KR20150045286A

KR20150045286A - Vegf-c에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20150045286A
Application number: KR20130124812A
Authority: KR
Inventors: 김석균; 한상열; 이광훈; 김경은
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2015-04-28
Also published as: KR102131370B1; US9562093B2; US20150110787A1

Abstract

혈관신생 유도인자인 VEGF-C(Vascular endothelial growth factor-C)에 특이적으로 결합하여 그 기능을 저해하는 폴리펩타이드 및 그 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 폴리펩타이드, 이를 포함하는 VEGF-C 특이적 항체, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 저해제 및 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 치료용 조성물, 및 상기 항체를 포함하는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물이 제공된다.

Description

VEGF-C에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 및 그의 용도{Polypeptide specifically binding to VEGF-C and use thereof}

혈관 신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 기관의 형성, 정상적인 생리학적 성장, 상처 치유 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 비정상적인 혈관 신생은 종양의 성장과 전이, 연령 관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증과 같은 질병에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

혈관신생은 종양의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며 새로운 개념의 암 치료제를 개발하기 위해 혈관 신생 기작에 대한 다양하고 심도 있는 연구가 선진국 및 다국적 제약사들에 의해 진행되고 있다. 이러한 연구는 대부분 종양으로의 혈액 공급을 억제하거나 제한하면 종양으로의 산소 및 영양분의 공급을 감소시켜 종양 세포 성장 및 증식을 정지시킬 것이라는 개념을 이용한다. 상기 연구의 표적이 된 단백질 중 하나가 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF) Family이며, VEGF Family로서 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 등이 알려져 있다.

림프관을 통한 국소 림프절로의 전이는 암의 진행에 있어서 통상적인 단계이다. 전이는 다수의 암 종류에 있어서 중요한 예후 인자이며, 국소 림프절의 외과 및 방사선 치료에 대한 기준을 형성한다. 종양 전이 과정은 국소 침윤 및 세포간 기질 파괴, 혈관 내 유입 (intravasation into blood vessel), 림프 또는 다른 채널을 통한 수송, 순환 혈액 중의 생존, 이차 부위에서의 혈관 외 유출 및 새로운 위치에서의 증식 순으로 일어난다 (Idler, et al., Adv. Cancer Res. 28,149-250 (1978), Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223-238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988) and Zetter, N. Eng. J. Med. 322,605-612 (1990)).

최근에 여러 문헌에서 림프관 신생, 림프관 형성이 림프절 전이를 촉진시킴을 보이고 있고, 따라서 림프관 신생 제어는 암 치료에 있어서의 림프절 전이를 예방하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있다 (Stacker et al., Nature Med. 7(2), 186-191 (2001); Skobe et al., Nature Med. 7(2), 192-8 (2001); Makinen et al., Nature Med. 7(2), 199-205 (2001)).

최근의 연구에 따르면, 혈관 내피세포 성장인자 (VEGF) 패밀리 중 하나인 VEGF-C가 수용체인 VEGFR2 또는 VEGFR3과 결합시, 림프관 신생, 림프 내피세포 성장 및 이동이 촉진되는 것으로 나타났다 (Karkkainen MJ, et al., Semin Cell Dev Biol. 13:9-18 (2002)). 또한, VEGF-C는 다수의 고형암, 예컨대 위암, 전립선암, 인간 결장 직장암, 침윤성 자궁경부암 등에 있어서의 종양 관련 림프관 신생 유도를 통한 림프관 매개 (lymphatic-mediated) 전이, 유방암 전이 및 인간 흑색종 전이를 촉진시키는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 암세포에서의 VEGF-C 과잉 발현은 종양 관련 림프관 신생을 증가시킴으로서 국소 림프절에로의 전이를 증가시킨다. (Stacker SA., et al., FASEB J 16:922-34 (2002)). 또한, VEGF-C/D 매개 시그널링의 차단은 마우스에 있어서의 종양 림프관 신생 및 림프절 전이를 억제하는 것으로 나타났다 (He Y., et al., J Natl Cancer Inst. 94:819-25 (2002)).

VEGF-C의 혈관신생 억제제 개발의 표적으로서의 중요성이 커져가고 있는 상황에서, 보다 효과적이고 강력한 VEGF-C 표적 물질의 개발이 요구되고 있다.

