KR20100059374A - Ｖｅｇｆ―특이적인 인간항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VEGF(Vascular endothelial growth factor)-특이적인 인간항체에 관한 것으로, 구체적으로 VEGF에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유도된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)과 프레임 워크 영역(framework region, FR)으로 구성된 인간 항체에 관한 것이다. 본 발명의 VEGF에 특이적인 인간 항체는 상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
VEGF, 인간항체, 암, 신생혈관 생성과 관련된 질환, 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 건선

Description

ＶＥＧＦ―특이적인 인간항체{VEGF―specific human antibody}
본 발명은 VEGF(Vascular endothelial growth factor)-특이적인 인간항체에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis) 생성은 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정을 말하며, 이러한 과정이 종양의 성장 및 전이에 중요하게 연관되었다고 알려지면서, 혈관신생형성 제어 의약품의 개발에 많은 관심이 고조되고 있다(Ferrara N, Nat Rev Cancer 2;795-803, 2002). VEGF(Vascular endothelial growth factor)는 혈관신생 촉진인자로서, 내피세포의 이동 및 증식 등에 관여하고(Jain RK, Nat Med 9;685-693, 2003), 혈관 내피세포막에 존재하는 VEGFR(VEGF receptor)의 활성화를 통해 작용한다고 알려져 있다(Gille H et al., J Biol Chem 276;3222-3230, 2001; Meyer M et al., Embo J 18;363-374, 1999).
VEGF는 발생과정의 혈관형성(vasculogenesis)과 혈관신생 및 종양 혈관신생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Ferrara N, Nat Rev Cancer 2;795- 803, 2002; Ferrara N et al., Nat Rev Drug Discov. 3:391-400, 2004; Klagsbrun M & D'Amore PA, Cytokine Growth Factor Rev. 7:259-270, 1996; Ferrara N et al., Nat Med. 9:669-676, 2003; Ferrara N & Henzel WJ, Biochem Biophys Res Commun. 161:851-858, 1989), 1989년에 Dr. N. Ferrara 그룹에 의해 VEGF 단백질이 분리 및 정제되었고 cDNA가 클로닝 되었는데(Leung DW et al., Science 246:1306-1309, 1989; Keck PJ et al., Science 246:1309-1312, 1989), 혈관 누출(vascular leakage)을 유도하는 VPF(Vascular Permeability Factor)와 동일한 단백질로 밝혀졌다(Tischer E et al., J. Biol. Chem. 266:11947-11954, 1991). VEGF 패밀리에 속하는 구성원으로는 현재까지 대표적으로 VEGF, PIGF(placenta growth factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D가 알려져 있다(Matsumoto T & Claesson-Welsh L, Sci STKE. 2001:RE21, 2001). VEGF-A라고도 부르는 VEGF는 약 45 kD의 동종 이중체 당단백질(homodimeric glycoprotein)로서, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 대표적으로 VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206 등의 아형들이 존재한다(Ferrara N & Henzel WJ, Biochem Biophys Res Commun. 161:851-858, 1989; Park JE et al., J Biol Chem. 269:25646-25654, 1994). 이 중, VEGF165가 가장 흔한 형태이며, 헤파린(heparin_에 결합하는 능력에의해 세포표면 및 세포외 기질에 부분적으로 머물러 있다. VEGF 는 VEGFR1(Flt-1)과 VEGFR2(KDR/Flk-1)에 각각 고친화도로 결합하지만, 주로 VEGFR2를 통해 VEGF 신호가 전달됨으로써 혈관내피세포의 증식과 이동, 혈관신생, 혈관 투과성(vascular permeability)이 유도되는 것으로 알려져 있다. 따라서 VEGFR2가 항-VEGF 치료의 주된 표적으로 간주되고 있다(Zeng H et al., J Biol Chem. 276:26969-26967, 2001). VEGFR1은 발생과정에서 VEGF와 VEGFR2의 결합을 막는 디코이 수용체(decoy receptor) 역할을 하거나 직접적으로 VEGFR2의 세포 내 신호를 억제하는 역할을 하는 것으로 보고된 바 있으며, VEGFR1이 조혈모세포의 생존을 유도함으로써 조혈작용에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났고 단핵백혈구(monocyte)의 활성 및 이동(migration)에 관여하는 것으로 보고되었다(Gerber HP et al., Nature 417:954-958, 2002; Hattori K et al., Nat Med. 8:841-849, 2002; Barleon B et al., Blood 87:3336-3343, 1996). VEGF는 발생과정의 혈관형성 및 혈관신생에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Soker S et al., J Cell Biochem.85:357-368, 2002), 녹아웃 마우스(Knockout mouse) 실험에서 VEGF 또는 VEGFR들을 각각 불활성화(inactivation )시킨 경우, 모두 초기 단계의 혈관형성에 결함이 생기고 태아사망(embryonic lethal)하며, VEGF 유전자의 1 대립유전자만을 불활성화한 경우, 혈관형성에 결함이 나타났다(Ferrara N et al., Nature 380:439-442, 1996; Carmeliet P et al., Nature 380:435-439,1996). VEGFR2의 녹아웃 마우스는 조혈세포 및 혈관내피세포의 분화와 발달에 결함이 나타난 반면(Shalaby F et al., Nature 376:62-66, 1995), VEGFR1의 경우, 정상적인 혈관내피세포의 분화는 관찰되었으나 혈관형성에 결함을 보였고(Fong GH et al., Nature 376:66-69, 1995, VEGFR3의 녹아웃 마우스는 혈관형성과 혈관신생이 일어난 반면, 심혈관이 비정상적으로 생성됨으로써, 발생과정의 심장혈관계통(cardiovascular system) 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(Dumont DJ et al., Science 282:946-949, 1998).
Dr. L. Ellis 그룹에 의해, VEGFR1이 혈관내피세포 외에 대장암, 췌장암 세포에도 과발현되어 직접적으로 종양 진행, 전이(metastasis)에 관여하는 것으로 보고되고 있어, VEGFR1은 혈관신생, 종양의 성장과 전이, 염증 등에서 중요한 역할을 하는 것으로 간주되고 있다(Wey JS et al., Cancer 104:427-438, 2005; Fan F et al., Oncogene 24:2647-2653, 2005). VEGF-C, VEGF-D는 림프관내피세포(lymphatic endothelial cell)에 존재하는 VEGFR3(Flt-4)에 결합함으로써 림프관신생을 유도하며 종양의 림프관 전이(lymphatic metastasis)를 일으키는 것으로 보고되고 있으며(Jeltsch M et al., Science 276:1423-1425, 1997; Skobe M et al., Nat Med. 7:192-198, 2001), 그 외 신경세포 수용체로 알려진 뉴로필린-1(neuropilin-1)이 혈관내피세포 및 종양세포에서 발현하면서 VEGF165 아형과 결합하는데, VEGF-VEGFR2 결합을 증가시키는 일종의 공동 수용체(co-receptor)로서 작용하는 것으로 알려져 있다(Stacker SA et al., Nat Med. 7:186-191, 2001; Soker S et al., Cell 92:735-745, 1998). VEGF는 종양 혈관신생에 있어 가장 중요한 인자 중 하나로서, 신장암(Tomisawa M et al., Eur J Cancer 35:133-137, 1999), 폐암(Volm M et al., Int J Cancer 74:64-68, 1997), 유방암(Yoshiji H et al., Cancer Res. 56:2013-2016, 1996), 난소암(Sowter HM et al., Lab Invest. 77:607-614, 1997)등 대부분의 종양 조직에서 발현되는데 종양세포뿐만 아니라 종양기질세포(tumorstromal cell)에서도 분비된다. VEGF 발현은 Ras와 같은 암유전자(oncogene)에 의해 증가 되고, VHL(von Hippel-Landau)과 같은 종양 억제자에 의해 감소된다(Okada F et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 95:3609-3614, 1998; Iliopoulos O et al., Proc Natl Acad Sci U SA. 93:10595-10599, 1996; Mole DR et al., IUBMB Life. 52:43-47, 2001). 종양의 성장을 저해하기 위해 VEGF 길항제(antagonist)를 이용한 시도로서 마우스 항-인간 VEGF 단일클론항체는 실험관에서 종양세포의 성장에는 별 영향을 미치지 않은 반면, 암(cancer) 동물모델에서 종양 혈관신생 및 종양성장을 뚜렷하게 저해하는 효과를 보여주었다(Kim KJ et al., Nature 362: 841-844, 1993; Borgstrom P et al., Cancer Res. 56:4032-4039, 1996).
