적으로 광역학치료의 효과를 볼 수 있다.
도 1은 중간엽줄기세포(sMSCs)에 대한 DK-AC101의 탑재가능을 확인한 그림으로, DK-AC101를 탑재할 경우 농도 의존적 형광신호 관찰이 가능함.
도 2는 sMSCs에 탑재된 DK-AC101은 3일 후에 세포 내로 빠져나와, 세포가 형광신호를 잃게되는 것을 보여주는 그림.
도 3은 DK-AC101의 농도에 따른 sMSCs의 세포독성효과 확인.
도 4는 MAESTRO 2에 의해 DK-AC101 탑재 sMSCs의 숫자 의존적으로 증가된 형광신호 관찰이 가능한 것을 보여주는 그림.
도 5는 생체 내 주입된 DK-AC101탑재 sMSCs 숫자 의존적으로 bio-imaging 형광신호가 관찰되었음을 나타낸 그림.
도 6은 DK-AC101 300 mM을 sMSCs에 4시간 탑재 시킨 후, 5X105 개 이상 DK-AC101탑재 sMSCs를 생체 내 주입할 경우 7일정도 까지 Bio-imaging으로 세포추적이 가능한 것을 보여주는 그림.
도 7은 Glioma 종양유발 Nude 생쥐 및 실험물질 투여 경로를 보여주는 그림.
도 8은 Bio-imaging을 통해 DK-AC101 탑재 sMSCs의 신호가 5일 째부터 종양부위에서 관찰됨을 확인한 그림.
도 9는 Glioma 종양유발 Nude 생쥐에서 DK-AC101 탑재 sMSCs의 종양 표적효과 재확인을 위한 실험물질 투여 경로를 보여주는 그림.
도 10은 생체 내로 투여된 DK-AC101과 DK-AC101 탑재 sMSCs의 Bio-imaging 형광신호가 종양부위에서 높게 관찰되는 것을 보여주는 그림.
도 11은 DK-AC101 탑재 sMSCs를 생체 내 주입 한 후 5일 째 DK-AC101 형광 신호가 종양 주변 및 종양 내에서 뚜렷하게 관찰되기 시작하는 것을 보여주는 그림.
도 12는 sMSCs는 CD44, CD105를 발현하고 CD45, CD117은 발현하지 않는다는 것을 보여주는 그림.
도 13은 DK-AC101 탑재 sMSCs는 안와총정맥주사 5일 후 종양부위로만 밀집됨을 보여주는 그림.
도 14은 DK-AC101 탑재 sMSCs가 5일 후 대부분 종양부위로 밀집되고 일부가 종양 내로 침투되어 있음을 보여주는 그림.
도 15는 레이져치료 실시 후 9일 째 종양 내부에서 더 많은 DK-AC101 신호가 감지됨을 보여주는 그림.
도 16은 레이져 치료 실시 후 9일 째 DK-AC101 탑재 sMSCs가 파괴되어 주변의 암세포가 DK-AC101을 탐식한 모양의 신호 관찰을 보여주는 그림.
도 17은 DK-AC101 탑재 관절낭 MSCs의 생체 내 주입 9일 째 종양부위로 밀집 및 종양 내부로 침투됨을 보여주는 그림.
도 18은 많은 수의 CD44 발현 DK-AC101 탑재 sMSCs가 종양 내부에서 관찰됨을 보여주는 그림.
도 19는 종양 내부의 DK-AC101 탑재 sMSCs는 대부분 DK-AC101을 여전히 탑재하고 있으며, 그러나 sMSC로 부터 유래된 DK-AC101 탐식 암세포도 관찰한 결과.
도 20은 레이져 치료 시, DK-AC101 탑재 sMSCs에 의해 Glioma 유래 종양의 성장이 효과적으로 지연됨을 보여주는 그림.
도 21은 레이져 치료 시, DK-AC101 탑재 sMSCs에 의해 Glioma U97MG 세포의 활성도가 급격하게 감소함을 in vitro 실험을 통해 확인한 그림.
도 22는 클로린 e6 tromethamine염의 합성의 개략도.
도 23은 클로로필 추출액의 LC 데이터
도 24는 클로로필 추출액의 absorption 데이터
도 25는 페오파이틴의 LC 데이터
도 26은 Chlorin e6 sodium salt의 LC/MS 데이터
도 27은 Chlorin e6의 LC/MS 데이터
도 28은 클로린 e6의 absorption 데이터
도 29는 클로린 e6의 1H-NMR 데이터
도 30은 Chlorin e6 tromethamine염의 LC/MS 데이터
도 31은 클로린 e6 tromethamine염의 absorption 데이터
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: DK - AC101 탑재 Synobial MSCs ( sMSCs ) 제작
DK - AC101 의 sMSCs 탑재 조건 확인
1) 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem Cells, sMSCs)에 대한 DK-AC101의 탑재가능 확인 (도 1):
DK-AC101이 일반 세포주와 유사하게 sMSCs에도 탑재가 가능한지를 우선적으로 확인해보았다. DK-AC101의 농도를 4, 8, 15 그리고 30 uM 농도로 1시간, 2시간 그리고 3시간 동안 sMSCs에 처리하여 준 후 형광현미경을 이용하여 DK-AC101의 신호를 관찰하였다. 4 uM에서는 전혀 DK-AC101신호가 감지되지 않았고, 8 uM 부터는 DK-AC101 농도 의존적으로 DK-AC101 신호가 확실하게 감지되었다. 또한 1시간 후 부터도 DK-AC101 신호가 확실하게 관찰됨을 확인하였다.
