KR20150056003A - 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법 - Google Patents

돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150056003A
KR20150056003A KR1020130138663A KR20130138663A KR20150056003A KR 20150056003 A KR20150056003 A KR 20150056003A KR 1020130138663 A KR1020130138663 A KR 1020130138663A KR 20130138663 A KR20130138663 A KR 20130138663A KR 20150056003 A KR20150056003 A KR 20150056003A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nos
dna
pork
gene
Prior art date
Application number
KR1020130138663A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101630806B1 (ko
Inventor
최봉환
정호영
채한화
이승수
정경용
김승창
박창민
Original Assignee
대한민국(농촌진흥청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(농촌진흥청장) filed Critical 대한민국(농촌진흥청장)
Priority to KR1020130138663A priority Critical patent/KR101630806B1/ko
Publication of KR20150056003A publication Critical patent/KR20150056003A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101630806B1 publication Critical patent/KR101630806B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지의 유전자 감식을 위한 초위성체 표지인자 개발에 관한 것으로 보다 자세하게는 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)를 이용한 다중중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 경제적인 방법으로 개체식별 및 친자를 감별하는 기술에 관한 것이다. 본 발명에 의한 23개의 초위성체(Microsatellite)표지인자들의 다중중합연쇄반응 방법은 돼지의 개체식별 및 친자감별을 유전자를 활용하여 고속, 저비용 분석이 가능하여 돼지 이력추적제에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법{Discrimination method for product traceability and identification of pork using Microsatellite DNA}
본 발명은 돼지의 유전자 감식을 위한 초위성체 표지인자 개발에 관한 것으로 보다 자세하게는 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)를 이용한 다중중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 경제적인 방법으로 개체식별 및 친자를 감별하는 기술에 관한 것이다.
일반적으로 국외내의 경우 축산물(돼지고기)의 원산지를 추적하는 것은 돈 콜레라, 구제역 등의 악성 질병이 사람이나 다른 지역의 가축, 동물 등으로 전파되는 것을 사전에 차단하기 위해 실시되고 있다.
이를 위해, 유럽의 경우 원산지로부터 개체 식별이 된 돼지만이 도축되거나 이동될 수 있도록 의무적으로 이표(귀에 부착된 바코드 표식)를 달도록 제도화 되어 있으며 도축 후에는 생축에서 확인된 바코드 번호가 연계되어 상품에 부착됨으로 인해 유통점에서 돼지고기의 원산지가 추적되는 시스템을 채택하고 있다.
그러나, 일본과 한국 등에서는 외국산 돼지고기와 국내산 돼지고기의 가격차이가 매우 높기 때문에, 의도적으로 도축 후에 원산지의 정보가 차단되는 경향이 많이 있는 실정이다. 또한 의도적이지 않는 경우에도 재래 돼지의 개체 식별체계(이표)의 오류 등의 원인으로 완벽한 원산지 정보가 연계되지 못하고 있다. 이에 몇몇 나라에서는 유전자 감식 기법의 도입을 통한 원산지 정보의 진위 여부임을 시도하고 있다. 하지만, 돼지의 유전자 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 돼지의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 재래돼지의 개체 식별을 위해서는 재래 돼지의 특이적인 유전양상에 근거한 표지 유전자를 선정하고, 이들을 활용한 유전자 감식 기법을 설정하는 것이 매우 중요하다.
한편, 국내에서는 대부분이 재래 돼지 유전자의 보존 측면과 품종간 유전적 다양성 연구와 친자 확인용으로 개발된 유전자표지(초위성체 유전자: Microsatellite DNA)를 활용한 유전자 감식 기법이 사용되고 있다. 그러나, 상기 사용되고 있는 유전자 표지를 부분적으로 재래 돼지의 유전자 감식용으로 활용할 경우, 유용성 및 정확도가 떨어지는 단점이 있다. 또한, 현재 개발된 일부의 유전자 표지는 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있는 실정이기 때문에, 좀더 유용한 유전자 표지를 선별하여 재래 돼지 개체 식별과 원산지 검증의 유효성을 높이면서, 다양한 개체의 품종을 확인할 수 있도록 충분한 수의 유전자 표지(Genetic marker)를 개발할 필요가 있다.
