JP6692349B2 - 幹細胞除去方法、分化細胞保護方法、及び培地組成物 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞除去方法、分化細胞保護方法、及び培地組成物に係り、特に多能性幹細胞を分化させる際における幹細胞除去方法、分化細胞保護方法、及び培地組成物に関する。

胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣｓ）及び人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）は、多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）と呼ばれる細胞の一種であり、未分化状態にあり、三胚葉全ての細胞に分化誘導可能な能力を持っている。このため、ヒトの多能性幹細胞は、各種疾患の再生医療に使用することが潜在的に期待されている。
多能性幹細胞を再生医療に用いる場合、特定の細胞、組織、又は臓器等の細胞群に分化誘導させた状態で体内に移植する必要がある。

たとえば、特許文献１を参照すると、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートと、前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、神経細胞を、ＳＤＦ１（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ−１）及びＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｐｅｉｎ−１）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法が開示されている。

特開２０１４−２３４５７号公報

しかしながら、特許文献１の技術のように、分化誘導された細胞群に、未分化の状態の多能性幹細胞が混入していると、生体内でテラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ、奇形腫）を生じるため、分化した細胞のみを選択する必要があった。また、特定の細胞系列に分化する能力をもつ体性幹細胞を分化誘導して体細胞を製造する場合にも、未分化の体性幹細胞が残っていると、その他の腫瘍等の原因となることがあった（以下、多能性幹細胞と体性幹細胞とを含む各種幹細胞を、単に「幹細胞」という。）。
このため、分化誘導された細胞群から、効率的に幹細胞を除去するための技術が切望されていた。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の問題を解消することを目的とする。

本発明の幹細胞除去方法は、幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含み、ガン細胞を含まない細胞群を、光増感剤を含む培地組成物で培養し、前記光増感剤を含む培地組成物で培養された前記細胞群に、特定波長の光を照射し、前記細胞群から、前記幹細胞を除去し、前記幹細胞は、多能性幹細胞であり、前記特定波長の光の波長は、４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ又は５８０〜６００ｎｍであり、照射照度は、１０ｍＷ／ｃｍ ² 〜２０ｍＷ／ｃｍ ² であり、照射時間は、１分〜２４０分であることを特徴とする。
本発明の幹細胞除去方法は、前記多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ）及びｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌ）のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明の幹細胞除去方法は、前記光増感剤は、アミノレブリン酸（ＡｍｉｎｏＬｅｖｕｌｉｎｉｃＡｃｉｄ）、その誘導体、又はそれらの塩であることを特徴とする。
本発明の幹細胞除去方法は、前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩の濃度は、１０μＭ〜２０００μＭであることを特徴とする。
本発明の幹細胞除去方法は、前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩を添加後に光照射されるまでの時間は、４時間以上であることを特徴とする。
本発明の分化細胞保護方法は、前記幹細胞除去方法により除去される際に、分化誘導された前記体細胞を保護する。
本発明の分化細胞保護方法は、保護される前記体細胞が中胚葉系細胞であることを特徴とする。
本発明の分化細胞保護方法は、保護される前記体細胞が外胚葉系細胞であることを特徴とする。
本発明の分化細胞保護方法は、保護される前記体細胞が内胚葉系細胞であることを特徴とする。
本発明の培地組成物は、幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含む細胞群を培養するための培地成分と、光増感剤とを含み、前記幹細胞は、多能性幹細胞であり、特定波長の光を照射した場合、前記幹細胞を除去し、前記特定波長の光を照射した場合、分化誘導された前記体細胞を保護し、前記特定波長の光の波長は、４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ又は５８０〜６００ｎｍであり、照射照度は、１０ｍＷ／ｃｍ ² 〜２０ｍＷ／ｃｍ ² であり、照射時間は、１分〜２４０分であることを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌ）のいずれかを含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記幹細胞から分化誘導される前記体細胞は、中胚葉系細胞、外胚葉系細胞、及び内胚葉系細胞からなる群のいずれか一種を含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記幹細胞から前記体細胞を分化誘導するグロースファクター成分を更に含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記培地成分は、細胞に栄養分を与えるための栄養成分を含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記培地成分は、培養中の環境を一定に保つためのバッファー成分を含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記培地成分は、前記体細胞の成育を促進する生育促進成分を含むことを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記光増感剤は、アミノレブリン酸（ＡｍｉｎｏＬｅｖｕｌｉｎｉｃＡｃｉｄ）、その誘導体、又はそれらの塩であることを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩の濃度は、１０μＭ〜２０００μＭであることを特徴とする。
本発明の培地組成物は、前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩を添加後に光照射されるまでの時間は、４時間以上であることを特徴とする。

本発明によれば、光増感剤を含む培地組成物で培養された細胞群に、特定波長の光を照射することで、幹細胞と分化誘導された体細胞とを含む細胞群から、容易に幹細胞を除去する技術を提供することができる。

本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの作用の評価における、添加時（０時間）のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの作用の評価における、ＡＬＡ添加から４時間後のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの作用の評価における、ＡＬＡ添加から２４時間後のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの作用の評価における、ＡＬＡ添加から４８時間後のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加時（０時間）のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加後、４８時間経過時のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加し赤色ＬＥＤを照射後、２４時間後のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１の図７の結果について、ＡＬＰの発現をキットで調べた際の写真を示す。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの光照射の波長による作用の比較における、ＡＬＡ添加し青色ＬＥＤ又は赤色ＬＥＤを照射後、２４時間後のｉＰＳ細胞を示す写真である。 本発明の実施例１の図９の結果について、ＡＬＰの発現をキットで調べた際の写真を示す。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴのＡＬＡの濃度による作用の比較における、生存したｉＰＳ細胞のＣＣＫ８によるカウント数の結果を示すグラフである。 本発明の実施例１に係るＨＤＦに対するＡＬＡ−ＰＤＴのＡＬＡの濃度による作用の比較における、生存したＨＤＦのＣＣＫ８によるカウント数の結果を示すグラフである。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞由来の神経細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞の写真である。 本発明の実施例１の図１３の結果をまとめた表図である。 本発明の実施例１に係るｉＰＳ細胞由来の心筋細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞の写真である。 本発明の実施例２に係るｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの添加からの時間を変化させた場合のＡＬＡ−ＰＤＴ後の生存率を示すグラフである。 本発明の実施例２に係るｉＰＳ細胞由来の肝細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ｉＰＳ細胞から分化誘導された肝細胞の写真である。 本発明の実施例２に係るｉＰＳ細胞由来の肝細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価における、ｉＰＳ細胞から分化誘導された肝細胞の写真である。

＜実施の形態＞
本発明者らは、幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含む細胞群から、未分化の状態の幹細胞を容易に除去する方法を実現するため、鋭意実験を行った。そして、アミノレブリン酸（Ａｍｉｎｏ Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ Ａｃｉｄ、以下「ＡＬＡ」と呼ぶ。）のような光増感剤を利用した光線力学的療法（ＰｈｏｔｏＤｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ、以下、「ＰＤＴ」と呼ぶ。また、以下、ＡＬＡを用いたＰＤＴを「ＡＬＡ−ＰＤＴ」と称する。）において、幹細胞は、光感受性になるものの、分化誘導された体細胞は光感受性になり難いことを見いだした。つまり、幹細胞と分化誘導された体細胞とでは、光感受性の程度が異なっていた。本発明者らは、更に実験を進めて、当該多能性幹細胞にＡＬＡ−ＰＤＴを適用することで、分化誘導された細胞群から未分化の幹細胞を容易に除去した上で、分化誘導された体細胞を保護する手法を確立し、本発明の幹細胞除去方法、細胞保護方法、及び培地組成物を完成するに至った。
なお、本実施形態において、幹細胞の除去とは、細胞死の誘導、剥離や分離、細胞の分裂停止、細胞を未分化状態に維持しなくする、未分化の維持能力の阻害、分化状態へ誘導する、テラトーマ形成能をなくす等の手段により実現される。また、本実施形態において、光感受性とは、光増感剤を使用したＰＤＴで特定波長の光を照射された際に、細胞死、剥離や分離、細胞の分裂停止、若しくは細胞の能力等が変化することをいう。この細胞の能力等の変化は、未分化の維持能力の阻害、分化状態への誘導、テラトーマ形成能の変化等を含む。
以下、実施の形態により、本発明の幹細胞除去方法、細胞保護方法、及び培地組成物の詳細について記載する。

より具体的に説明すると、本実施形態において除去される幹細胞は、特に多能性幹細胞と体性幹細胞とを含む。
このうち、本実施形態の多能性幹細胞は、ヒトを含む霊長類、霊長類以外のほ乳類、その他の脊椎動物等の生物で各種細胞に分化可能な、多分化能を備える幹細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を含む。また、本実施形態の多能性幹細胞は、継代可能であり、継代しても分化が進まない状態を保ち、核型等が変化しにくく、又はエピジェネティックな表現型が変化しにくい性質を有することが好適である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、これに関連して、生体外又は生体内で十分な増殖能力を備えていることが好適である。このような本実施形態の多能性幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳ細胞）、その他の人工的に生成され若しくは選択された多能性を備える幹細胞等が挙げられる。この人工的に作成された多能性幹細胞は、特定の遺伝子を含むレトロウィルスやアデノウィルスやプラズミド等の各種ベクター、ＲＮＡ、低分子化合物等により、体細胞を再プログラミングして作成した多能性幹細胞であってもよい。
なお、本実施形態の多能性幹細胞としては、必ずしも全能性に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高いナイーブ（Ｎａｉｖｅ）な細胞を用いることも可能である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、ＰＮＡ等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えがされていてもよい。

また、本実施形態の体性幹細胞は、生殖幹細胞、生殖細胞、多分化能の幹細胞、及び単分化能の幹細胞のいずれかを含む。
このような体性幹細胞のうち、多分化能の幹細胞及び単分化能の幹細胞の具体例としては、造血幹細胞、表皮幹細胞、腸組織幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞が含まれる。これに加えて、胚性幹細胞以外の体細胞であり、多能性と自己複製能を同時に保持する細胞であればよい。また、本実施形態の体性幹細胞は、特定の組織の幹細胞等であってもよい。
また、本実施形態の体性幹細胞は、体細胞を各種ベクター、ＲＮＡ、低分子化合物等により、体細胞が直接再プログラミングして作成した幹細胞であってもよい。

また、本実施形態において幹細胞の除去時に保護される体細胞は、幹細胞から分化誘導された体細胞である。
このような体細胞は、上述の多能性幹細胞や体性幹細胞に特定の分化誘導用因子であるグロースファクター成分（後述）を特定の培養条件下で加えて、特定の段階まで分化誘導された細胞、及び分化の最終段階に到達した体細胞を含む。
また、本実施形態の体細胞は、特定の系列の細胞まで分化することが可能な特定の形質が固定されている細胞であってもよい。

また、本実施形態の特定の段階まで分化誘導された体細胞は、中胚葉系、外胚葉系、又は内胚葉系の細胞を含む。この中胚葉系、外胚葉系、又は内胚葉系の細胞は、特定の遺伝子マーカーを発現するまで分化した細胞、各種前駆細胞等を含む。この際、本実施形態の体細胞は、特定の種類の系列に分化誘導された細胞を、各種マーカーや目視等によりコロニー等の形式で選択したものであってもよい。また、本実施形態の体細胞は、分化誘導された各種体細胞を含む混合細胞集団、組織、臓器等（以下、「組織等」という。）であってもよい。この組織等の具体例としては、脳組織、眼胞、眼杯、水晶体胞、肝小葉等の三次元構造の組織、細胞融合された骨格筋組織、各種細胞シート、３Ｄプリンターにより細胞が積層された組織、担体に把持された組織等であってもよい。また、これらの組織等には、血管等の構造が形成されていてもよい。また、組織等から、後述するように、特定の種類の体細胞のみを、ＡＬＡ−ＰＤＴにより、光感受性の有無又は程度に基づいて選別してもよい。

また、本実施形態において中胚葉系細胞の具体例としては、例えば、心筋細胞が挙げられる。しかしながら、これに限られず、その他の間葉系細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）であってもよい。また、その他の中胚葉系細胞の具体例としては、骨、結合組織、筋肉、血液、性腺等の細胞が挙げられる。
また、本実施形態において外胚葉系細胞の具体例としては、例えば、神経細胞が挙げられる。また、外胚葉系細胞の具体例として、中枢神経、末梢神経、神経細胞、軸索、髄鞘、皮膚、角膜、網膜、内耳、外耳等の細胞が挙げられる。
また、本実施形態において内胚葉系細胞の具体例としては、例えば、肝細胞が挙げられる。また、内胚葉系細胞の具体例として、その他の消化器系、呼吸器系の細胞が挙げられる。

また、本実施形態の光増感剤は、特定波長の光を吸収して、蛍光若しくは活性酸素を発生させる、ＰＤＴ用の光増感剤である。
本実施形態において、このような光増感剤の具体例としては、ＡＬＡが好適に使用される。このＡＬＡは、ＡＬＡ、その誘導体（以下、「ＡＬＡ類」と称する。）、又はそれらの塩を用いることが可能である。ＡＬＡは、アミノ酸の一種であり、それ自身では可視光の光照射で蛍光も活性酸素も発生させない。しかしながら、ＡＬＡは、細胞に導入後、光増感物質であるプロトポルフィリンに代謝され、光増感剤として作用する。また、ＡＬＡは、細胞毒性が少なく、安全性が高い。

ＡＬＡやその誘導体は、下記式（Ｉ）で示される。式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。

本実施形態のＡＬＡとしては、式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子であるＡＬＡ又はその塩を好適に例示することができる。ＡＬＡは、δ−アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。
また、ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、５−ＡＬＡ以外の化合物が挙げられる。

式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイル基等の炭素数７〜１４のアロイル基が挙げられる。

式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１〜８のアルキル基が挙げられる。

式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１−シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられる。

式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６〜１４のアリール基が挙げられる。

式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができる。また、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができる。より具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７〜１５のアラルキル基が挙げられる。

上述のＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましい。また、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せ等についても、好適に例示できる。

ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、エステル、または生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与可能である。例えば、ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。

以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、ＡＬＡ、及びＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、若しくは、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。このうち、ＡＬＡ塩酸塩及びＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。

また、ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの方法によって製造したものであってもよい。

また、ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。

また、本実施形態の光増感剤として、ＡＬＡ類又はその塩の他に、可視光を吸収して蛍光を発し、また、活性酸素を発生することができる、光増感剤であればすべて使用することができる。本実施形態においては、特に、テトラピロール系化合物を好適に例示することができる。具体的には、フォトフリン、レザフリン、プロトポルフィリンIX、フォスキャン、クロリン、ウロポルフィリンI、ウロポルフィリンIII、ヘプタカルボキシルポルフィリンI、ヘプタカルボキシルポルフィリンIII、ヘキサカルボキシルポルフィリンI、ヘキサカルボキシルポルフィリンIII、ペンタカルボキシルポルフィリンI、ペンタカルボキシルポルフィリンIII、コプロポルフィリンI、コプロポルフィリンIII、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、エチオポルフィリン、ピロポルフィリン、デューテロポルフィリンIX、ペンプトポルフィリン、ＡＴＸｓ−１０等を挙げることができる。また、投与量はＡＬＡ−ＰＤＴで効果があった量と同等の量を用いることが好適である。

また、本実施形態の光増感剤として、クエン酸第一鉄ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｆｅｒｒｏｕｓ Ｃｉｔｒａｔｅ、以下、「ＳＦＣ」という。）等のＡＬＡ−ＰＤＴの効果を高める化合物が、ＡＬＡに加えられてもよい。

本実施形態において、後述する培地組成物に光増感剤として加えられ、幹細胞除去方法又は分化細胞保護方法において使用される際のＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度は、１０μＭ〜２０００μＭであることが好適であり、１００μＭ〜１５００μＭであることが更に好適である。ＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度が１０μＭ未満であると、ＡＬＡ−ＰＤＴにより、多能性幹細胞又は体性幹細胞を除去する率が十分ではない。また、ＡＬＡの濃度が２０００μＭ以上であっても、ＡＬＡ−ＰＤＴにより、多能性幹細胞又は体性幹細胞を除去する効果が変化しない。
また、本実施形態において、ＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度は、多能性幹細胞又は体性幹細胞の種類、分化誘導された体細胞の種類、培養条件、特定波長の光の照射条件等により、適宜調整可能である。たとえば、後述の実施例で示すように、ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞を含む細胞群について、２５０μＭ〜５００μＭのＡＬＡ類又はそれらの塩を導入してＰＤＴを行った場合、多能性幹細胞又は体性幹細胞を２４時間で６０％以上除去しつつ、分化誘導された神経細胞を保護することが可能である。これに対して、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を含むコロニーの場合には、ＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度が５００μＭでＰＤＴを行うと、拍動が失われてコロニーも崩れる。このため、例えば、１００〜４００μＭ程度の濃度のＡＬＡ類又はそれらの塩を導入してＰＤＴを行うことが好適である。逆に、特定の濃度のＡＬＡ類又はそれらの塩に対するＰＤＴの効果が体細胞の種類により異なることを利用して、例えば、多能性幹細胞又は体性幹細胞と、神経細胞及び筋細胞とが含まれる混合細胞集団から、５００μＭ〜１５００μＭのＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度でＡＬＡ−ＰＤＴにより、神経細胞のみを保護して取得し、それ以外の細胞を除去するといった構成も可能である。

また、本実施形態において、ＡＬＡ類又はそれらの塩を添加後に光照射されるまでの時間は４時間以上、より好ましくは２４時間以上であることが好適である。
具体的には、ＡＬＡ類又はそれらの塩を導入してから４時間以上経過してからＰＤＴを行った場合、ＡＬＡ導入していないものと比較して、より未分化の多能性幹細胞又は体性幹細胞を除去することが可能になる。さらに、ＡＬＡ類又はそれらの塩を導入してから２４時間以上経過してからＰＤＴを行った場合、多能性幹細胞又は体性幹細胞を７％程度になるまで除去しつつ、分化誘導された細胞を保護することが可能である。この際に、下記の実施例２で示すように、ＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度は、２５０μＭ〜１０００μＭで十分な効果が得られる。

また、本実施形態で照射される特定波長の光の波長は、４００ｎｍ〜７５０ｎｍであり、照射照度は、１ｍＷ／ｃｍ²〜２００ｍＷ／ｃｍ²であり、照射時間は、１分〜２４０分であることが好適である。より好適には、特定波長の光の照射照度は、１０ｍＷ／ｃｍ²〜２０ｍＷ／ｃｍ²であり、照射時間は、５分〜２０分である。

具体的に、本実施形態において、ＡＬＡ−ＰＤＴに使用する特定波長の光は、紫外光〜可視光〜近赤外光の波長として、波長４００〜７５０ｎｍの光を使用可能である。波長４００ｎｍ未満の紫外線域では、分化誘導された体細胞のＤＮＡ等にダメージが大きく、７５０ｎｍ以上の赤外線領域では、ＡＬＡが細胞内で代謝されたプロトポルフィリンの光吸収領域から外れるためである。
また、本実施形態の特定波長の光の波長として、可視光線中の４３０ｎｍ〜４８０ｎｍの青色光、及び５８０〜６００ｎｍの赤色光が、分化誘導された体細胞を保護する効果が高く、特に好適に使用可能である。

また、本実施形態の特定波長の光の照射照度としては、１ｍＷ／ｃｍ²〜２００ｍＷ／ｃｍ²程度とすることが好適である。特定波長の光の照射照度は、より好適には、１０ｍＷ／ｃｍ²〜２０ｍＷ／ｃｍ²程度である。この際、一般的なＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）の照射装置や、レーザー等を用いた照射装置（図示せず）を使用して照射してもよい。
また、本実施形態の特定波長の光の照射時間は、１分〜２４０分程度であることが好適である。特定波長の光の照射時間は、より好適には、５分〜３０分程度、更に好適には、１０分〜２０分程度である。１分よりも照射時間が短いと、多能性幹細胞又は体性幹細胞と分化誘導された体細胞とを含む細胞群から、十分に多能性幹細胞又は体性幹細胞を除去することができない。また、２４０分より長いと、細胞死する体細胞が増加するためである。また、本発明者の実験により、多能性幹細胞又は体性幹細胞は、ガン細胞よりもＰＤＴの感度が低いことが、予備的な実験により分かっている。このため、本実施形態において、光増感剤を加えられたことにより光感受性を備えるようになった幹細胞を除去するための照射時間は、各種ガン細胞等へのＰＤＴよりも長い時間、例えば、１０分以上であることが好適である。また、体細胞への光照射によるダメージを抑えるためには、細胞種により適切な照射時間を選択する。この際、繊維芽細胞では３０分より長くてもよく、逆に神経細胞では３０分未満、特に２０分未満であることが好適である。これにより、分化誘導の課程でガン化した細胞が万が一含まれていても、これを除去し、更に未分化の多能性幹細胞又は体性幹細胞の除去しつつ、分化誘導された体細胞を保護することも可能となる。
なお、このＰＤＴで照射される光の波長及び照射時間についても、多能性幹細胞又は体性幹細胞の種類、分化誘導された体細胞の種類、培養条件、ＡＬＡ類又はそれらの塩の濃度等の条件により、適宜調整可能である。