일 예는 VEGF-C에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 항 VEGF-C 항체의 상보성 결정 영역으로서 작용 가능하다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는, VEGF-C에 특이적으로 결합하는 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 VEGF-C 길항제를 제공한다.

다른 예는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 VEGF-C 길항제를 유효성분으로 포함하는 VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 예는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 VEGF-C 길항제를 포함하는 VEGF-C 검출용 조성물 및 VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 혈관신생 유도인자인 VEGF-C의 기능을 저해하는 항체 및 그의 용도에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 암조직내 암세포 성장에 필수적인 신생혈관형성을 유도하는 인자인 VEGF-C가 그의 세포내 수용체(receptor)인 VEGF-R2 또는 VEGF-R3와 결합하는 것을 방해함으로써 암조직내 신생혈관형성 및 암전이를 억제하고 VEGF-C의 활성 및/또는 과발현과 연관된 질병의 진단 및 치료에 유용한 항체를 개발하고자 하는데 그 목적을 두고 있다.

본 발명의 일 예는 신규한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종, 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는 VEGF-C와 특이적으로 결합하고, 이의 기능을 저해하는 기능을 가지며, 이러한 기능에 의하여 항 VEGF-C 항체의 상보성 결정 부위로서 작용할 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 항 VEGF-C 항체의 상보성 결정 부위로서의 기능을 아래의 표 1에 정리하였다:

	중쇄 CDR		경쇄 CDR
CDR-H1	SYDMS(서열번호1)	CDR-L1	SGSSSNIGSNNVS(서열번호4)
CDR-H2	AISYDNGSTYYADSVKG(서열번호2)	CDR-L2	YNSHRPS(서열번호5)
CDR-H3	ARDPYLARLNTFDY(서열번호3)	CDR-L3	ATWDSSLNG(서열번호6)

일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 7의 폴리펩타이드는 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 항 VEGF-C 항체의 중쇄 가변 영역으로서 기능을 하는 것일 수 있다. 또한 상기 서열번호 8의 폴리펩타이드는 상기 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 항 VEGF-C 항체의 경쇄 가변 영역으로서 기능을 하는 것일 수 있다.

<서열번호 7: 항 VEGF-C 항체의 중쇄 가변 영역 기능 가짐>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISYDNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYLARLNTFDYWGQGTLVTVSS

　　(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이다)

<서열번호 8: 항 VEGF-C 항체의 경쇄 가변 영역 기능 가짐>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNNVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDSSLNGYVFGGGTKLT

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3이다)

상기 폴리펩타이드는 VEGF-C에 대한 길항제, 예컨대, 항 VEGF-C 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 또는 항 VEGF-C 항체 유사체 (항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 구조체; 예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등)의 전구체 또는 구성 부분으로서 역할을 할 수 있다.

따라서, 다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 VEGF-C에 대한 길항제를 제공한다. 상기 길항제는 VEGF-C의 기능을 저해하는 역할을 하는 것으로, 항 VEGF-C 항체, 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 항 VEGF-C 항체 유사체 (예컨대, 펩티바디, 나노바디, 이중 결합 항체, 다중 결합 항체 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, VEGF-C)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, VEGF-C)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 리간드(표적)에 대한 수용체에 결합하여, 수용체 인산화(phosphorylation)를 감소시키거나, 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 리간드와 경쟁적으로 수용체에 결합하거나, 수용체의 3차 구조의 변화 또는 하향 조절(down regulation)에 의해 상기 수용체-리간드 간 상호 작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.

용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 상기 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용하여, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다.

용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.

용어 "이중 결합 항체" 또는 "다중 결합 항체"는 2개(이중 결합 항체) 또는 그 이상(다중 결합 항체)의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 이중 결합 항체 또는 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 상기 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGF-C을 특이적으로 인식하거나 VEGF-C에 특이적으로 결합한다. 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 　한편, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.

상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 표적이 되는 VEGF-C는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor) 계열 중 일원으로, 혈관신생, 림프관 생성, 및/또는 혈관내피세포 및/또는 림프관내피세포의 성장에 관여한다. VEGF-C는 또한 혈관 침투능(permeability)에도 영향을 미친다. VEGF-C는 VEGFR-3에 결합하고 활성화시킨다.