한국공개특허 10-2005-0119274
이에, 본 발명자는 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 원산지 정보를 도축 후 포장되어 유통점에 이동되거나 판매되어 소비자에 전달된 상태에서 채취한 시료로부터 분석한 개체 유전자 감식 정보와 비교하여, 개체 식별 및 친자확인을 신속하고 정확하게 검증할 수 있는 다양한 돼지의 유전자 표지를 선정하고 이의 유전자표지를 이용한 분석 방법을 개발하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 돼지의 초위성체 유전자로부터 유전자 표지를 선정하고, 이를 이용하여 신속성 및 정확성이 매우 우수한 돈육의 원산지 추적 및 품종특성에 따른 개체 식별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 초위성체 DNA를 증폭하여 돼지의 개체를 식별하기 위한, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32, 서열번호 33 및 34, 서열번호 35 및 36, 서열번호 37 및 38, 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 및 42, 서열번호 43 및 44, 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍의 조합이 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기의 프라이머쌍의 조합을 포함하는 돼지의 개체 식별용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 따른 측면에 따르면, 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 상기 제1항의 프라이머쌍으로 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 증폭시키는 단계; 및 상기 중합효소 연쇄반응 산물의 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 개체 식별방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 15분간 반응하고, 94℃에서 40초, 59~60℃에서 35~45초, 72℃에서 40초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25~35회 반복하고, 72℃에서 10분간을 반응시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 돼지의 초위성체 DNA는 대립유전자의 수가 3~6개이고, 이형접합체 출현율은 60%보다 높게 나타나며, 유전자의 크기는 81~289bp일 수 있다.
본 발명에 의한 23개의 초위성체(Microsatellite)표지인자들의 다중중합연쇄반응 방법은 돼지의 개체식별 및 친자감별을 유전자를 활용하여 고속, 저비용 분석이 가능하여 돼지 이력추적제에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지의 초위성체 유전자좌에 특이적인 유전자 증폭 프라이머를 이용하여 검체에서 각각의 초위성체 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물을 크기별로 분획하여 상기 프라이머별로 증폭된 유전자 산물의 크기를 측정한 다음, 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는 돈육 원산지 추적 및 개체식별의 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하자면 다음과 같다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
아울러, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 재래 돼지의 혈액 및 기타 조직 시료에서 개체 식별을 위한 유전자 표지로, 염색체 내의 고도 원심분리에 의해 주 염색체와 분리되는 초위성체 유전자 (Microsatellite DNA)를 이용한다.
본 발명에 사용된 공시동물과 DNA 시료는 돼지 5품종으로 재래 돼지(Korean native pig), 버크셔(Berkshire), 랜드레이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 듀록(Duroc)로 구성되어있으며 재래돼지 20두를 제외하고 각각 19두씩, 총 96두를 활용하여 혈액으로부터 게놈 DNA 추출 키트(Promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리 하였다.
본 발명은 돼지의 유전자 개체식별을 위한 다중중합연쇄반응(Multiplex PCR) 방법을 통한 유전자 감식방법으로서 선정된 초위성체 마커들은 초위성체 유전자좌 (Microsatellite Marker)는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Mapviewer 데이터베이스에 보고된 돼지의 초위성체 유전자좌 들을 기초로 하여 선정하였고, 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp.), 증폭산물의 크기(Product Size) 형광물질(Dye) 등을 고려하여 최종적으로 총23개의 세트로 나누어 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)이 가능하도록 조합되었다.