また、本実施形態の培地組成物は、幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含む細胞群を培養するための培地成分と、光増感剤とを含む。
本実施形態の培地成分は、幹細胞又は体細胞用の培地としては、例えば、幹細胞又は体細胞に特化した特定成分を含む培地等を用いることが可能である。
また、本実施形態の培地組成物の培地成分は、幹細胞から体細胞を分化誘導するためのグロースファクター成分、培養中の環境を一定に保つためのバッファー成分、及び細胞に栄養分を与えるための栄養成分、分化誘導された体細胞の成育を促進する生育促進成分を含む。

このうち、本実施形態の培地成分に含まれるグロースファクター成分は、例えば、心筋細胞に分化誘導するための成分として低分子のＫＹ０２１１１（ＷＮＴ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１１１８８０７−１３−８）やＢＩＯ（ＢＩＯ（ＧＳＫ―３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：６６７４６３―６２―９）を使用してもよい。また、神経細胞に分化誘導するための成分として、ＤＡＰＴ（γ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ）、レチノイン酸、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、ＣＮＴＦ（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ＮＯＧＧＩＮ等を使用してもよい。また、肝細胞に分化誘導するための成分として、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａを添加しても良いし、ＳＯＸ１７及びＨＥＸ遺伝子産物等をそれぞれの体細胞の種類に対応して含ませてもよい。なお、このグロースファクター成分は、目的の体細胞に分化誘導するため、低分子の化合物の他に、各種ペプチド、タンパク質、マイクロＲＮＡ、ウィルスベクター、プラズミドベクター等を含んでいてもよい。このウィルスベクター、プラズミドベクター等の場合、分化誘導する体細胞に応じた遺伝子のｍＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ等用の配列を含んでいてもよい。

また、本実施形態の培地成分に含まれる栄養成分は、各種血清及び血清代替物、アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、抗生物質、コラーゲン前駆体、微量金属イオンや錯体、各種塩等が加えられて使用されてもよい。このうち、各種血清代替物が含まれた培地は、異種由来成分不含有（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ、ＸＦ、又はＡｎｉｍａｌ． Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−Ｆｒｅｅ、ＡＣＦ）の培養系で使用されてもよい。なお、本実施形態の培地成分には、各種血清を加えてもよい。

また、本実施形態の培地成分に含まれるバッファー成分は、培地成分のｐＨをＣＯ₂インキュベーター内で保つために、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（Ｎ'−２ Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔ ｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ'−２ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ等を含む。また、バッファーのｐＨを目視するために、フェノール・レッド（Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）が加えられていてもよい。また、その他にも、培地成分の環境を維持するための成分が加えられていてもよい。

また、本実施形態の培地成分に含まれる体細胞の生育促進成分は、成長因子であるＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）やＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）やＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）等の成分が、培養する幹細胞と、分化誘導された体細胞との種類等に対応した濃度で加えられていてもよい。
なお、本実施形態の培地成分には、その他必要な成分が加えられてもよい。

また、本実施形態の培地組成物は、幹細胞を培地成分のみで培養し、当該幹細胞を体細胞に分化誘導する際に、光増感剤が加えられてもよい。また、逆に、幹細胞を分化誘導する前に、光増感剤が加えられてもよい。また、この光増感剤をいつ加えるかについては、幹細胞の種類、分化誘導される体細胞の種類、分化誘導のプロトコル、ＡＬＡ類又はそれらの塩の添加のタイミング、特定波長の光の照射のタイミング等により、適宜選択可能である。

また、本実施形態の多能性幹細胞又は体性幹細胞と、分化誘導された体細胞とを培養する際には、接着性細胞の場合は、フィーダー細胞上又はコラーゲン等の基底膜マトリックスをコーティングした細胞培養用プレート等で培養されてもよい。また、これらの細胞の継代培養の際に、培養された細胞を取得して単一細胞に解離してから、培地成分を加えてもよい。また、単一細胞への解離には、プロテアーゼやキレート剤等を含む幹細胞分離用の試薬を使用することができる。なお、接着性の多能性幹細胞又は体細胞の種類によっては、又は血液系等の浮遊性細胞の多能性幹細胞又は体細胞の場合には、細胞の解離処理をせずに継代を行ってもよい。

また、本実施形態において、ＡＬＡ−ＰＤＴにより幹細胞が除去された体細胞は、そのまま治療等に用いても、更に各種遺伝子マーカー等により幹細胞が残留していないか検出されてから治療等に用いられてもよい。この際に、この体細胞は、特定期間培養したり、複数回、継代培養したりしてもよい。たとえば、ＡＬＡ−ＰＤＴ処理後の細胞群を、１２時間（オーバーナイト）〜４８時間程度培養することで、幹細胞を酸化ストレス等により死滅させ、更に、体細胞をＡＬＡ−ＰＤＴによるダメージから回復させることが可能となる。また、その後、体細胞は、さらに最終的に分化した細胞へ分化誘導されてもよい。また、複数の種類の体細胞を混合して、組織や臓器を作成してもよい。
また、本実施形態の幹細胞除去方法及び体細胞保護方法により実現可能な治療等としては、例えば、心筋細胞の場合は疾病の心臓に注入、心筋シートや心筋組織の移植等の治療に用いることができる。また、神経細胞の場合は、パーキンソン病やアルツハイマー病のような脳の疾病、事故や脳梗塞や腫瘍等による脳損傷、脊椎損傷、その他の中枢神経や末梢神経の再生等の治療に用いることが可能である。また、肝細胞の場合は、肝硬変や肝ガン等による肝臓の機能向上の治療のため、脾臓や腹腔内への注入、担体に把持された肝臓の移植等により用いることが可能である。
また、本実施形態の幹細胞除去方法及び体細胞保護方法により体細胞を用いて製造した臓器は、例えば、ヌードマウス、遺伝子組み換えブタ等への異種移植の手法により成長させ、これを取得して治療目的でヒトに移植する用途に用いることも可能である。

以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
近年、多能性幹細胞や体性幹細胞から各種の体細胞を分化誘導して、特に再生医療用に使用する技術が開発されつつあり、安全性を確保する必要があった。
また、従来、ガン細胞を光感受性にする光増感剤を投入し、悪性腫瘍内に光化学反応を起こさせて腫瘍組織を壊死させる方式として、ＰＤＴが提唱されていた（例えば、国際公開第２０１３／００５３７９号等を参照）。しかしながら、ＰＤＴを、多能性幹細胞又は体性幹細胞を除去し、この際に分化誘導された体細胞を保護する目的で使用か否かは知られていなかった。
これに対して、本実施形態の幹細胞除去方法では、幹細胞と、分化誘導された体細胞とを含む細胞群を、ＡＬＡ類又はそれらの塩を含む培地組成物で培養し、培養された細胞群に特定波長の光を照射し、細胞群から幹細胞を除去する。これにより、幹細胞から分化誘導させた体細胞から、移植時に残存させるべきでない幹細胞を容易に除去しつつ、目的の分化誘導された体細胞を保護することが可能である。
よって、本実施形態では、再生医療使用可能な分化誘導された体細胞を、安全且つ効果的に提供することが可能となる。また、本実施形態では、ＡＬＡ類又はそれらの塩を加えて培養し、光照射を行うだけで、幹細胞を除去できるため、コストも安くできる。また、ＡＬＡは、食品添加物や医療用途にも使用されるアミノ酸であるため、残存しても安全性が高く、医療用途に容易に使用可能となる。