VEGF가 실제로 종양 이외에 많은 질병과도 관련성이 높다는 사실은 많은 보고와 논문에서도 알려져 있으며, 이에 대한 치료제 개발 또한 다각도로 시도되어오고 있다. 대표적인 예로, 신생혈관 생성과 관련된 질환인 류머티즘성 관절염(RA; rheumatoid arthritis), 당뇨병(diabetes)성 망막증, 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy) 및 건선(psoriasis) 등이 있는데, VEGF가 이러한 질병에 중요한 요인으로 작용함이 밝혀지고 있다. RA의 경우 대조군의 환자들에 비하여 RA환자들의 혈청 VEGF의 양이 상승되어 있고, 혈청 VEGF의 양이 관절 손상(joint damage) 양과 상관관계가 있음이 또한 방사선 연구 결과로 보였으며(Paleolog E, Arthritis Res. 4: S81-90, 2002), VEGF 수용체 Flt-1, KDR 및 NRP-1과 함께 VEGF121과 VEGF165등이 RA 활액(synovial fluid)에서 발현되며, 이들 모두 대조군의 환자들에 비해 RA환자들에서 상승됨이 확인되었다(Ikeda M et al., J Pathol. 191:426-33, 2000). 또 한, 당뇨병 환자들에게서 혈장 VEGF가 상승되는데, 상승된 혈당이 내피에 독성 영향을 끼쳐 고혈당성 불완전 저산소 상태(hyperglycemic pseudo-hypoxic state)를 유도하고, 이는 VEGF 생성을 유도하여, 이러한 상승된 혈장 VEGF 양이 당뇨병에서 내피손상(endothelial damage)과 장애(dysfunction)와의 상관관계가 있음을 보여주고 있다(Lim HS et al., Diabetes Care 27: 2918-24; 2004). 망막(retina)에서 VEGF의 과도한 분비는 안내신생혈관(ocular neovascularisation), 혈종(Hemorrhages)을 야기하여, 혈관 투과성을 유도하여 그 결과 시각장애/맹목(visual impairment/blindness)이 된다. 증식당뇨망막병증(PDR: proliferative diabetic retinopathy)과 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema)과 관련된 시력 상실(visual loss)을 방지하고 레이저 치료와 같은 파괴적인 치료(destructive treatments)와 관련된 부작용을 피하기 위한 노력에서, 연구들이 비정상적인 혈관 성장(vessel growth)과 망막의 혈관 누출을 개시한다고 생각되어지는 성장인자를 차단하는데 초점을 두고 있다. 이에 대한, 하나의 접근은 VEGF의 모든 아형에 선택적으로 결합하는 인간화된 단일클론 항-VEGF 항체 단편를 포함하며, 따라서 VEGF의 작용을 억제한다. Genentech 사에 의해 생산된, rhuFab V2라 불리는 이 화합물은 현재 임상연구중이며, PDR 또는 당뇨병성 황반 부종(macular edema)을 방지하는데 효과를 보이고 있다(Heier JS, Program and abstracts of the American Academy of Ophthalmology 2002 Annual Meeting; October 20-23, Orlando, Florida).
현재 40 종 이상의 다양한 혈관신생 억제제들이 다양한 종류의 종양에 대해 임상개발이 진행되고 있다. VEGF 및 VEGF 수용체는 가장 대표적인 표적으로서, 활 성, 신호전달, 생산을 저해하는 약제 들이 포함된다. VEGF 저해제로 항체, 수용성 VEGF 수용체(VEGF trap) 등이 있다. 종양 치료제로서의 혈관신생 억제제로는 인간화 항-VEGF 단일클론항체인 베바시주맙(bevacizumab; Avastin™, Genentech)이 대규모의 임상시험에서 전이성대장암 환자들의 생명연장의 효과를 나타남으로써 2004년 2월 FDA 승인을 받았으며, 1989년 VEGF를 최초로 발견하고 그 기능을 규명한 Dr. N. Ferrara 에 의해 실제 개발되었고 FDA 승인으로까지 이어졌음은 주목할 만하다. 베바시주맙은 괄목할만한 매출액을 기록함으로써 제약업계의 대히트작으로서의 입지를 구축하고 있으며, 현재 다양한 종류의 종양에 대해 임상시험이 계속 진행 중이다. 그 뒤를 이어, VEGFR2의 저분자(small molecule) 저해제 다수가 임상시험 중이다. VEGFR2를 저해하는 완전히 인간 단일클론 항체(fully human monoclonal antibody)인 IMC-1121B(ImClone Systems) 는 임상 진행 중이다.
따라서 이러한 항-VEGF 인간 단일클론 항체의 개발은 신생혈관의 치료를 비롯한 이와 관련된 다양한 질환의 치료를 위한 유망한 후보물질로서 부작용을 극소화시켜 임상 및 전임상에 이용할 수 있는 장점을 가지고 있으며, 이를 이용한 다방면의 치료제 개발이 주목받고 있음은 당연하다.
이에, 본 발명자들은 이에, 본 발명자들은 VEGF에 특이적으로 결합하는 14종의 인간 항체를 선별하고, 상기 인간 항체가 기존의 인간화 항-VEGF 단일클론항체인 아바스틴과 유사한 수준의 결합능 및 중화능을 가지고, 마우스 VEGF와 교차반응성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명의 인간 항체가 VEGF가 과발현 질환의 치료 에 효과적으로 이용될 수 있음을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 중쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 경쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체를 포함하는, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편의 진단적 유효량을 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 VEGF가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생체내 VEGF가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 VEGF가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 VEGF가 과발현되는 암 치료의 예후 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은은 상기 인간 항체를 동물실험 모델에 투여하는 단계를 포함하는 상기 인간 항체의 부작용을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 5 내지 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 18 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 31 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 57 내지 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 70 내지 82로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 83 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발 현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 VEGF가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 VEGF가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 VEGF가 과발현되는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 인간 항체를 VEGF를 과발현하는 질환에 걸린 동물실험 모델에 투여하는 단계를 포함하는 상기 인간 항체의 부작용을 측정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"가변영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.