이때, 상기 유전자 진단용 프라이머는 유전자 표지당 2종의 프라이머를 제작하여 대립유전자를 분석할 수 있게 하고, 돼지 초위성체 DNA와 함께 PCR 증폭 반응을 수행하여, 돼지에서 특이적으로 발현되는 각각의 유전자 표지별 대립 유전자(Allele)를 증폭시킨다.
그리고, 증폭된 대립 유전자들은 적합한 분석기기를 사용하여, 각각의 유전자 표지별로 대립유전자의 수, 유전자의 위치, 유전자 크기 및 이형접합체 출현율로 분류한다.
그런 다음, 본 발명은 상술한 선정방법으로부터 돼지 집단에서 높은 빈도로 출현하는 유효성이 높은 유전자 표지를 확보한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 초위성체 DNA를 증폭하여 돼지의 개체를 식별하기 위한, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32, 서열번호 33 및 34, 서열번호 35 및 36, 서열번호 37 및 38, 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 및 42, 서열번호 43 및 44, 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍의 조합이 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기의 프라이머쌍의 조합을 포함하는 돼지의 개체 식별용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 따른 측면에 따르면, 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 DNA를 상기 제1항의 프라이머쌍으로 중합효소 연쇄반응을 통해 유전자를 증폭시키는 단계; 및 상기 중합효소 연쇄반응 산물의 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 돼지의 개체 식별방법이 제공될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 15분간 반응하고, 94℃에서 40초, 59~60℃에서 35~45초, 72℃에서 35~45초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 수차례 반복한 다음, 72℃에서 10분간을 반응시킬 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응의 사이클은 61℃에서 40초간 5사이클, 60℃에서 40초간 5사이클 및 59℃에서 40초간 5사이클 동안 반응하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 초위성체 유전자(Microsatellite DNA)를 검출하기 위해, 방사성 물질을 사용하는 것보다는 형광 프로브 방법을 사용하고, 유전자 증폭용 프라이머에 형광물질을 결합하여 사용하는 것이 바람직하다.
다중 중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)은 주형 genomic DNA(50ng/ul) 6μl, 각각의 초위성체 조합별 형광염색 프라이머(10pmole) 세트당 0.3μl - 0.4μl, Hot Start Taq DNA중합효소 (2Unit/ul) 2.6μl, 10X buffer 4μl, 2.5mM dNTP 3μl의 조성에 증류수를 채워 총 반응액은 25ul가 되도록 하였다. 상기 혼합물은 Veriti 96 well Thermal Cycler (Applied Biosystem, CA, USA)을 이용하여 95℃에서 15분간의 첫 반응을 시작으로 94℃에서 40초간 변성, 61℃에서 40초간 결합, 72℃에서 40초간 신장하여 5사이클, 94℃에서 40초간 변성, 60℃에서 40초간 결합, 72℃에서 40초간 신장하여 5사이클, 94에서 40초간 변성, 59℃에서 40초간 결합, 72℃에서 40초간 신장하여 25사이클을 실시한 후, 마지막으로 72℃에서 20분간 최종 신장반응을 실시하였다. PCR 후의 증폭된 산물은 ABI-3730 DNA자동 염기서열 분석장치(Applied Biosysytems, USA)를 이용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하고, GeneMapper version 4.0(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 PCR산물의 크기와 표지인자의 종류별로 분류하여 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel, USA) 프로그램으로 자료를 수집하였다.
또한, 본 발명에서는 돈육의 원산지 추적 및 개체식별을 하기 위해, 유전자 표식(genetic marker)으로 사용하는 초위성체 유전자는 대립 유전자의 수가 3~6개이고, 이형접합체 출현율은 60%보다 높은 나타나며, 유전자의 크기는 81~289bp인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 대립 유전자의 수가 3개 미만일 경우에는 개체식별 확률이 너무 저하되고, 6개를 초과할 경우에는 실제 유전자 분석을 위해 실험을 실시할 경우, 대립 유전자의 다양한 출현으로 인해 개체의 유전자 분석 정보를 처리하기에 복잡해지는 문제점이 발생되고, 유전자의 크기가 300bp 이상이 되면 검출감도가 떨어지기 쉽고, 이형접합체 출현율이 60% 미만이면 대립 유전자가 개체마다 다양한 조합을 이루어 발현할 수가 없어서, 대립유전자의 수와 크기를 수치화하기가 어려워지기 때문이다.