본 발명에서, 상기 VEGF-C는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. P49767), 원숭이 유래의 원숭이 VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. B6EBK4), 마우스 유래의 Mouse VEGF-C (NCBI Accession No. P97953), 래트 유래의 래트 VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. O35757) 등일 수 있다.

항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 이합체(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.　 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항체는 VEGF-C에 대한 결합 활성을 가지며,　VEGF-C가 자신의 세포내 수용체(receptor)인 VEGF-R2 또는 VEGF-R3와 결합하는 것을 방해함으로써 암조직내 신생혈관형성을 억제하는 효과를 갖는 항체이다.　　구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 항체는 VEGF-C와의 결합에 있어서 VEGF-R3와 경쟁함으로써, VEGF-C와 VEGF-R3와의 결합을 저해하는 것일 수 있으며, 예컨대, VEGF-C의 VEGF-R3와의 결합 부위를 인식 및/또는 결합함으로써 VEGF-C와 VEGF-R3와의 결합을 저해하는 것일 수 있다.

따라서, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGF-C와 VEGF-R2 또는 VEGF-R3와의 결합부위를 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 것일 수 있다. 　

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFvFc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이 때, 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

항 VEGF-C　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 VEGF-C와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 VEGF-C에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.

본 발명의 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 저해용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 혈관신생 억제는 신생 혈관의 형성 억제 및/또는 신생 림프관 형성 억제도 포함한다.

또 다른 예에서, 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생 저해 방법이 제공된다. 상기 혈관신생 저해 방법은 상기 투여 단계 이전에 혈관신생 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 상기 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 혈관신생 저해를 위한 용도 또는 혈관신생 저해제를 제조하는데 사용하기 위한 용도가 제공된다. 또 다른 예에서, 상기 VEGF-C에 대한 길항제, 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 상기 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 용도가 제공된다.

상기 VEGF-C에 대한 길항제, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하여 제제화될 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 VEGF-C에 대한 길항제, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 소망하는 효과, 즉 혈관신생 저해, 및/ VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 VEGF-C에 대한 길항제, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 약학 조성물의 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.

상기 VEGF-C에 대한 길항제, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

특히, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.

한편, 상기 VEGF-C에 대한 길항제 또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 VEGF-C에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 VEGF-C를 검출하거나, VEGF-C의 활성화 및/또는 과발현 여부를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 VEGF-C 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응(결합) 여부를 확인하는 단계를 포함하는 VEGF-C 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에 있어서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 생물 시료에 VEGF-C이 존재하는 것으로 판단할 수 있다. 또 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGF-C 검출을 위한 용도를 제공한다. 상기 생물 시료는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등의 포유류로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 VEGF-C의 검출은 VEGF-C의 존재 여부, 발현 여부, 또는 VEGF-C의 존재 또는 발현 정도 등을 확인하는 것을 의미한다.

또 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현 및/또는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는, VEGF-C의 활성화 및/또는 과발현, 또는 VEGF-C의 활성화 및/또는 과발현 관련 질병의 진단(판단)에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 상기 생물 시료에서의 항원-항체 반응의 정도가 정상 시료에서의 항원-항체 반응의 정도보다 높은 경우, 생물 시료 또는 상기 생물 시료가 얻어진 상기 환자를 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현 증상이 존재하거나, VEGF-C의 활성화 및/또는 과발현 관련 질병을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 정상 시료에 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 VEGF-C에 대한 길항제 및/또는 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현 및/또는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병의 진단을 위한 용도를 제공한다.