"상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
"패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 5 내지 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 18 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 31 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 57 내지 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 70 내지 82로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 83 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 44 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 94 내지 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편 을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명에서는 VEGF에 대한 인간 항체를 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 scFv 형태로 수득하였으며, 단일 파지 클론(mono phage clone) 형태로 스크리닝(screening)함으로써 VEGF에 특이적인 14종의 단일 클론 파아지(monoclone phage)를 수득하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 VEGF(도 1 내지 도 4 참조)를 단일클론 항체의 제조에 이용하였다. 상기 VEGF를 다양성을 가진 인간 유 래 scFv 라이브러리 세포(human naive scFv library cell)로부터 제조한 라이브러리 파지와 반응하여 패닝(panning)시킨 후, VEGF 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스크리닝(screening)하였다(표 1, 2 및 도 5 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 핑거프린팅(fingerprinting)으로 확인한 후(도 6 참조), 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다(표 5 및 도 7, 8 참조). 상기 항체와 생식 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인한 결과(표 6 참조), 14종의 VEGF에 특이적인 파아지 항체를 얻었다. 상기 선별된 단일 클론 항체는 G12> D12> E9> F6> H7> C5> B12> G9> F9> C11> F2> A4> C9> C12의 순으로 VEGF에 대한 결합능을 나타내었고(도 9a 및 도 9b 참조), VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성(capillary-like tube formation)을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 아바스틴과 비슷한 중화능을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF에 대해 인간 VEGF만큼의 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11 참조). 아바스틴은 마우스 VEGF에 대해 전혀 교차반응하지 않으므로, 상기 아바스틴에 의한 부작용을 위한 동물실험연구가 어려운 것으로 알려졌는데, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체는 마우스와 교차반응하므로, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌고, 본 발명의 VEGF 중화 인간항체는 마우스 VEGF에 대해 높은 교차반응을 나타내므로, 동물실험 연구에 용이할 것이다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 VEGF를 이용하여, VEGF 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스크리닝(screening)하였다(표 1, 2 및 도 5 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 핑거프린팅으로 확인한 후(도 6 참조), 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다(표 5 및 도 7, 8 참조). 상기 항체와 생식 계열 항체군의 유사성을 확인한 결과(표 6 참조), 15종의 VEGF에 특이적인 파아지 항체를 얻었다. 상기 선별된 단일 클론 항체의 VEGF에 대한 결합능을 측정하였고(도 9a 및 도 9b 참조), VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 아바스틴과 비슷한 중화능을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF와 인간 VEGF에 대해 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11 참조). 아바스틴은 마우스 VEGF에 대해 전혀 교차반응하지 않으므로, 상기 아바스틴에 의한 부작용을 위한 동물실험연구가 어려운 것으로 알려 졌는데, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체는 마우스와 교차반응하므로, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌고, 본 발명의 VEGF 중화 인간항체는 마우스 VEGF에 대해 높은 교차반응을 나타내므로, 동물실험 연구에 용이할 것이다.
본 발명의 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
상기 발현벡터의 제작 시에는, 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다. 상기 인간 항체를 수득하여, VEGF에 대한 결합능(도 9a 및 도 9b 참조), 중화능(도 10 참조) 및 마우스 및 인간 VEGF에 대한 교차반응성(표 8 및 도 11 참조)을 확인하였다.
본 발명에 따른 상기 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 자가 또는 동종 이계 동물 세포에 도입하여 제조된 형질전환체는 개체에 투여되어 암을 치료하는 세포치료 등에 이용될 수도 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법 은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 VEGF에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 인간 항체를 정제하는 단계를 포함하는 VEGF 에 특이적인 인간 항체의 제조방법을 제공한다.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 항체 정제 방법은 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다. 상기 인간 항체를 수득하여, VEGF에 대한 결합능(도 9a 및 도 9b 참조), 중화능(도 10 참조) 및 마우스 및 인간 VEGF에 대한 교차반응성(표 8 및 도 11 참조)을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환이다. 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다. 또한, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환에는 류머티즘성 관절염(RA; rheumatoid arthritis), 당뇨병(diabetes)성 망막증, 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 건선(psoriasis), 증식당뇨망막병증(PDR: proliferative diabetic retinopathy) 및 당뇨병성황반부종(diabetic macular edema) 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, VEGF에 대한 결합능을 나타낸(도 9a 및 도 9b 참조) VEGF 단일클론 항체는 인간 제대정맥 내피세포주에서, VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성(capillary-like tube formation)을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 아바스틴과 비슷한 중화능을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF에 대해 인간 VEGF만큼의 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11 참조). 아바스틴은 마우스 VEGF에 대해 전혀 교차반응하지 않으므로, 상기 아바스틴에 의한 부작용을 위한 동물실험연구가 어려운 것으로 알려졌는데, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체는 마우스와 교차반응하므로, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌고, 본 발명의 VEGF 중화 인간항체는 마우스 VEGF에 대해 높은 교차반응을 나타내므로, 동물실험 연구에 용이할 것이다. 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현된 질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 VEGF에 특이적인 인간 항체 또는 상기 형질전환체를 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위해서 상기에 기재된 유효성분 이외에 추가로 약제학적 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 아울러, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 약학적 조성물은 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 약학적 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 약학적 조성물의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할 수록 본 발명의 약학적 조성물을 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환이다. 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다. 또한, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환에는 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증과 당뇨병성황반부 등이 있다.
바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다. 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환이다. 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다. 또한, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환에는 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증과 당뇨병성황반부 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, VEGF에 대한 결합능을 나타낸(도 9a 및 도 9b 참조) VEGF 단일클론 항체는 인간 제대정맥 내피세포주에서, VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성(capillary-like tube formation)을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 아바스틴과 비슷한 중화능 을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF에 대해 인간 VEGF만큼의 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11 참조). 아바스틴은 마우스 VEGF에 대해 전혀 교차반응하지 않으므로, 상기 아바스틴에 의한 부작용을 위한 동물실험연구가 어려운 것으로 알려졌는데, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체는 마우스와 교차반응하므로, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌고, 본 발명의 VEGF 중화 인간항체는 마우스 VEGF에 대해 높은 교차반응을 나타내므로, 동물실험 연구에 용이할 것이다. 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현된 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명이 적용가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
본 발명의 인간 항체의 투여방법은 사용목적에 따라 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 등에 투여하는 방법)로 할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여가 바람직하다. 경우에 따라 고형암에 대한 투여에서는 항체의 접근을 빠르고 용이하게 하기 위하여 국부적인 투여가 바람직할 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 5 내지 500 ㎎/m2의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료 하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 암환자의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 검출용 조성물을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환이다. 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다. 또한, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환에는 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증과 당뇨병성황반부 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 VEGF 항체는 VEGF에 대한 높은 결합능을 나타내는 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된다. 바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 VEGF가 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 VEGF 항체는 VEGF에 대한 높은 결합능을 나타내는 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현되는 암의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출용 조성물은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
또한, 암세포는 상기 검출용 조성물과 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 VEGF가 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 단일클론 VEGF 항체는 VEGF에 대한 높은 결합능을 나타내는 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b 참조). 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현되는 암의 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수득되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
상기 VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난 소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 VEGF가 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, VEGF에 대한 결합능을 나타낸(도 9a 및 도 9b 참조) VEGF 단일클론 항체는 인간 제대정맥 내피세포주에서, VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성(capillary-like tube formation)을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었다(도 10 참조). 또한, 아바스틴과 비슷한 중화능을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF에 대해 인간 VEGF만큼의 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11 참조). 아바스틴은 마우스 VEGF에 대해 전혀 교차반응하지 않으므로, 상기 아바스틴에 의한 부작용을 위한 동물실험연구가 어려운 것으로 알려졌는데, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체는 마우스와 교차반응하므로, 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌고, 본 발명의 VEGF 중화 인간항체는 마우스 VEGF에 대해 높은 교차반응을 나타내므로, 동물실험 연구에 용이할 것이다. 이에, 본 발명의 단일클론 항체는 VEGF가 과발현되는 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것 으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 인간 항체를 동물실험 모델에 투여하는 단계를 포함하는 상기 인간 항체의 부작용을 측정하는 방법을 제공한다.