이에, 본 발명에서는 상술한 조건에 적합하면서 돼지에서 출현 빈도가 높은 초위성체 유전자인 SW403, S0226, SW210, SW2410, S0107, S0227, SWR414, S0068, SW1920, SWR2516, S0101, S0018, SW1041, SW1377, SW1557, SW1989, SW2401, SW2456, SW2515, SW316, SWR1526, SWR1849, SWR1941을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 23개 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 조합이 본원의 서열번호 1~46에 수록되어 있다.
이하, 본 발명의 유전자 감식에 의한 돈육의 원산지 추적 및 품종 판별 방법 및 효과를, 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명하기로 한다.
그러나, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되지 않는다.
[실시예]
1. 공시재료
본 발명에 사용된 공시동물과 DNA 시료는 돼지 5품종으로 재래 돼지(Korean native pig), 버크셔(Berkshire), 랜드레이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 듀록(Duroc)로 구성되어있으며 재래돼지 20두를 제외하고 각각 19두씩, 총 96두를 활용하여 혈액으로부터 게놈 DNA 추출 키트(Promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 분리 하였다.
2. 대상 유전자 표지 및 유전자 증폭 프라이머 제작
본 발명은 돼지의 유전자 개체식별을 위한 다중중합연쇄반응(Multiplex PCR) 방법을 통한 유전자 감식방법으로서 선정된 초위성체 마커들은 초위성체 유전자좌 (Microsatellite Marker)는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Mapviewer 데이터베이스에 보고된 돼지의 초위성체 유전자좌들을 기초로 하여 선정하였고, 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp.), 증폭산물의 크기(Product Size) 형광물질(Dye) 등을 고려하여 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)이 가능하도록 조합하였다.
본 발명에서 사용한 대상 유전자 표지는 초위성체 DNA(마이크로세터라이트)를 사용하였으며, 이들 유전자 표지를 분석하기 위해 유전자좌를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
표 1 및 표 2의 유전자 표지명은 종래 당해 기술 분야에서 그 의미가 확실하게 되어 있는 것으로, 예를 들면 웹사이트(www.NCBI.nlm.nih.gov)에도 나와 있다.
표 1 및 표 2는 전체 23개 초위성체 마커에 대한 프라이머 조합을 나타낸다.