상기 생물 시료는 진단 대상 환자로부터 얻어진 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 정상 시료는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현 및/또는 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병을 갖지 않는 환자로부터 얻어진(분리된) 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택된 것일 수 있다.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 VEGF-C 활성화 및/또는 과발현과 관련된 질병은 암; 암전이; 암침윤/침습; 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증 등의 안구질환; 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증, 패혈증 등의 염증성 질환; 말라리아 등이 있다. 상기 암은 VEGF-C를 과발현하는 것일 수 있고, 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 예는 상기한 바와 같은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 이들의 조합을 암호화하는 것일 수 있다. 또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL^λ프로모터, CMV ㅍ프프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명은 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis)에 광범위하게 작용하는 사람의 VEGF-C 단백질을 인지하고, 그 수용체인 VEGF-R2 또는 VEGF-R3 와의 결합을 억제 함으로서 그 결과 신생혈관 생성 및 암세포의 전이을 억제하는 기능을 가진 항체에 관한 것으로, 상술한 항체는 VEGF-C의 활성화 및/또는 과발현과 연관된 질병의 진단 및 치료에 이용될 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 항-VEGF-C 항체의 림프관 내피세포(HLEC)의 증식 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 항-VEGF-C 항체의 혈관내피세포 (EC)의 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 항-VEGF-C 항체의 림프관 내피세포(LEC)의 이동 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1. 항- VEGF -C 인간　항체 제조

인간 VEGF-C 폴리펩타이드(R&D systems; Human VEGF-C; Accession # P49767(hVEGF-C))에 대하여 파지 디스플레이 scFv 라이브러리(이화여대 산학협력단으로부터 입수)를 사용하여 완전 인간 VEGF-C 항체를 제작하였다. 구체적 프로토콜은 다음과 같다.

상기 VEGF-C 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug(microgram)/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 1차, 2차, 3차 패닝을 통하여 VEGF-C 에 반응하는 항체를 enrich 시키는 과정을 수행하였다. PBS((Phosphate Buffer Saline)에 용해된 약 3%(v/v)의 우유를 사용하여 이뮤노튜브의 표면을 차단시킨 후, 약 0.5 ㎖ 의 3%(v/v) 우유에 상기 기재된 동일한 파지 디스플레이 scFv 라이브러리로부터 유래하는 약 1x10¹²개의 파지 입자를 넣고 함께 37℃로 1시간 동안 항온 처리하여 blocking 하였다. 그 후 VEGF-C 로 평판된 이뮤노튜브에 우유로 blocking 한 파지를 넣고 실온에서 1 시간 동안 항온 처리 하여 VEGF-C 와 파지를 결합시켰다.

파지의 항온 처리 후, 파지 표면을 PBS 와 약 0.1%(v/v) 트윈 20으로 3 내지 5 회 세척한 후,　100 mM 트리에탄올아민을 사용하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 E. coli ER2537 세포(New England Biolabs., USA) 내로 감염시키고 증폭시킨 뒤 수득하여 다음 단계인 스크리닝에 사용하기 위하여 준비하였다. 이러한 과정을 상기 VEGF-C 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 3회 반복 실시 후에, 하기 기재한 바와 같이 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 친화 검정(하기 실시예 2 참조)을 사용하여 측정한 인간 VEGF-C(Accession # P49767)를 인식하는 약 600개의 특정한 VEGF-C-결합 scFv 클론을 확인하였다.

실시예 2. 항- VEGF -C 항체 생산 클론　선별 및 항체 정제

ELISA 포맷을 이용하여 VEGF-C와의 결합능에 기초하여, 상기 실시예 1에서 얻어진 약 600개의 VEGF-C-결합 scFv 클론들로부터 항-VEGF-C 항체를 생산하는 20 개의 클론들을　선별하였다. 구체적으로, VEGF-C에 결합하고 VEGF-C와 VEGR-R3와의 결합을 억제할 수 있는 클론 중에서 ELISA OD 가 높은 클론들을 선별하였다. 그런 다음, 각각의 클론들을 OD 600=1.0 수준까지 ampicillin 이 첨가된 SB Media(BD Bioscience)에서 배양하여 1 mM IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 주입 후 주변 세포질(periplasm) 분획을 모아 NI-NTA 칼럼(QIAGEN)을 이용하여 scFv 형태의 항-VEGF-C 단클론항체를 부분 정제하였다.

실시예 3. scFv 형태의 항 VEGF -C 항체를 이용한 VEGF -C: VEGR - R3 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )

상기 실시예 2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체의 VEGF-C:VEGR-R3결합 저해 효능을 알아보기 위하여, 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 2　ug/ul의　인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hVEGR-R3-Fc(R&D Systems. Accession No.P35916)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

VEGF-C:VEGR-R3 neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 200 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hVEGF-C(Accession # P49767)와 함께 상기 hVEGR-R3-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul(microliter)의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온 ℃에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50 ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 VEGF-C:VEGR-R3의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 2에 나타내었다.

항체 명칭	VEGF-C:VEGR-R3 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	33.36

상기 표 2에서와 같이,　항-VEGF-C 항체가 VEGF-C와 VEGR-R3 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. hVEGF -C와의 결합 ELISA

상기 실시예 2에서 정제된 항체의 항원에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 1　ug/ml의　인간 VEGF-C (R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine Serum Albumin)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 실시예 2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다.

그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-HA(HA-probe Antibody (F-7) HRP conjugated)　항체 (Santacruz)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:1,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고, 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 인간 VEGF-C 단백질에 대한 50% 결합　농도(Kd)를 구함으로써 항-VEGF-C 항체의 상기 단백질에 대한 결합력 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다:

항체 명칭	인간 VEGF-C (Kd, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	26.2

실시예 　5. 항- VEGF -C 인간　항체 유전자 클로닝

상기 실시예 2의 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열을　증폭시켰다 (PC3X Reverse primer: 5'-AAC CAT CGA TAG CAG CAC CG-3', PC3X Forward primer: 5'-GCA CGA CAG GTT TCC CGA C-3'):

PCR 조건

94℃에서 5분간;

[94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 30　사이클;

72℃에서 6분간;

4℃로 냉각.

각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)으로 세정하였다.

상기 확보된 PCR 결과물들을 클로닝한 후 공시된 방법으로 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였다. 그 결과 표 4과 5에 나타난 CDR 및 서열번호 7 (중쇄 가변 영역) 및 서열번호 8 (경쇄 가변 영역)의 아미노산 서열들을 확보할 수 있었다.

중쇄 아미노산 서열
항체명칭	CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SAIT-VEGFC-AB-4A2	SYDMS (서열번호1)	AISYDNGSTYYADSVKG (서열번호2)	ARDPYLARLNTFDY (서열번호3)

경쇄 아미노산 서열
항체명칭	CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
SAIT-VEGFC-AB-4A2	SGSSSNIGSNNVS (서열번호4)	YNSHRPS (서열번호5)	ATWDSSLNG (서열번호6)

실시예 6. 완전　항체의 발현 및 정제

상기 실시예 5에서 얻어진 중쇄 가변 영역 (서열번호 7)을 암호화 하는 염기서열 (서열번호 9)와 경쇄 가변 영역(서열번호 8)을 암호화하는 염기서열 (서열번호 10)을 각각 서로 다른 벡터에 클로닝시켰다.

중쇄 가변 영역은 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter)를 가지고 있으며 인간 IgG1의 불변 영역(constant region)과 Fc 영역을 포함하는 벡터 pOPTI-VAC (Invitrogen)에 클로닝하였다. 경쇄 가변 영역은 CMV 프로모터를 가지고 있으며, 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하는 벡터 pFUSE2-CLIg-hl2 (Invivogen)에 클로닝을 하였다.

구체적으로, 상기 중쇄 가변 영역과 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)와 NheI(neb)의 제한효소(restriction enzyme)를 처리하고, 경쇄 가변 영역과 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)과 avrII(neb)의 제한 효소를 처리한 후, T4 DNA Ligase(New England Biolab)로 라이게이션(ligation)을 시켜 원하는 가변영역이 포함된 항체 발현용 중쇄 벡터와 경쇄 벡터를 제조하였다.

이렇게 하여 얻어진 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 293-F　세포(invitrogen)에 같이 트랜스펙션(transfection)시켰다. 상기 세포를 혈청(serum)을 넣지 않은 293-f expression medium (Invitrogen)배지에서 배양시키면서 5 일째 되는 날 배양액을 회수 하였다. 상기　배양을 통해 얻어진 배양액은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 가변영역을 갖는 중쇄와 경쇄로 구성된 항체를 포함하였다. 상기 발현된 항체가 함유된 배양액을 1000xg 속도로 10 분간 원심분리하여 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거한 후, 항체 Fc 영역과 강한 친화력을 갖는 Protein A(GE-Healthcare)를　이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 low PH elution을 통해 IgG 형태의 항 VEGF-C 항체를 정제하였다.

실시예 7. IgG 형태의 항 VEGF -C 항체를 이용한 VEGF -C: Tie -2 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )

상기 실시예 6에서 정제된 IgG 형태의 항-VEGF-C 항체의 VEGF-C:VEGR-R3결합 저해 효능을 알아보기 위하여, 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다.

96-웰의 MaxiSorp^TM flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 2 ug/ul의 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hVEGFR3-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

VEGF-R3:VEGF-C neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 6에서 정제된 IgG 형태의 항-VEGF-C 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 200 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 VEGF-C와 함께 상기 hVEGFR3-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 　그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG 항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul의 양으로 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 　 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 μl의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 VEGF-C:VEGF-R3의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 6에 나타내었다.

항체 명칭	VEGF-C:VEGF-R3 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	9.2

상기 표 6에서와 같이,　항-VEGF-C 항체가 VEGF-C와 VEGF-R3 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.

　 실시예 8. IgG 형태 항 VEGF -C 항체의 세포 증식( cell proliferation ) 저해 효과

혈관 및 림프관 내피세포의 증식의 측정은 Cell counting kit-8 (Dojindo Molecular Technology)를 이용하여 분석을 수행하였다. P5-P7의 림프관 내피세포(HLEC; ATCC)를 Collagen coated 96 well plate (BD Bioscience)에 3000~5000 cells /well로 넣은 뒤 배양하였다. 1ug/ml VEGF-C(P49767)를 EBM-2 (Lonza)에 혼합하여 준비한 뒤, 상기 혼합물의 일부에 상기 실시예 6에서 정제된 IgG 형태의 항 VEGF-C 항체를 넣어주었다. 96-웰 플레이트의 배양액 제거 후 PBS로 세척한 뒤, VEGF-C 및 항 VEGF-C 항체가 혼합된 배지를 첨가한 뒤, 3일간 배양하였다. 세포증식 분석을 위하여 10ul의 CCK-8 solution (Dojindo)을 첨가하여 1시간동안 배양한 뒤, Microplate reader (Perkin Elmer)기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 　

상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 림프관 내피세포에서VEGF-C에 의한 세포증식 효과가 항 VEGF-C 항체에 의해 저해됨을 확인하였다.

　 실시예 9. IgG 형태 항 VEGF -C 항체의 세포이동( cell Migration ) 저해 효과

혈관 및 림프관 내피세포의 이동성의 측정은 GE Healthcare의 xCelligence RTCA (Realtime cell analyzer)를 이용하여 측정하였다. RTCA는 realtime으로 impedance를 측정함으로써 세포의 변화를 확인할 수 있는 non-invasive한 cell monitoring system이다. Cell migration assay 수행을 위해 lower chamber와 upper chamber로 구성된 CIM-plate16 (GE Healthcare)을 사용하는데, upper chamber에 impedance를 측정하는 미세전극이 배열되어 있어 chamber에 seeding된 세포가 미세구멍을 통해 이동하면 미세 전극에 부착되어 세포의 이동 정도를 확인할 수 있고, 이를 migration index로 나타내었다. EGM-2 배지 (Lonza)에서 자란 혈관내피세포 (EC; ATCC)와 림프관 내피세포(LEC; Lonza)를 1% FBS가 첨가된 EBM 배지에서 6시간 동안 배양하였다. CIM-plate16의 lower chamber 각 well에 2% FBS가 첨가된 EBM 배지에 1 ug/ml VEGF-C와 10 또는 20 ug/ml VEGF-C 항체를 넣은 뒤 fibronectin (Sigma) coating된 upper chamber와 assembly 하였다. Upper chamber에 serum free EBM 배지를 30 ul 씩 넣어준 뒤, plate와 배지간의 equilibration을 위해 1시간 동안 incubator에 두고 CIM-plate를 incubator내의 device station에 장착한 후 background value 측정하였다. Serum-free media로 resuspension된 림프관 내피세포를 60,000 cells/well의 양으로 seeding하고, 15분간 settle down하도록 방치한 뒤, device에 장착하여 세포 이동을 실시간으로 측정하였다. 세포 이동 정도는 Slope (1/hr) 로 나타내었다.

상기 얻어진 결과를 도 2 (EC) 및 도 3 (LEC)에 나타내었다. 도 2 및 도3에서 보는 것과 같이, VEGF-C에 의하여 증가된 혈관 및 림프관 내피세포의 이동이 VEGF-C 항체에 의하여 억제됨을 확인하였다.

실시예 10. 표면 플라즈몬 공명( Surface Plasmon Resonance , SPR ) 방식을 이용한 항원 친화도 ( Kd values ) 측정

항 VEGF-C 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.

25 ug/ml 농도의anti-human Fc 항체를 pH 5.0 sodium acetate 용액과 amine coupling kit (GE Healthcare)를 이용하여 CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 여기에 상기 실시예 2에서 얻어진 항 VEGF-C 항체를 2 ug/ml 농도로 capture 시킨 후, 재조합 VEGF-C 단백질 (R&D Systems)을 HBS-P 용액을 이용하여 200 nM 농도로부터 순차적으로 희석시켜 흘려 보내는 방식으로 항체와의 결합(on) 및 해리(off)시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 하기 표 7에 나타내었다:

항체 명칭	온 레이트(On rate) (1/Ms)	오프 레이트(Off Rate) (1/s)	친화도(Affinity) (Kd, M)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	7.454x10⁶	0.002575	3.454x10^-10

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Polypeptide specifically binding to VEGF-C and use thereof <130> DPP20132763KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H1 of an anti-Ang2 antibody <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H2 of an anti-Ang2 antibody <400> 2 Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H3 of an anti-Ang2 antibody <400> 3 Ala Arg Asp Pro Tyr Leu Ala Arg Leu Asn Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L1 of an anti-Ang2 antibody <400> 4 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L2 of an anti-Ang2 antibody <400> 5 Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L3 of an anti-Ang2 antibody <400> 6 Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a heavy chain variable region of an anti-Ang2 antibody <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Leu Ala Arg Leu Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a light chain variable region of an anti-Ang2 antibody <400> 8 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asn Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 <210> 9 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding the pokypeptide of SEQ ID NO: 7 <400> 9 gaagtccagc tgctagaatc tggggggggc ctggtccagc ctggtggatc tctcagatta 60 tcctgtgccg caagcggatt caccttctca tcttacgaca tgagttgggt gaggcaagcc 120 ccaggcaagg gcttggagtg ggtgagcgcg atctcctacg acaatggtag tacttactat 180 gccgattccg ttaaaggccg ctttacgatt agtagagata acagcaagaa tacactgtat 240 ttgcagatga actccctgag agcagaggat actgctgtgt actattgcgc cagagacccc 300 tatctggctc ggctgaatac ctttgactac tggggacagg ggacacttgt gaccgtatca 360 agc 363 <210> 10 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding the pokypeptide of SEQ ID NO: 8 <400> 10 cagagtgtcc ttacccagcc cccatcagcc tccggtacgc ctggccagag agtgactata 60 agctgctctg gatcctcctc caatatcgga agcaacaacg tttcttggta ccagcaactg 120 cctggcacag cacctaagct gctcatttac tataattctc acagacccag cggggtgcca 180 gacagatttt ctggctcaaa gtcgggtacc tcagccagtc tggcaatcag cgggctgaga 240 tcagaggatg aagctgatta ttattgtgct acctgggaca gcagtctgaa tggctacgtg 300 ttcggcgggg gaacaaaatt gactgtccta ggc 333

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 서열번호 7, 서열번호 8 또는 이들의 조합을 포함하는, 폴리펩타이드.
서열번호 1 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 폴리펩타이드; 또는
서열번호 7의 폴리펩타이드, 서열번호 8의 폴리펩타이드, 또는 이들의 조합
을을 포함하는 VEGF-C에 대한 길항제.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는, 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는, 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제4항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제3항의 VEGF-C에 대한 길항제, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 암침윤 또는 암침습, 안구 질환, 염증성 질환, 및 말라리아로 이루어진 군에서 선택된 것인, VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항의 VEGF-C에 대한 길항제, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, VEGF-C 검출용 조성물.
제3항의 VEGF-C에 대한 길항제, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물.
제10항에 있어서, 상기 VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 암침윤 또는 암침습, 안구 질환, 염증성 질환, 및 말라리아로 이루어진 군에서 선택된 것인, VEGF-C 활성화 또는 과발현과 관련된 질병의 진단용 약학 조성물.