なお、本実施形態の幹細胞除去方法及び体細胞保護方法により取得された体細胞は、再生医療以外の用途、例えば、薬の副作用の検査、バイオリアクター、人工臓器の製造、クローン個体の作成等、各種用途に使用可能である。

次に図面に基づき本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。

〔実験材料及び方法〕
（多能性幹細胞の維持）
多能性幹細胞株として、リプロセル社で樹立され５０回継代培養されたヒトｉＰＳ細胞株（ｉＰＳＣ）が使用された。多能性幹細胞の細胞株は、オンフィーダー培養の場合、マイトマイシンＣで処理したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞（ＲＣＨＥＦＣ００３、リプロセル社製）上で、従来の手法と同様に、多能性幹細胞用培地（Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＣＨＥＭＤ００１、リプロセル社）、ＲｅｐｒｏＣｏａｔ（リプロセル社製）をコートした６０ｍｍポリスチレンプレート（ディッシュ）により維持された。ＲｅｐｒｏＣｏａｔは、プレートに０．２μｇ／ｃｍ²の濃度で使用し、４℃で一晩放置することでコーティングを行った。

（分化誘導された体細胞、その他の体細胞）
多能性幹細胞から分化誘導された体細胞について、中胚葉系細胞の一例として心筋細胞であるＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ ２（ＲＣＥＳＤ００８、リプロセル社製）を、外胚葉系細胞の一例として神経細胞であるＲｅｐｒｏＮｅｕｒｏ（ＲＣＥＳＤＮ００１、リプロセル社製）を、内胚葉系細胞の一例として肝細胞であるＲｅｐｒｏＨｅｐａｔｏ Ｔｙｐｅ １（ＲＣＥＳＤＨ００１、リプロセル社製）を、それぞれ添付のプロトコルに従って培養して使用した。この際、神経細胞はニューロンを十分延ばすまで、心筋細胞は拍動する心筋細胞塊となるまで、肝細胞は三次元構造となるまで継代して培養した。
また、比較例用に、市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＡ１０６Ｋ０５ａ、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ社製、ＨＤＦ）を用いた。
それぞれ、維持用の培地成分は、各細胞に添付の培地を用い、各細胞に添付の説明書のプロトコルに従って培養した。

（ＡＬＡ溶液、ＳＦＣ溶液の作成方法）
ＡＬＡ塩酸塩（Ｍ．Ｗ．＝１６７．６、ＳＢＩファーマ株式会社製）を３４ｍｇ秤量し、ＰＢＳ（−）（和光純薬工業製）を１０００μＬ添加した。これにより、２００ｍＭのＡＬＡ溶液を作成する。作成したＡＬＡ塩酸塩の溶液（以下、単に「ＡＬＡ溶液」と称する。）は、使用時まで−２０℃の冷凍庫で保存した。
また、ＳＦＣ（関東化学株式会社製）についても、同様の濃度の溶液を作成して保存した。

（ＡＬＡ−ＰＤＴ）
（以下は、６０ｍｍディッシュの場合の量を示す）冷凍庫からＡＬＡ溶液（２００ｍＭ）を取り出して、氷上にて溶解した。多能性幹細胞又は分化誘導された体細胞培養用の培地を４ｍＬ準備する。ＡＬＡ溶液（２００ｍＭ）を２０μＬ添加した。これにより、ＡＬＡが１ｍＭの培地となる。その後、ピペッティングで混合し、５％ＣＯ₂インキュベーターから細胞を取り出し、培地を吸引等で除去し、ＡＬＡを含む培地を４ｍＬ添加した。なお、添加するＡＬＡ溶液の量は、培地に含まれるＡＬＡの濃度により調整した。５％ＣＯ₂インキュベーターに細胞を戻して、４時間〜各実験で特定される時間、培養した。細胞を取り出して、１０分間、特定波長の光を、ＬＥＤ光源にて照射した。当該ＬＥＤ光源は、最大ワット数：１．０Ｗ、１．０Ｗ時照射パワー強度：３５．４ ｍＷ／ｃｍ²（距離５０ｍｍ）、赤色ＬＥＤのピーク波長：６３５ｎｍ、青色ＬＥＤのピーク波長：４０５ｎｍ、底面より約５０ｍｍの高さで照射したときφ６ｃｍディッシュ底面をほぼ均一に照射可能である。この際、赤色ＬＥＤ又は青色ＬＥＤについて、照射パワー４００ｍＷ（照射パワー強度１４．１ｍＷ／ｃｍ²）で、１０分間照射した。その後、ＡＬＡを含む培地を除去し、幹細胞又は体細胞用の培地を４ｍＬ添加した。２４時間〜各実験で特定される時間後、顕微鏡で観察した。この際、生存している細胞数を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学社製、以下、「ＣＣＫ８」という。）で評価した。また、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、「ＡＬＰ」という。）の発現による未分化状態の評価を、Ｖｅｃｔｏｒ（商標）社製、Ｂｌｕｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ ＩＩＩ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＫ−５３００）を使用して行った。

〔結果〕
（ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡの作用の評価）
まず、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣをｉＰＳ細胞へ添加して、光照射を行わない場合に影響があるかどうか評価を行った。
具体的には、ｉＰＳ細胞を継代播種して、６０ｍｍディッシュに播種し培養し、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣを添加した培地に交換し、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣを添加した培地に交換し、添加時（０時間）、４時間後、２４時間後、４８時間後の細胞形態を観察した。この実験では、ＰＤＴは行わなかった。
培養条件は、使用した細胞株：２０１Ｂ７、使用した培地：Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＡＬＡの添加濃度：１０００μＭ、ＳＦＣの添加濃度：５００μＭであった。
結果を、図１〜図４を参照して説明する。

図１は、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加時（０時間）の細胞形態の写真を示す。図中の各写真は、ＡＬＡ添加なし（−）又は添加あり（＋）、ＳＦＣ添加なし（−）又は添加あり（＋）の各組み合わせによるｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。また、各組み合わせにおいて、上の写真はスケールが５００μｍ、下の写真は対応する上の写真を２倍に拡大したものである。
図２は、同様に、ＡＬＡ添加から４時間後のｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。図３は、２４時間後のｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。図４は、４８時間後のｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。
いずれにおいても、ｉＰＳ細胞は形態から未分化維持された正常な状態を示していた。すなわち、ｉＰＳ細胞に対する影響は観察されなかった。よって、ＡＬＡは、添加するだけで光照射を行わない場合は、ｉＰＳに対する毒性等はないと考えられる。

（ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価）
次に、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣをｉＰＳ細胞へ添加して、光照射を行うことで、ｉＰＳ細胞の除去作用があるかどうか評価を行った。
具体的には、ｉＰＳ細胞を継代播種して、６０ｍｍディッシュに播種し培養し、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣを添加した培地に交換し、４８時間、そのまま培養した。その後、青色ＬＥＤ（波長４０５ｎｍ）を１０分間照射し、２４時間後に細胞形態を観察した。
培養条件は、使用した細胞株：２０１Ｂ７、使用した培地：Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＡＬＡの添加濃度：１０００μＭ、ＳＦＣの添加濃度：５００μＭであった。
結果を、図５〜図８を参照して説明する。

図５は、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加時（０時間）の細胞形態の写真である。各写真は図１の場合と同様であり、ｉＰＳ細胞は形態から未分化維持された正常な状態を示していた。
図６は、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加から４８時間後のｉＰＳ細胞の細胞形態の写真を示す。この時点でも、図４と同様に、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加４８時間による影響は特に観察されなかった。
図７は、ＡＬＡ及び／又はＳＦＣ添加から４８時間後に青色ＬＥＤを１０分間照射し、その２４時間後に撮影した写真を示す。ＡＬＡを添加したｉＰＳ細胞（ＡＬＡ（＋）／ＳＦＣ（−）、ＡＬＡ（＋）／ＳＦＣ（＋））においては、ｉＰＳ細胞のコロニーが崩れて一部は剥離していることが分かる。
図８は、図７の各コロニーについて、ＡＬＰの発現により未分化状態の評価を行った結果を示す。ＡＬＡを添加したｉＰＳ細胞（ＡＬＡ（＋）／ＳＦＣ（−））、ＡＬＡとＳＦＣを添加したｉＰＳ細胞（ＡＬＡ（＋）／ＳＦＣ（＋））においては、添加していないもの（ＡＬＡ（−）／ＳＦＣ（−））より色が薄く、ＡＬＰが陰性となったことが分かる。これは、未分化状態が維持できなくなったことを示している。また、ＳＦＣ単独の添付（ＡＬＡ（−）／ＳＦＣ（＋））では、添加していないものと同様に色が濃く、未分化状体を維持していた。
結論として、ＡＬＡを添加し、特定波長の光を照射した後、未分化のｉＰＳ細胞が観察されなくなった。すなわち、未分化のｉＰＳ細胞が除去された。

（ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの光照射の波長による作用の比較）
次に、ヒトｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの光照射の波長の差による作用の比較を行った。
上述の「ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価」と同様に、ｉＰＳ細胞を継代播種して、６０ｍｍディッシュに播種し培養し、ＡＬＡ（１００μＭ又は１０００μＭ）を添加した培地に交換し、４時間、そのまま培養した。その後、培養したｉＰＳ細胞に、赤色ＬＥＤ（波長６３５ｎｍ）又は青色ＬＥＤ（波長４０５ｎｍ）を１０分間照射し、２４時間後に細胞形態を観察した。
培養条件は、使用した細胞株：２０１Ｂ７、使用した培地：Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍであった。
結果を、図９〜図１０を参照して説明する。

図９は、ＡＬＡを添加して４時間後に１０分間、青色ＬＥＤ又は赤色ＬＥＤの光照射の結果を撮影した写真を示す。図中の各写真は、それぞれ、ＡＬＡの添加量（１００μＭ又は１０００μＭ）、赤色ＬＥＤ（赤ＬＥＤ）、青色ＬＥＤ（青ＬＥＤ）の各組み合わせによるｉＰＳ細胞のコロニーの形態を示す。また、各組み合わせにおいて、上の写真はスケールが５００μｍ、下の写真はこれを２倍に拡大したものである。青色ＬＥＤにおいても、図７の赤色ＬＥＤとほぼ同様に、ＡＬＡ−ＰＤＴによるコロニーが崩れる作用が観察された。
図１０は、図９の結果について、ＡＬＰの発現をキットで調べた際の写真を示す。各図において、上は顕微鏡写真、下はディッシュのＡＬＰ発現を示す。それぞれ、青色が薄くなっており、未分化状態が維持できなくなっている。青色ＬＥＤの光照射によるＡＬＡ−ＰＤＴの作用は、赤色ＬＥＤとほぼ同様であった。

（ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴのＡＬＡの濃度による作用の比較）
次に、ヒトｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴにおいて、ＡＬＡの濃度を変化させた際の作用の比較を行った。
上述の処理と同様に継代処理をしたｉＰＳ細胞を、２〜４分、３７℃でＣＴＫ（コラゲナーゼ・トリプシンＫＳＲ）を用いてインキュベートし、その後、ピペット操作によって分離した。その分離したｉＰＳ細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり１５，０００細胞ずつ播種後、３日目の細胞にＡＬＡ塩酸塩を添加して培養し、４時間後に、赤色ＬＥＤを１０分間照射し、ＣＣＫ８の溶液を添加した、その２４時間後に４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定し、生存する細胞数をカウントした。
この結果を、図１１を参照して説明する。

図１１は、上述の実験で生存したｉＰＳ細胞のＣＣＫ８によるカウント数の結果を示すグラフである。縦軸は、ＡＬＡの濃度（０μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ）、横軸は、各細胞種におけるＡＬＡ濃度が０μＭの値を１．０（１００％）としたときの細胞数の割合（変化率）を示す（ｎ＝３）。
他にも図示しない実験によると、およそ１００μＭ以上の濃度で、ＡＬＡ−ＰＤＴによる１０％以上のｉＰＳ細胞の細胞死の誘導が観察された。また、２５０μＭ以上の濃度で、６０％の割合以上のｉＰＳ細胞の細胞死が誘導されている。本発明者の実験等の結果（図示せず）によると、１０％程度のｉＰＳ細胞の細胞死が起こるような培養状態では、ｉＰＳ細胞の未分化能は失われている。また、特に、６０％のｉＰＳ細胞の細胞死が起こるような培養状態では、ｉＰＳ細胞の未分化能自体は確実に失われている。このため、ＡＬＡ−ＰＤＴにより、ｉＰＳ細胞を確実に除去することが可能である。

（ＨＤＦに対するＡＬＡ−ＰＤＴのＡＬＡの濃度による作用の比較）
次に、多能性幹細胞又は体性幹細胞以外の体細胞を用いて、ＡＬＡ−ＰＤＴの作用の比較を行った。
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）について、上述の「ｉＰＳ細胞に対するＡＬＡ塩酸塩の濃度とＡＬＡ−ＰＤＴの光照射による作用の比較」と同様の条件によるＡＬＡの濃度とＡＬＡ−ＰＤＴの作用の比較を行った。
この結果を、図１２を参照して説明する。

図１２は、上述の実験で生存したＨＤＦのＣＣＫ８によるカウント数の結果を示すグラフである。縦軸はＡＬＡの濃度、横軸は各細胞種におけるＡＬＡ濃度が０μＭの値を１．０（１００％）としたときの細胞数の割合（変化率）を示す（ｎ＝３）。
図１２によると、ＨＤＦでは、ＡＬＡ−ＰＤＴによる細胞死の誘導は、観察されなかった。すなわち、上述の結果と合わせると、ＡＬＡ−ＰＤＴにより、ＨＤＦは細胞死させず、ｉＰＳ細胞のみを除去することが可能である。

（ｉＰＳ細胞由来の神経細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価）
次に、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞（ｉＰＳ細胞由来の神経細胞）へのＡＬＡ−ＰＤＴによる作用の評価を行った。この神経細胞はＲｅｐｒｏＮｅｕｒｏを使用した。ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞を６０ｍｍディッシュに播種し培養し、ＡＬＡ（０μＭ、２５０μＭ、５００μＭ）を添加した培地に交換し、４時間、そのまま培養した。その後、細胞形態を観察した。そして、培養した神経細胞に、赤色ＬＥＤ（波長６３５ｎｍ）を１０分間照射し、１２時間（オーバーナイト）経過後、細胞形態を観察した。その後、培地をＡＬＡが含まれないものに交換し、７日間、培地を交換しつつ培養した後、細胞形態を観察した。
この結果を、図１３〜図１４を参照して説明する。

図１３の各写真は、ＡＬＡの濃度（０μＭ、２５０μＭ、５００μＭ）、上はＡＬＡ添加前、下はＡＬＡ−ＰＤＴ後７日間培養したものの写真をそれぞれ示す。
ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞は、ＡＬＡの添加とＬＥＤ照射によって、神経突起が一時的に短くなった（図示せず）。しかしながら、７日間、培養を継続したところ、死滅せずに生存し続け、ＡＬＡ添加前と同様に回復した。
図１４は、上述の結果をまとめたものである。ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経細胞は、ＡＬＡ−ＰＤＴで神経突起の短縮はみられるが、生存し続けた。つまり、ｉＰＳ細胞とは異なり、ＡＬＡ−ＰＤＴによっても神経細胞は除去されず、保護された。
また、ＡＬＡの濃度を２５０μＭ、５００μＭ添加した７日後においては、細胞接着を確認でき、いずれも神経突起が伸長してきた。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来神経細胞は、ＡＬＡ−ＰＤＴにより神経突起の短縮はみられるが、継続培養することで神経突起の再伸長が観察されて、生存し続けた。

（ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価）
次に、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞（ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞）へのＡＬＡ−ＰＤＴによる作用の評価を行った。ここでは、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞のコロニーを取得し、６０ｍｍディッシュに播種し培養し、ＡＬＡ（５００μＭ）を添加した培地に交換し、４時間培養し、その時点で細胞形態を観察した。その後、赤色ＬＥＤを１０分間照射し、１２時間（オーバーナイト）経過後、もう一度細胞形態を観察した。
この結果を、図１５を参照して説明する。

図１５の（ａ）はＡＬＡ−ＰＤＴ前（ＡＬＡ暴露前）の心筋細胞のコロニーの状態、（ｂ）はＡＬＡ−ＰＤＴ後（ＡＬＡ暴露後、１０分照射の後）の心筋細胞のコロニーの写真である。ＡＬＡ−ＰＤＴ後、本来拍動している心筋が止まり、心筋コロニーの形も崩れた。これにより、ＡＬＡ濃度が５００μＭのＡＬＡ−ＰＤＴでは、心筋細胞は保護されないことが分かる。
これに対して、図示しない予備実験では、２５０μＭ程度のＡＬＡ濃度 のＡＬＡ−ＰＤＴでは、心筋細胞は、ＡＬＡ−ＰＤＴ後、数日程度培養することで、神経細胞と同様に回復して拍動した。すなわち、２５０μＭ以下の濃度のＡＬＡ−ＰＤＴで、心筋細胞は保護しつつ、上述の結果からいうと、ｉＰＳ細胞は除去することが可能である。逆に、５００μＭ以上のＡＬＡ−ＰＤＴで、ＨＤＦや神経細胞を保護しつつ、心筋細胞とｉＰＳ細胞を除去するといった、細胞の種類による選択的な除去も可能となる。

また、予備的な実験から、ｉＰＳ細胞から分化誘導された肝細胞（ｉＰＳ細胞由来の肝細胞）に関しても、上記の神経細胞と同様に、２５０μＭ濃度のＡＬＡを添加しても保護されており、ｉＰＳ細胞を選択的に除去することが可能である。

（他のｉＰＳ細胞株及び添加後時間に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価）
多能性幹細胞株として、別途、上述の実施例１と同様の２０１Ｂ７細胞株、リプロセル社製のＲＣ００１、ＲＣ０１０について、上述の実施例１と同様に維持した後、ＡＬＡ作用の評価を行った。ＲＣ００１は、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ由来で、上述の２０１Ｂ７細胞株と同様にレトロウィルスベクターによりｉＰＳ細胞化されたものである。また、ＲＣ０１０は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ（ＥＰＣ）由来で、ＲＮＡの導入によりｉＰＳ細胞化されたものである。

これらの株について、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２０，０００細胞ずつ播種後、３〜４日培養した。その後、ＡＬＡ塩酸塩を各濃度（０、１２５、２５０、５００、１０００μＭ）添加した培地で培養した。上記培地で４時間培養後又は２４時間培養後に赤色ＬＥＤを１０分照射した。赤色ＬＥＤは、照射パワー４００ｍＷ（照射パワー強度 １４．１ｍＷ／ｃｍ²）で１０分間照射した。ＣＣＫ８の溶液を添加して、その２４時間後に４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定して生存する細胞数をカウントし、２４時間後の細胞生存率を算出した。
結果を、下記の表１に示す：

いずれの細胞株においても、上述の実施例１と同様に、ＡＬＡ−ＰＤＴにより各細胞株の生存、増殖が抑制された。すなわち、ＡＬＡ−ＰＤＴは、複数の細胞株で共通して、ｉＰＳ細胞への傷害作用があることが明らかであった。これにより、他のｉＰＳ細胞においても、一般的にＡＬＡ−ＰＤＴの効果が期待できる。

次に、ｉＰＳ細胞へのＡＬＡ添加後に光照射されるまでの時間（添加後時間）の違いによる作用について比較した。すなわち、ｉＰＳ細胞へのＡＬＡ添加後に光照射する際の待ち時間について検討した。
図１６は、上述の２０１Ｂ７細胞株を、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２０，０００細胞ずつ播種後、３日目の細胞にＡＬＡ塩酸塩を添加後、４時間又は２４時間後に赤色ＬＥＤを１０分作用させて、４日目にＣＣＫ８で評価した結果である。各濃度において、グラフのバーは各細胞種におけるＡＬＡ添加０μＭ（コントロール）の値を１００としたときの変化率（％）を示す。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝９６）を示す。
結果として、ＡＬＡの添加後時間が４時間で、コントロールと比べてｉＰＳ細胞の細胞生存率を減少させられた。実際に、図１６（ａ）に示すように、２５０μＭのＡＬＡを加えて光照射した場合、添加後時間が４時間では、光照射していないコントロールと比べて６５％の細胞生存率となった。
また、ＡＬＡの添加後時間がより長い２４時間で光照射を行うと、更に低い濃度でｉＰＳ細胞の細胞生存、増殖の抑制することが可能となった。図１６（ｂ）に示すように、添加後時間が２４時間では、コントロールと比べて７％の細胞生存率となった。
なお、予備的な実験において、ＡＬＡの添加後時間を２４時間より増やしても、２４時間のものと比べて、細胞生存率に変化はなかった。

（ｉＰＳ細胞由来の肝細胞に対するＡＬＡ−ＰＤＴの作用の評価）
上述の実施例１と同様のヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞について、ＡＬＡ−ＰＤＴによる作用の評価を行った。本実施例では、培養条件は２４ウェルプレートに、１ウェルあたり５００，０００細胞を播種後、７日目の細胞にＡＬＡ塩酸塩を各濃度（０、２５０、５００μＭ）添加後、２４時間後に赤色ＬＥＤにより１０分間光照射し、翌日以降に形態観察した。赤色ＬＥＤの照射パワーは、上述と同様である。

この結果を、図１７及び図１８に示す。
図１７は、２５０μＭのＡＬＡ塩酸塩を添加して（ａ）２４時間経過後で光照射前（ＬＥＤ照射前）、（ｂ）光照射後２４時間経過後（ＬＥＤ照射後２４時間）、（ｃ）光照射後４８時間経過後（ＬＥＤ照射後４８時間）のヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞のプレートの写真である。図１７（ａ）においては、肝細胞特異的な敷石状の形態と核が明瞭に確認できる。図１７（ｂ）の光照射後、２４時間経過しても、敷石状の形態と核が明瞭な細胞が残存している。また、図１７（ｃ）の光照射後、４８時間経過しても、敷石状の形態と核が明瞭な細胞が生存し続けた。これにより、分化したヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞が残存することが確認できた。
また、図１８は、ＡＬＡ塩酸塩の濃度を０μＭ、２５０μＭ、５００μＭに変化させた際の、光照射前（ＬＥＤ照射前）、光照射後２４時間経過後（ＬＥＤ照射後２４時間）、（ｃ）光照射後６０時間経過後（ＬＥＤ照射後６０時間）のヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞のプレートの写真である。このうち、２５０μＭの写真は、図１７とは別のプレートの写真を示している。ＡＬＡ−ＰＤＴの各条件下において、生存したヒトｉＰＳ細胞由来肝細胞が存在していることが分かった。また、目視によると、２５０μＭの条件下の方が、５００μＭよりも生存している細胞の状態がよかった。
結果として、ｉＰＳ細胞由来の肝細胞に関しても、実施例１の神経細胞と同様に、２５０μＭ濃度のＡＬＡを添加しても正常な細胞を残存させることができ、これ以外のｉＰＳ細胞を選択的に除去することが可能であった。

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明の幹細胞除去方法は、幹細胞を生体外で培養して、体細胞に分化誘導した後で幹細胞を容易に除去し、その後、分化誘導された体細胞のみを体内に導入する等の再生医療等に利用することができ、産業上に利用することができる。

Claims (19)

1. 幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含み、ガン細胞を含まない細胞群を、光増感剤を含む培地組成物で培養し、
   前記光増感剤を含む培地組成物で培養された前記細胞群に、特定波長の光を照射し、
   前記細胞群から、前記幹細胞を除去し、
   前記幹細胞は、多能性幹細胞であり、
   前記特定波長の光の波長は、４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ又は５８０〜６００ｎｍであり、照射照度は、１０ｍＷ／ｃｍ ² 〜２０ｍＷ／ｃｍ ² であり、照射時間は、１分〜２４０分である
   ことを特徴とする幹細胞除去方法。
2. 前記多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）及びｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）のいずれかを含む
   ことを特徴とする請求項１に記載の幹細胞除去方法。
3. 前記光増感剤は、アミノレブリン酸（Ａｍｉｎｏ Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、その誘導体、又はそれらの塩である
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の幹細胞除去方法。
4. 前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩の濃度は、１０μＭ〜２０００μＭである
   ことを特徴とする請求項３に記載の幹細胞除去方法。
5. 前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩を添加後に光照射されるまでの時間は、４時間以上である
   ことを特徴とする請求項３又は４に記載の幹細胞除去方法。
6. 請求項１乃至５のいずれか１項に記載の幹細胞除去方法により除去される際に、分化誘導された前記体細胞を保護する
   ことを特徴とする分化細胞保護方法。
7. 保護される前記体細胞が中胚葉系細胞である
   ことを特徴とする請求項６に記載の分化細胞保護方法。
8. 保護される前記体細胞が外胚葉系細胞である
   ことを特徴とする請求項６に記載の分化細胞保護方法。
9. 保護される前記体細胞が内胚葉系細胞である
   ことを特徴とする請求項６に記載の分化細胞保護方法。
10. 幹細胞と、幹細胞から分化誘導された体細胞とを含む細胞群を培養するための培地成分と、光増感剤とを含み、
    前記幹細胞は、多能性幹細胞であり、
    特定波長の光を照射した場合、前記幹細胞を除去し、
    前記特定波長の光を照射した場合、分化誘導された前記体細胞を保護し、
    前記特定波長の光の波長は、４３０ｎｍ〜４８０ｎｍ又は５８０〜６００ｎｍであり、照射照度は、１０ｍＷ／ｃｍ ² 〜２０ｍＷ／ｃｍ ² であり、照射時間は、１分〜２４０分である
    ことを特徴とする培地組成物。
11. 前記多能性幹細胞は、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、及びｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）のいずれかを含む
    ことを特徴とする請求項１０に記載の培地組成物。
12. 前記幹細胞から分化誘導される前記体細胞は、
    中胚葉系細胞、外胚葉系細胞、及び内胚葉系細胞からなる群のいずれか一種を含む
    ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の培地組成物。
13. 前記幹細胞から前記体細胞を分化誘導するグロースファクター成分を更に含む
    ことを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の培地組成物。
14. 前記培地成分は、細胞に栄養分を与えるための栄養成分を含む
    ことを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項に記載の培地組成物。
15. 前記培地成分は、培養中の環境を一定に保つためのバッファー成分を含む
    ことを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか１項に記載の培地組成物。
16. 前記培地成分は、前記体細胞の成育を促進する生育促進成分を含む
    ことを特徴とする請求項１０乃至１５のいずれか１項に記載の培地組成物。
17. 前記光増感剤は、アミノレブリン酸（Ａｍｉｎｏ Ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ Ａｃｉｄ）、その誘導体、又はそれらの塩である
    ことを特徴とする請求項１０乃至１６のいずれか１項に記載の培地組成物。
18. 前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩の濃度は、１０μＭ〜２０００μＭである
    ことを特徴とする請求項１７に記載の培地組成物。
19. 前記アミノレブリン酸、その誘導体、又はそれらの塩を添加後に光照射されるまでの時間は、４時間以上である
    ことを特徴とする請求項１７又は１８に記載の培地組成物。

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