염색체 마커 프라이머
F: 정방향(5`3`)
R: 역방향(3`5`)		 증폭산물
크기		 형광
물질		 서열
번호
16 SW403 F GTGTATGTTCATGCATGGGTG 100~114 Fam 1
R GTCTCTGCTTTGCTTGCATG 2
2 S0226 F GGTTAAACTTTTNCCCCAATACA 175~206 Fam 3
R GCACTTTTAACTTTCATGATGCTCC 4
14 SW210 F TCATCACCATCATACCAAGATG 215~250 Fam 5
R AATTCTGCCAAGAAGAGAGCC 6
8 SW2410 F ATTTGCCCCCAAGGTATTTC 102~124 VIC 7
R CAGGGTGTGGAGGGTAGAAG 8
4 S0107 F CAAGGATGCCTGTAACTGGTGCAG 165~190 VIC 9
R TCCTTAAGGCCTCGTAGGATCTGT 10
4 S0227 F GATCCATTTATAATTTTAGCACAAAGT 225~256 VIC 11
R GCATGGTGTGATGCTATGTCAAGC 12
18 SWR414 F GATTTGACCCCATGCCTG 138~158 NED 13
R AAGGCAAACCCCTTGAGTTC 14
13 S0068 F AGTGGTCTCTCTCCCTCTTGCT 211~260 NED 15
R CCTTCAACCTTTGAGCAAGAAC 16
17 SW1920 F GATCCGTATCTATAGCCACCTG 90~135 PET 17
R ATGAAAGCTACCAACCCTTCC 18
2 SWR2516 F GTGCATTATCGGGAGGTATG 154~178 PET 19
R ACCCTGTATGATACTGTAACTCTGG 20
7 S0101 F GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG 197~216 PET 21
R GTCTCCCTCACACTTACCGCAG 22
염색체 마커 프라이머
F: 정방향(5`3`)
R: 역방향(3`5`)		 증폭산물
크기		 형광
물질		 서열
번호
5 S0018 F GCACAGTTGATGCTTCATGC 248~277 NED 23
R GATCAAAAGTCCCCAATTCC 24
10 SW1041 F ATCAGAAAATGGTCAACAGTTCA 93~103 PET 25
R GGAGAATTCCCAAAGTTAATAGG 26
11 SW1377 F TTCAAGGTTGGAAAGACAGTCC 205~228 NED 27
R ATGAGGAGTTTGAACTATTGGG 28
14 SW1557 F TTCAAGGTTGGAAAGACAGTCC 84~100 NED 29
R ATGAGGAGTTTGAACTATTGGG 30
15 SW1989 F TGCTCTAATCTACCCGGGTC 228~243 Fam 31
R CCACCCCACTCCCTTCTG 32
9 SW2401 F TGAACAAGTCCAACCAAGAGC 148~170 Fam 33
R CCCAACTAACGGGCTTGTG 34
X SW2456 F GAGCAACCTTGAGCTGGAAC 189~211 PET 35
R AATGTGATTGATGCTGTGAAGC 36
14 SW2515 F CCATCTCATCCAGAAACATCC 90~108 Fam 37
R AGGATGCTGAGGTGTTAGGC 38
6 SW316 F TTCTCCAGCCATCATGAGTG 133~159 PET 39
R AATGACCATTCCTGAGGCTG 40
5 SWR1526 F CGGTGGCTACAGATAACAATAC 114~146 VIC 41
R ATCCGATTCAACCCCTAGC 42
10 SWR1849 F CCTGTTCTGCCTCTAGCCTG 115~160 NED 43
R CTGAGAAGCCTGTGCATCAG 44
13 SWR1941 F AGAAAGCAATTTGATTTGCATAATC 202~222 VIC 45
R ACAAGGACCTACTGTATAGCACAGG 46
이 때, 상기 프라이머 조합에 대한 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)의 최적 어닐링 온도(Tm)는 표 1의 경우 60℃이고, 표 2의 경우 61℃로써, 모두 60~61 ℃내에 존재한다. 이는 각 프라이머 간의 최적 어닐링 온도의 편차가 극소화 되도록 프라이머의 염기서열을 디자인함으로써, 연쇄중합반응의 용이성뿐만 아니라, 반응 결과의 정확도가 극대화되도록 한 것이다.
3. 다중 PCR (Multiplex PCR)
PCR증폭 반응은 형광 염색된 초위성체 DNA의 색상과 이의 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 다중 PCR을 수행하였고, 18종에 대한 유전자형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 초위성체의 유전자 표지를 인지하기 위해 형광 물질을 유전자 증폭 프라이머에 부착하였다.