상기 동물실험 모델은 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환에 걸린 동물이 바람직하다.
본 발명의 VEGF에 특이적인 인간 항체는 상기 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> VEGF 항원단백질 제조
<1-1> VEGF 유전자 클로닝
<1-1-1> YK602를 사용하여 클로닝
한국생명공학연구원 인간유전체기능연구사업단의 KUGI(Korean UniGene Information)에서 인간 VEGF 유전자를 함유하고 있는 플라스미드(UG-0036-D12)를 분양받았다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하고, 상기 VEGF의 도메인만을 발현시키기 위해서 정방향 프라이머(서열번호 1: 5'-GCTCTAGAGTGATGAACTTTCTGCTGTCTT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 2: 5'-CGGAATTCCCGCCTCGGCTTGTCACA-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, XbaI과 EcoRI으로 처리한 후, 라이게이즈를 이용하여 pcDNA3.1/myc-His(-) 벡터(V80020: Invitrogen, USA)에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 500 ng이 되도록 넣어 주었고, 94℃ 5 분, 95℃ 30 초, 55℃ 30 초, 72℃ 1분 30초로 25 사이클, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
상기 pcDNA3.1-VEGF를 주형 DNA로 하고, 정방향 프라이머(서열번호 3: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGCAGAAGGAGGAGGGCAG-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 4: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAACCGCCTCGGCTTGTCACA-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiI으로 처리한 후, 라이게이즈를 이용하여 pYK602 벡터(도 13a)에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, 94℃ 5 분, 95℃ 30 초, 58℃ 30 초, 72℃ 1분으로 25 사이클, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다. 아울러, 상기 서브클로닝된 pYK602-VEGF 벡터의 염기서열을 확인하였다.
<1-1-2> pYK602-His와 pYK603을 사용하여 클로닝
실시예 1-1-1과 동일한 방법으로 pcDNA3.1-VEGF를 주형으로 하여 pYK602- His(도 13b)와 pYK603 벡터(도 13c)에 VEGF를 서브클로닝 하였다. 아울러, 상기 서브클로닝된 pYK602-His-VEGF와 pYK603-VEGF 벡터의 염기서열을 확인하였다.
<1-2> VEGF 단백질 발현 및 정제
<1-2-1> pYK602를 사용하여 VEGF 발현 확인
먼저 150 ㎜ 디쉬 10장에 5 × 106 293E 세포를 깔아준 후, 다음날 상기 서브클로닝된 pYK602-VEGF 벡터 10 μg을 PEI(23966: Polysciences, Inc, USA)를 처리하여 형질전환하였다. 다음날 성장배지(무혈청 DMEM)로 바꿔준 후 이틀마다 상등액를 얻어 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 1번째부터 7번째까지 계대배양의 상등액 VEGF 20 ㎕가 로딩된 10% SDS-PAGE 젤 2장을 100 V로 2시간 정도 전기영동한 후, NC 막(HATF00010: millipore, 미국)에 85 V로 2시간 동안 전달하였다. 이후, 막을 4% skim milk in TBST로 4℃에서 밤새도록 차단하였다. 이후, 상업적으로 구매한 항-인간 Fc-HRP(0.8 ㎎/㎖; 제품번호 31413:Thermo Sci, USA)를 4% skim milk in TBST에 1:4000으로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응하였다. TBST로 10분에 한 번씩 5번 세척한 후, 현상(12145:Intron, USA)하여 단백질의 발현량을 비교하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 VEGF는 7번째 계대배양까지 발현되며 전반적으로 VEGF의 발현양은 그리 많지 않았고, 2번째 및 3번째에서 발현양이 많았다.
또한, 상기 상등액을 Protein A 컬럼(17-1279-03:GE Healthcare, USA)을 이용하여 1.5 ㎖/분의 속도로 정제한 후, 0.25 ㎎/㎖의 단백질을 얻었고 이를 PBS로 투석한 후, 침전물이 생기는 것을 확인하였다.
이에, 상대적으로 침전이 적게 생성되는 pYK602-His와 pYK603 벡터에 재서브클로닝하였다.
<1-2-2> pYK602-His와 pYK603을 사용하여 VEGF 발현 확인
서브클로닝된 pYK602-His-VEGF와 pYK603-VEGF 벡터를 실시예 1-2-1의 방법으로 형질도입양한 후, 여러 차례 계대배양하면서 상등액를 수득하였다.
pYK602-VEGF, pYK602-His-VEGF 및 pYK603-VEGF 벡터의 1차 및 2차 계대배양 상등액을 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 또한 침전물 생성도 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 pYK602-VEGF와 pYK602-His-VEGF 벡터는 발현양이 비슷하였으며 상대적인 침전물 형성도 적었고,pYK603-VEGF 벡터에서는 상대적으로 이보다 발현양이 적게 나타났다.
이에, 최종적으로 pYK602-His-VEGF 벡터를 이용해 VEGF를 발현시켜 정제하였다.
<1-2-3> pYK602-His-VEGF 벡터 발현 확인
150 ㎜ 디쉬 10장에 5 × 106 293E 세포를 깔아준 후, pYK602-His-VEGF 벡터를 형질도입한 후, 계대배양하면서 1 내지 7차 계대배양의 상등액 300 ㎖를 수득하였다. 상기 상등액을 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 2 및 3차 상등액에서 발현량이 가장 많았다.
<1-2-4> VEGF 단백질 발현 및 정제
상기 2 및 3차 상등액을 50 ㎖로 농축한 후, 300 ㎖의 Ni-NTA 결합 완충용액(Qiagen, 미국)으로 교환한 후, 다시 50 ㎖로 농축하였다. 상기 농축액에 Ni-NTA 비드(1024473, Qiagen, 미국)를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 결합한 후, 세척하고 용리하였다.
상기 용리액을 멤브레인(10K, 132574:SPECTRAPOR, USA)에 넣은 후 ,4℃에서 4L의 PBS용액에 4시간 이상 완충용액을 바꿔준 후, 다시 미리 차게 해둔 4L의 PBS 용액에 넣어 밤새 투석하여 완충용액을 바꿔주었다. 밤새 투석한 다음, e-tube로 옮기고, Bradford 방법으로 단백질 농도를 농도를 측정한 후, 10% SDS-PAGE 젤에서 확인하였다(도 4).
그 결과, 600 ㎍의 VEGF 단백질을 수득하였다.
<실시예 2> 라이브러리 파아지의 제조
다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7 × 1010를 2×YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3 L)에서 37℃에서 2~3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YT CM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.
<실시예 3> 단일 클론 항체의 제조
<3-1> 패닝(Panning) 과정
실시예 1에서 수득한 정제된 VEGF 항원 50 ㎍을 Immunosorb 튜브(Nunc 470319)에 4 ㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]으로 4℃에서 16시간 정도 회전기(rotator)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 동안 PBS에 녹여 skim milk[(BD,232100)-4% in 1XPBS]를 사용하여 면역튜브(immunotube)에서 차단하였다. 면역튜브에 실시예 2에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고 PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균(XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서(2차: 13번, 3차: 23번) 동일한 방법으로 2차 및 3차 패닝을 수행하였다.
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 2차부터 항원에 대한 파아지의 콜로니 역가가 1000배 이상 증폭됨을 확인하였다.
표적 항원 패닝 횟수 초기 파아지수 결합한 파아지수
VEGF 1st 4.2 x 1013 6.0 x 105
2nd 2.6 x 1013 1.3 x 108
3rd 1.4 x 1013 1.9 x 108
<3-2> 파아지 ELISA에 의한 파아지 항체 탐색
<3-2-1> 패닝 결과 확인
1차부터 3차까지 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물(stock)을 5 ㎖의 2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl2 배지에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이때, VEGF와 상관없는 발생과정에 관련 있는 WW45항원에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 실시예대로 제조된 단일 파아지항체(#39)를 대조군으로 이용하였다. 배양 세포를 원심분리한 후(4500 rpm, 15 분, 4℃) 상등액(1차~3차 패닝 poly scFv-파아지)을 새 튜브로 옮겼다. 96웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 VEGF 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 녹인 skim milk(4 %)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 씻어준 다음 1차~3차 패닝 poly scFV-파아지를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-M13-HRP(Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD 정제(Sigmap 8787-TAB)를 PC 완충용액[C6H8O7·H2O(sigma, C0706) 5.1 g, Na2HPO4(sigma, S7907) 7.3 g]에 녹인 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 Spectrophotometer(MolecularDevice, 미국)로 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 VEGF 항원에 대한 결합능이 2차 다클론 scFv-파아지 풀(pools)부터 증강하여 2차에 결합능이 포화상태에 이르렀으며, 태깅된 His에 대한 값은 상대적으로 낮았다.
<3-2-2> 단일 클론 항체 선별
상기 결합능이 큰 다클론 파아지 항체군(3차 패닝)에서 얻은 콜로니를 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지 1 ㎖이 포함된 96-deep 웰 플레이트(바이오니아 90030)에서, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 OD600 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 1 ㎖의 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지에 희석한 다음, 96-deep 웰 플레이트에서 37℃에서 OD600 값이 0.5~0.7 되도록 2~3시간 배양하였다. M1 헬퍼 파아지를 MOI값이 1:20이 되도록 감염시킨 후, 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15 분, 4℃)한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10분, 4℃)하여 상등액을 취해 새 튜브에 옮겨 3차 패닝하여 얻은 단일 클론 scFv-phage를 4℃에서 보관하였다.
이후, 96웰 면역 플레이트에 VEGF 항원을 웰당 100 ng씩을 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 녹인 skim milk(4%)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 세척한 다음 3차 패닝하여 얻은 단일클론 scFv-파아지(each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 씻어준 후 2차 항체인 anti-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 세척한 후에 발색하여 흡광도 490 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 항원 VEGF에 대한 결합능이 1.5 이상인 50개의 단일 파아지 클론들(표 2에서 강조한 것)을 선별하였다.
Figure 112008081584008-PAT00001
<3-3> 단일 클론 파아지 분류 및 검사
<3-3-1> 핑거 프린팅에 의한 검증
1차 선별된 단일 클론 50개 단일 클론 세포 1 ㎕와 Taq.DNA polymerase(젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머(pelB5, 서열번호 125:5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3') 및 역방향 프라이머(cla3, 서열번호 126:5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3') 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. PCR 프로그램의 조건은 하기 표 3과 같다.
온도 시간 사이클(cycle)
95℃ 5 min
95℃ 30 sec 30 사이클
56℃ 30 sec
72℃ 1 min
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상기 콜로니 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(Seakem LE, CAMERES 50004)에서 확인하였고, BstNI(Roche11288075001, 10 U/㎕) 0.2 ㎕를 가하여 37℃에서 2~3시간 반응하였다. 반응 조건은 하기 표 4와 같다. 상기 절단된 산물을 8% DNA 폴리아크릴 아마이드 겔에서 확인하였다.
10X Buffer 3 ㎕
콜로니 PCR 산물 10 ㎕
BstNI(10U/㎕) 0.2 ㎕
증류수 16.8 ㎕
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 대해 다양성이 확인되었다.
<3-3-2> 염기서열 분석에 의한 검증
상기 50 종의 단일 파아지 클론을 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지(5 ㎖)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA 정제 키트(Nuclogen 5112)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 서열번호 125의 pelB5 프라이머를 이용한 서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트, 한국).
그 결과, 표 5 및 도 7 및 도 8에서 나타난 바와 같이 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역을 확인하였다.
이들 항체와 생식세포 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 조사한 결과 14종의 VEGF에 특이적인 파아지 항체를 얻었고 이는 하기 표 6에서 정리하여 제시하였다. 특히, 중쇄의 경우 인간 생식세포 계열서열과 89.9%에서 대략 96%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 89.2%에서 약 97%의 상동성을 보여주었다. 또한, 각각의 인간항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석하였으며, 서로 다른 서열이 다른 것을 확인하였다.
Heavy Chain Light Chain
그룹 클론명 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
1 A4 DYAMH : 서열번호 5 FINEDGGNIYYGDSVKG : 서열번호 18 EPSGSLTFDY : 서열번호 31 RASQTISSYLN : 서열번호 57 AASRLQS : 서열번호 70 QQSYSTPYT : 서열번호 83
2 B12 SYAIS : 서열번호 6 GIIPIFGTANYAQKFQG : 서열번호 19 DRSGYTAMDY : 서열번호 32 RASQGISSYLA : 서열번호 58 AASTLQS : 서열번호 71 QQGHTTPYT : 서열번호 84
3 C11 SDAIS : 서열번호 7 GVIPIFATTTYAQGFQG : 서열번호 20 GQMDRGGGLDP : 서열번호 33 RASQGIGNYLN : 서열번호 59 AASSLQR : 서열번호 72 QQSYTTPYS : 서열번호 85
4 C12 SYGMN : 서열번호 8 SISSSSSSIHYADSVKG : 서열번호 21 LGPYDAFDF : 서열번호 34 PGGTSNIDSKYVH : 서열번호 60 RNDQRPS : 서열번호 73 QSYDTSLSAPYV : 서열번호 86
5 C5 SYSMH : 서열번호 9 GISYDGSSKQFGDSVKG : 서열번호 22 DGVPGHSYGIGMDV : 서열번호 35 RASQGISSWLA : 서열번호 61 AASILQT : 서열번호 74 QQANSFPYT : 서열번호 87
6 C9 SYAMH : 서열번호 10 VISYDGSNKYYADSVKG : 서열번호 23 DVDSWSQGWFPH : 서열번호 36 RASQTISTFVN : 서열번호 62 SASSLQS : 서열번호 75 QQNYSTPLT : 서열번호 88
7 D12 EYAMH : 서열번호 11 LISGDDYNTFYADSVKG : 서열번호 24 DAGPAGGGGLDH : 서열번호 37 RTSQTITNFLN : 서열번호 63 GASSLQS : 서열번호 76 QQSHGTPYT : 서열번호 89
8 E9 TSGVAVG : 서열번호 12 LIYWDNDKRYSPSLKN : 서열번호 25 GDGWLFDF : 서열번호 38 TGSNSNIGAGHDVH : 서열번호 64 GNTNRAS : 서열번호 77 QSYDNSLSGYV : 서열번호 90
9 F2 SYAMS : 서열번호 13 YISSSGHDIYYADPVKG : 서열번호 26 DKLATPGAFDI : 서열번호 39 RASQSISNWLA : 서열번호 65 EASSLES : 서열번호 78 QQSHGTPYT : 서열번호 89
10 F6 TSGVAVG : 서열번호 12 LIYWDNDKRYSPSLKN : 서열번호 25 GDGWLFDF : 서열번호 38 TGSNSNIGAGHDVH : 서열번호 64 GNTNRAS : 서열번호 77 QSYDNSLSGYV : 서열번호 90
11 F9 TTAIT : 서열번호 14 WITPFNGNTFYAQKFQD : 서열번호 27 SQAAELGTGAFDI : 서열번호 40 SGSYSNIGTNYVY : 서열번호 66 KNTQRPS : 서열번호 79 SAWDDSLSAVL : 서열번호 91
12 G12 NYAIS : 서열번호 15 RIIPIYGTPTYAQKFRD : 서열번호 28 ERSFWNWFAP : 서열번호 41 TGSSSNIGAGYDVH : 서열번호 67 GNNNRPS : 서열번호 80 QSYDSRLGVV : 서열번호 92
13 G9 TYALH : 서열번호 16 VISHDGTTDYYRDSVKG : 서열번호 29 DGSGYFFDY : 서열번호 42 TGSSSDVGGYNYVS : 서열번호 68 DVTKRPS : 서열번호 81 SSYSSSTFYV : 서열번호 93
14 H7 KYGMH : 서열번호 17 FIWFDGSNKFYADSVKG : 서열번호 30 DRDYYGSGPLDY : 서열번호 43 RASQRIATYLH : 서열번호 69 AASSLQS : 서열번호 82 QQSYSTPYT : 서열번호 83
Figure 112008081584008-PAT00002
<실시예 4> VEGF에 대한 인간항체의 특성 분석
<4-1> 결합능 측정
VEGF에 대한 실시예 3에서 선별된 14종의 단일클론 파아지 항체들의 결합능을 측정하기 위해, 실시예 3-2의 방법으로 결합능을 각각 측정하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에서 나타난 바와 같이 상기 14종의 단일클론 파아지 항체들의 결합능 순위는 G12> D12> E9> F6> H7> C5> B12> G9> F9> C11> F2> A4> C9> C12이었다.
<4-2> 전체 IgG 변환 분석
VEGF에 대한 단일 클론 파아지 항체들을 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕와 10 pmole/㎕ 표 7의 중쇄 정방향 프라이머와 중쇄 역방향 프라이머, 10X buffer 5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 또한, 경쇄도 표 7의 경쇄 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행하였다.
클론명 Heavy Chain Light Chain
Forward primer
(Sfi I) 		Reverse primer
(NheI) 		Forward primer
(Sfi I) 		Reverse primer
(Bgl II)
A4 NATVH7-1 : 서열번호 107 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGGAGTC NATJH-ALL : 서열번호 114 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVK 1-1 : 서열번호 115 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC
NATJK-R7 : 서열번호 119
 GAGGAGAGATCTTTTGATATCCACCTTGGT
C5 NATVH3-1 : 서열번호 108 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATJK-R1 : 서열번호 120
 GAGGAGAGATCTTTTTGATCTCTACCTTGGT
C11 NATVH1-2 : 서열번호 109 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGCAGTC NATJK-R2 : 서열번호 121
 GAGGAGAGATCTTTTTGATCTCCACTTTGGT
C12 NATVH7-1 : 서열번호 107 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGGAGTC NATVL10 : 서열번호 116 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCTCGTGCTGACTCAGCC NATJL1-R : 서열번호 122
 GAGGAGAGATCTTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC
E9 NATVH2-1 : 서열번호 110 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTCACCTTGAAGGAGTC NATVL2 : 서열번호 117 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCC
F2 NATVH3-2 : 서열번호 111 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATJH-ALL : 서열번호 114 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVK 1-1 : 서열번호 115 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R5 : 서열번호 123
 GAGGAGAGATCTTTTTGATTTCCAGCTTGGT
F6 NATVH2-1 : 서열번호 110 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTCACCTTGAAGGAGTC NATVL2 : 서열번호 117 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCC NATJL1-R : 서열번호 122
 GAGGAGAGATCTTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC
G9 NATVH3-2 : 서열번호 111 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATVL9 : 서열번호 118 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGAATTTTATGCTGACTCAGCC
G12 NATVH1-1 : 서열번호 112 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC NATJH-ALL : 서열번호 114 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVL2 : 서열번호 117 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCCTGTGCTGACTCAGCC NATJL2-R : 서열번호 124
 GAGGAGAGATCTTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC
H7 NATVH7-2 : 서열번호 113 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTAAAGTC NATVK 1-1 : 서열번호 115 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R1 : 서열번호 120
 GAGGAGAGATCTTTTTGATCTCTACCTTGGT
D12 NATVH7-1 : 서열번호 107 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGATGCAGCTGGTGGAGTC NATJK-R5 : 서열번호 123
 GAGGAGAGATCTTTTTGATTTCCAGCTTGGT
C9 NATVH7-3: 서열번호 128 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTAAAGTC NATJH-ALL : 서열번호 114 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVK1-1
서열번호 115		 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R3: 서열번호 129 GAGGAGAGATCTTTTGATCTCCAGTCGTGT
F9 NATVL10
서열번호 116		 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGCTCGTGCTGACTCAGCC NATJL2-R
서열번호 124		 GAGGAGAGATCTTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC
B12 NATVH1-1
서열번호 112		 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC NATVK1-1
서열번호 115		 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R5
서열번호 123		 GAGGAGAGATCTTTTGATTTCCAGCTTGGT
PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트(Qiagen)로 정제한 후, pNATAB H 벡터(도 12a) 1 ㎕(10 ng), 중쇄(100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, Ligase (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Amp 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
또한, 경쇄는 pNATAB L 벡터(도 12b)를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
상기 수득한 DNA의 CMV-proF 프라이머(서열번호 127: AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트).
그 결과, 전체 IgG로 전환한 VEGF에 대한 14개의 클론 파아지의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
<4-3> 전체 IgG의 검증
293E 세포(Invitrogen)에 PEI 40 ㎍과 전체 형태(Whole form) 항체 중쇄 DNA 10 ㎍, 경쇄 DNA 10 ㎍을 넣어 공동-형질감염을 하여 얻은 상등액을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 대조군으로는 정상 인간 IgG(Jackson Lab)을 이용하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 성공적으로 전체 IgG 형태로 전환되었음을 확인하였다.
<4-4> 관형성 억제분석을 통한 항-VEGF 항체들의 중화능 확인
약 80% 컨플루언스(confluence) 상태의 인간 제대정맥 내피세포인 HUVEC 세포(C2517A: Lonza)의 단일세포층(monolayer)을 1% FBS가 첨가된 EBM-2(CC3156, Cambrex) 배지로 교체하고 37℃/5% CO2 배양기에서 4시간 동안 영양고갈(starvation) 상태로 만들었다. 이후에 세포를 트립신으로 모아서 3 × 105/㎖로 영양고갈 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액 100 ㎕와 정제된 본 발명의 인간 VEGF Ab 용액 150 ㎕(VEGF Ab는 스타베이션 배지에 희석하여 4 ㎍/㎖의 농도로 처리), 음성대조군으로 정상 인간 IgG를 4 ㎍/㎖의 농도로 처리 또는 양성대조군으로 아바스틴(Avastin; Genentech)을 4 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 37℃에서 한 시간동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션을 하는 중간에 24-웰 플레이트에 얼음으로 식힌 Matrigel(354230: BD Bio-science, USA)을 200 ㎕씩 넣고 37℃/5% CO2배양기에서 30분 동안 호모게나이징하였다. 반응이 끝난 세포와 Ab의 혼합물에 재조합 인간 VEGF를 20 ng/㎖의 농도로 첨가한 후 Matrigel 위에 넣고, 37℃/5% CO2에서 배양하였다. 16시간 동안 배양한 후 관 형성을 측정하기 위해 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 넣어서 30분간 실온에서 고정하였다. 다음으로 0.01% 크리스탈 바이올렛/100 mM NaBorate 500 ㎕에 30분간 염색하였고 건조시켜서 현미경으로 × 100 배율에서 관의 형성 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 정제된 VEGF Ab는 양성대조군보다 뚜렷한 관형성 억제를 보였다.
E9, F6, G12 및 C5의 4개 항체 중 C5를 제외한 3 종류의 항체들은 모두 VEGF에 의해서 유도되는 HUVEC 세포의 모세관 유사 관형성(capillary-like tube formation)을 현저하게 억제시키는 것이 관찰되었으며, 이는 본 발명의 VEGF에 대한 인간항체들의 중화능을 확인시켜 주었다.
<4-5> 항-VEGF 항체들의 마우스에서의 교차반응 확인
또한, 각 항체들이 인간 VEGF뿐만 아니라 마우스 VEGF에 대해서 교차반응(cross-reactivity) 하는지를 알아보기 위해, ELISA를 수행하였다.
두 개의 96 웰 면역플레이트에 재조합 인간 VEGF(293-VE, R&D systems, USA)와 재조합 마우스 VEGF(493-MV, R&D systems, USA) 단백질을 웰당 50 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 코팅한 후, PBS에 녹인 skim milk(4%)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0. 2 ㎖을 가하여 씻어준 다음, 아바스틴을 대조군으로 하여 E9, F6 및 G12 단일클론 항체를 333 nM부터 1/3씩 순차적으로 희석하여 두 항원이 코팅된 플레이트 각각의 웰에 동시에 나란하게 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 가하여 4번 씻어준 후 이차 항체인 항-인간 Fc-HRP를 1:3000으로 희석하여 실온에서 30 분 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 씻어준 후에 OPD 정제를 PC 완충용액에 넣어 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 5분 동안 발색시킨 다음 흡광도 490 ㎚에서 Spectrophotometer로 측정하였다.
ELISA 결과는 Graphpad prism ver.4 software(CA 92037: Graphpad Software Inc., USA)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에서 아바스틴과 비슷한 중화능을 보였던 E9, F6 및 G12 단일클론 항체들은 모두 마우스 VEGF에 대해 인간 VEGF만큼의 높은 친화력을 나타내어 교차반응하였다(표 8 및 도 11). 또한, 가장 큰 중화능을 나타냈던 F6 항체는 일관성있게 아바스틴보다 보다 약 2배나 낮은 K D값을 나타내었다. 이로써 본 발명의 VEGF 중화 인간 항체가 기존의 항암제인 아바스틴과 에피토프가 다를 확률이 확실하게 높아졌다.
Figure 112008081584008-PAT00003
도 1은 pYK602-VEGF 벡터에서의 VEGF 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 pYK602-VEGF, pYK602-His-VEGF 및 pYK603-VEGF 벡터에서의 VEGF 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 pYK603-VEGF 벡터에서의 VEGF 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 정제된 VEGF를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 패닝 1 내지 3차에서의 파아지 항체 탐색 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 VEGF에 대한 인간 VEGF 단일 파아지 클론 항체 다양성을 핑거프린팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 VEGF에 대한 인간 VEGF 단일 파아지 클론 항체의 중쇄 CDR에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 VEGF에 대한 인간 VEGF 단일 파아지 클론 항체의 경쇄 CDR에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 인간 VEGF 단일클론 항체의 결합 특이성을 비교한 결과를 나타낸 도이다:
a: C5, E9, F6, G12, A4, C11, 및 F2; 및,
b: H7, G9, C9, B12, F9, D12 및 C12.
도 10은 HUVEC 세포에서 인간 VEGF 단일클론 항체의 관형성을 억제하는 중화능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 인간 VEGF 단일클론 항체의 hVEGF와 mVEGF에 대한 교차반응성을 측정한 결과를 나타낸 도이다:
a: 반응곡선; 및,
b: 결과치.
도 12는 pNATAB H 벡터 및 pNATAB L 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다:
a: pNATAB H 벡터; 및,
b: pNATAB L 벡터.
도 13은 pYK602 벡터, pYK602-His 벡터 및 pYK603 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다:
a: pYK602 벡터;
b: pYK602-His 벡터; 및,
c: pYK603 벡터.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> VEGF specific human antibody <130> 8P-10-70 <160> 129 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Forward primer <400> 1 gctctagagt gatgaacttt ctgctgtctt 30 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Reverse primer <400> 2 cggaattccc gcctcggctt gtcaca 26 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.1-VEGF orward primer <400> 3 cagggggccg tgggggccgc agaaggagga gggcag 36 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcDNA3.1-VEGF Reverse primer <400> 4 tagcggccga cgcggccaac cgcctcggct tgtcaca 37 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 HC-CDR1 <400> 5 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B12 HC-CDR1 <400> 6 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C11 HC-CDR1 <400> 7 Ser Asp Ala Ile Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C12 HC-CDR1 <400> 8 Ser Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 HC-CDR1 <400> 9 Ser Tyr Ser Met His 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C9 HC-CDR1 <400> 10 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D12 HC-CDR1 <400> 11 Glu Tyr Ala Met His 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E9 & F6 HC-CDR1 <400> 12 Thr Ser Gly Val Ala Val Gly 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 HC-CDR1 <400> 13 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F9 HC-CDR1 <400> 14 Thr Thr Ala Ile Thr 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G12 HC-CDR1 <400> 15 Asn Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G9 HC-CDR1 <400> 16 Thr Tyr Ala Leu His 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 HC-CDR1 <400> 17 Lys Tyr Gly Met His 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 HC-CDR2 <400> 18 Phe Ile Asn Glu Asp Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B12 HC-CDR2 <400> 19 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C11 HC-CDR2 <400> 20 Gly Val Ile Pro Ile Phe Ala Thr Thr Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C12 HC-CDR2 <400> 21 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 HC-CDR2 <400> 22 Gly Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Lys Gln Phe Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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81 Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 LC-CDR2 <400> 82 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A4 & H7 LC-CDR3 <400> 83 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B12 LC-CDR3 <400> 84 Gln Gln Gly His Thr Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C11 LC-CDR3 <400> 85 Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Tyr Ser 1 5 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C12 LC-CDR3 <400> 86 Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Leu Ser Ala Pro Tyr Val 1 5 10 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 LC-CDR3 <400> 87 Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C9 LC-CDR3 <400> 88 Gln Gln Asn Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D12 & F2 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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 95 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF B12 light chain <400> 95 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 20 25 30 Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser His Phe Thr Leu Thr Ile Thr 65 70 75 80 Asn Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His 85 90 95 Thr Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 96 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF C11 light chain <400> 96 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 20 25 30 Ile Gly Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Val Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Gly Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Thr Thr Pro Tyr Ser Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 97 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF C12 light chain <400> 97 Gly Val Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly 1 5 10 15 Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Pro Gly Gly Thr Ser Asn 20 25 30 Ile Asp Ser Lys Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile 65 70 75 80 Thr Gly Leu Gln Ala Ala Asp Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr 85 90 95 Asp Thr Ser Leu Ser Ala Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu 115 120 125 Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 98 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF C5 light chain <400> 98 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly 20 25 30 Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ser Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn 85 90 95 Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 99 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF C9 light chain <400> 99 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr 20 25 30 Ile Ser Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 100 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF D12 light chain <400> 100 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 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Ala 65 70 75 80 Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 85 90 95 Tyr Asp Asn Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu 115 120 125 Ile Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 102 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF F2 light chain <400> 102 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 20 25 30 Ile Ser Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Ser His 85 90 95 Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 103 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF F9 light chain <400> 103 Gly Val Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly 1 5 10 15 Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Thr Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr His Gln Leu Pro Gly Thr Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Val Ile Gln Lys Asn Thr Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile 65 70 75 80 Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Phe Cys Ser Ala Trp 85 90 95 Asp Asp Ser Leu Ser Ala Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 104 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF G12 light chain <400> 104 Gly Val Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Gln Arg Val Ile Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn 20 25 30 Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr 35 40 45 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 65 70 75 80 Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser 85 90 95 Tyr Asp Ser Arg Leu Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 105 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF G9 light chain <400> 105 Gly Val Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 1 5 10 15 Ser Pro Arg Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp 20 25 30 Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 35 40 45 Ala Pro Gln Leu Ile Ile Tyr Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val 50 55 60 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser 85 90 95 Tyr Ser Ser Ser Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr 100 105 110 Val Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile 115 120 125 Ser Glu Glu Asp Leu 130 <210> 106 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF H7 light chain <400> 106 Gly Val Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg 20 25 30 Ile Ala Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Gly Gly Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu 130 <210> 107 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH7-1 <400> 107 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagatgcagc tggtggagtc 50 <210> 108 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH3-1 <400> 108 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtggagtc 50 <210> 109 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH1-2 <400> 109 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagatgcagc tggtgcagtc 50 <210> 110 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH2-1 <400> 110 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtcacct tgaaggagtc 50 <210> 111 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH3-2 <400> 111 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtggagtc 50 <210> 112 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH1-1 <400> 112 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtgcagtc 50 <210> 113 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH7-2 <400> 113 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagatgcagc tggtaaagtc 50 <210> 114 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJH-ALL <400> 114 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 115 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVK 1-1 <400> 115 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gacatccaga tgacccagtc 50 <210> 116 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL10 <400> 116 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagctcgtgc tgactcagcc 50 <210> 117 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL2 <400> 117 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagcctgtgc tgactcagcc 50 <210> 118 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL9 <400> 118 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg aattttatgc tgactcagcc 50 <210> 119 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R7 <400> 119 gaggagagat cttttgatat ccaccttggt 30 <210> 120 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R1 <400> 120 gaggagagat ctttttgatc tctaccttgg t 31 <210> 121 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R2 <400> 121 gaggagagat ctttttgatc tccactttgg t 31 <210> 122 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL1-R <400> 122 gaggagagat ctttaggacg gtgaccttgg tccc 34 <210> 123 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R5 <400> 123 gaggagagat ctttttgatt tccagcttgg t 31 <210> 124 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL2-R <400> 124 gaggagagat ctttaggacg gtcagcttgg tccc 34 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB5 primer <400> 125 ctagataacg agggcaaatc atg 23 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cla3 primer <400> 126 cgtcaccaat gaaaccatc 19 <210> 127 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-proF primer <400> 127 aaatgggcgg taggcgtg 18 <210> 128 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH7-3 <400> 128 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtaaagtc 50 <210> 129 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R3 <400> 129 gaggagagat cttttgatct ccagtcgtgt 30

Claims (42)

  1. 서열번호 5 내지 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 18 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 31 내지 43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
    서열번호 57 내지 69로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 70 내지 82로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 83 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 VEGF에 특이적인 인간 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 44 내지 56으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 94 내지 106으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
  4. 제 1항의 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 1항의 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  7. 제 5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  8. 제 6항의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  9. 제 7항의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  10. 제 6항 및 제 7항의 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체.
  11. 1) 제 10항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    2) 상기 배양액으로부터 제 1항의 인간 항체를 정제하는 단계를 포함하는 VEGF에 특이적인 인간 항체의 제조방법.
  12. 제 1항의 인간 항체를 포함하는, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 화학적 요법과 병행하여 투여하는 것을 특징으로 하는 약 학적 조성물.
  14. 제 1항의 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제 12항 또는 제 14항에 있어서, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증 및 당뇨병성황반부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 약학적으로 유효한 양의 제 1항의 인간 항체를 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 치료방법.
  21. 제 20항에 있어서, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치료방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증 및 당뇨병성황반부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  24. 제 1항의 인간 항체, 상기 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환의 검출용 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난 소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증 및 당뇨병성황반부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 검출용 조성물.
  30. 제 24항의 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 VEGF가 과발현되는 암의 면역검출 방법.
  31. 제 30항에 있어서, VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역검출 방법.
  32. 1) 제 24항의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
    2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 VEGF가 과발현되는 암의 영상화 방법.
  33. 제 32항에 있어서, VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 영상화 방법.
  35. 1) 제 24항의 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
    3) 상기 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 VEGF가 과발현되는 암의 생체내 치료 방법.
  36. 제 35항에 있어서, VEGF가 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 생체내 치료 방법.
  37. 1) 제 24항의 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
    3) 단계 2)에서 종양세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으 로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료 환자의 예후 평가 방법.
  38. 제 1항의 인간 항체를 동물실험 모델에 투여하는 단계를 포함하는 상기 인간 항체의 부작용을 측정하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 동물실험 모델은 VEGF가 과발현되어 야기되는 질환에 걸린 동물인 것을 특징으로 하는 부작용을 측정하는 방법.
  40. 제 38항에 있어서, VEGF가 과발현되어 야기되는 질환은 암 또는 신생혈관 생성과 관련된 질환인 것을 특징으로 하는 부작용을 측정하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 부작용을 측정하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 신생혈관 생성과 관련된 질환은 류머티즘성 관절염, 당뇨병성 망막증, 허혈성 망막병증, 건선, 증식당뇨망막병증 및 당뇨병성황반부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 부작용을 측정하는 방법.
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