2) sMSCs에 탑재된 DK-AC101은 3일 후에 대부분 세포 외로 빠져나온다:
sMSCs에 탑재된 DK-AC101이 세포 외로 빠져나오는지 어떤지를 확인하였다. DK-AC101을 15 uM 농도로 3시간 동안 sMSCs에 탑재시킨 후 배양액을 교체하지 않은 경우와, DK-AC101이 포함되어 있지 않은 새로운 배양액으로 교체하여 주고 3일 후 DK-AC101 신호를 유세포분석기를 통해 분석하였다. 배양액을 교체하지 않은 경우에는 sMSCs 내에서 여전히 DK-AC101이 관찰되었지만 (도 2. 왼쪽), 배양액을 교체하여 준 경우에는 DK-AC101 신호가 사라짐을 관찰하였다. 따라서 sMSCs에 탑재된 DK-AC101은 3일 후에는 모두 세포 밖으로 빠져나옴을 확인할 수 있었다. 이 결과를 통해, DK-AC101이 세포 밖으로 완전히 또는 매우 천천히 빠져나오게 만들 개량의 필요성이 있음을 확인하였다.
3) sMSCs에 탑재된 DK-AC101의 세포독성효과 확인:
sMSCs에 탑재된 DK-AC101의 세포독성효과를 확인하였다. sMSCs에 DK-AC101을 20, 50, 100, 200, 300 그리고 500 uM의 농도로 1일 간격으로 지속적으로 또는 1회 처리하여 준 후 1일, 2일, 3일 그리고 4일 후에 sMSCs의 세포수를 확인하고 그래프로 그 결과를 나타내었다. DK-AC101을 500 uM로 지속적으로 처리하여 준 경우를 빼고는 나머지 농도에서 세포수는 지속적으로 증가하였다 (도 3. 위). 그러나 4일 째에는 모든 농도에서 세포수 증가가 급격하게 감소하였다. 이를 통해 지속적으로 sMSCs에 DK-AC101을 탑재할 경우 세포독성이 매우 큼을 확인하였다. DK-AC101을 1회만 처리하여 준 경우에는 모든 농도에서 3일까지는 세포수가 대조군과 유사하게 정상적으로 증식함을 관찰하였다 (도 3. 아래). 4일 째에는 100 uM 이하에서는 세포증식이 잘 유지되었고 200 uM에서는 세포수가 감소하였다. 따라서 DK-AC101을 200 uM 이상 농도로 처리할 경우 세포독성이 있음을 확인하였다. 그러나 4일 동안 장시간 배양을 통한 세포배양 조건에도 문제가 있을 수 있기 때문에 현재 이에 대한 조사를 진행 중이다.
DK - AC101 탑재 줄기세포의 in vivo Bio - imaging 기법 응용가능성 실험
1)DK - AC101 의 형광신호와 sMSCs 세포수와의 상관관계 규명:
DK-AC101이 탑재된 sMSCs를 생쥐에 생체 내 주입하고 Bio-imaging이 가능한지를 확인하기 위해 DK-AC101이 탑재된 sMSCs를 bio-imaging기법으로 확인하였다. 50 uM의 DK-AC101을 sMSCs에 3시간 동안 탑재시킨 후 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 그리고 0.1 X 10^6개의 세포들을 96well에 각각 분주한 후 MAESTRO 2 bio-imaging기기로 확인하였다. 그 결과 5 X 10^6 와 2.5 X 10^6개세포수에서 세포수 의존적으로 DK-AC101의 신호가 매우 뚜렷하게 확인됨을 확인하였다 (도 4).
2) 생체 내 주입된 DK - AC101 탑재 sMSCs 의 bio - imaging 기법 활용 가능성 확인:
DK-AC101탑재 sMSCs가 생체 내에서도 MAESTRO 2에 의해 bio-imaging이 가능하고 세포 주입 후 몇 일까지 추적가능한지를 확인하였다. DK-AC101을 50 uM의 농도로 sMSCs에 3시간 동안 탑재시킨 후 생쥐의 등 피하조직에 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 그리고 0.1 X 10^6개의 세포를 각각 주사하였다. 주사하여 준 후 1일, 5일 그리고 13일 후에 bio-imaging을 수행하였다. 우선 모든 경우에 있어서 세포수에 의존적인 DK-AC101신호를 생쥐의 피하조직으로부터 얻을 수 있었다 (도 5). 또한 5 X 10^6개의 세포를 주사한 경우는 13일 까지도 매우 확실하게 DK-AC101신호를 확인하였다 (도 5. 1번과 그래프의 맨 왼쪽). 2.5 X 10^6개를 주입한 경우에는 5일　째까지는 신호를 확인할 수 있었지만 그 이후로는 신호를 확인할 수 없었다 (도 5. 2번 부위와 그래프 왼쪽에서 두 번째). 1 X 10^6 개 이하로 주입한 경우에는 3일 째에서도 매우 희미한 신호를 확인할 수 있었다. 이를 통해, DK-AC101을 50 uM 농도로 sMSCs에 탑재할 경우 1 X 10^6개의 세포를 생체 내 주입함이 장기간 bio-imaging을 하기에 적합함을 확인하였다.
3) 생체 내 주입된 DK - AC101 탑재 sMSCs 의 최적화 Bio - imaging 조건 수립:
생체 내로 많은 수의 sMSCs를 주입할 경우 세포 자체적으로 면역학적 부작용을 유발시킬 수 있다. 또한 DK-AC101에 660 nm 파장의 빛을 쬐어 sMSCs를 생체 내에서 파괴시킬 경우 그 잔존물들에 의한 면역학적 부작용 및 다양한 부작용을 초래할 수 있다. 따라서 이러한 부작용을 피하기 위해 Bio-imaging이 가능한 최소 세포수를 확인하고자 하였다. 최소수의 sMSCs를 사용하기 때문에 이 경우 300 uM 농도를 사용하였다. DK-AC101을 sMSCs에 탑재하고 3시간 후 1번 생쥐의 등 부위 (도 6. 왼쪽)와 2번 생쥐의 다리 부위 (도 6. 오른쪽)에 5, 2.5, 1.25, 0.625 X 10^5개 씩의 세포를 각각 주입하였다. 1일 째에는 두 마리 생쥐 모두에서 주입된 세포군에 대한 Bio-imaging이 명확하게 가능하였다. 그러나, 4일 째에서는 두 마리 생쥐에서 모두 5 X 10^5개의 세포를 주입한 생쥐에서만 DK-AC101 신호가 관찰되었으며 이 신호는 7일　째까지 관찰가능하였다 (도 6. 빨간 화살표). 이를 통해 세포수는 최소한 5 X 10^5개 이상을 이용하는 것이 생체 내 Bio-imaging을 위해 적합함을 확인하였다.
실시예 2: DK - AC101 탑재 sMSCs 의 종양부위 표적효과
DK - AC101 탑재 sMSCs 의 in vivo Bio - imaging 가능성 연구
1) DK - AC101 탑재 sMSCs 의 Bio - imaging 실험조건
▶ Nude mouse 사용 Glyoma 세포주 (U87MG, 5 X106, ~15일)
▶ 생체 실험군 :
① PBS (3마리), 근육주사
②③ DK-AC101 근육주사 (2마리)
④⑤ DK-AC101 탑재 sMSCs 안와정맥총 주사 (Retro-ovital intravenous injection, RO i.v.) (2마리) 1일 1회, 3일
▶ Glyoma 종양 유발: Glyoma 세포주(U87MG) 5 X106개 주입 후, ~15일 성장
▶ DK-AC101 탑재 sMSCs (300 μM 탑재, 1X106, 4시간 )
▶ 안와정맥총 혈관 주사량 : 200 μl
▶ Bio-imaging 관찰: Maestro II, X 9일
▶ Laser 조사 (660 nm, ~ 200 J/Cm2): ①,② 그리고 ③ 만 → 2-3일, 6 - 8일만 조사 (5일 동안)
2) DK - AC101 탑재 sMSCs 의 Bio - imaging 을 통한 종양부위 표적효과 가능성 확인.
① DK-AC101만을 주사한 경우 3시간 안에 종양부위에 밀집되지만, 12시간 이 후 급격히 감소한다 (결과 미기재). 그러나 DK-AC101 탑재 MSCs를 종양 내로 직접 주사한 의 경우, 9일 동안 종양부위에 매우 특이적으로 DK-AC101 신호가 관찰됨을 Bio-imaging 분석법을 통해 확인하였다 (도 8. 오른쪽 첫째줄). 이 결과를 통해 DK-AC101을 MSCs에 탑재해 줄 경우, DK-AC101이 종양 부위에 9일 동안 장기간 머물러 있을 수 있기 때문에, DK-AC101의 레이져치료 효과를 현저하게 높일 수 있음을 확인하였다.
② 정맥내주사한 DK-AC101 탑재 MSCs은 5일만에 종양부위로 표적되어 계속머물러 있는 듯함: DK-AC101 탑재 sMSCs를 안와정맥 내 주사한 군에 대해 Bio-imaging분석을 수행한 결과, DK-AC101탑재 MSCs가 5일만에 종양 부위로 표적되어 계속 머물러 있음을 확인하였다(도 8, 오른쪽 중간과 밑줄 그림). 따라서 종양 내에 직접 DK-AC101 탑재 MSCs를 주사하지 않고 정맥 내 주사하여도 표적하는 DK-AC101탑재 MSCs가 암 조직으로 이동하고, 레이져 조사를 통해 암세포를 파괴할 수 있음을 확인하였다.
DK - AC101 탑재 sMSCs 의 종양부위 표적에 대한 Bio - imaging 검사법과 종양조직검사결과와의 상관관계 확인
1) DK - AC101 탑재 sMSCs 종양부위 표적의 새로운 Bio - imaging 실험조건:
정맥에 주사한 DK-AC101 탑재 sMSCs가 종양부위에 머물러 있다는 결과를 확인한 후 새로운 Bio-imaging 조건으로 실험을 진행하였다. 생쥐에 glyoma 세포주 (U87MG)를 5x10^6개 주입한 후 15일 정도 성장시킨 후 PBS, DKAC101 , DK-AC101탑재 sMSCs 정맥주사 각 5마리씩 실험하였다. 이때 DK-AC101은 15ug/100ul로 사용하였고, DK-AC101탑재 sMSCs는 300uM의 DK-AC101을 4시간 배양한 후 4x10^6/100ul로 사용하였다. 이때 PBS와 DK-AC101은 근육주사로 종양 부위에 직접 주사하였고, DK-AC101탑재 sMSCs의 경우에는 도 8의 결과와 같이 정맥을 통해 주사하였다. 이후 2일,3일 그리고 5일 6일에 레이저를 조사하였다. 구체적인 생체 내 실험 조건은 아래와 같다 (도 9).
▶ Nude mouse 사용
▶ Glyoma 종양 유발: Glyoma 세포주(U87MG) 5 X106개 주입 후, ~15일 성장
▶ 생체 실험 :
① PBS (5마리), 근육주사
② DK-AC101 근육주사 (5마리)
③ DK-AC101 탑재 sMSCs (5마리)
▶ DK-AC101 (15 μg/100μl PBS)
▶ DK-AC101-sMSCs (sMSCs 1X106/100φ dish 2~3일 culture, DK-AC101 농도 = 300 μM, ~4시간 배양, 탈착 후 ~4X106/100μl PBS로 제조)
▶ DK-AC101 탑재 sMSCs (300 μM 탑재, 1X106, 4시간 )
▶ 모든 생쥐군 안와정맥총 혈관 주사 (100μl)
▶ 안와정맥총 혈관 주사량 : 100 μl
▶ Bio-imaging 관찰: Maestro II, X 9일
▶ Laser 조사 (660 nm, ~ 200J/Cm2) : 6-8일,14-16일 (6일 동안)
2) DK - AC101 탑재 sMSCs 의 Bio - imaging 을 통한 종양부위 표적결과 재확인
PBS, DK-AC101, DK-AC101탑재 sMSCs를 생체 내에 1일 1회씩 4회 투여하고 레이쳐 치료 기간을 포함하여 전체 9일 동안 Bio-imaging을 통해 종양부위의 표적 결과를 재 확인 하였다 (도 10). 생체 내로 투여된 DK-AC101과 DK-AC101탑재 sMSCs의 경우 10일 이후에도 종양 부위에 효과적으로 표적되어 있음을 확인할 수 있었다. 특히 DK-AC101탑재 sMSCs의 경우 종양 부위에 뚜렷하게 표적되어 있음을 재 확인할수 있었다. 따라서 DK-AC101탑재 sMSCs는 종양 부위 특이적으로 이동하여 종양 부위에 표적되어 있음을 Bio-imaging을 통해 재확인하였다.
3) 종양의 동결절편조직의 형광현미경 검사를 통한 DK - AC101 과 DK - AC101 탑재 sMSCs 의 종양부위 표적결과 확인
Bio-imaging을 통해 확인한 종양 부위를 동결절편조직으로 만들어서 형광 염색을 통해 종양부위 표적결과를 확인하였다. 종양부위를 따로 떼어낸 후 OCT compound 블록으로 만든 후 절편 조직을 만들어 고정하지 않은 채 DK-AC101 형광신호를 관찰하였다. 5일째 절편에서 PBS의 경우에는 형광 신호가 없었고 (도 11. 맨 윗줄), DK-AC101과, DK-AC101탑재 sMSCs의 경우에는 종양 부위에서 형광 신호를 뚜렷하게 관찰할 수 있었다 (도 11. 두 번째 줄 이하). DK-AC101의 경우 종양 부위에서 미세한 점의 형태로 관찰 되었고, 그러나 DK-AC101 탑재 sMSCs의 경우 종양부위의 주변에서 다수, 그리고 종양부위 안쪽에서도 덩어리 형태의 DK-AC101 신호가 관찰되었다 (도 11. 세 번째 줄 이하). 따라서 DK-AC101 탑재 sMSCs가 종양부위로 몰려들어서 종양 부위로 몰려들고 안쪽으로도 침범하고 있음을 확인할 수 있었다.
4) DK - AC101 탑재 sMSCs 의 종양부위 표적결과 확인을 위한 sMSCs 표지항체 결정
도 11 세 번째 이하와 같이 종양 주변 및 내부에서 관찰된 DK-AC101 형광신호가 DK-AC101 탑재 sMSCs에 의해 전달되었음을 확인하기 위해 sMSCs를 형광항체로 면역염색 한 후 FACS를 통해 확인하고자 하였다. 따라서 안와정맥총 내로 주입한 sMSCs의 표식항체를 선정하기 위해 CD44, CD45, CD105와 CD117를 이용하여 FACS 분석을 시도하였다. 이 결과 안와정맥총 내로 주입한 sMSCs가 CD44와 CD105는 발현하며, CD45와 CD117은 발현하지 않는다는 것을 확인하였다(도 12).
5) DK - AC101 탑재 sMSCs 생체 주입 후 5일 째 종양 종양주변에 많은 CD44 발현 sMSCs 가 확인되었다.
도 12에서 확인한 CD44와 45항체를 사용하여 DK-AC101 탑재 sMSCs 생체주입 후 5일째 되는 생쥐의 조직 절편을 면역형광 염색을 한 후, 형광현미경을 통해 확인하였다(도 13). 생쥐의 조직은 종양, 비장, 림프절, 간, 폐, 신장, 심장을 확인하였다. 이때 sMSCs에 발현하는 CD44의 경우 종양 조직에서만 발견됨을 확인할 수 있었다 (도 13). 이때 종양 주변으로 모여들거나 소수의 DK-AC101 탑재 sMSCs가 종양 내부로 들어가는 경향의 결과를 관찰하였다. 특히, DK-AC101 탑재 sMSCs를 안와정맥총으로 주사해 줄 경우 생체내 종양조직 이외 다른 조직에는 전혀 표적이 되지 않음을 확인할 수 있었다. sMSCs에 발현하지 않는 CD45의 경우 종양은 물론 다른 조직에서도 CD45 신호가 발견되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 DK-AC101 탑재 sMSCs는 종양 특이적으로 이동하여 종양에서만 발견되고 이를 통해 DK-AC101을 종양에 매우 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
5일째 종양 부위로 밀집되고, 종양 내부로 침투한 sMSCs가 실제로 DK-AC101을 탑재하고 있는 확인하기 위해 도 13에서 사용한 조직을 고배율로 관찰하였다. 조양조직 내 세포들은 DAPI을 이용한 핵 염색을 하였다 (도 14. 파란색). 5일째 DK-AC101 탑재 sMSCs를 주입한 경우 많은 수의 sMSCs가 종양 부위로 매우 뚜렷하게 밀집됨이 관찰되었고 (도 14, 왼쪽에서 두 번째, 세 번째 그림), 일부가 종양 내부로 침투하고 있음을 확인하였다(도 14, 왼쪽에서 네 번째 다섯 번째 그림).
6) DK - AC101 과 DK - AC101 탑재 sMSCs 생체 주입 후 9일 째 종양의 동결절편조직에서 훨씬 뚜렷한 DK - AC101 형광신호가 확인되었다.
PBS ,DK-AC101, DK-AC101 탑재 sMSCs를 생체 주입 후 6, 7, 8일 째 각각 레이저 치료를 실시 한 후 9일째 생쥐의 종양부위와 도 13에서 관찰한 조직을 동결절편조직으로 만들어서 고정하지 않고 형광 현미경을 통해 DK-AC101 신호를 확인하였다. PBS를 주입한 경우 전혀 신호가 관찰되지 않았고 (도 15. 맨 윗줄), DK-AC101과,DK-AC101 탑재 sMSCs의 경우 종양 주변부 및 특히 종야 내부에서도 뚜렷한 신호를 관찰하였다 (도 15, 두 번째줄 이하). 또한 DK-AC101의 경우 보다 DK-AC101 탑재 sMSCs의 경우에 좀더 많은 DK-AC101 신호를 관찰할 수 있었다 (도 15, 두 번째줄과 세버째줄 이하 비교).
매우 중요하게도 DK-AC101 탑재 sMSCs를 주입한 경우 종양 내부에서 관찰된 DK-AC101의 신호가 DK-AC101만을 주입한 경우와 유사하게, 미세한 점의 형태로 관찰되었다 (도 15, 세 번째 줄 이하). 이와 같은 결과는 따라서 DK-AC101 탑재 sMSCs가 레이저 치료에 의해 파괴되고 튀어나온 DK-AC101이 주위의 종양조직으로 흡수되었기 때문으로 예상되어졌다. 이를 확인하기 위해 DK-AC101과 DK-AC101 탑재 sMSCs를 주입한 후 레이져 치료를 실시하기 전의 결과들(도 11, 두 번째와 세 번째 줄)과 레이져 치료 실시 후의 결과들 (도 15, 두 번째와 세 번째 줄 이하)를 직접적으로 비교하여보았다. 그 결과, DK-AC101의 경우는 모두에서 미세한 점의 형태가 관찰된 반면에 (도 16, 윗 그림들), DK-AC101 탑재 sMSCs를 주사한 생쥐의 종양에서는 5일째에는 세포 내부에 탑재되어 덩어리 모양의 DK-AC101 신호가 관찰되다가 레이져 치료 후에는 DK-AC101 단독 투여했을 때와 동일한 미세한 신호가 뚜렷하게 관찰되었다 (도 16, 아래 그림들 비교). 따라서 레이저 치료 후 DK-AC101 탑재 sMSCs가 실제로 터지면서 DK-AC101이 sMSCs로부터 배출되고, sMSCs 주변에 있던 주변 암세포들이 DK-AC101을 흡수하여 이와 같은 결과가 관찰되는 것임을 더욱 확실하게 예측할 수 있었다.
7) DK - AC101 탑재 sMSCs 의 생체 내 주입 후 9일째 매우 많은 CD44 발현 sMSCs 가 특이적으로 종양 내부에서 관찰된다.
DK-AC101 탑재 sMSCs 주입 후 5일째에 관찰한 바와 같이(도 13), PBS, DK-AC101, DK-AC101 탑재 sMSCs를 주사한 생쥐의 종양, 비장, 림프절, 간, 폐, 신장, 심장 조직을 차례로 동결절편으로 만들고 CD44와 CD45 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다. 9일 째 종양부위에서는 종양 중심부에 CD44 발현 sMSCs가 다수 관찰됨을 확인하였다 (도 17, 위에서 세 번째, 맨 왼쪽그림). CD45 형광 신호는 역시 모든 조직에서 나타나지 않았다. 매우 고무적이게도, 9일째에도 종양 조직 이외의 조직 에서는 CD44 발현 sMSCs가 관찰되지 않았다.
관찰된 종양 조직을 DAPI와 CD44와 CD45항체를 이용해 이중염색을 하고 고배율로 CD44 발현 sMSCs의 종양부위에 대한 표적정도를 분석하여 보았다. 도 17에서 관찰된 바와 같이 CD45 발현은 어는 군에서도 관찰되지 않았고 (도 18, 아랫줄), CD44의 경우 DK-AC101 탑재 sMSCs가 주입된 군의 종양 부위에서만 특이적으로 관찰되었다 (도 18, 윗줄 외쪽 3, 4, 5번 째 그림). 특히, 종양 내부에도 매우 의미성 있는 수의 CD44발현 sMSCs가 관찰됨을 확인하였다.
9일 째 종양부위에서 관찰되는 CD44 발현 sMSCs에 실제로 DK-AC101이 탑재되어 있는지를 확인하기 위해 도 18에서 사용된 종양부위 조직에 대해 DK-AC101 (red), CD44 (green) 그리고 DAPI (blue)에 대한 형광신호를 고배율로 관찰하였다. DK-AC101 탑재 sMSCs에서 CD44 형광신호가 나타나는 세포 부위를 관찰하였을 때 정확히 모든 부위에서 DK-AC101 형광신호(Red) 와 CD44 형광신호(green) 는 겹쳐져 있었고 이 부위에서 DAPI 형광신호(blue) 를 확인하여 신호들이 겹쳐나온 부분이 sMSCs 부위라는 것을 확인하였다 (도 19, 왼쪽 줄). 따라서 레이져를 종양 부위에 조사해 준 이후에도 DK-AC101을 탑재한 sMSCs가 여전히 종양 내부로 침투되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 레이져 치료에 의해 sMSCs로 부터 배출된 DK-AC101가 미세한 점의 형태로 매우 많은 수의 sMSCs 주변의 암세포에서도 관찰됨을 확인할 수 있었다 (도 19, 두 번째 줄, 왼쪽 세 번째와 네 번째 그림). 그러나 DK-AC101이 생체 내 주입 후 9일 동안 체내 순환과정에서 DK-AC101 탑재 sMSCs로부터 배출된 후, DK-AC101을 탑재하지 않은 채 종양부위로 표적된 sMSCs도 관찰되었다 (도 19, 맨 아랫줄).
실시예 3: DK - AC101 탑재 sMSCs 의 생체 내 종양성장 억제효과
DK - AC101 탑재 sMSCs 에 의해 nude 생쥐에 유발된 Glioma 종양의 성장이 효과적으로 억제되었다.
지금까지 관찰된 여러 실험 결과를 토대로 과연 정말 DK-AC101 탑재 sMSCs에 의해 nude 생쥐에 유발된 Glioma 종양의 성장이 억제 되었는가, 치료 효과가 있는가 확인하기 위해서 생쥐의 무게 및 종양 부위의 크기 비율을 확인하여 보았다(도 20, A). 모든 생쥐는 성체를 사용하였기 때문에 종양이 커지지 않는다면 무게의 비율은 큰 차이를 보이지 않는 것으로 가정하고 보았을 때, PBS는 레이져 치료와는 상관없이 무게가 계속해서 증가하고, 종양 크기도 처음의 4배까지 증가하는 경향을 보였다 (도 20, A의 파란색선). 그리고 DK-AC101만을 주입해준 경우, 무게와 종양의 크기가 조금 줄어들어 보이다가 후반부에는 무게와 종양 크기비율 모두 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 20, A의 갈색선).하지만 DK-AC101 탑재 sMSCs를 주사하고 레이져 치료를 실시한 이후 15일 째부터 생쥐의 무게와 종양의 성장이 모두 증가되지 않음을 관찰하였다 (도 20, A의 녹색선). 또한 17일째 nude 생쥐의 종양을 절제해서 크기를 비교해 보았을 때 PBS와 DK-AC101에 비해 DK-AC101 탑재 sMSCs를 주사한 생쥐의 종양 크기가 뚜렷하게 작다는 것을 확인 하였으며(도 20, B), DAPI 염색을 통해 조직의 치밀도를 확인해 보았을 때 PBS와 DK-AC101와 비교해서 DK-AC101 탑재 sMSCs의 경우 종양 조직의 치밀도가 크게 떨어짐을 확인할 수 있었다(도 20, C). 따라서 DK-AC101 탑재 sMSCs를 이용해 DK-SC101을 종양부위에 효과적으로 전달해주고 레이져 조사를 통해 DK-AC101을 활성화 시켜주게되면 최종적으로 암세포를 파괴하여 종양 조직의 성장을 억제할 수 있다는 것을 명확하게 확인하였다. 본 실험은 종양의 크기가 지름 15 mm 상태에서 실험을 진행하였기 때문에 종양제거 효과를 관찰하지 못한 것으로 예상된다. 따라서 지금 5mm 이하 크기의 종양을 이용해 실험할 경우 종양제거 효과를 얻을 수 있을 것이라 예상하고, 현재 후속 연구를 수행 중에 있다.
실시예 4: DK - AC101 탑재 Synobial MSCs 의 시험관 내 암세포 살상 효과
DK - AC101 탑재 sMSCs 에서 역류된 DK - AC101 에 의해 Glioma 암세포가 제거될 수 있음을 시험관 내 실험에서 확인하였다.
DK-AC101 탑재 sMSCs를 이용해 U97MG (Glioma 암세포)를 제거할 수 있는지를 시험관 내 실험방법을 통해 재확인하였다. 먼저 sMSCs와 U97MG 세포 각각에 DK-AC101을 처리한 후 레이져를 1,2, 5와 10분간 처리한 24시간 후 세포의 활성도를 확인하였다. 그 결과, sMSCs와 U97MG세포 모두 세포의 활성도가 급격하게 감소함을 확인하였다 (도 21, A의 왼쪽과 오른쪽 그래프 각각). 이 결과를 통해 DK-AC101를 탑재한 세포 모두에서 레이져 조사에 의한 세포 살상효과가 있음을 재확인하였다. 이번에는 DK-AC101을 탑재시킨 sMSCs와 U97MG를 1:1, 1:10의 비율로 함께 배양해 준 후, 레이져 조사를 통해 sMSCs 파괴시킨 후 배출된 DK-AC101가 U97MGl에 전달되고 두 번째 레이져 조사를 통해 U97MG가 죽어나가는지를 확인해 보았다. 위의 두세포를 각각의 비율로 함께 배양시킨 후 3시간 간격으로 두 번에 걸쳐 레이져를 5분씩 조사해 주고 난 후 6시간 째 U97MG의 세포 활성도를 측정한 결과, U97MG의 활성도가 거의 5% 이하로 감소됨을 확인하였다 (도 21. B, 오른쪽 그래프). 이를 통해, 시험관 내 실험에서도 DK-AC101 탑재 sMSCs를 이용해 DK-AC101을 암 세포에 전달해 줄 경우, 암세포를 효과적으로 파괴할 수 있음을 명확하게 재확인하였다.
제조예: 클로린 e6의 tromethamine염(DK-AC101) 합성
천연의 스피루리나로부터 클로린 e6의 tromethamine염을 합성하는 단계는 아래의 단계로 이루어진다.
각 단계별 합성 방법은 다음과 같다.
A. 클로로필 추출
1.스피루리나 10kg의 무게를 측정한다.
2.50L 용량의 교반기에 스피루리나 10kg을 넣고 에탄올 45L를 첨가한 후 빛을 차단한 채 23시간 교반한다.
3.교반이 끝나면 종이필터와 천으로 된 필터를 이용하여 감압 여과한다.
4.여과된 여과액을 -20°C의 냉동고에 보관하여 불순물을 냉동 침전시킨다.
5.냉동 침전된 용액을 뷰흐너 깔대기와 종이필터를 사용하여 불순물이 제거된 클로로필 추출액을 얻는다.
클로로필 추출액의 LC 데이터는 아래의 기기와 조건에서 수행하였다.
HPLC: Agilent Technologies 1200 series
Agilent Eclipse Plus C18 5μm column(4.6x250mm)
용출 용매는 MeOH : acetonitril = 50 : 50, isocratic
주입되는 시료는 1μL, 유속은 1.0mL/min
B. 페오파이틴 합성
1.37L 반응용기에 상기 A 단계의 클로로필 추출액을 담는다.
2.교반하면서 5N HCl 70mL를 넣고 (pH ~2)　3시간 정도 실온에 둔다.
3.반응용기에 빛이 들어가지 않도록　뚜껑을 덮은 뒤 -20°C　냉동고에 12시간 이상 넣어둔다.
4.반응이 끝난 반응 용액을 뷰흐너 깔대기와 종이필터 2장을 이용하여 감압 여과한다.
5.걸러진 페오파이틴을 60% 아세톤과 물로 충분히 세척해준다.
6.세척된 페오파이틴을 동결건조 후 수득량을 측정한다.(~80-90g)
페오파이틴의 LC 데이터는 아래의 기기와 조건에서 수행하였다.
HPLC: Agilent Technologies 1200 series
MS: Agilent Technologies 6320 Ion Trap
Agilent Eclipse Plus C18 5μm column(4.6x250mm)
용출용매는 MeOH : dichloromethane : acetonitrile = 66.5 : 23.5 : 10, isocratic
주입되는 시료는 1μL, 유속은 1.0mL/min
C. 클로린 e6의 sodium salt 합성
1.상기 B 단계에서 얻은 페오파이틴을 99.9% 아세톤에 녹인다.
2.위의 페오파이틴 용액을 종이필터와 membrane filter(GV)를 이용하여 감압 여과한다.
3.5L 둥근 플라스크에 페오파이틴 용액과 마그네틱 바를 넣고 Reflux 하(~60°C)에서 5N NaOH(3-4당량)를 페오파이틴 용액에 첨가한다.
4.Reflux 하에서 2.5시간 반응 시킨 후 용액의 온도가 실온으로 떨어지기 전에 뷰흐너 깔대기와 종이필터를 이용하여 감압 여과한다.
5.걸러진 클로린의 Na염 용액을100%아세톤과 CHCl3로 충분히 세척해 주고 마지막에 hexane으로 세척한다.
6.합성된 raw product의 수득량을 측정한 후 동결 건조시킨다.(~60-70g)
Chlorin e6 sodium salt의 LC/MS 데이터는 아래의 기기와 조건에서 수행하였다.
시료 5mg을 증류수에 녹여 측정하였으며,
HPLC: Agilent Technologies 1200 series
MS: Agilent Technologies 6320 Ion Trap
Agilent Eclipse Plus C18 5μm 컬럼(4.6x250mm)
용출 용매는 MeOH : 0.1% TFA(in H2O) = 90 : 10, isocratic
주입되는 시료는 1μL, 유속은 0.85mL/min
D. 산-클로린(클로린 e6) 합성
1.여과액에 5N HCl을 가하는데 이 때 pH는　4 이하로 떨어지지 않도록 한다. (pH가 5 이상일 때는 반응이 완결되지 않으며 pH가 4 이하로 떨어지는 경우 다른 불순물들이 생성된다.)
2.산을 가한 반응 용액을 원심분리기통에 넣어 침전을 분리하고 수층은 따라버린다.
3.수층이 중성이 되고 약간의 침전이 수층에 suspension될 때까지 반복한다.
4.남은 침전을 동결 건조하여 수득량을 측정한다.(~50-60g)
Chlorin e6의 LC/MS 데이터는 아래의 기기와 조건에서 수행하였다.
시료 5mg을 acetone 또는 MeOH에 녹여 측정하였으며,
HPLC: Agilent Technologies 1200 series
MS: Agilent Technologies 6320 Ion Trap
Agilent Eclipse Plus C18 5μm 컬럼(4.6x250mm)
용출 용매는 MeOH : 0.1% TFA(in H2O) = 90 : 10, isocratic
주입되는 시료는 1μL, 유속은 0.85mL/min
클로린 e6의 absorption 데이터는 클로린 e6을 MeOH에 녹여서 측정하였으며,클로린 e6의 1H-NMR 데이터는 Bruker Biospin AVANCE II 400(400MHz)로 시료를 dmso-d6에 녹여 측정하였다.
E. 클로린 e6의 tromethamin(tris) 염 합성
1.2.5당량의Tromethamine(Tris)　을 소량의 증류수에 녹인다.
2.Tromethamine 용액에　클로린 e6를　첨가하고 클로린 e6가 완전히 녹을 때까지 3차 증류수를 조금씩 첨가한다. (동결건조를 시킬 것이므로 최소량의 증류수를 사용함)
3.동결건조기를 사용하여 용매를 날린 후 powder 형태의 최종 물질(클로린 e6의 tromethamine염을 얻는다.
Chlorin e6 tromethamine염의 LC/MS 데이터는 아래의 기기와 조건에서 수행하였다.
시료 5mg을 증류수에 녹여 측정하였으며,
HPLC: Agilent Technologies 1200 series
MS: Agilent Technologies 6320 Ion Trap
Agilent Eclipse Plus C18 5μm column(4.6x250mm)
용출 용매는 MeOH : 0.1% TFA(in H2O) = 90 : 10, isocratic
주입되는 시료는 1μL, 유속은 0.85mL/min
클로린 e6 tromethamine염의 absorption 데이터로, 클로린 e6의 tromethamine염의 absorption spectrum은 증류수에 녹였을 때는 650±2nm에서 Q-band peak이 나타나는 반면 dmso에 녹였을 때는 662±2nm에서 Q-band peak이 나타났다.

Claims (8)

  1. 클로린 e6 트로메타민(tromethamine)을 중간엽줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 중간엽줄기세포에 클로린 e6 트로메타민(tromethamine)을 탑재하는 방법에 의하여 제조되고,
    여기서 상기 클로린 e6 트로메타민(tromethamine)은 중간엽줄기세포에 8 uM- 200uM 처리하는 것을 특징으로 하는 클로린 e6 트로메타민(tromethamine) 탑재 중간엽 줄기세포.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 클로린 e6 트로메타민(tromethamine) 탑재 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군 중에서 선택 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항의 클로린 e6 트로메타민(tromethamine) 탑재 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 생체 이미징(bio-imaging)용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포의 수는 5x105 ~ 5x106인 것을 특징으로 하는 생체 이미징(bio-imaging)용 조성물.
  8. 제1항의 클로린 e6 트로메타민(tromethamine) 탑재 줄기세포를 종양부위 또는 정맥 내 주사하여 종양에 타겟하게 한 후 빛을 조사하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 종양 치료 방법.
KR1020130066945A 2013-06-12 2013-06-12 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도 KR101449599B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130066945A KR101449599B1 (ko) 2013-06-12 2013-06-12 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130066945A KR101449599B1 (ko) 2013-06-12 2013-06-12 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101449599B1 true KR101449599B1 (ko) 2014-10-13

Family

ID=51997300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130066945A KR101449599B1 (ko) 2013-06-12 2013-06-12 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101449599B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016159661A1 (ko) * 2015-03-31 2016-10-06 가톨릭대학교 산학협력단 광감각제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도
EP3282011A4 (en) * 2015-04-07 2018-09-05 Reprocell Incorporated Method for eliminating stem cells, method for protecting differentiated cells, and culture medium composition
WO2021174868A1 (zh) * 2020-03-04 2021-09-10 苏州大学 一种二氢卟吩纳米光敏剂及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110085935A (ko) * 2010-01-20 2011-07-27 주식회사 진코스 클로린 유도체와 불포화 지방산의 접합체, 이를 함유하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110085935A (ko) * 2010-01-20 2011-07-27 주식회사 진코스 클로린 유도체와 불포화 지방산의 접합체, 이를 함유하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016159661A1 (ko) * 2015-03-31 2016-10-06 가톨릭대학교 산학협력단 광감각제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도
EP3282011A4 (en) * 2015-04-07 2018-09-05 Reprocell Incorporated Method for eliminating stem cells, method for protecting differentiated cells, and culture medium composition
US11421204B2 (en) 2015-04-07 2022-08-23 Reprocell Incorporated Method of removing pluripotent cells from culture
WO2021174868A1 (zh) * 2020-03-04 2021-09-10 苏州大学 一种二氢卟吩纳米光敏剂及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Feng et al. Design of superior phototheranostic agents guided by Jablonski diagrams
Avirah et al. Squaraine dyes in PDT: from basic design to in vivo demonstration
Yue et al. ROS-responsive mitochondria-targeting blended nanoparticles: chemo-and photodynamic synergistic therapy for lung cancer with on-demand drug release upon irradiation with a single light source
Gao et al. Theranostic nanodots with aggregation-induced emission characteristic for targeted and image-guided photodynamic therapy of hepatocellular carcinoma
Shen et al. pH-responsive aerobic nanoparticles for effective photodynamic therapy
Li et al. Histology and antitumor activity study of PTX-loaded micelle, a fluorescent drug delivery system prepared by PEG-TPP
CN109310702A (zh) 用于化学疗法、靶向疗法、光动力疗法、免疫疗法和它们的任何组合的纳米颗粒
Iqbal et al. Phthalocyanine-biomolecule conjugated photosensitizers for targeted photodynamic therapy and imaging
CN101687040A (zh) 整合光活性的小分子及其用途
IL102645A (en) Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
Ma et al. Zinc phthalocyanine-soybean phospholipid complex based drug carrier for switchable photoacoustic/fluorescence image, multiphase photothermal/photodynamic treatment and synergetic therapy
KR101405403B1 (ko) 클로린 유도체와 불포화 지방산의 접합체, 이를 함유하는 광감작제, 및 이를 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 조성물
CN101400658A (zh) 光活性化合物和组合物及其用途
CN107469081B (zh) 靶向PEG修饰的金纳米棒与AlpcS4偶联的结合体及其制备、应用和抗肿瘤组合物
CN101484160A (zh) 含吲哚-3-烷基羧酸的光敏剂，和含该光敏剂用于光动力学疗法的试剂盒
KR101449599B1 (ko) 광민감제 탑재 성체 줄기세포 및 그 용도
WO2015026963A2 (en) Phthalocy anine-dendrimer compositions and a method of using
CN1984915B (zh) 荧光染料和肿瘤亲和的四吡咯的加合物
Zhao et al. In vitro and in vivo antitumor activity of a novel hypocrellin B derivative for photodynamic therapy
KR101586849B1 (ko) 신규한 클로린 e6의 트로메타민 염, 및 그 제조방법 및 그 용도
Boscencu et al. Porphyrin macrocycles: General properties and theranostic potential
Wu et al. Heavy-atom engineered hypoxia-responsive probes for precisive photoacoustic imaging and cancer therapy
Sakuma et al. Photodynamic therapy with glycoconjugated chlorin photosensitizer
Xu et al. Red light triggered photodynamic-chemo combination therapy using a prodrug caged by photosensitizer
CN101518528B (zh) 一组碳花青染料类的近红外荧光化合物的用途

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171010

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181002

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190930

Year of fee payment: 6