다중 PCR은 약 50ng의 주형 DNA, 20ng의 각 프라이머, 1.25mM의 각 dNTP, 0.5U의 Taq DNA 중합효소(Promega)과 1μl 10X PCR 완충용액(100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25% nonidet P40 and 20mM MgCl2)를 혼합하여 각 반응액의 총량이 10μl가 되게 한 후, 상기 혼합물을 진앰프 9700(GeneAmp 9700, Applied Biosystems)에서 95℃에서 15분간 반응하고, 94℃에서 40초, 60℃에서 40초, 72℃에서 40초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25회 반복하고, 72℃에서 10분간을 반응하였다. PCR 후의 증폭된 산물은 ABI-3730 DNA자동 염기서열 분석장치(Applied Biosysytems, USA)를 이용하여 크기 및 형광물질별로 분류되도록 전기영동을 실시하고, GeneMapper version 4.0(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 PCR산물의 크기와 표지인자의 종류별로 분류하여 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel, USA) 프로그램으로 자료를 수집하였다.
최종적으로 Genotyper Software에 의해 결정되어진 초위성체 표지인자(Microsatellite Marker)별 대립 유전자들은 Cervus 3.0 program (version 3.0.3 The University of Edinburgh)를 이용하여 분석 집단별 및 개체별로 정리한 후 전체 집단에 대한 관측 이형접합률 (observed heterozygosity), 대립유전자빈도 (allele frequency), 각 좌위별 대립유전자수 및 품종 집단별 대립유전자수를 산출하여 하기 표 3에 나타내었다. 또한, 상기 검체에 대한 기대 및 관측 이형접합율과 PIC(polymorphic information content) 값을 산출하여 돼지 품종별 대립유전자형의 다양성을 표 4에 나타내었다.
표 3은 각 유전자 표지별로 대립유전자의 크기 분포 및 대립유전자의 수를 나타내며, 이를 개체별 분석의 자료로 활용할 수 있다.
초위성체
마커		 대립유전자
크기분포		 대립유전자수
(전체
품종)		 대립유전자수
(K)		 대립유전자수
(B)		 대립유전자수
(L)		 대립유전자수
(Y)		 대립유전자수
(D)
SW403 100~114 4 2 3 3 4 2
S0226 175~206 5 4 5 5 3 2
SW210 215~250 8 3 6 5 3 3
SW2410 102~124 6 1 1 4 3 3
S0107 165~190 9 3 4 5 5 3
S0227 225~256 4 2 2 2 1 3
SWR414 138~158 4 1 3 2 2 3
S0068 211~260 9 3 6 5 3 6
SW1920 90~135 10 3 6 5 3 6
SWR2516 154~178 7 2 6 4 4 2
S0101 197~216 7 2 4 4 4 3
S0018 248~277 6 2 3 4 3 4
SW1041 93~103 4 3 2 2 4 2
SW1377 205~228 4 3 3 2 2 2
SW1557 84~100 6 2 3 6 5 4
SW1989 228~243 8 3 5 4 3 4
SW2401 148~170 7 3 5 5 5 4
SW2456 189~211 5 3 4 5 3 5
SW2515 90~108 9 2 7 6 5 2
SW316 133~159 9 3 5 4 4 3
SWR1526 114~146 5 1 4 3 4 5
SWR1849 115~160 8 3 5 3 4 4
SWR1941 202~222 9 2 4 5 6 4
K :한국재래종, B :버크셔, L :랜드레이스, Y :요크셔, D :듀록
표 4는 각 표지인자의 5가지 품종의 돼지에 대한 기대 및 관측 이형접합율 과 PIC 값을 나타낸다.
Figure pat00001
Ex H : 기대이형접합율(Expected Heterozygosity)
Ob H : 관측이형접합율(Objectived Heterozygosity)
PIC : 다형정보량(polymorphic information content)
상기 표에서 유전자 다양성(gene diversity)은 기대이형접합율로 설명될 수 있으며, 집단으로부터 무작위로 선택된 2개의 대립유전자가 서로 다른 형태로 존재할 수 있는 확률로 정의된다. 상기 지표에서 변별력의 기준이 되는 것은 PIC 값이다.
상기와 같은 23개의 초위성체(Microsatellite)표지인자들을 다중중합연쇄반응으로 증폭하여 돼지의 개체에서 나타날 수 있는 여러 대립유전자들을 분석함으로써, 고속, 저비용으로 돼지의 개체식별 및 친자감별이 가능하므로 돼지 이력추적제에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Discrimination method for product traceability and identification of pork using Microsatellite DNA <130> NPF24993 <160> 46 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> pork <400> 1 gtgtatgttc atgcatgggt g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 2 gtctctgctt tgcttgcatg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> pork <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 ggttaaactt ttnccccaat aca 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> pork <400> 4 gcacttttaa ctttcatgat gctcc 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 5 tcatcaccat cataccaaga tg 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> pork <400> 6 aattctgcca agaagagagc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 7 atttgccccc aaggtatttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 8 cagggtgtgg agggtagaag 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> pork <400> 9 caaggatgcc tgtaactggt gcag 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> pork <400> 10 tccttaaggc ctcgtaggat ctgt 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> pork <400> 11 gatccattta taattttagc acaaagt 27 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> pork <400> 12 gcatggtgtg atgctatgtc aagc 24 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> pork <400> 13 gatttgaccc catgcctg 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 14 aaggcaaacc ccttgagttc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 15 agtggtctct ctccctcttg ct 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 16 ccttcaacct ttgagcaaga ac 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 17 gatccgtatc tatagccacc tg 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> pork <400> 18 atgaaagcta ccaacccttc c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 19 gtgcattatc gggaggtatg 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> pork <400> 20 accctgtatg atactgtaac tctgg 25 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> pork <400> 21 gaatgcaaag agttcagtgt agg 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 22 gtctccctca cacttaccgc ag 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 23 gcacagttga tgcttcatgc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 24 gatcaaaagt ccccaattcc 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> pork <400> 25 atcagaaaat ggtcaacagt tca 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> pork <400> 26 ggagaattcc caaagttaat agg 23 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 27 ttcaaggttg gaaagacagt cc 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 28 atgaggagtt tgaactattg gg 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 29 ttcaaggttg gaaagacagt cc 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 30 atgaggagtt tgaactattg gg 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 31 tgctctaatc tacccgggtc 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> pork <400> 32 ccaccccact cccttctg 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> pork <400> 33 tgaacaagtc caaccaagag c 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> pork <400> 34 cccaactaac gggcttgtg 19 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 35 gagcaacctt gagctggaac 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 36 aatgtgattg atgctgtgaa gc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> pork <400> 37 ccatctcatc cagaaacatc c 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 38 aggatgctga ggtgttaggc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 39 ttctccagcc atcatgagtg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 40 aatgaccatt cctgaggctg 20 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> pork <400> 41 cggtggctac agataacaat ac 22 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> pork <400> 42 atccgattca acccctagc 19 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 43 cctgttctgc ctctagcctg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> pork <400> 44 ctgagaagcc tgtgcatcag 20 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> pork <400> 45 agaaagcaat ttgatttgca taatc 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> pork <400> 46 acaaggacct actgtatagc acagg 25

Claims (5)

  1. 초위성체 DNA를 증폭하여 돼지의 개체를 식별하기 위한, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30, 서열번호 31 및 32, 서열번호 33 및 34, 서열번호 35 및 36, 서열번호 37 및 38, 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 및 42, 서열번호 43 및 44, 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍의 조합.
  2. 제 1 항의 프라이머쌍의 조합을 포함하는 돼지의 개체 식별용 키트.
  3. 시료에서 DNA를 추출하는 단계;
    상기 추출된 DNA에 대해 상기 제1항의 프라이머쌍으로 중합효소 연쇄반응을 시켜 돼지 초위성체 DNA를 증폭시키는 단계; 및
    상기 중합효소 연쇄반응 산물의 유전자형을 분석하는 단계
    를 포함하는 돼지의 개체 식별방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 중합효소 연쇄반응은 95℃에서 15분간 반응하고, 94℃에서 40초, 60~61 ℃에서 35~45초, 72℃에서 40초간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 25~35회 반복하고, 72℃에서 10분간을 반응시키는 것을 특징으로 하는 돼지의 개체 식별방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 돼지의 초위성체 DNA는 대립유전자의 수가 3~6개이고, 이형접합체 출현율은 60%보다 높게 나타나며, 유전자의 크기는 81~289bp인 것을 특징으로 하는 돼지의 개체 식별방법.
KR1020130138663A 2013-11-14 2013-11-14 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법 KR101630806B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130138663A KR101630806B1 (ko) 2013-11-14 2013-11-14 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130138663A KR101630806B1 (ko) 2013-11-14 2013-11-14 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150056003A true KR20150056003A (ko) 2015-05-22
KR101630806B1 KR101630806B1 (ko) 2016-06-16

Family

ID=53391440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130138663A KR101630806B1 (ko) 2013-11-14 2013-11-14 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101630806B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210085864A (ko) * 2019-12-31 2021-07-08 (주)티엔티리써치 초위성체 마커를 이용한 개의 개체식별, 친자확인 방법 및 이를 이용한 분석 키트

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050119274A1 (en) 2002-04-03 2005-06-02 Jean-Pierre Evenou Indolylmaleimide derivatives

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050119274A1 (en) 2002-04-03 2005-06-02 Jean-Pierre Evenou Indolylmaleimide derivatives

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
농업생명과학연구지. Vol. 46, No. 5, 페이지 71-80 (2012)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210085864A (ko) * 2019-12-31 2021-07-08 (주)티엔티리써치 초위성체 마커를 이용한 개의 개체식별, 친자확인 방법 및 이를 이용한 분석 키트

Also Published As

Publication number Publication date
KR101630806B1 (ko) 2016-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101823368B1 (ko) 돈육내 다가 불포화지방산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
CN105274094B (zh) Snp标记及其应用
KR100842432B1 (ko) 귤에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR102009712B1 (ko) 대추 복조 품종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR101961653B1 (ko) 고구마 품종 판별용 ｓｎｐ 분자 마커 및 이의 용도
KR20050046330A (ko) 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체식별 방법
Ciavaglia et al. Molecular identification of python species: development and validation of a novel assay for forensic investigations
KR102126809B1 (ko) 참당귀 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도
KR20180050470A (ko) 재래닭 개체 식별용 초위성체 마커 및 이를 이용한 재래닭의 개체 식별 방법
KR101630806B1 (ko) 돼지의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법
KR101595016B1 (ko) 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법
KR20110067634A (ko) 미토콘드리아 ｄｎａ 다형성 분석에 의한 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도
KR20150056004A (ko) 닭의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법
CN105331696B (zh) 一种鉴定猪肋骨数相关性状的方法及专用引物
KR102226281B1 (ko) 고양이의 초위성체 마커를 이용한 개체식별 방법
KR101535925B1 (ko) 염소 개체 식별용 초위성체 마커
KR101985659B1 (ko) 단일염기다형성 마커를 이용한 백우 품종 식별 방법
KR102001528B1 (ko) 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도
Losi et al. An alternative method to isoenzyme profile for cell line identification and interspecies cross-contaminations: cytochrome b PCR-RLFP analysis
KR102019993B1 (ko) 소의 성 및 품종 판별용 조성물, 및 이를 이용한 판별방법
KR102512271B1 (ko) 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법
Suwanchatree et al. Discrimination of highly degraded, aged Asian and African elephant ivory using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
KR102382857B1 (ko) 재래 흑염소 개체 식별 및 친자 확인용 초위성체 마커
US20180105870A1 (en) Molecular tag attachment and transfer
KR101801019B1 (ko) 60s 리보좀 유전자 기반 잎마름병 저항성 백합 품종 판별용 SNP 마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant