KR20150042291A - 액체 칼코게나이드 조성물 및 이의 제조방법과 사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼코게나이드 또는 이의 염을 포함하는 안정한 신규 액체 조성물을 제공한다. 이들 조성물은 생물학적 물질의 보존 뿐만 아니라 허혈성 또는 저산소성 손상의 치료와 예방을 포함하는 다양한 목적에 사용될 수 있다.

Description

액체 칼코게나이드 조성물 및 이의 제조방법과 사용방법{Liquid chalcogenide compositions and methods of manufacturing and using the same}

본 발명은 일반적으로 액체 칼코게나이드 조성물, 보다 특히 칼코게나이드를 포함하는 안정한 액체 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 손상, 질환 및 조기 사망으로부터 세포 및 동물을 보호하기 위한 이들 조성물의 용도에 관한 것이다.

칼코겐 원소, 즉 원소 주기율표의 6족 원소를 함유하는 화합물(단, 산화물 제외)은 통상 "칼코게나이드" 또는 "칼코게나이드 화합물"로 불리워진다. 이들 원소는 황(S), 셀레늄(Se), 텔레륨(Te) 및 폴로늄(Po)이다. 통상의 칼코게나이드는 기타 원소 이외에 하나 이상의 S, Se 및 Te를 함유한다.

최근 들어, 칼코게나이드를 사용한 처리는 생물학적 물질의 정체를 유도하고 저산소성 및 허혈성 손상으로부터 생물학적 물질을 보호하는 것으로 밝혀졌다. 이들 연구에서, 황화수소(H₂S) 기체(산소 소비의 유효 억제제)는 대사작용을 감소시킬 수 있고, 저산소성 손상으로부터 마우스 및 래트를 보호할 수 있다(PCT 국제공개공보 제WO2005/041655호). 황화수소 기체는 통상 의학용 기체로서 간주되지는 않지만, 이러한 예상치 못한 결과는 다수의 동물 및 사람 질환, 특히 저산소증 및 허혈증 관련 질환 및 손상을 치료하거나 예방하기 위한 흥미있는 가능성을 제시한다.

특정한 칼코게나이드 화합물(예: 황화수소 및 셀렌화수소)는, 이들이 산소와 화학적으로 반응하여 산화 및 화학적 변형을 유도할 가능성이 있기 때문에 산소의 존재하에 안정하지 않다. 예를 들면, 설파이드의 화학적 변형은 약제로서의 이의 용도를 제한하는데, 이는 제한된 안정성, 제한된 저장 수명, 및 제조, 저장 또는 사용 동안 산화 생성물의 도입 가능성 때문이다. 설파이드의 가능한 산화제는 산화 생성물의 혼합물(예: 설파이트, 설페이트, 티오설페이트, 폴리설파이드, 디티오네이트, 폴리티오네이트 및 원소 황)을 생성할 수 있는 산소, 이산화탄소 및 고유 금속 불순물을 포함한다. 따라서, 저장 동안 설파이드의 신속한 산화는 약제로서의 이의 사용을 제한한다.

칼코게나이드로 치료할 필요가 있는 세포 또는 환자에게 약제학적 잇점을 제공하기 위해서는, 안정하고, 용이하고 재현가능하게 제조되며, 표준 투여 경로용으로 설계되는 최종 용량형이 요구된다. 명백하게는, 설파이드를 함유하는 것들을 포함하여, 칼코게나이드의 안정한 액체 약제학적 조성물이 당해 기술분야에서 요구되고 있다. 설파이드는 2가 상태에서 황으로서, H₂S 또는 이의 염(예: NaHS, Na₂S 등)으로서 규정되고, 이들은 응급 상황시 당해 분야에서의 치료와 같은 조절된 의학 환경(예: 질환 치료용)에서 또는 비극적 손상 또는 삶을 위협하는 의학적 사건에 대한 비상 관리시에 환자에게 편리하게 투여될 수 있다. 본 발명은 칼코게나이드의 안정한 신규 액체 약제학적 조성물을 제공함으로써 이러한 요구를 충족시키며, 다른 손상 및 질환 상태 뿐만 아니라 저산소성 및/또는 허혈성 상태로부터 발생하는 손상 및 사망으로부터 동물을 보호하는 것이 본원에서 증명된다.

본 발명은 칼코게나이드의 액체 조성물 및 이의 제조방법과 사용방법을 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 안정한 액체 약제학적 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염 또는 전구체를 약제학적으로 허용되는 담체 속에 포함하는 조성물에 있어서, 상기 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 염의 농도, pH 및 산화 생성물이 액체 약제학적 조성물의 저장 후에 허용 기준 범위 내로 존재하는 조성물을 제공한다.

다른 양태에서, 칼코게나이드 화합물 또는 칼코게나이드 염은 H₂S, Na₂S, NaHS, K₂S, KHS, Rb₂S, CS₂S, (NH₄)₂S, (NH₄)HS, BeS, MgS, CaS, SrS 및 BaS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 칼코게나이드 화합물 또는 칼코게나이드 염은 H₂Se, Na₂Se, NaHSe, K₂Se, KHSe, Rb₂Se, CS₂Se, (NH₄)₂Se, (NH₄)HSe, BeSe, MgSe, CaSe, SrSe, PoSe 및 BaSe로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정한 양태에서, 칼코게나이드 화합물 또는 칼코게나이드 염은 설파이드이고, 이의 농도는 95mM 내지 150mM 범위이다.

특정한 양태에서, 칼코게나이드 화합물 또는 칼코게나이드 염은 설파이드이고, 당해 설파이드는 약 80% 내지 약 100% w/v, 약 90% 내지 100% w/v 또는 약 95% 내지 100% w/v의 양으로 존재한다.

특정한 양태에서, 액체는 수산화나트륨이다.

특정한 양태에서, 조성물은 pH가 6.5 내지 8.5 범위이다.

하나의 양태에서, 조성물은 산소 함량이 0.5μM 이하이다.

하나의 양태에서, 조성물은 폴리설파이드, 설파이트, 설페이트 및 티오설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 산화 생성물을 추가로 포함한다. 산화 생성물은 (0% 내지 1.0%) 범위의 설페이트, (0% 내지 1.0%) 범위의 설파이트, (0% 내지 1%) 범위의 폴리설파이드 또는 (0% 내지 1.0%) 범위의 티오설페이트이다.

저장 기간은 (23℃ 내지 27℃) 범위에서 약 3개월 또는 (23℃ 내지 27℃) 범위에서 약 6개월일 수 있다.

하나의 양태에서, 조성물은 몰삼투압 농도가 250 내지 330 mOsmol/L 범위이다. 이는 등장성 또는 거의 등장성일 수 있다.

특정한 양태에서, 조성물은 불투과성 용기에 저장된다.

다른 양태에서, 조성물은 킬레이트제를 추가로 포함한다. 이러한 킬레이트제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 데페록사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. DTPA는 0.1mM 내지 1.0mM 범위로 존재할 수 있다. 데페록사민은 0.1mM 내지 1mM 범위로 존재할 수 있다.

하나의 양태에서, 조성물은 pH 개질제를 추가로 포함한다. 이러한 pH 개질제는 이산화탄소, 수산화나트륨, 염산 및 황화수소로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또다른 양태에서, 조성물은 환원제를 추가로 포함한다. 이러한 환원제는 디티오트레이톨(DTT) 및 글루타티온으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 디티오트레이톨(DTT)은 0.1mM 내지 1M 범위로 존재할 수 있다. 글루타티온은 0.1mM 내지 1M 범위로 존재할 수 있다.

추가의 양태에서, 조성물은 유리 라디칼 스캐빈저를 추가로 포함한다. 이러한 유리 라디칼 스캐빈저는 (6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산)(Trolox) 및 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 유리 라디칼 스캐빈저는 스핀 포착제일 수 있다. 유리 라디칼 스캐빈저는 N-t-부틸-페닐니트론(PBN), 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥실(TEMPO), 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(TEMPOL)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또다른 양태에서, 조성물은 방부제를 추가로 포함한다. 이러한 방부제는 벤질 알콜, 페놀, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤 및 벤즈알코늄 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 방부제는 벤질 알콜(0% 내지 2.0%)(w/v), 페놀(0% 내지 0.5%)(w/v), 메틸 파라벤(0% 내지 0.25%)(w/v), 에틸 파라벤(0% 내지 0.25%)(w/v), 프로필 파라벤(0% 내지 0.25%)(w/v), 부틸 파라벤(0% 내지 0.4%)(w/v), 벤즈알코늄 클로라이드(0% 내지 0.02%)(w/v) 범위로 존재할 수 있다.

하나의 양태에서, 황화수소 기체 1당량은 수산화나트륨 용액 1당량에 용해되고, 상기 생성된 조성물은 pH가 6.5 내지 8.5 범위이며, 몰삼투압 농도가 250 내지 330 mOsmol/L 범위이고, 산소 함량이 5μM 이하이며, 3개월 저장 후에 0% 내지 3.0%(w/v) 범위로 존재하는 산화 생성물을 포함한다.

관련 양태에서, 황화수소 기체 1당량은 수산화나트륨 용액 1당량에 용해되고, 상기 생성 조성물은 pH가 6.5 내지 8.5 범위이며, 몰삼투압 농도가 250 내지 330 mOsmol/L 범위이고, 산소 함량이 5μM 이하이며, 5개월 저장 후에 0% 내지 2.0%(w/v) 범위로 존재하는 산화 생성물을 포함한다.

추가의 관련 양태에서, 황화수소 기체 1당량은 수산화나트륨 용액 1당량에 용해되고, 상기 생성 조성물은 pH가 7.5 내지 8.5 범위이며, 몰삼투압 농도가 250 내지 330 mOsmol/L 범위이고, 산소 함량이 5μM 이하이며, 5개월 저장 후에 1% 내지 2.0%(w/v) 범위로 존재하는 산화 생성물을 포함한다.

본 발명은 추가로,

황화수소 기체 1당량을 액체 1당량에 용해시켜 설파이드 조성물을 생성하는 단계(a) 및

단계(a)로부터 수득한 조성물의 pH를 pH 6.5 내지 8.5 범위로 조절하여 동물 투여에 적합한 설파이드 액체 조성물을 생성하는 단계(b)를 포함하는, 동물 투여에 적합한 설파이드 조성물의 제조방법을 제공한다.

특정한 양태에서, pH는 염화수소, 이산화탄소, 수산화나트륨 및 황화수소 하나 이상의 첨가에 의해 조절된다. 다른 양태에서, pH는 질소, 이산화탄소 및/또는 황화수소를 단계(a)로부터 수득한 조성물에 용해시킴으로써 조절된다. pH는 또한 질소와 이산화탄소의 배합물 또는 질소와 황화수소의 배합물을 단계(a)로부터 수득한 조성물에 용해시킴으로써 조절될 수 있다. 또한, pH는 황화수소를 단계(a)로부터 수득한 조성물에 용해시킴으로써 조절될 수 있다.

본 발명의 방법은 단계(b)로부터 수득한 조성물의 몰삼투압 농도를 250 내지 350 mOsmol/L 범위로 조절하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 방법은 단계(b)로부터 수득한 조성물을 불활성 대기 또는 희가스(noble gas)하에 광-보호 바이알에 분배하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 부형제를 단계(b)로부터 수득한 조성물에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 방법의 특정한 양태에서, 산소 함량은 약 6개월 동안 5μM 이하이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 pH가 6.5 내지 8.5 범위인 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 염의 조성물을 포함하는 용기를 하나 이상 포함하는 키트를 포함한다.

하나의 양태에서, 용기는 갈색 바이알과 같이 광-보호성이다. 또다른 양태에서, 용기는 기체 불투과성이다.

특정한 키트에서, 조성물은 불활성 대기 또는 희가스하에 용기에 저장된다.

특정한 양태에서, 불활성 또는 희가스는 헬륨(He), 네온(Ne), 아르곤(Ar), 크립톤(Kr), 크세논(Xe) 또는 라돈(Rn)일 수 있다.

또다른 관련 양태에서, 본 발명은 생물학적 물질을 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 염의 조성물 유효량과 접촉시킴을 포함하는, 허혈성 또는 저산소성 상태에 노출된 생물학적 물질의 손상 또는 사람 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 접촉은 정맥내, 경피내, 동맥내, 복강내, 병변내(intralesionally), 두개내, 관절내, 전립선내, 흉강내, 기관지내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 복강내, 안내, 피하, 결막하, 혈관내, 점막내, 심막내, 자궁내, 안내, 경구, 국부 접촉; 주사, 주입, 연속 주입, 흡수, 흡착, 침지, 국소 관류에 의한 접촉; 카테터 또는 세척을 통한 접촉을 포함한다.

특정한 양태에서, 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 염은 H₂S, Na₂S, NaHS, K₂S, KHS, Rb₂S, CS₂S, (NH₄)₂S, (NH₄)HS, BeS, MgS, CaS, SrS 및 BaS로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정한 양태에서, 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 염은 H₂Se, Na₂Se, NaHSe, K₂Se, KHSe, Rb₂Se, CS₂Se, (NH₄)₂Se, (NH₄)HSe, BeSe, MgSe, CaSe, SrSe 및 BaSe로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 허혈성 또는 저산소성 상태는 생물학적 물질에 대한 손상, 생물학적 물질에 역효과를 나타내는 질환의 발병 또는 진행 또는 생물학적 물질의 출혈로부터 발생한다.

또다른 양태에서, 생물학적 물질은 손상 전, 질환의 발병 또는 진행 전 또는 생물학적 물질의 출혈 전에 조성물과 접촉된다.

다른 양태에서, 생물학적 물질은 손상, 질환의 발병 또는 진행 또는 생물학적 물질의 출혈 후에 조성물과 접촉된다.

하나의 양태에서, 손상은 외부 물리적 원인으로부터 발생한다.

특정한 양태에서, 손상은 외과적 수술이다.

특정한 양태에서, 생물학적 물질은, 손상, 질환의 발병 또는 진행 또는 생물학적 물질의 출혈로부터 발생하는 손상 또는 사망으로부터 생물학적 물질을 보호하는 양 또는 시간 동안 조성물과 접촉된다.

관련 양태에서, 생물학적 물질은 세포, 조직, 기관, 생물체 및 동물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정한 양태에서, 생물학적 물질은 동물이고, 보다 특정한 양태에서 동물은 포유동물 또는 사람이다.

하나의 양태에서, 생물학적 물질은 혈소판을 포함한다.

또다른 양태에서, 생물학적 물질은 이식되는 것이다.

또다른 양태에서, 생물학적 물질은 재관류 손상의 위험 상태에 있다.

한가지 특정한 양태에서, 생물학적 물질은 출혈 쇼크의 위험 상태에 있다.

칼코게나이드를 포함하는 조성물 및 이의 제조와 사용에 유용한 방법이 제공된다. 당해 조성물은 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염이나 전구체의 안정한 액체 조성물이고, 치료제로서의 이의 효과는 산화 생성물을 생성하는 산화 반응의 결과로서 제조 및 액체 중의 저장 동안 통상적으로 절충된다. 본 발명의 액체 조성물은 증가된 저장 수명을 갖고, 용이하고 재생가능하게 제조되며, 표준 투여 경로를 위해 설계되고, 종래의 액체 또는 기체 칼코게나이드 조성물이 고려되는 질환과 상태의 치료 및 예방에 유리하다. 본 발명은 질환 또는 손상, 특히 허혈성 또는 저산소성 손상으로부터 생물학적 물질을 보호하는 방법 뿐만 아니라 생물학적 물질에서의 정체 또는 예비-정체를 유도하는 방법에서 이들의 용도를 포함한다.

A. 안정한 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물

본 발명은 칼코게나이드를 포함하는 안정한 액체 조성물 및 이의 제조에 유용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 약제학적 조성물과 관련하여 용어 "액체"는 용어 "수성"을 포함하는 것으로 의도된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 약제학적 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염 또는 전구체를 포함하는 안정한 액체 약제학적 조성물에 있어서, 상기 칼코게나이드의 농도, pH 및 산화 생성물이 소정 시간 동안 액체 약제학적 조성물의 저장 후에 허용 기준 범위(수치 제한, 범위 또는 기재된 시험의 다른 기준) 내로 존재하는 조성물에 관한 것이다.

본원에 사용된 "안정한"은 허용 기준 범위 내에 존재하는 활성 칼코게나이드 조성물의 농도, 칼코게나이드 조성물의 pH 및/또는 칼코게나이드 산화 생성물을 의미한다.

"허용 기준"은 약물 물질 또는 약물 생성물이 의도된 용도에 허용되는 것으로 간주되도록 순응해야 하는 기준들을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 허용 기준은, 포유동물에 사용될 약물 생성물에 대해 규정되는, 시험 목록, 분석 공정에 대한 기준 및 적절한 척도이다. 예를 들면, 칼코게나이드의 안정한 액체 약제학적 조성물에 대한 허용 기준은 안정성 시험에 근거하여 특정한 약물 조성물의 약제 용도에 허용되는 소정 범위의 약물 물질, pH 및 산화 생성물 수준의 기준을 의미한다. 허용 기준은 다른 제형과 상이할 수 있으며, 국소 및 미용 용도의 것들을 포함한다. 허용 기준은 일반적으로 각각의 산업에서 규정되어 있다.

다양한 허용 기준은 미국 FDA(US Food and Drug Administration)에서 공표한 상품 제조 시행령 규정에 부합하는, 본원에 기재된 임의의 값 또는 범위를 포함한다. 특정한 양태에서, 허용 기준은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 pH가 7.4-9.0, 6.5 내지 8.5 또는 6.5 내지 9.0 범위이다. 특정한 양태에서, 허용 기준은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 몰삼투압 농도가 250-350 mOsm/L 범위 또는 250-330 mOsm/L 범위이다. 특정한 양태에서, 허용 기준은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 설파이드 농도가 5.0 내지 6.0mg/ml이다. 또다른 양태에서, 허용 수준은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 칼코게나이드 농도가 0.1-100 mg/ml, 1-10 mg/ml 또는 95-150 mM 범위내이다. 또다른 양태에서, 허용 기준은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 설파이드가 총 설파이드 및 이의 산화 생성물의 80%(w/v) 이상, 85%(w/v) 이상, 90%(w/v) 이상, 95%(w/v) 이상, 96%(w/v) 이상, 97%(w/v) 이상, 98%(w/v) 이상 또는 99%(w/v) 이상 존재한다. 관련 양태에서, 산화 생성물은 4℃, 25℃ 또는 40℃에서 0, 1, 2, 3 또는 4개월 저장 시점에서 총 설파이드 및 산화 생성물의 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만의 농도로 존재한다.

문구 "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은, 의학적 또는 수의학적 설정에서 사람 또는 동물에게 투여되는 경우, 알레르기성 또는 예상치 못한 유사 반응을 생성하지 않는 분자 속성 및 조성물을 의미한다.

"칼코게나이드" 또는 "칼코게나이드 화합물"은 칼코겐 원소, 즉 원소 주기율표의 6족 원소(산화물 제외)를 함유하는 화합물을 의미한다. 이들 원소는 황(S), 셀레늄(Se), 텔루륨(Te) 및 폴로늄(Po)이다. 구체적인 칼코게나이드 및 이의 염에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, H₂S, Na₂S, NaHS, K₂S, KHS, Rb₂S, CS₂S, (NH₄)₂S, (NH₄)HS, BeS, MgS, CaS, SrS, BaS, H₂Se, Na₂Se, NaHSe, K₂Se, KHSe, Rb₂Se, CS₂Se, (NH₄)₂Se, (NH₄)HSe, BeSe, MgSe, CaSe, SrSe, PoSe 및 BaSe이 포함된다.

"칼코게나이드 전구체"는, 생물학적 물질에의 노출 또는 노출 후와 같이 특정한 조건하에 칼코게나이드(예: 황화수소(H₂S))를 생성할 수 있는 화합물 및 제제를 의미한다. 이러한 전구체는 하나 이상의 효소적 또는 화학적 반응에 의해 H₂S 또는 또다른 칼코게나이드를 생성한다. 특정한 양태에서, 칼코게나이드 전구체는 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸설파이드(DMS), 메틸머캅탄(CH₃SH), 머캅탄에탄올, 티오시아네이트, 시안화수소, 메탄티올(MeSH) 또는 이황화탄소(CS₂)이다. 특정한 양태에서, 칼코게나이드 전구체는 CS₂, MeSH 또는 DMS이다.

하나의 양태에서, H₂S는 다음 반응식에 따라 수용액 중에서의 H₂S 공여체, 황화수소나트륨(NaHS)의 자발적 해리에 의해 생성된다.

특정한 양태에서, 칼코게나이드 화합물은 황을 포함하지만, 다른 것들은 셀레늄, 텔루륨 또는 폴로늄을 포함한다. 특정한 양태에서, 칼코게나이드 화합물은 하나 이상의 노출된 설파이드 그룹을 함유한다. 특정한 양태에서, 이러한 칼코게나이드 화합물은 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 노출된 설파이드 그룹 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위를 함유하는 것으로 간주된다. 특정한 양태에서, 이러한 설파이드 함유 화합물은 CS₂(이황화탄소)이다. 특정한 양태에서, 칼코게나이드는 염, 바람직하게는 칼코겐이 -2가 산화 상태인 염이다. 본 발명의 양태에 포함되는 설파이드 염에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 황화나트륨(Na₂S), 황화수소나트륨(NaHS), 황화칼륨(K₂S), 황화수소칼륨(KHS), 황화리튬(Li₂S), 황화루비듐(Rb₂S), 황화세슘(Cs₂S), 황화암모늄((NH₄)₂S), 황화수소암모늄((NH₄)HS), 황화베릴륨(BeS), 황화마그네슘(MgS), 황화칼슘(CaS), 황화스트론튬(SrS), 황화바륨(BaS) 등이 포함된다.

설파이드가 불안정한 화합물이고 이러한 화합물 부류를 안정화시키는 다수의 시도가 이루어져 왔음은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 특히, 설파이드 산화는 측정할 수 있는 산화 생성물을 생성한다. 따라서, 액체 조성물에서 설파이드의 저장 동안 생성된 산화 생성물의 범위는, 본원에 기재되고 당해 기술분야에 공지된 표준 분석 방법을 사용하여 시간경과에 따라 산화 생성물의 수준을 측정함으로써 용이하게 측정할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "산화 생성물"은 설파이드 화학적 변형으로부터 수득되는 생성물(예를 들면, 설파이트, 설페이트, 티오설페이트, 폴리설파이드, 디티오네이트, 폴리티오네이트 및 원소 황을 포함함)을 의미한다. 이러한 설파이드 산화 생성물은 처리, 제조 또는 저장(예: 산화에 의해) 결과로서 발생할 수 있다.

"저장 기간"은 액체 칼코게나이드 조성물의 제조 후부터 환자 또는 생물학적 물질에 대한 이의 투여 전까지의 기간을 의미한다. 본 발명의 액체 약제학적 조성물은, 제조되는 경우, 대상에게 즉시 투여되지 않을 수도 있다. 오히려, 제조 후에, 이들은 액체 형태, 반고체 형태, 젤라틴 형태, 고체 형태 또는 대상에의 투여에 적합한 다른 형태로 저장을 위해 포장된다. 특정한 양태에서, 저장은 1개월 내지 12개월, 1개월 내지 6개월 또는 2개월 내지 5개월 범위이다.

본 발명의 조성물은 당해 기술분야에 일반적으로 공지된 방법 및 부형제[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (2005); 21^st Edition, Troy, David B. Ed. Lippincott, Williams and Wilkins]에 의해 약제학적 투여용으로 제조될 수 있다.

본 발명의 액체 약제학적 조성물은 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염이나 전구체를 임의의 목적하는 농도로 포함할 수 있다. 이러한 농도는, 편리한 방식으로 적절한 시간에 걸쳐 유효량을 전달하도록, 예를 들면, 처리되는 생물학적 물질의 종류 또는 투여 경로에 따라 용이하게 최적화될 수 있다. 특정한 양태에서, 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염이나 전구체의 농도는 0.001 mM 내지 5,000 mM 범위, 1 mM 내지 1000 mM 범위, 50 내지 500 mM 범위, 75 내지 250 mM 범위 또는 95 mM 내지 150 mM 범위이다.

본 발명의 액체 약제학적 조성물은, 설파이드의 농도가 1 mM 내지 250 mM 범위인 설파이드로 이루어진 칼코게나이드를 추가로 포함한다. 또다른 양태에서, 설파이드의 농도는 10 mM 내지 200 mM 범위이다.

특정한 양태에서, 본 발명의 액체 조성물 중의 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7. 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 mM 또는 M 이상 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위(기준 온도 및 압력(STP)에서)이다. 예를 들면, 특정한 양태에서 황화수소 기체의 경우, 이러한 농도는 약 0.01 내지 약 0.5 M (STP에서)일 수 있다.

몰농도는 용적당 중량으로 용이하게 전환시킬 수 있다. 따라서, 상기 범위의 몰농도는, 예를 들면, mg/ml로 기재될 수도 있다. 따라서, 특정한 양태에서, 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물 중의 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 농도는 0.01-1000 mg/ml, 0.1-100 mg/ml 또는 1-10 mg/ml 범위이다. 다른 양태에서, 이러한 농도는 대략 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml 또는 10 mg/ml이다.

본 발명의 한 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 액체에 용해시킨 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염이나 전구체를 포함한다. 하나의 양태에서, 액체는 물(H₂O)이고, 다른 양태에서는 보다 생리학적으로 적합한 용액, 예를 들면, 인산염 완충 염수(PBS) 또는 링거액이다. 추가의 양태에서, 액체는 수중 수산화나트륨 또는 수중 수산화칼륨이다.

몇몇 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염이나 전구체와 관련하여 포화 용액인 것으로 생각된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "%"는, 한정(w/v, v/v 또는 w/w와 같이) 없이 사용되면, 액체 중의 고체 용액의 경우에 %(w/v), 액체 중의 기체 용액의 경우에 %(w/v), 액체 중의 액체 용액의 경우에 %(v/v) 및 고체 및 반고체 혼합물의 경우에 (w/w)를 의미한다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (2005); 21^st Edition, Troy, David B. Ed. Lippincott, Williams and Wilkins].

하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 80% - 100% (w/v)에서 측정한 설파이드를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 90% - 100% (w/v)에서 측정한 설파이드를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 95% - 100% (w/v)에서 측정한 설파이드를 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 98% - 100% (w/v)에서 측정한 설파이드를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물의 pH는 (3.0-12.0) 범위인 반면, 다른 양태에서 조성물의 pH는 (5.0-9.0) 범위이다. 액체 약제학적 조성물의 pH는 생리학적으로 적합한 범위로 조절할 수 있다. 예를 들면, 하나의 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 pH는 6.5-8.5 범위이다. 다른 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 pH가 7.5-8.5 범위 또는 7.4-9.0 범위이다.

하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0 μM - 5 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0 μM - 3 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0.01 μM - 1 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0.001 μM - 1 μM 범위로 측정된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 산화 생성물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 산화 생성물에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 설파이트, 설페이트, 티오설페이트, 폴리설파이드, 디티오네이트, 폴리티오네이트 및 원소 황이 포함된다. 다양한 양태에서, 하나 이상의 이들 산화 생성물이 10% 미만, 6.0% 미만, 3.0% 미만, 1.0% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만 또는 0.01% 미만의 양으로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(설파이트)는 0%-10%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설파이트)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설파이트)는 1.0%-3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설파이트)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(설페이트)는 0%-10.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설페이트)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설페이트)는 1% 내지 3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(설페이트)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(티오설페이트)는 0%-10%(w/v) 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, 산화 생성물(티오설페이트)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, 산화 생성물(티오설페이트)는 1.0%-3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, 산화 생성물(티오설페이트)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물은 0%-10%(w/v) 범위로 존재하는 폴리설파이드를 포함한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리설파이드)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리설파이드)는 1.0%-3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리설파이드)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(디티오네이트)는 0%-10%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(디티오네이트)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(디티오네이트)는 1.0%-3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(디티오네이트)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리티오네이트)는 0%-10%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리티오네이트)는 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리티오네이트)는 1.0%-3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(폴리티오네이트)는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 산화 생성물(원소 황)은 0%-10%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(원소 황)은 3.0%-6.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(원소 황)은 1.0% -3.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화 생성물(원소 황)은 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다.

당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 액체 약제학적 조성물(약물 생성물)이 바람직하게는 포유동물로의 투여 전에 저장 동안에 안정한 상태로 유지됨을 인지할 것이다. 하나의 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 3개월이고, 저장 온도는 18℃-27℃ 범위이다. 또다른 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 6개월이고, 저장 온도는 18℃-27℃ 범위이다. 또다른 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 12개월이고, 저장 온도는 18℃-27℃ 범위이다.

하나의 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 3개월이고, 저장 온도는 4℃-23℃ 범위이다. 또다른 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 6개월이고, 저장 온도는 4℃-23℃ 범위이다. 또다른 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 저장은 약 12개월이고, 저장 온도는 4℃-23℃ 범위이다.

하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물의 제조방법은 액체 약제학적 조성물의 몰삼투압 농도를 200-400 mOsmol/L 범위의 몰삼투압 농도로 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 몰삼투압 농도는 240-360 mOsmol/L 범위 또는 등장성 범위이다. 특정한 양태에서, 액체 약제학적 조성물의 몰삼투압 농도는 250-330 mOsmol/L 범위이거나, 조성물의 몰삼투압 농도는 250-350 mOsm/kg 범위이다. NaCl은 몰삼투압 농도를 조절하기 위한 부형제로서 사용될 수 있다.

특정한 양태에서, 액제 약제학적 조성물의 등장성은 투여시 통증을 감소시키고 고장성 또는 저장성 조성물과 관련된 용혈 효과 가능성을 최소화시킨다는 점에서 바람직하다. 따라서, 본 발명의 안정화된 조성물은 저장 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라, 산 및 산의 염 형태로 이루어진 하나 이상의 종래의 완충 시스템을 사용하는 제형과 비교하여 투여시 통증을 실질적으로 감소시키는 추가의 잇점을 갖는다.

하나의 양태에서, 안정한 액체 약제학적 조성물은 불투과성 용기에 포장된다. "불투과성 용기"는 기체 분자의 통과를 영구 차단하는 용기를 의미한다. 불투과성 용기는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 기체 불투과성 구조재를 포함하는 "수액(i.v.) 백" 또는 밀봉 유리 바이알이 포함된다. 액체 약제학적 조성물은 불활성 대기 또는 희가스하에 불투과성 용기에 포장될 수 있다. 희가스는 헬륨(He), 네온(Ne), 아르곤(Ar), 크립톤(Kr), 크세논(Xe) 및 라돈(Rn)을 의미한다. 불활성 기체는 질소(N₂)를 의미한다. 용어 "불활성 대기"는 용기 중의 질소 또는 아르곤 대기를 의미한다. 액체 약제학적 조성물은 광-보호 바이알 또는 용기(예: 갈색 바이알)에 포장될 수 있다. 하나의 양태에서, 이러한 조성물은 밀봉되어 유리 앰풀에 저장될 수 있다.

몇몇 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 저장 동안 칼코게나이드의 산화를 방지하기 위해 포함되는 하나 이상의 부형제를 포함하며, 여기서 저장은 1 내지 12개월 또는 그 이상의 범위이다. 몇몇 양태에서, 저장은 1 내지 6개월 범위이다. 몇몇 양태에서, 저장은 3 내지 6개월 범위이다. 몇몇 양태에서, 저장은 4 내지 5개월 범위이다. 본 발명의 양태는 단일 부형제 또는 부형제 배합물을 사용할 수도 있다. 다수의 적합한 부형제가 존재한다. 이의 예에는 킬레이트제, pH 개질제, 환원제, 산화방지제, 스핀 포착제 및 방부제가 포함된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 킬레이트제 또는 킬레이트화제를 임의로 함유할 수 있다. 킬레이트는 금속 이온과 착화제와의 수용성 착물이다. 이는 통상적으로 용액에서 용이하게 해리하지 않으며, 불활성 착물을 형성한다. 그러나, 불안정한 착물에서, 금속 이온은 용이하게 교환될 수 있다. 전이 원소의 금속 착물은 공지되어 있지만, 킬레이트화는 보다 광범위한 원소 속에서 발생한다. 가용성 금속 착물을 제공하는 킬레이트화제는 또한 봉쇄제(sequestering agent)로서 불리운다. 킬레이트화제는 통상 금속에 전자쌍을 제공하는 2개 이상의 관능기(예: -O, -NH₂ 또는 -COO^-)를 갖는다. 추가로, 이들 그룹은 금속과 환을 형성하도록 위치된다. 천연 킬레이트제의 예에는 카보하이드레이트(폴리사카라이드 포함), 하나 이상의 배위 그룹을 갖는 유기 산, 지질, 스테로이드, 아미노산 및 관련 화합물, 펩타이드, 포스페이트, 뉴클레오타이드, 테트라피롤, 페리옥사민, 이오노포어(예: 그라미시딘, 모넨신, 발리노마이신) 및 페놀이 포함된다. 합성 킬레이트제의 예에는, 이로써 한정되지는 않지만, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 5나트륨 염(DTPA5), CaDTPAH, 디머캅롤(BAL), 데페록사민, 데스페랄, 2,2'-비피리딜 디머캅토프로판올에틸렌디아미노테트라아세트산, 에틸렌디옥시-디에틸렌디니트릴로-테트라아세트산(EDTA), CaNa₂에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌 글리콜-비스-(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 이오노포어, 니트릴로트리아세트산(NTA), 오르토-페난트롤린, 살리실산, 석시머(메소-2,3-디머캅토석신산(DMSA)), 트리에탄올아민(TEA), N-(2-하이드록시에틸)에틸렌디아민-N,N',N'-트리아세트산 3나트륨 염(HEDTA), 니트릴로트리아세트산(NTA)이 포함된다.

하나의 양태에서, 합성 킬레이트제는 DTPA이다. 특정한 양태에서, DTPA의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다. 하나의 양태에서, DTPA는 0.1 mM 내지 50 mM 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 합성 킬레이트제는 DTPA5로 구성된다. 특정한 양태에서, DTPA5의 농도는 (0.0001%-0.1%)(w/v) 범위이다. 또다른 양태에서, DTPA5는 (0%-1.0%)(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, DTPA5는 (0% 내지 0.01%)(w/v) 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 합성 킬레이트제는 CaDTPA이다. 특정한 양태에서, CaDTPA의 농도는 (0.0001%-0.1%)(w/v) 범위이다. 하나의 양태에서, CaDTPA는 (0% 내지 0.01%)(w/v) 범위이다. 또다른 양태에서, CaDTPA는 (0%-1.0%)(w/v) 범위이다.

하나의 양태에서, 합성 킬레이트제는 데페록사민이다. 특정한 양태에서, 데페록사민의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다. 하나의 양태에서, 데페록사민은 0.1 mM 내지 10 mM 범위로 존재한다.

하나의 양태에서, 합성 킬레이트제는 EDTA이다. 특정한 양태에서, EDTA의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다. 특정한 양태에서, EDTA는 0%-1%(w/v) 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, EDTA는 0.0001 %-0.1 %(w/v) 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, EDTA는 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, EDTA는 0% 내지 0.01%(w/v) 범위로 존재한다.

본 발명의 액체 약제학적 조성물은 하나 이상의 pH 개질제를 추가로 포함한다. pH 개질제는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 무기 염, 예를 들면, 탄산아연, 탄산마그네슘, 탄산칼슘, 수산화마그네슘, 인산수소칼슘, 칼슘 아세테이트, 수산화칼슘, 칼슘 락테이트, 칼슘 말레에이트, 칼슘 올레에이트, 칼슘 옥살레이트, 인산칼슘, 마그네슘 아세테이트, 인산수소마그네슘, 인산마그네슘, 마그네슘 락테이트, 마그네슘 말레에이트, 마그네슘 올레에이트, 마그네슘 옥살레이트, 염화나트륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화칼륨, 인산칼륨, 중탄산나트륨, 티오글리콜산, 아연 아세테이트, 인산수소아연, 인산아연, 아연 락테이트, 아연 말레에이트, 아연 올레에이트, 아연 옥살레이트, 및 이들의 배합물이 포함된다. 다른 pH 개질제에는, 예를 들면, 아세트산, 푸마르산, 말산, 질산, 인산, 프로피온산, 황산, 타르타르산, 이산화탄소, 카본산, N-메틸-D-글루카민, 4-(2-하이드록시에틸)-모르폴린, 트로메타민, 오로트산 및 염산이 포함된다. 하나의 양태에서, pH 개질제는 수산화나트륨이다.

pH 개질제는 산성 또는 염기성 용액에 첨가되는 경우에 완충제로서 사용될 수 있고, pH를 개질시킨 다음 새로운 pH를 유지시킬 수 있음은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 이해된다[참조: The United States Pharmacopeia-National Formulary 29^th Edition, (2006) Rockville, MD; Stahl, P. Wermuth, C. ed. Handbook of Pharmaceutical Salts Properties, Selection and Use. Wiley (2002)]. 특정한 양태에서, pH 개질제는 완충제로서 사용되고, 이산화탄소 또는 황화수소로 구성된다.

특정한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 환원제인 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 글루타티온(참조: US 6,586,404), 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TSEP), I-시스테인, 시스테인 또는 메티오닌을 포함한다. 하나의 양태에서, 환원제는 글루타티온[참조: Vincent et al., Endocrine Reviews (2004) 25:612-628], 디티오트레이톨(DTT)[참조: Weir et al., Respir and Physiol Biol; (2002) 132:121-30] 또는 디티오에리트리톨(DTE)이다. 특정한 양태에서, 글루타티온의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다. 특정한 양태에서, 디티오트레이톨(DTT)의 농도는 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다. 특정한 양태에서, 환원제는 디티오에리트리톨(DTE)이고, 약, 최소 약 또는 최대 약 0, 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mM 또는 M, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위이다.

본 발명의 액체 약제학적 조성물은 유리 라디칼 스캐빈저 또는 산화방지제를 임의로 포함할 수 있다. 유리 라디칼 스캐빈저 또는 산화방지제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 아스코르브산(비타민 C), D-알파 토코페롤 아세테이트, DL-알파-토코페롤(비타민 E), 멜라토닌, 중아황산나트륨, 아황산나트륨, 나트륨 메타비설파이트, 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸 크로만-2-카복실산), 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP), 멜라토닌, 디티오나이트, 피로설파이트, 시스테인, 중아황산칼륨, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오에틸렌 글리콜, L-트레오아스코르브산, 아세틸살리실산, 살리실산, 레시틴, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니돌, 아스코르브산, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시퀴논, 부틸하이드록시아니솔, 하이드록시코마린, 부틸화 하이드록시톨루엔, 세팜, 에틸 갈레이트, 프로필 갈레이트, 옥틸 갈레이트, 라우릴 갈레이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 트리하이드록시부틸로페논, 디메틸페놀, 레시틴, 에탄올아민, 메글루민 및 이들의 배합물(참조: US 2005/0106214)이 포함된다.

하나의 양태에서, 산화방지제(예: 아황산나트륨)는 0%-2%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화방지제(예: 아황산나트륨)는 0%-1%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 산화방지제(예: 아황산나트륨)는 0%-0.2%(w/v) 범위로 존재한다[참조: Swadesh et al., Anal Biochem (1984), 141 :397].

하나의 양태에서, 산화방지제는 스핀 포착제이다. 스핀 포착제의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, N-t-부틸-페닐니트론(PBN)[참조: Kotake, Y., Antioxid Redox Signal (1999) 481], 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실(TEMPOL)[참조: Gariboldi, M.B., et al. (2000), Free Radic. Biol. Med. 29:633; Miura, Y., et al. J. Radial Res. (Tokyo) (2000) 41 :103; Mota- Filipe, H., et al. (1999), Shock 12:255R: 22-41; S: 39-26], 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥실(TEMPO)[참조: Lapchak, et al., Stroke (2001) 32:147- 53]; (디나트륨-[(3급-부틸이미노)메틸] 벤젠-1,3-디설포네이트 N-옥사이드(NXY-059)[참조: Lapchak et al., CNS Drug Rev (2003) 9:253-62]가 포함된다.

몇몇 양태에서, 스핀 포착제는 TEMPO이고, 이는 0 mg/kg-1,000 mg/kg 범위로 존재한다. 몇몇 양태에서, 스핀 포착제는 TEMPO이고, 100 mg/kg-1,000 mg/kg 범위로 존재한다. 또다른 양태에서, 스핀 포착제는 TEMPO이고, 0 mg/kg-100 mg/kg 범위로 존재한다.

본 발명의 칼코게나이드 조성물은 방부제를 임의로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "방부제"는 미생물의 증식을 방지하기 위해 사용된 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 화합물은, 비제한적으로 예를 들면, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알콜, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 브롬화세트리모늄, 염화세틸피리디늄, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 크레졸, 메틸파라벤 나트륨, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐리 아세테이트, 페닐머큐리 니트레이트, 페닐머큐리 아세테이트, 티메로살, 메타크레졸, 미리스틸감마 피콜리늄 클로라이드, 칼륨 벤조에이트, 칼륨 솔베이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 프로피오네이트, 소르브산, 티오글리세롤, 티메로살, 티몰, 및 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 및 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 화합물이 포함된다. 이러한 방부제는 기재된 바와 같은 허용되는 약제학적 처방에 따라 통상적인 농도로 액체 칼코게나이드 조성물에 사용된다[참조: The United States Pharmacopeia-National Formulary 29th Edition, (2006) Rockville, MD; Remington's Pharmaceutical Sciences (2005) 21^st Edition, Troy, DB, Ed. Lippincott, Williams and Wilkins]. 특정한 양태에서, 방부제는 벤질 알콜이고, 0%-1.0%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 방부제는 벤질 알콜이고, 0%-0.5%(w/v) 범위로 존재한다. 하나의 양태에서, 방부제는 0%-0.5%(w/v) 범위의 페놀이다. 특정한 양태에서, 방부제는 (0.0%-0.25%)(w/v) 범위의 메틸 파라벤이다. 특정한 양태에서, 방부제는 0%-0.25%(w/v) 범위의 에틸 파라벤이다. 특정한 양태에서, 방부제는 0%-0.25%(w/v) 범위의 프로필 파라벤이다. 특정한 양태에서, 방부제는 0%-0.4%(w/v) 범위의 부틸 파라벤이다. 특정한 양태에서, 방부제는 0%-0.02%(w/v) 범위의 벤즈알코늄 클로라이드이다.

특정한 양태에서, 부형제의 배합은 폴리설파이드 형성을 감소시킨다. 하나의 양태에서, 폴리설파이드 형성을 감소시키는 부형제의 배합은 0%-0.1%(w/v) 범위의 아황산나트륨과 0%-0.01%(w/v) 범위의 EDTA를 포함한다. 하나의 양태에서, 폴리설파이드 형성을 감소시키는 부형제의 배합은 아황산나트륨과 DTPA5이다. 하나의 양태에서, 폴리설파이드 형성을 감소시키는 부형제의 배합은 아황산나트륨, DTPA5 및 벤질 알콜이다.

특정한 양태에서, 본 발명의 제형은 0.01 mg/ml 이하의 철, 10, 5, 2.7, 2.5 또는 1 EU/ml 이하의 내독소, 10, 5 또는 1 ppm 이하의 카보닐 설파이드 및 5, 2.5 또는 1 ppm 이하의 이황화탄소를 포함한다.

이들 물질은 식품 첨가제 및 처리 보조제로서 광범위하게 허용되고 이러한 적용을 위해 미국 FDA에서 "안전한 것으로 일반적으로 승인"(또는 "GRAS") 상태를 획득하였기 때문에 상기 어느 양태가 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 액체 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 특정한 양태에서, 이러한 키트는 본 발명의 액체 약제학적 조성물을 저장하기 위한 하나 이상의 용기를 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 조성물은 불활성 또는 희가스하에 용기에 저장되고, 당해 용기는 밀봉되며, 불투과성 광-보호 용기(예: 갈색 바이알)를 갖는다.

B. 액체 약제학적 조성물의 제조방법

본 발명의 방법의 다양한 양태에 따르면, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 생물학적 물질에, 예를 들면, 정맥내, 경피내, 동맥내, 복강내, 병변내(intralesionally), 두개내, 관절내, 전립선내, 흉강내, 기관지내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 국소, 종양내, 근육내, 복강내, 안내, 피하, 결막하, 혈관내, 점막내, 심막내, 자궁내, 안내, 경구, 국소, 주사, 주입, 연속 주입, 흡수, 흡착, 침지, 국소 관류, 카테터 또는 세척으로 제공된다.

비경구 투여용 액체 또는 조성물에 용해된 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체를 공지된 및 목적하는 농도로 함유하는 조성물이 고려된다. "비경구"는 소화관 이외의 다른 물질 투여 경로를 의미한다. 일반적으로, 액체 약제학적 조성물은, 예를 들면, 칼코게나이드 기체(예: H₂S)를 조성물과 접촉(예: 용해 또는 주입)시켜 기체 분자를 적절한 pH 개질제로 이루어진 액체에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 하나의 양태에서, 칼코게나이드 기체는 완충제이고, 약제학적으로 허용되는 담체로 이루어진 액체에 용해된다. 추가의 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 단일 부형제 또는 부형제 배합물을 첨가하면서 상기한 바와 같이 제조한 칼코게나이드 기체 용액으로 구성된다.

당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 조성물에 용해되는 기체의 양이 다수의 변수에 따라 달라질 수 있음을 인지할 것이고, 이러한 변수에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 액체 또는 용액에서의 기체의 용해도, 액체 또는 용액의 화학적 조성, 이의 온도, 압력, pH, 조성물 중의 화학물질의 pKA, 이온 강도 및 기체 농도 및 기체의 용액으로의 접촉 정도(예: 용해 또는 주입 속도와 기간)가 포함된다. 비경구 투여를 위한 액체 또는 용액 중의 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 농도는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 용해도는 액체 칼코게나이드 조성물을 제조 또는 생산한 다음에 상이한 시간 간격 후에 이의 농도를 측정함으로써 결정될 수 있고, 이때 출발 농도와 비교하여 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 농도 감소는 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 화학적 전환의 저하를 나타낸다.

대안적으로, 액체 칼코게나이드 약제학적 조성물의 안정성은 조절된 저장 조건(예: 온도, 습도, 광 노출)하에 가장 풍부한 칼코게나이드 화합물(또는 이의 염이나 전구체)의 화학적 변형(예: 산화)에 의해 생성되는 화학적 물질의 시간 경과에 따른 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다.

몇몇 양태에서, 액체 칼코게나이드 조성물은 칼코게나이드의 염 형태를 멸균수 또는 염수(0.9% 염화나트륨)에 용해시켜 약제학적으로 허용되는 비경구 제형(예: 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 척수내, 복강내 및 경피내) 용량형을 수득함으로써 제조한다. 또다른 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 경구, 비내(흡입 또는 에어로졸), 구강내 또는 국소 투여 용량형으로 제형화된다. 비경구 액체 용량형은 특정한 pH로 완충되어 칼코게나이드 화합물의 용해도를 향상시키거나 칼코게나이드 화합물의 이온화 상태에 영향을 미칠 수 있다. 황화수소 또는 셀렌화수소의 경우, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다수의 염 형태가 충분할 수 있으며, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 나트륨, 칼슘, 바륨, 리튬 또는 칼륨이 포함된다. 하나의 양태에서, 황화나트륨 또는 셀렌화나트륨을 멸균 인산염 완충 염수에 용해시키고, pH를 염산으로 7.5 내지 8.5 범위로 조절하여 대상에게 투여할 수 있는 공지된 농도의 용액을 수득한다.

다양한 양태에서, 액체 칼코게나이드 조성물은 액체 또는 용액을 칼코게나이드 화합물과 접촉시키기 전에 산소가 감소된 액체 또는 용액으로 제조한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물의 제조방법은 약제학적 조성물의 제조 및 저장의 각 양태에서 산소 함량을 제한하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0 μM-5 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0 μM-3 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0.001 μM-0.1 μM 범위로 측정된다. 하나의 양태에서, 산소는 약제학적 조성물에서 0.1 μM-1 μM 범위로 측정된다.

특정한 칼코게나이드 화합물(예: 황화수소, 셀렌화수소)는 이들이 산소와 화학적으로 반응하기 때문에 산소의 존재하에 불안정하며, 이는 이들의 산화 및 화학적 변형을 유도한다. 따라서, 산소는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 액체 또는 용액으로부터 제거될 수 있으며, 공지된 방법으로는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 액체 또는 용액에 대한 부압(진공 탈기)의 적용, 또는 산소를 결합 또는 "킬레이트화"시켜 이를 용액으로부터 효과적으로 제거하는 시약에 용액 또는 액체를 접촉시키는 방법이 포함된다.

하나의 양태에서, 액체 칼코게나이드 조성물은 불투과성 용기에 저장된다. 이는 산소가 용액으로부터 이미 제거되어 칼코게나이드 또는 이의 염이나 전구체의 산화를 제한하거나 방지하는 경우에 특히 바람직하다. 추가로, 불투과성 용기에의 저장은 액체 또는 용액으로부터 칼코게나이드 기체의 산화 생성물을 억제하여, 용해된 칼코게나이드의 농도를 일정하게 유지되도록 한다. 불투과성 용기는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 기체 불투과성 구성 재료를 포함하는 "수액 백" 또는 밀봉 유리 바이알이 포함된다. 기밀 저장 용기에서 공기에 대한 노출을 방지하기 위해, 질소 또는 아르곤 등의 불활성 또는 희가스를 밀폐 전에 용기에 도입할 수 있다.

다른 관련 양태에서, 액체 약제학적 조성물은 내광성 또는 광-보호 용기 또는 바이알, 예를 들면, 갈색 바이알에 저장된다. 이러한 조성물은 바람직하게는 유리 바이알에 포장된다. 이는 바람직하게는 불활성 대기(예: 질소)하에 약간 과압으로 충전되어 조성물의 산화적 파괴를 방지/지연시키고, 광의 진행이 방지되는 형태로 함유되어 조성물의 광화학적 분해를 방지한다. 이는 갈색 바이알을 사용하여 대부분 효과적으로 달성될 수 있다. 용액을 산소 비함유 환경하에 저장하는 용기 시스템은 다수의 정맥내 용액이 산소에 감수성이기 때문에 공지되어 있다. 예를 들면, 충전 및 밀봉 공정 동안 산소가 퍼징되는 유기 용기를 사용할 수 있다. 또다른 양태에서, 산소로부터 밀봉하기 위해 팩키징재로 밀폐될 수 있는 가요성 플라스틱 용기를 사용할 수 있다. 기본적으로, 산소가 액체 약제학적 조성물과 상호작용하는 것을 방지하는 모든 용기가 사용될 수 있다[참조: US 6,458,758]. 하나의 양태에서, 용기는 하나 이상의 산소 스캐빈저를 포함한다. 예를 들면, 산소 소거 조성물은 생성물 지지 또는 보유 수단의 내부 표면 위에 피막 또는 라이닝으로 적용되어 산소 투과에 대한 차단 기능을 할 수 있다[참조: US 5,492,742].

하나의 양태에서, 본 발명은 액체 용액에 칼코게나이드 염을 용해시킴을 포함하는 약제학적 조성물의 제조방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 칼코게나이드 염은 황화나트륨이다. 또다른 양태에서, 칼코게나이드 및 염은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, H₂S, Na₂S, NaHS, K₂S, KHS, Rb₂S, CS₂S, (NH₄)₂S, (NH₄)HS, BeS, MgS, CaS, SrS, BaS가 포함된다. 하나의 양태에서, 액체는 물 또는 인산염 완충 염수이다. 하나의 양태에서, 액체는 수산화칼륨 또는 수산화나트륨 용액이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 기체 형태의 칼코게나이드, 예를 들면, H₂S(황화수소)를 액체에 주입함을 포함하는 약제학적 조성물의 제조방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 액체는 수산화칼륨 용액 또는 수산화나트륨 용액이다.

상이한 양태에서, 본 발명의 칼코게나이드를 포함하는 액체 약제학적 조성물의 제조방법은 조성물의 pH를 조절하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 양태에서, pH는 염화수소, 이산화수소, 질소 또는 황화수소를 첨가함으로써 조절된다. 또다른 양태에서, pH는 질소, 이산화탄소 또는 황화수소를 조성물 또는 이의 배합물에 용해시킴으로써 조절된다. 하나의 양태에서, pH는 질소와 이산화탄소의 배합물 또는 질소와 황화수소의 배합물을 조성물에 용해시킴으로써 조절된다. 특정한 양태에서, 용액의 pH는 황화수소를 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에 용해시킴으로써 조절된다. 하나의 양태에서, 황화수소 용액 1당량을 수산화나트륨 용액 1당량에 용해시킨다.

또한, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 금속 킬레이트제, 유리 라디칼 스캐빈저 및/또는 환원제의 첨가를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 방법에서, 액체 칼코게나이드 조성물은 pH 측정, 기체 첨가, 및 외부 대기와의 접촉 없는 분배를 위한 입구 포트와 함께 액체 칼코게나이드 조성물을 유지하기 위한 용기를 함유하는 밀봉 용기에서 제조된다. 하나의 양태에서, 용기는 초점판 유리 장치를 갖는 3구 플라스크이다. 하나의 양태에서, 용기에는 질소 기체 또는 아르곤 기체가 분출되어 산소 함량을 0.00 μM-3 μM 범위로 최소화시킨다. 특정한 양태에서, 용기 중의 산소 함량은 0.01 μM-0.03 μM 범위에서 측정된다. 액체 칼코게나이드 조성물의 최종 설파이드 농도는 NaOH의 초기 농도에 의해 결정된다. 예를 들면, NaOH 용액을 임의의 목적하는 첨가제와 함께 3구 플라스크에 넣어 용해도(DTPA)를 향상시키거나 몰삼투압 농도(NaCl)를 평형화한다. 이러한 용액은 교반하면서 15분 동안 5 psi에서 아르곤으로 용해시켜 탈산소화한다. 황화수소 기체(H₂S)를, 용액의 pH가 7.6 내지 7.8의 범위에 도달할 때까지, 교반하면서 용액에 용해시킨다. 하나의 양태에서, 허용되는 pH 범위는 7.5 내지 8.0이다. 이러한 용액은 공간부에 아르곤을 최대까지 충전하여 산소가 용액에 들어가는 것을 방지함으로써 플라스크로부터 양성 아르곤 압력하에 바이알 또는 병에 분배한다. 분배 바이알 또는 병은, 일정한 아르곤 스트림을 분출시켜 산소를 0.00 μM-0.5 μM 범위로 최소화시키는 글로브 박스에 넣고, 각 병 또는 바이알은 분배 전에 아르곤을 분출시킨다. 바이알 및 병은 갈색 유리로 제조하여 안정성을 향상시키고, 테플론 라이너 규소로 라이닝된 캡으로 밀폐하거나 플라스틱 캡으로 밀봉한 고무로 밀폐하고, 마개 크림퍼를 사용하여 기밀 밀봉을 제공한다. 하나의 양태에서, 바이알 및 병은 보로실리케이트 유리로 이루어져 있다. 하나의 양태에서, 바이알 및 병은 이산화규소로 이루어져 있다.

C. 액체 약제학적 조성물의 사용방법

본 발명의 액체 약제학적 조성물은 기체 형태의 칼코게나이드[참조: WO 2005/041655] 또는 액체 칼코게나이드 조성물을 사용하여 치료되는 임의의 질환 또는 질환을 포함하여 다양한 질환 및 질환을 치료하거나 방지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 황화나트륨을 사용한 치료는 심근 경색, 패혈증[참조: Hui, et al. J Infect (2003):47:155], 경화증의 혈관 이상[참조: Fiorucci S, et al., Hepatology. (2005) 42:539]에 대한 강력한 치료법으로서, 심장보호제로서[참조: Geng, et al., Biochem and Biophy Res Com (2004) 313:362], 심근 허혈 재관류 손상[참조: Johansen et al., Basic Res Cardiol (2006) 101 : 53]에서의 신경보호제로서[참조: Qu K. et al, Stroke. (2006) 889], 혈관 석회화를 감소시키기 위해[참조: Wu et al., Acta Pharmacol Sin. (2006) 27:299], 약물 치료에 의해 유도된 위장관 손상을 감소시키기 위해[참조: Fiorucci, S. et al., Gastroenterology (2005) 129: 1210], 호중구 부착을 감소시키고 백혈구 매개된 염증을 조절하기 위해[참조: Zanardo et al., FASEB J. (2006) 20: 2118-2120], 발기 기능장애에서[참조: Srilatha B. et al., Eur J Pharmacol. (2006) 535:280], 과민성 장 증후군에서[참조: Distrutti E., et al., JPET (2006) 319:447] 및 염증후 과민증에서 항통각 효과를 위한 강력한 치료제로서 동물 모델에서 사용되어 왔다. 치료 용도 및 관련 정보의 추가의 예는 표 1에 요약되어 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 다양한 생물학적 물질에서 정체 또는 예비 정체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 또한 허혈증 또는 저산소증으로부터 발생하는 손상의 치료 또는 방지에 사용될 수 있다.

용어 "생물학적 물질"은 살아있는 모든 생물학적 물질을 의미하며, 세포, 조직, 기관 및/또는 생물체 및 이들의 임의의 배합을 포함한다. 본 발명의 방법은, 생물체 속에 존재하거나 생물체로부터 제거되든지에 관계없이, 생물체의 일부분(예를 들면, 세포에서, 조직에서, 및/또는 하나 이상의 기관에서) 또는 전체 생물체에 대해 실시될 수 있는 것으로 예상된다. 더욱이, 세포 및 조직과 관련하여 동질성 및 이종성 세포 모집단도 본 발명의 양태의 대상이 될 수 있는 것으로 예상된다. 용어 "생체내 생물학적 물질"은 생체내, 즉 생물체 속에 여전히 존재하거나 생물체에 부착되어 있는 생물학적 물질을 의미한다. 더욱이, 용어 "생물학적 물질"은 용어 "생물학적 재료"와 동의어로서 이해될 것이다. 특정한 양태에서, 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관이 생물체로부터 분리되는 것으로 예상된다. 용어 "분리된"은 이러한 생물학적 물질을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 생체내 및/또는 분리된 생물학적 물질에 대해 실시될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 처리된 세포는 진핵성 또는 원핵성일 수 있다. 특정한 양태에서, 세포는 진핵성이다. 보다 구체적으로, 몇몇 양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 포유동물 세포에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사람, 원숭이, 마우스, 래트, 래빗, 햄스터, 염소, 돼지, 개, 고양이, 족제비, 소, 양 또는 말의 세포가 포함된다. 더욱이, 본 발명의 세포는 이배체일 수 있지만, 몇몇 경우에 세포는 반수체(생식 세포)이다. 추가로, 세포는 다배체, 홀배수체 또는 무핵체일 수 있다. 세포는 특정한 조직 또는 기관, 예를 들면, 심장, 폐, 신장, 간, 골수, 췌장, 피부, 골, 정맥, 동맥, 각막, 혈액, 소장, 대장, 뇌, 척수, 평활근, 골격근, 난소, 고환, 자궁 및 탯줄로부터 기원할 수 있다. 특정한 양태에서, 세포는 하나 이상의 다음 세포 형태로서 특징지을 수 있다: 혈소판, 골수세포, 적혈구, 임파구, 지방세포, 섬유아세포, 상피세포, 내피세포, 평활근 세포, 골격근 세포, 내분비 세포, 아교 세포, 뉴론, 분비 세포, 차단 기능 세포, 수축 세포, 흡수 세포, 점막 세포, (각막)가장자리 세포, 줄기 세포(전능성, 만능성 또는 다능성), 불임 또는 가임 난모세포 또는 정자.

용어 "조직" 및 "기관"은 통상의 및 명백한 의미에 따라 사용된다. 조직은 세포로 구성될 수 있지만, 용어 "조직"은 명백한 종류의 구조적 물질을 형성하는 유사한 세포의 집합체를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 기관은 특정한 형태의 조직이다. 특정한 양태에서, 조직 또는 기관은 "분리된" 것이고, 이는 생물체 속에 위치하지 않음을 의미한다.

용어 "저산소증" 및 "저산소성"은 산소 수준이 정상 미만인 환경을 의미한다. 저산소증은 산소의 정상 생리학적 수준이 세포, 조직 또는 기관에 공급되지 않은 경우에 발생한다. "정상산소증"은 특정한 세포 종류, 세포 상태 또는 당해 조직에 있어서 산소의 정상 생리학적 수준을 의미한다. "무산소증"은 산소의 부재이다. "저산소성 상태"는 세포, 기관 또는 생물체의 저산소증을 유도하는 것들이다. 이들 상태는 세포의 대사 상태 뿐만 아니라 세포 종류, 및 조직 또는 기관에서 세포의 특정한 구조 및 위치에 따라 좌우된다. 본 발명의 목적을 위해, 저산소성 상태는 산소 농도가 표준 대기 상태 이하인 상태, 즉 20.8, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0%를 포함한다. 대안적으로, 이들 수는 1대기압에서 기압 퍼센트(101.3 kPa)를 나타낼 수 있다. "산소결핍증"은 산소의 부재이다. 0%의 산소 농도는 산소결핍 상태를 규정한다. 따라서, 저산소성 상태는 산소결핍 상태를 포함하지만, 몇몇 양태에서는 0.5% 이상의 저산소성 상태가 실시된다. 본원에 사용된 바와 같이, "정상산소성 상태"는 대략 20.8% 이상의 산소 농도를 구성한다.

표준 온도 및 압력(STP)에서, 공기에 노출된 물은 280μM 용해 산소를 포함한다. 특정한 양태에서, "공식 저산소증"은 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물이 물에서 제형화되고 수중의 산소 수준이 저산소성 상태로 감소되는, 즉 수중 산소가 본원에 기재되고 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용하여 280 μM 미만으로 감소되는 경우에 발생한다.

또다른 양태에서, 공식 저산소증은 산소 농도가 정상 대기 상태 미만, 즉 20.8, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0%인 상태를 포함하며, 또는 이들 수치는 1대기압에서의 기압 퍼센트(101.3 kPa)를 나타낼 수 있다.

저산소증 또는 무산소증을 달성하는 표준 방법은 잘 확립되어 있고, 산소를 챔버로부터 제거하기 위해 화학적 촉매에 의존하는 환경적 챔버를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 챔버는, 예를 들면, BD Diagnostic Systems(Sparks, MD)사에서 GASPAK 휴대 수소 + 이산화탄소 엔벨로프(Carbon Dioxide Envelopes) 또는 BIO-BAG 환경 챔버(Environmental Chambers)로서 시판하고 있다. 또는, 산소는 질소 등의 비산소 기체로 챔버 속의 공기를 교환함으로써 고갈시킬 수 있다. 산소 농도는, 예를 들면, FYRITE 산소 분석기(Oxygen Analyzer)(Bacharach, Pittsburgh PA)를 사용하여 측정할 수 있다.

하나의 양태에서, 용어 "유효량"은 측정가능한 결과를 달성할 수 있는 양을 의미한다. 하나의 양태에서, "유효량"은, 예를 들면, 조절된 2상 또는 3상 임상 시험에서 의약적 치료를 필요로 하는 사람 대상에게 투여하는 경우, 소정의 임상적 종점(예: 사망)에 대하여 통계학적으로 유의적인 이점을 생성하는 양이다. 유효량은 질환 또는 손상에 반응하여 생물학적 물질의 생존성을 향상시키거나, 생물학적 물질에서 정체 또는 예비 정체를 유도하는 양이다.

조직 또는 기관에서 정체 또는 예비 정체를 유도하는 경우, 유효량은 조직 또는 기관의 세포 호흡의 집합적 양으로 측정한, 조직 또는 기관에서 정체 또는 예비 정체를 유도하는 양이다. 따라서, 예를 들면, 심장(집합적으로 심장의 세포에 대하여)에 의한 산소 소비 수준이 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물의 특정량에의 노출 후에 약 2배(즉, 50%) 이상 감소되는 경우, 당해 특정량은 심장에서의 정체를 유도하는 유효량인 것으로 이해될 것이다. 유사하게는, 생물체에서 정체 또는 예비 정체를 유도하는 유효량은 정체 또는 예비 정체의 특정 파라미터의 집합적 또는 전체적 수준에 대하여 평가되는 양이다. 또한, 생물체에서 정체 또는 예비 정체를 유도하는 경우, 유효량은, 생물체의 특정 부분을 목표로 하지 않는 경우, 전체 생물체의 정체 또는 예비 정체를 일반적으로 유도하는 양인 것으로 이해된다. 또한, 유효량은 정체 또는 예비 정체를 유도하기에 충분한 양일 수 있거나, 또다른 제제 또는 자극인자(예: 또다른 화합물)와 병용하여 정체 또는 예비 정체, 손상 또는 질환 상태를 유도하기에 충분한 양일 수 있는 것으로 이해된다.

특정한 양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 표적화되는 생물학적 물질에서 정체 또는 예비 정체를 유도한다. 본원에 사용된 바와 같이, "정체"는 생물학적 물질이 살아있지만 다음중의 하나 이상을 특징으로 하는 저대사성 상태를 의미한다: 생물학적 물질에 의한 이산화탄소 생성 속도 또는 양의 50% 이상(즉 2배) 감소; 생물학적 물질에 의한 산소 소비 속도 또는 양의 50% 이상 감소; 및 이동 또는 사망의 10% 이상 감소(정자 세포 또는 심장 또는 사지 등과 같이 이동하는 세포 또는 조직에만 적용; 또는 정체가 전체 생물체에서 유도되는 경우)(집합적으로 "세포 호흡 지표"로서 언급됨).

본 발명의 특정한 양태에서, 생물학적 물질에 의한 산소 소비 속도는 약, 최소, 최소 약 또는 최대 약 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 100-, 150-, 200-, 250-, 300-, 350-, 400-, 450-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900-, 1000-, 2000-, 3000-, 4000-, 5000- 또는 10000-배 이상, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위로 감소되는 것으로 생각된다. 또는, 본 발명의 양태는 생물학적 물질에 의한 산소 소비 속도의 감소와 관련하여 약, 최소, 최소 약 또는 최대 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위인 것으로 언급될 수 있는 것으로 이해된다.

산소 소비를 측정하는 임의의 분석법을 사용할 수 있으며, 통상의 분석법은, 밀폐된 환경을 사용하고, 당해 환경에 도입된 산소와 소정 시간 후에 당해 환경에 잔류된 산소의 차이를 측정하는 것을 포함한다. 추가로, 이산화탄소 생성을 측정하여 생물학적 물질에 의한 산소 소비 양을 측정할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이산화탄소 생성이 감소하는 것은 산소 소비가 감소하는 것에 상응할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, "예비 정체"는 생물학적 물질이 정체에 도달하기 위해 전이해야 하는 저대사 상태를 의미한다. 예비 정체는 정체로서 규정된 것보다 낮은 정도의 생물학적 물질에서 대사의 감소를 특징으로 한다. 유효 화합물을 사용하여 정체를 달성하기 위해, 생물학적 물질은 산소 소비 및 CO₂ 생성이 생물학적 물질에서 50% 이하로 감소되어 있는 변화된 대사 상태를 통해 반드시 전이해야 한다. 대사 또는 세포 호흡이 50% 이하 정도까지 감소되어 있는 이러한 연속성을 "예비 정체" 상태로서 기재한다.

또한, 다양한 양태에서, 예비 정체는 정상 생리학적 상태와 비교하여 대사 활성이 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 미만인 하나 이상의 지표의 감소를 특징으로 한다. 다른 양태에서, 예비 정체는 또다른 자극인자에 반응하여 정체로의 진행을 향상시키거나 촉진하는 이의 능력 또는 상해로부터 발생하는 손상, 질환 또는 출혈, 특히 불가피한 조직 손상, 출혈성 쇼크 또는 사망을 유도할 수 있는 출혈의 개시 또는 진행으로부터 생물학적 물질의 생존을 향상시키거나 생물학적 물질을 보호하는 이의 능력을 특징으로 한다. 본원에서 명백하게 예시된 "정체"의 유도를 의미할 수도 있지만, 이들 방법은 "예비-정체"의 유도에도 용이하게 적용할 수 있으며, 예비 정체를 유도하는 이러한 방법도 본 발명에 의해 포함되는 것으로 이해될 것이다. 또한, 정체의 유도에 사용된 본 발명의 방법 및 조성물도 또한 정체의 유도에 사용된 것보다 낮은 투여량 및/또는 짧은 시간 동안 이들을 생물학적 물질에 제공함으로써 예비 정체의 유도에도 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 방법에 따르면, 정체 또는 예비 정체는 일시적 및/또는 가역적이고, 이는 생물학적 물질이 몇몇 최후 시점에서 정체의 특성을 더이상 나타내지 않고 당해 처리가 생물학적 물질을 사망 또는 분해할 정도로 생물학적 물질에 독성이 없음을 의미한다.

본 발명의 방법의 다양한 양태에 따르면, 정체 또는 예비 정체는 직접 자체로서 정체를 유도하는 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물 양으로 생물학적 물질을 처리하거나, 또는 정체 또는 예비 정체를 자체로 유도하지는 않지만 또다른 자극인자(이로써 한정되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 손상, 질환, 저산소증, 과다 출혈 또는 하나 이상의 유효 화합물을 사용한 처리)에 반응하여 생물학적 물질이 정체를 달성하는데 필요한 시간을 단축시키는 능력을 촉진하거나 향상시키는 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물 양으로 생물학적 물질을 처리함으로써 유도된다.

특정한 양태에서, 본 발명의 액체 약제학적 조성물은 허혈성 또는 저산소성 상태에 노출된 생물학적 물질의 손상을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 하나의 양태에서, 이들 방법은 손상, 외상 또는 중요한 관리 치료를 받았거나, 받을 예정이거나, 또는 이들에 감수성인 환자를 치료하는데 사용된다. 손상은 외적 상해, 예를 들면, 화상, 창상, 절단, 총상 또는 외과적 외상, 이상 수술, 전립선 수술, 내적 상해, 예를 들면, 패혈성 쇼크, 발작 또는 심근경색, 급격한 순환 감소를 야기하는 심장발작, 또는 비침습성 스트레스(예: 추위 또는 자외선에의 노출)에 기인하는 순환 감소에 의해 유발될 수 있다. 세포 수준에서, 손상은 종종 저산소증에 대한 세포, 조직 및/또는 기관의 노출을 발생시키고, 이에 의해 예정된 세포 사멸 또는 "아폽토시스"를 유도한다.

따라서, 본 발명은 소정의 손상 효과로부터 보호하는 방식으로 조직, 기관, 사지 및 심지어 전체 생물체를 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물 유효량에 접촉시킴을 포함한다. 특정한 양태에서, 의학적 처치를 용이하게 이용할 수 없는 경우, 이는 이들이 적절한 의학적 처치를 받을 때까지 환자에게 시간을 벌수 있게 한다. 본 발명은 또한 지연된 창상 치유 및 조직 재생을 일으킬 수 있는 생물학적 처리의 방지/지연에 의해 조직 재생 및 창상 치유를 유도하는 방법을 포괄한다. 이와 관련하여, 사지 및 생물체에 실질적인 창상이 존재하는 경우에, 생물학적 물질을 액체 칼코게나이드 조성물과 접촉시키는 것은 치유와 재생을 억제하는 생물학적 과정을 조정함으로써 창상 치유와 조직 재생을 조장한다. 창상 치유 이외에, 본 발명의 방법은 심장 정지 또는 발작 등의 외상 및 출혈성 쇼크를 예방하거나 치료하기 위해 실시될 수 있다. 본 발명은 개흉술, 개복술 및 비장 상호작용 또는 심장 수술, 동맥류, 수술, 뇌수술 등의 응급 수술 과정으로부터의 외상 위험에 중요하다.

특정한 양태에서, 본 발명의 방법은 생존성을 향상시키고 심장정지 또는 발작을 일으키는 허혈성 손상을 방지하기 위해 실시될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은, 유효량의 액체 칼코게나이드 조성물을 심근경색, 심장정지 또는 발작 전, 후 또는 전후에 환자에게 제공함을 포함하는, 심장정지 또는 발작 위험이 있는 환자에서 생존성을 향상시키고 허혈성 손상을 감소시키는 방법을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "질환의 치료"는 질환, 상태 또는 질병이 발병된 환자의 처치 및 관리를 의미한다. 치료 목적은 질환, 상태 또는 질병의 유해 효과를 감소시키는 것이다. 치료는 질환, 상태 또는 질병과 관련된 증상 또는 합병증을 완화시키는 것뿐만 아니라 질환, 상태 또는 질병을 제거하거나 조절하는 유효 화합물의 투여를 포함한다.

특정한 양태에서, 본 발명의 방법은 생물학적 물질, 예를 들면, 환자를 허혈성 또는 저산소성 손상 또는 질환 손상 전에 예비 치료하는 것을 포함한다. 이들 방법은 허혈증 또는 저산소증을 유발할 가능성이 있는 손상 또는 질환이 미리 계획되거나 선출되는 경우 또는 유사하게 발생할 가능성이 예상되는 경우에 사용될 수 있다. 이의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈액 손실이 자발적으로 일어날 수 있는 주요 수술, 또는 수술 결과로서 혈액의 산소화가 손상되거나 혈액의 혈관 전달이 감소(심장 동맥 우회술 이식(CABG) 수술에서와 같이)되는 심폐 우회술, 또는 기관 이식을 필요로 하는 수용체로 운반 및 이식하기 위한 공여체 기관의 제거 전에 기관 공여체의 처리가 포함된다. 이의 예에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 손상 또는 질환 진행이 고유하거나 의학적 진단 시험을 사용하는 위험이 진단될 수 있는 의학적 상태(예를 들면, 불안정성 협심증, 후속 동맥성형술, 출혈 동맥류, 출혈성 발작, 후속 주요 외상 또는 혈액 소실)가 포함된다.

더욱이, 본 발명의 추가의 양태는 혈액 손실 또는 세포 또는 조직에 대한 산소화의 다른 결여, 예를 들면, 적절한 혈액 공급의 결여로부터 생존성을 향상시키고 비가역적 조직 손상을 방지하는 것에 관한 것이다. 이는, 예를 들면, 실제 혈액 손실의 결과일 수 있거나, 세포 또는 조직으로의 혈액 유동의 차단을 유발하고 생물체에서 혈압을 국지적으로 또는 전체적으로 감소시키며, 혈액에 함유된 산소의 양을 감소시키거나 혈중 산소 함유 세포의 수를 감소시키는 상태 또는 질환으로부터 기원할 수 있다. 관련될 수 있는 상태 또는 질환에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 혈액 응고 및 색전증, 낭종, 성장, 종양, 빈혈(낫적혈구 빈혈 포함), 혈우병, 기타 혈액 응고 질환(예: 폰 빌레브란트 또는 ITP) 및 죽상동맥경화증이 포함된다. 이러한 상태 및 질환에는 또한 손상, 질환 또는 상태 때문에 생물체에서 세포 또는 조직에 대해 저산소성 또는 무산소성 상태를 실질적으로 생성하는 것들이 포함된다.

하나의 양태에서, 본 발명은, 출혈성 쇼크 위험 또는 출혈성 쇼크 상태의 생물학적 물질을 당해 손상의 1시간 이내에 가능한 신속하게 액체 칼코게나이드 조성물의 유효량과 접촉시킴을 포함하는, 출혈성 쇼크를 받은 생물학적 물질의 생존성을 향상시키고 생물학적 물질의 상해 또는 손상을 방지하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 초기 손상 원인을 해소시킬 수 있으며, 환자가 조절된 방식으로 정상 기능으로 복귀할 수 있는, 조절된 환경(예: 수술)으로 환자를 운반할 수 있다. 이러한 지시를 위해, 손상후 최초 1시간("황금 시간(golden hour)"이라 함)은 성공적인 성과에 중요하다.

상이한 기타 양태에서, 본 발명의 방법은 허혈증 또는 저산소증과 관련된 신경변성 질환의 치료, 저체온증의 치료, 과증식성 질환의 치료 및 면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 상이한 기타 양태에서, 생물학적 상태는 다음 중의 하나 또는 이들의 합병증이다: 신경 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 감염성 질환, 폐 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환 및 면역 관련 질환.

특정한 양태에서, 본 발명의 방법은 저산소성 또는 허혈성 상태(예를 들면, 분리 세포, 조직 및 기관)를 겪는 생체외 생물학적 물질의 생존성을 향상시키는 데 사용된다. 이러한 생체외 생물학적 물질의 구체적인 예에는 이식되는 조직 및 기관 뿐만 아니라 혈소판 및 기타 혈액 생성물이 포함된다.

하나의 양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들면, 세포주 또는 실험용 생물체가 냉동보관 및 저장 동안 저산소성 또는 허혈성 상태를 의도적으로 겪는 경우에 실험 및 연구에 있어서 생물학적 물질의 생존성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포, 조직 또는 기관은 본 발명의 액체 칼코게나이드 조성물의 존재하에 저장하거나 운반할 수 있다. 본 발명의 방법은 공여체 조직 및 기관의 생존성을 증가시킴으로써 공여체 조직을 수용체로 이식하거나 혈류를 저장하기 전의 시간을 연장시키기 위해 사용할 수 있다. 이들 방법은 기타 방부제 및 산소 관류의 사용을 포함하는 현재의 보존 방법과 병용할 수 있다. 본 발명은, 혈소판을 저장 동안 액체 칼코게나이드 조성물의 유효량과 접촉시킴을 포함하는, 혈소판, 특정한 양태에서 무산소 환경에 저장된 혈소판의 생존성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 살아있지 않은 생물학적 물질을 보존하고 무생물학적 물질의 저장 수명을 보존하거나 연장하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 방법은 살아있지 않은 생물학적 물질 또는 무생물학적 물질을 액체 칼코게나이드 조성물과 접촉시킴을 포함한다.

특정한 양태에서, 생물학적 물질에 제공되는 양 또는 유효량은 약, 최소 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 mg, mg/kg 또는 mg/m2, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위일 수 있다. 또는, 당해 양은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 mM 또는 M, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위로서 표시될 수 있다.

본 발명의 다양한 양태에서, 생물학적 물질은 약, 최소, 최소 약 또는 최대 약 30초, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상, 및 그 이내의 임의 범위 또는 이의 조합 동안 본 발명의 액체 약제학적 조성물에 노출된다.

추가로, 정맥내 투여하는 경우, 다음 파라미터: 약, 최소 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 gtts/분 또는 μgtts/분, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위의 유동 속도를 적용할 수 있는 것으로 이해된다. 몇몇 양태에서, 용액의 양은 액체 칼코게나이드 조성물의 농도에 따라 용적으로 명시된다. 시간 양은 약, 최소 약 또는 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 1, 2, 3, 4, 5주 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 또는 이로부터 유도가능한 임의 범위일 수 있다.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 ml 또는 L, 또는 그 이내의 임의 범위의 용적을 전체에 걸쳐 또는 단일 시점에 투여할 수 있다.

본 명세서에 인용되고/되거나 본 출원 자료 용지에 수록된 상기 모든 미국 특허, 미국 특허 공보, 미국 특허원, 외국 특허, 외국 특허원 및 비특허 공보는 이들의 전체가 본원에서 참조로서 인용된다.

본원 발명은 적어도 4개월 동안 안정한 수성 설파이드 조성물을 제공한다.

도 1은, 설파이드 농도가 분자 산소의 농도보다 큰 경우([설파이드]>[O₂]), pH 7.0 내지 9.0 범위에서 검출된 설파이드 산화 종을 설명하는 도면이다.
도 2는 pH 7.0 내지 9.0 범위에서 설파이드 수용액에서 검출되는 산화 생성물을 설명하는 도면이다.
도 3은 H₂S의 액체 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)의 상이한 3개 제제에 대한 시간 경과에 따른 설파이드 농도를 도시하는 그래프이다.
도 4는, 합성 킬레이트제인 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)의 존재 또는 부재하에 제조한, 129일에 걸쳐 H₂S 조성물(액체 약제학적 조성물 IV) 중의 설파이드 안정성을 비교하는 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는, DTPA의 존재(5b) 또는 부재(5a)하에 산소 비함유 환경에서 제조한 황화수소(H₂S)의 액체 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)에서 129일에 걸쳐 측정한 산화 생성물(즉, 설파이트, 폴리설파이드, 티오설페이트, 설페이트 및 37분에서 확인된 미공지 산화 생성물)의 농도를 도시하는 그래프이다.
도 6은 129일간에 걸쳐 특정 간격에서 측정한 설파이드(97mM H₂S) 액체 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)의 pH 수준의 그래프이다.
도 7a는 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 주사(bolus injection) 후에 뇨 티오설페이트 배출을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프는 투여 후 지시된 시점에서 래트 뇨에서 측정한 티오설페이트의 양을 도시한다.
도 7b는 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 주사 후에 뇨 설페이트 배출을 나타내는 그래프이다. 당해 그래프는 투여 후 지시된 시점에서 래트 뇨에서 측정한 설페이트의 양을 도시한다.
도 8a는 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 주사(1mg/kg) 후에 240분에 걸쳐 래트에서 측정한 혈중 티오설페이트 농도를 나타내는 그래프이다. 당해 연구에서, 혈액은 경동맥으로부터 취하고, 샘플은 PFBBr로 유도체화하여 GC-MS에 의해 분석한다.
도 8b는 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 주사(1mg/kg) 후에 240분에 걸쳐 래트에서 측정한 혈중 설파이드 농도를 나타내는 그래프이다. 당해 연구에서, 혈액은 경동맥으로부터 취하고, 샘플은 PFBBr로 유도체화하여 GC-MS에 의해 분석한다.
도 9는 Na₂S(액체 약제학적 조성물 I)을 주입하고 저산소성 상태(4% O₂)에 노출시킨 마우스의 시간경과에 따른 코어 체온을 나타내는 그래프이다. 주입을 개시 및 종료한 시간과 저산소성 상태에의 노출을 개시 및 종료한 시간이 제시되어 있다.
도 10은, 비히클을 주입하거나 Na₂S 주입(액체 약제학적 조성물 I)으로 처리한, 저산소증(4% O₂)에 노출된 C57BL/6 마우스의 시간경과에 따라 측정한 생존율을 비교하는 카플란 마이어(Kaplan Meier) 그래프이다.
도 11은 지시된 양의 액체 약제학적 조성물 IV로 처리한 마우스의 혈청 AST 및 ALT 농도를 나타내는 그래프이다. AST 농도는 최고 시험 농도(3.0mg/kg)에서 통계학적으로 유의적 감소를 달성하였다. ALT 농도는 비히클과 비교하여 3개 처리 그룹(0.3mg/kg, 1.0mg/kg 및 3.0mg/kg)에서 감소되었다. 0.05(^*)의 통계학적 유의 p-값 및 p<0.01(^**)가 제시되어 있다.
도 12는 지시된 양의 설파이드 액체 약제학적 조성물로 처리한 마우스에서 퍼센트 LV 또는 AAR을 나타내는 그래프이다. 0.05(^*)의 통계학적 유의 p-값 및 p<0.01(^**)가 제시되어 있다.
도 13a 및 도 13b는 액체 약제학적 조성물 IV의 존재 또는 부재하에 아이스 링거액으로 처리한 돼지의 코어 체온을 도시하는 그래프이다. 도 13a 및 도 13b는 제공된 p-값과 함께 2개 실험으로부터 수득한 결과를 나타낸다.
도 14는 대조군 비히클 또는 액체 약제학적 조성물 IV의 존재하에 허혈증 및 재관류 손상 처리된 돼지에서 경색 크기를 나타내는 그래프이다.
도 15는 대조군 비히클 또는 액체 약제학적 조성물 IV의 존재하에 허혈증에 대한 개의 전부하 동원성 박출 작업량(preload recruitable stroke work; PRSW) 감소를 나타내는 그래프이다.
도 16은 대조군 비히클 또는 액체 약제학적 조성물 IV로 전처리한 동물에서 퍼센트 AAR 또는 LV를 나타내는 그래프이다.
도 17은 대조군 비히클 또는 황화수소의 존재하에 심폐 우회술 전 또는 후의 동물에서 좌심실 기능을 증명한다. 도 17a는 대조군 비히클 또는 비경구 황화수소의 존재하에 심폐 우회술 전후의 동물에서 좌심실 dP/dT를 나타내는 그래프이다. 도 17b는 대조군 비히클 또는 비경구 황화수소의 존재하에 심폐 우회술 전후의 동물에서 PRSW를 나타내는 그래프이다.
도 18은, 대조군 비히클 또는 황화수소의 존재하에 심폐 우회술 전후의 동물에서 DCBF[%]를 도시하는, 생체내 내피 세포 기능을 나타내는 그래프이다.
도 19는 대조군 비히클 또는 황화수소의 존재하에 생체외 내피 기능을 증명한다. 도 19a는 대조군 비히클 또는 황화수소의 존재하에 심폐 우회술의 존재 또는 부재하 아세틸콜린에 대한 혈관압 감소를 나타내는 그래프이다. 도 19b는 대조군 비히클 또는 황화수소의 존재하에 심폐 우회술의 존재 또는 부재하 SNP에 대한 혈관압 감소를 나타내는 그래프이다.

실시예 1

액체 약제학적 조성물 I 내지 IV의 제조 방법

4개의 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물은 이하 기술된 바와 같이 제조하였다.

저장 용액은 탈산소화를 사용하여 제조하였다. 진공하에 공기를 제거하고 압축 질소(99.99%)로 30분 동안 용해시켜 물을 탈산소화시켰다. 2.5M Na₂S의 포화된 저장 용액은 산소 비함유 증류된 탈이온수로 세정된 Na₂S*9H2O 결정(Fisher #5425)으로부터 제조하였다. 이 저장 용액을 긴밀하게 밀봉하고 빛으로부터 보호하여 저장하였다. 220mM의 HCl 저장 용액은 진한 산(Fisher # A144-212)의 희석으로 제조하고, 압축 질소로 용해시켜 탈산소화시켰다.

액체 약제학적 조성물은 질소 기체로 충전된 염기성 글로브 박스 중의 흄 후드 내에서 제조하여 산소 비함유 환경을 제공하였다. pH 측정기, 버블러 및 교반기가 장착된 반응기를 글로브 박스에 위치시켰다. 글로브 박스 중의 산소 수준은 감도 수준 0.03μM로 산소 측정기(Mettler-Toledo)로 모니터하였다. 본 발명의 액체 약제학적 조성물의 제조방법은 약제학적 조성물의 제조 및 저장 국면 각각에서 산소 함량을 제한함을 포함하고, 이때 산소는 약제학적 조성물 중에서 0 내지 5μM 범위로 측정된다.

액체 약제학적 조성물은 다음과 같은 특징을 갖는 초점판 유리 용구가 장착된 각각의 개구부를 갖는 3구 플라스크(Willmad Labs)에서 제조하였다:

a) 중심 오리피스 및 o-환을 갖는 플라스틱 캡을 갖는 범용 어댑터. 이 어댑터에는 pH 프로브가 장착되고, O-환으로 밀봉되었다.

b) 호스 연결기와 중심 오리피스 및 o-환을 갖는 플라스틱 캡을 갖는 범용 어댑터. 이 어댑터에는 유리 프릿이 있는 기체 분산 튜브가 장착되어 있다. 분산 튜브는 압축 기체 실린더에 연결되고, 압축 질소로 용해시킴으로써 용액을 탈산소화시키고 pH를 H₂S 및 질소의 혼합물을 중화시키는데 사용된다. 호스 연결기에는 압력을 배출시키는 플라스틱 튜브가 장착되어 있다. 이들 두 연결기를 역전시켜 양성 질소 압력하에 플라스크의 내용물을 분배시킨다.

c) 3구를 초점판 유리 마개로 밀봉시키고, 플라스크에 Na₂S 용액 또는 물을 첨가하는데 사용한다.

1. 액체 약제학적 조성물 I - Na₂S 9수화물

액체 약제학적 조성물 I은 다음 단계로 제조하였다:

a) 산소 비함유 증류된 탈이온수를 3구 플라스크에 첨가하고, 교반하면서 질소로 30분 동안 용해시켜 탈산소화시켰다.

b) 2.5M Na₂S 스톡을 첨가하여 200mM Na₂S 용액을 수득하였다.

c) 200mM Na₂S 용액을 교반하면서 15분 동안 압축 질소로 버블링시켰다.

d) 압축 질소로 용해시키고 교반하면서 최종 pH 7.8 내지 8.0까지 220mM HCl을 첨가하였다.

e) 탈산소화된 탈이온수를 첨가하여 최종 농도 100mM Na₂S를 수득하였다.

2. 액체 약제학적 조성물 II - Na₂S 9수화물

액체 약제학적 조성물 II는 다음 단계로 제조하였다:

a) 탈이온화된 산소 비함유 수를 3구 플라스크에 첨가하고, 교반하면서 질소로 30분 동안 용해시켜 탈산소화시켰다.

b) 2.5M Na₂S 스톡을 첨가하여 100mM Na₂S 용액을 수득하였다.

c) 100mM Na₂S 용액을 교반하면서 15분 동안 압축 질소로 버블링시켰다.

d) 용액을 pH 7.8에 도달할 때까지 압축 질소 및 CO₂(99.9%)의 50:50 혼합물로 버블링시켰다.

3. 액체 약제학적 조성물 III - H₂S 및 질소를 포함하는 Na₂S

액체 약제학적 조성물 III은 다음 단계로 제조하였다:

a) 탈이온화된 산소 비함유 수를 3구 플라스크에 첨가하고, 교반하면서 질소로 30분 동안 용해시켜 탈산소화시켰다.

b) 2.5M Na₂S 스톡을 첨가하여 100mM Na₂S 용액을 수득하였다.

c) 100mM Na₂S 용액을 교반하면서 15분 동안 압축 질소로 버블링시켰다.

d) 용액을 pH 8.2에 도달할 때까지 압축 질소 및 H₂S의 50:50 혼합물로 버블링시켰다. 이는 최종 농도 90mM 설파이드를 생성하였다.

4. 액체 약제학적 조성물 IV - H₂S

액체 약제학적 조성물 IV의 최종 설파이드 농도는 NaOH의 초기 농도로 측정하였다. 액체 약제학적 조성물 IV는 다음 단계로 제조하였다:

a) 5 내지 500mM 용액 범위의 NaOH를 첨가제(DTPA, 산화방지제)와 함께 3구 플라스크에 첨가하였다(도 1).

b) 교반하면서 5psi에서 15분 동안 아르곤으로 버블링시켜 용액을 탈산소화시켰다.

c) H₂S를 pH 7.7(또는 7.6 내지 7.8의 범위)로 감소될 때까지 교반하면서 용액을 통해 버블링시켰다.

d) 플라스크 중의 공간부분을 아르곤으로 플러슁하였다.

e) 갈색 분배 병 또는 바이알을 일정한 아르곤 기류로 플러슁한 글로브 박스에 위치시키고, 각 병 또는 바이알을 아르곤으로 플러슁하였다.

f) 제형을 아르곤하에 분배시켜 산소 비함유 환경을 유지시켰다.

용액의 안정성은 설파이드 농도, pH 및 흡광 스펙트럼(폴리설파이드 형성)의 측정으로 모니터하였다. 추가의 분석을 수행하여 설파이트, 설페이트, 티오설페이트 및 황 원소를 포함하는 산화 생성물을 모니터하였다.

액체 약제학적 조성물을 밀봉된 글로브 박스내에서 양성 질소 압력하에 3구 플라스크로부터 분배시켰다. 갈색 바이알 또는 갈색 병을 불활성 대기 아르곤 또는 질소 중의 약간 과압으로 충전시켜 액체 약제학적 조성물의 산화적 파괴를 억제하고/늦추고, 크라운-캡 크림퍼(Aldrich Z112976)를 사용하여 테플론/실리콘 라이너를 갖는 플라스틱 캡 또는 중앙 테플론 라이닝된 실리콘 격벽을 갖는 플라스틱 캡으로 밀봉시켜 기밀 밀봉을 제공한다.

실시예 2

안정한 설파이드 및 감소된 설파이드를 갖는 산소 비함유 환경에서 제조된 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물

산소화 생성물

설파이드에 산소화하여 도 1 및 2에 도시된 것들을 포함하여 각종 산화 생성물을 생성한다[참조: Chen et al., Environ. Sci Technol. (1972), p. 529-537; Kotronarou et al., Environ. Sci Technol. (1992), p. 2420-2428; Beaucham et al., Critical Reviews in Toxicology (1984); p. 25-97)].

산소 비함유 환경을 수득하기 위해 질소 기체로 충전된 염기성 글로브 박스 중의 흄 후드에서 제조될 경우, 액체 약제학적 조성물 IV의 3개의 제형의 안정성을 시험하였다. 이 연구에서, 글로브 박스 중 및 용액 중의 산소 수준은 감도 수준 0.03μM로 산소 측정기(Mettler-Toledo)로 모니터하였다. 액체 약제학적 조성물은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.

(1) 97mM, pH 7.62, 273mOsm; (2) 98mM, pH 7.71, 291mOsm; 및 (3) 98mM, pH 7.75, 276mOsm을 포함하는 액체 약제학적 조성물 IV의 세 개의 제제를 제조하였다. 산소 비함유 환경에서 제제가 설파이드 안정성을 향상시키고 측정가능한 산화 생성물을 감소시키는지를 측정하기 위해 시험하였다. 액체 약제학적 조성물은 질소 기체로 플러슁하여 박스 중의 산소 함량을 최소화 한(0.02μM) 밀봉 글로브 박스 중의 반응기 장치로 제조하였다. 비경구 액체 약제학적 조성물의 설파이드 수준 및 산화 생성물(폴리설파이드, 설파이트, 티오설페이트, 설페이트 및 공지되지 않은 피크)을 129일 동안 분석하였다.

설파이드는 이온 선택적 전기화학(ISE)으로 측정하였다. 이온 선택적 전기화학(ISE)은 이온 종을 측정하는 기법이다. 전극은 이온 종에 특이적인 멤브레인을 함유하고, 이때 이온은 멤브레인의 표면에 결합한다. 멤브레인에 결합된 이온량은 용액 중의 이온의 농도에 좌우되는 전위차를 설정한다. 설파이드 수준은 측정 시간에 대한 대조군 100%에서 유지시킨다(도 3).

설파이트, 티오설페이트 및 설페이트는 이온 크로마토그래피(IC)로 분석했고, 0, 8, 22, 30, 37, 51, 72, 100 및 129일에 분석하였다. 이온 크로마토그래피(IC)는 이온 종의 분석용으로 사용되고, 이상 시스템 주의 샘플 성분의 시차 이동을 측정한다. 정지상과 덜 상호작용하는 샘플 성분은 컬럼 중에서 시간을 덜 소비한다. 이온이 컬럼 중에서 주입으로부터 검출까지 소비하는 시간은 성분 본체의 척도인 보유 시간으로 공지되는 반면, 피크 높이 또는 면적은 성분 농도의 척도이다. 분석에서 설페이트에 대한 검출 상한치는 0.08% 미만이었고, 설페이트 전위값의 범위는 0 내지 0.08% 미만인 것으로 고려되었다. 폴리설파이드는 증류된 H₂O에 비해 370nM에서 스펙트라맥스로 측정하였다[참조: Weiss, J. and Weiss T. Handbook of Ion Chromatography; Wiley, Third Edition (2005); O'Brien D. J. et al., Environ. Sci. Technol. 1977, p. 1114-1120; Hoffmann M. R., et al., Environ. Sci. Technol. 1979, p. 1406-1414; Tossell, J.A, Chemical Geology. 1997, p. 93-103; Chen, K. Environ. Sci. Technol. 1972, p. 529-537; Kotronarou A. et al., Environ. Sci. Technol. 1992, p. 2420-2428]. 검출된 산화 생성물의 양은 도 5a에 도시하였다.

실시예 3

DTPA의 존재 또는 부재하에 폴리설파이드의 형성에 의해 측정된 액체 약제학적 조성물 IV의 안정성

설파이드의 액체 약제학적 조성물의 안정성을 향상시키는 합성 킬레이트의 능력을 시험하였다. 2개의 액체 약제학적 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)을 산소 비함유 환경을 수득하기 위해 질소 기체로 충전된 염기성 글로브 박스 중의 흄 후드 중에서 제조하였다. 액체 칼코게나이드 조성물은 pH 측정 및 기체 첨가용 출입구 및 외부 대기와 접촉하지 않고 분배하는데 이용가능한 입구를 갖는 액체 칼코게나이드 조성물을 유지하기 위한 초점판 유리 용구(용기)가 장착된 3구 플라스크가 함유된 밀봉 용기에서 제조하였다. 용기를 질소 기체 또는 아르곤 기체로 플러슁하여 산소 함량을 최소화하였다. 이들 약제학적 조성물에서, 최종 설파이드 농도는 NaOH의 초기 농도로 측정하였다.

NaOH 용액을 안정성을 향상시키기 위해 임의의 첨가제를 첨가하지 않거나 DTPA를 사용하여 3구 플라스크에 위치시켰다. 두 제형은 몰삼투압 농도를 균형시키기 위한 NaCl을 함유하고, 용액은 교반하면서 15분 동안 5psi에서 아르곤으로 용해시켜 탈산소화시켰다. 글로브 박스 중의 산소 수준은 감도 수준 0.03μM로 산소 측정기(Mettler-Toledo)를 사용하여 모니터하였다. 설파이드 H₂S 97mM의 시험된 액체 약제학적 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)을 합성 킬레이트제인 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)(1mM)을 사용하거나 사용하지 않고 제조하였다. 설파이드 및 폴리설파이드 수준은 피크 흡광도 370㎚에서 분광 광도계(Spectromax)를 사용하여 0, 8, 22, 30, 37, 51, 72, 100 및 129일에 측정하였다. 도 4에 예시된 바와 같이, 1mM DTPA의 존재는 129일에 제형 중의 설파이드의 안정성을 향상시킨다.

산화 생성물 설파이트(uM), 설페이트(uM), 티오설페이트(uM) 및 37분에 측정된 공지되지 않은 생성물(U)을 129일에 측정하였다. 도 5a 및 5b에 도시한 바와 같이, 1mM DTPA의 존재는 129일에 산화 생성물 수준을 감소시킨다. 폴리설파이드 형성은 129일 말기에 총 설파이드 농도의 0.03% 미만에서 측정한다.

실시예 4

pH는 설파이드의 액체 약제학적 조성물 중에서 안정하다.

황화수소는 약한 이양성자산이고, 용액 중에 3개의 형태(H₂S, HS- 및 S₂-)로 존재한다. 용액 중 황 종의 비는 pH에 의존한다. HS-는 기본적인 종이다. H₂S는 pH 7 이하에서 우세한 종이다(참조: O'Brien D. J. et al., Environ. Sci. Technol. 1977, p. 1114-1120).

액체 약제학적 조성물 IV 중의 설파이드의 약제학적 안정성을 시험하기 위해, pH를 129일 동안 특정 시점에서 측정하였다. 설파이드 100mM H₂S의 액체 약제학적 조성물(액체 약제학적 조성물 IV)을 박스 중의 산소 함량(0.02μM 미만에서 측정됨)을 최소화하기 위해 질소 기체로 플러슁한 밀봉된 글로브 박스 중의 반응기 장치 중에서 제조하였다. pH를 pH 측정기(Thermo Electron Corp.)를 사용하여 0, 8, 22, 30, 37, 51, 72, 100 및 129일에 측정하였다. pH는 평균치 7.68 ± 0.04(평균 + 표준편차)로 129일 동안 안정하였다(도 6).

각종 공업적으로 허용되는 온도 및 지속 시간에서 저장 후 농도, pH 및 몰삼투압 농도를 포함하는 적정 제조 실시(GMP) 허용 기준을 충족시키는 황화나트륨의 액체 약제학적 조성물을 제조하였다.

실시예 5

액체 약제학적 조성물 IV의 투여 후 래트 뇨에서 설파이드 및 산화 생성물의 검출

뇨 중의 설파이드의 산화 생성물의 대사 프로필을 설치류 중에서 측정하였다. 산화 생성물 티오설페이트 및 설페이트의 수준은 액체 액제학적 조성물 IV((98mM 설파이드, pH 7.65, 293m/Osmol)의 볼루스의 정맥내 투여 후 래트 뇨에서 측정하였다.

10 내지 11주령 200 내지 250g의 자성 스프라그 다울리 래트(Taconic, Prunedale, CA)를 마취하고(100mg/kg 케타민 및 10mg/kg 크실라진), 2개의 경정맥 카테터(JVC) 및 하나의 요도 캐뉼라를 이식하였다. 실험 기간 동안 마취를 유지시켰다. 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 투여량(0.5mg/kg)을 경정맥 카테터를 통해 주입하였다. 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 실험 기간 동안 3mL/hr의 속도로 주입 펌프(Harvard Apparatus)를 사용하여 주입하였다. 뇨 샘플을 주입 전(시간= 0)에 및 투여 후 및 분석을 위해 4℃에서 저장 후 60분 이하 동안 15분 간격으로 수집하였다.

뇨 티오설페이트 및 설페이트 수준은 이온 크로마토그래피(Metrohm AG 861 IC, Metrosep A supp 5 column)로 분석하였다. 뇨 샘플을 IC 용출제(3.2mM 탄산나트륨/1.0mM 중탄산나트륨)으로 1:20 희석하였다. 60분 말기에, 배설된 티오설페이트의 수준은 배설된 300μM로 증가하였다(도 7a). 배설된 설페이트의 수준은 60분 동안 평균 22 ± 3mM이었다(도 7b). 이들 데이터는 설파이드 산화 생성물 티오설페이트 및 설페이트가 뇨에서 배설되고, 이온 크로마토그래피로 검출될 수 있음을 나타낸다.

실시예 6

액체 약제학적 조성물 IV의 투여 후 래트 혈액 중의 설파이드 및 티오설페이트 검출

설파이드 및 티오설페이트 수준을 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스의 정맥내 투여후 유도체화 방법 및 GC-MS 분석을 사용하여 래트 혈액 중에서 측정하였다.

하나의 경정맥 카테터(JVC) 및 하나의 목동맥 캐뉼라(CAC)를 갖는 3마리의 10 내지 11주령 (326 내지 350g) 웅성 스프라그 다울리 래트(Taconic, Prunedale, CA)를 시험하였다. 동물들을 회복시키고, 실험 절차 개시 전에 5 내지 6일 동안 온도 및 습도 조절된 환경에 순응하도록 하였다. 음식 및 물을 무제한으로 제공하였다.

기준선 혈액 샘플(약 0.3ml)을 각 래트로부터 목동맥 캐뉼라를 통해 23g 루어 스텁(Luer stub) 어댑터가 장착된 헤파린 피복된 1ml 시린지로 수집하였다. 샘플링 후, 상응하는 용적의 염수를 목동맥 캐뉼라를 통해 동물에게 서서히 주입한 후, 100㎕의 헤파린 용액(헤파린화 덱스트로스 50IU/ml)을 주입하였다. 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 투여량(1mg/kg 정맥내)(98mM 설파이드, pH 7.65, 293mOsm)을 경동맥 카테터를 통해 주입하였다. 혈액(약 0.3mL)을 23g 루어 스텁(Luer stub) 어댑터가 장착된 헤파린 피복된 1mL 시린지를 사용하여 목동맥 카테터를 통해 투여 후 즉시 수집하였다. 혈액 샘플을 상기한 바와 같이 즉시 처리하였다. 샘플링 후, 상응하는 용적의 염수를 목동맥 카테터를 통해 동물에 서서히 주입하였다. 혈액 샘플링을 주입한 지 10분, 30분, 60분, 2시간 및 4시간 후에 반복하였다.

0.2ml의 래트 혈액을 시린지를 사용하여 인출하고, 즉시 5% NaCl 용액, 200mM 아스코르브산 용액(새로 제조됨), 아세톤 중의 20mM 펜타플루오로벤질브로마이드(PFBBr) 용액을 함유하는 9ml 갈색 바이알에 첨가하였다. 당해 제제를 스크류 캡(PTFE-라이닝 격막 포함)으로 밀폐시키고, 1분 동안 와동시켰다. 혼합물을 15분 동안 배양시킨 다음, 각 바이알에 나트륨-테트라보레이트로 포화된 산소 비함유 수 중의 5mM 테트라데실디메틸벤질암모늄 클로라이드 용액, 에틸아세테이트 중의 25mM 요오드 용액, 에틸아세테이트 중의 50mM 펜타플루오로벤질브로마이드 용액을 첨가하였다. 제제를 30초 동안 와동시킨 후, 5분 동안 배양시켰다. 이어서, 100mg의 인산이수소칼륨을 첨가하고, 용액을 30초 동안 와동시켰다. 이어서, 용액을 1시간 동안 배양시켜 반응을 완료한 후, 2500rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상청액(유기 상)을 제거하고, GC/MS로 분석하기 위해 건조시켰다(참조: Kage, et al., Journal of Forensic Science (1988) 33:217; Kage, et al, Journal of Analytical Toxicology (1991) 15:148).

이러한 결과는 PFB-Br 유도체화 방법을 사용하여 설파이드 및 티오설페이트가 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 투여량으로 정맥내 주입된 래트의 혈액에서 동시에 검출될 수 있음을 보여준다(도 8a 및 8b). 설파이드 수준은 10분에서 Cmax와 함께 240분 연구 기간 동안 혈액으로부터 회복하였다(도 8b).

실시예 7

액체 약제학적 조성물은 저산소성 상태하의 생존을 향상시킨다.

기상 H₂S에 의한 처리가 저산소 조건하에 생존하는 동물의 능력을 향상시킨다는 것을 보여준다. 그러나, 특정 상황하에, 예를 들어, 먼위치에서 즉시 생명 위협적인 손상이 발생하면, 환자가 액체 약제학적 칼코게나이드 조성물로 치료하도록 할 수 있는 것이 매우 유리하다. 액체 설파이드 조성물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 저산소 환경에서 생존하는 동물의 능력을 향상시키는 이들의 능력을 시험하였다.

한 세트의 실험에서, 3개의 상이한 액체 약제학적 조성물을 1mL 또는 5mL 루어-록(Luer-Lok) 시린지(Becton Dickison)를 사용하여 액체 설파이드 액체 약제학적 조성물을 동물에 주입하여 5 내지 6주령 웅성 C57BL/6 경정맥 카테터화(JVC) 마우스(Taconic)에서 시험하였다. BMDS(Bio Medic Data Systems)으로부터의 IPTT-300 트랜스폰더를 사용하여 체온을 모니터하였다. 트랜스폰더를 적어도 실험 24시간 전에 동물의 등에 피하(S.C.) 주사하였다. BMDS로부터 DAS-6008 데이터 수집 모듈은 트랜스폰더를 통해 마우스의 체온을 기록하고, 데이터를 컴퓨터 스프레드시트로 입력하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.

각 마우스에 주입 펌프(Harvard Apparatus)를 사용하여 유치 도관을 통해 액체 약제학적 조성물을 투여하였다. 피부에 이식된 온도 칩이 33℃의 체온을 등록할 때까지 주입하였다. 마우스가 온도가 33℃로 강하되기 전에 고통의 사인을 나타내면, 주입을 10분 동안 정지하고, 이전 속도보다 느린 속도로 재시작하였다. 동물의 온도가 33℃ 이하로 강하되면, 주입을 정지하고, 마우스를 저산소 대기(4.0% O₂)로 옮겼다.

제1 실험에서, 마우스(ID: MJVC07)에 pH 7.75의 액체 Na₂S 용액(액체 약제학적 조성물 I)을 주입하였다. 이 실시예에서, 액체 약제학적 조성물 I은 탈이온화된 탈산소화 H₂O 중의 Na₂S의 포화된 스톡을 희석하고, 이 용액을 최소한의 공기 접촉으로 pH 모니터링 및 기체 첨가를 가능하게 하는 초점판 유리 용구가 장착된 3구 플라스크에서 30분 동안 교반하면서 100% N₂로 용해시켜 탈산소화시킴으로써 제조하였다. 용액의 pH는 N₂로 용해시키고 교반하면서 220mM HCl를 사용하여 7.75로 조정하였다. 최종 용액(액체 약제학적 조성물 I)을 최소 공간을 사용하여 갈색 바이알로 아르곤하에 분배시키고, 테플론/실리콘 라이너 또는 격막을 사용하여 캡으로 밀봉시켰다. 액체 약제학적 조성물 I를 제조하는데 사용되는 Na₂S의 포화된 스톡은 탈이온화된 탈산소화 H₂O 1ml 당 약 1.0g 세척된 Na₂S 결정을 용해시킴으로써 자체 제조하였고, 이 스톡을 긴밀하게 마개를 하여 저장하고, 광으로부터 보호하였다.

피부에 이식된 온도 칩이 체온 33℃를 등록할 때까지 마우스에게 액체 약제학적 조성물 I의 0.8mM/kg H₂S의 유효 투여량을 60분 동안 6.4μL/분의 주입 속도로 주입하였다(도 9), 이어서, 주입을 정지하고, 동물을 1분 이내에 저산소 대기(4.0% O₂)에 위치시켰다. 1시간 말기에, 마우스를 저산소 챔버로부터 제거하고, 우리에 넣고 모니터하였다. 마우스는 처리후 전혀 고통의 신호를 나타내지 않았다. 대조적으로, 대조군 비히클로 처리된 마우스는 사망하였다(도 10).

제2 실험에서, 마우스(ID: MCAT08)에게 pH 8.2의 Na₂S(액체 약제학적 조성물 II)를 주입하였다. 액체 약제학적 조성물 II는 탈이온화된 탈산소화 H₂O 중의 Na₂S의 포화 스톡을 41mM의 농도로 희석하고, 당해 용액을 초점판 유리 용구가 장착된 3구 플라스크 중에서 30분 동안 교반하면서 100% N₂로 용해시켜 탈산소화시켜 제조하였다. NaCl을 첨가하여 용액의 최종 몰삼투압 농도를 300mOsmol/L로 조정하였다. pH는 N₂ 및 CO₂의 50/50 혼합물로 용해시켜 조정하였다. 최종 용액(액체 약제학적 조성물 II)은 공기 중에 최소한 노출시키면서 최소한의 공간을 사용하여 갈색 바이알 또는 병에 분배시키고, 테플론/실리콘 라이너 또는 격막을 사용하여 캡으로 밀봉시켰다.

마우스에게 초기 주입 속도 8μL/분으로 62분 동안 주입하였다. 30분 주입 후, 관찰된 고통 사인으로 인해 주입을 4μL/분으로 감소시켰다. 4μL/분으로 12분 주입 후, 체온이 33℃로 강하될 때까지 주입 속도를 6μL/분으로 증가시켰다. 주입을 중지하고, 동물을 5분 이내에 저산소 대기(4.0% O₂)에 위치시켰다. 마우스는 저산소 대기에서 60분 동안 생존하였다.

제3 실험에서, 마우스(ID: MJVC03)에게 Na₂S(H₂S 및 질소로 완충됨), 액체 약제학적 조성물 III, pH 8.35를 주입하였다. 이 실시예에서, 액체 약제학적 조성물 III은 Na₂S의 포화된 스톡을 65mM로 희석시키고, 희석된 용액을 초점판 유리 용구가 장착된 3구 플라스크에서 30분 동안 교반하면서 100% N₂로 용해시켜 탈산소화시키고, 당해 용액을 N₂ 및 H₂S의 50/50 혼합물로 용해시켜 pH 조정하여 제조하였다. 최종 용액(액체 약제학적 조성물 III)을 공기에 최소한 노출시키면서 최소한의 공간을 사용하여 갈색 용기 또는 병로 분배시키고, 테플론/실리콘 라이너 또는 격막을 사용하여 캡으로 밀봉시켰다.

마우스에 Na₂S(H₂S 및 질소로 완충됨), 액체 약제학적 조성물 III을 60분 동안 4.3μL/분의 주입 속도로 주입하였다. 체온이 33℃로 강하될 경우, 주입을 정지시키고, 동물을 1분 이내에 저산소 대기(4.0% O₂)에 위치시켰다. 마우스는 4.0% 저산소증에서 53분 동안 생존하였다.

마우스가 액체 H₂S로 처리될 경우에 수득된 결과와 대조적으로, 비히클(10μL/분)이 주입된 대조군(순수한) 웅성 C57BL/6 마우스(체중 22g)는 단지 0.06±0.38℃의 평균 온도 강하로 4.0% O₂에서 평균 단지 7분 동안 생존하였다.

또다른 실험에서, 액체 약제학적 조성물(50mM H₂S)(액체 약제학적 조성물 IV), pH 7.9의 보호 효과를 임의의 실험 화합물에 대해 순수한 삽관형 웅성 스프라그 다울리 래트(RJVC40)(310g, Taconic)로 시험하였다. 동물에게 유치 혈관 도관을 외과적으로 이식하고, 절차 전에 스트레스 및 질환의 신호에 대해 시험하였다. 동물을 절차 이전에 칭량하고, 케이지 카드 위에 중량을 적었다. Bio Medic Data Systems(BMDS)으로부터의 IPTT-300 트랜스폰더를 사용하여 체온을 모니터하였다. 트랜스폰더를 실험 24시간 이상 전에 동물의 등에 피하(S.C.) 주입하였다. BMDS로부터 DAS-6008 데이터 수집 모듈은 트랜스폰더를 통해 래트의 체온을 기록하고, 데이터를 컴퓨터 스프레드시트로 입력하고, 시간에 대해 플롯팅하였다.

고통의 신호 및 피하로 이식된 IPTT-300 트랜스폰더로 측정된 체온의 감소를 모니터하면서 래트에 주입 펌프(Harvard Apparatus)를 사용하여 283분 동안 유치 도관을 통해 50mM H₂S(액체 약제학적 조성물 IV), pH 7.9를 주입하였다. 출발 주입 속도는 6.5μL/분이었고, 이를 피부에 이식된 온도 칩이 체온 33℃를 등록할 때까지 15분 마다 6.5μL/분씩 증가시켰다. 동물이 고통의 신호를 나타낼 때 10분 동안 주입을 정지하고 이전 속도보다 느린 13.0μL/분의 속도로 재시작하였다. 체온이 33℃로 강하되면, 주입을 정지하고 동물을 8분 이내에 저산소 대기(3.5% O₂)로 옮겼다. 동물은 32분 동안 생존하였다. 측정된 체온은 저산소 챔버에서 2.5℃ 강하하였다.

4개(순수한)의 웅성 SD 래트(평균 중량 342g; Harlan)의 대조군은 1.6 ± 0.2℃의 평균 체온 강화와 함께 3.5% O₂에서 평균 15±4분 생존하였다.

이러한 실험은 황화수소의 액체 약제학적 조성물이 동물에 대해 보호 효과를 갖고, 이는 저산소 조건하에 생존하는 이들의 능력을 향상시킨다는 것을 입증한다. 이 결과는 추가로 H₂S의 액체 약제학적 조성물의 투여가, 예를 들어, 손상 또는 질환에 의해 유도된 저산소 또는 허혈 상태로 고통받고 있거나 고통받을 위험에 있는 환자에게 유리하고, 저산소 또는 허혈 손상으로부터 생물학적 물질을 보호하고 저장하는 수단을 제공한다는 것을 입증한다.

실시예 8

설파이드의 액체 약제학적 조성물은 뮤린 간 허혈-재관류 손상 모델에 간 손상으로터의 세포보호 이점을 제공한다.

간 허혈-재관류(I/R) 손상 모델에게 세포보호 이점을 제공하는 설파이드의 액체 약제학적 조성물의 능력을 마우스에게 시험하였다. 이 연구에서, 후-간 허혈 및 5시간 재관류 시간 직전에 액체 약제학적 조성물 IV(설파이드, 95mM, pH 7.92)의 복강내 볼루스 투여가 혈청에서 측정된 간 트랜스아미나제 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)를 감소시키고 조직병리학 등급을 향상시킨다는 것이 입증된다. 대조적으로, 비히클에 의한 처리는 간 I/R 손상에 어떤 보호 이점도 제공하지 않았다.

이 연구에 사용된 마우스는 C57-BL6/J 마우스, 8 내지 10주령(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)이었다. 음식 및 물을 무제한 제공하였다. 시험 동물을 실험 절차 개시전에 온도 및 습도 조절 환경에 순응하도록 하였다.

마우스를 케타민 및 크실라진으로 마취시키고, 수술 절차 동안 가온된 채로 유지시켜 간 허혈-재관류(I/R) 손상을 유도하였다. 구체적으로, 중선 절개를 수행하여 간을 노출시키고, 헤파린을 주입하여 혈액 응괴를 억제하였다. 간동맥 및 문맥 둘 다 허혈 간의 좌측 양엽 및 중간엽을 제공하기 위해 미세동맥류 클램프로 고정시켰다. 간을 이의 최초 위치 중의 복강에 유지시키고 0.9% 생리식염수가 스며든 거즈로 수분을 유지시키면서 허혈을 45분 동안 진행시켰다. 대조군 마우스는 간 혈류가 미세동맥류 클램프로 감소되지 않았지만, 모의 수술하였다. 45분 말기에, 미세동맥류 클램프를 제거하였다. 혈청 간 트랜스아미나제 수준(AST 또는 ALT)은 분광 광도계 및 시판되는 시약(Sigma-Aldrich)을 사용하여 5시간 간 재관류후 시험하였다.

뮤린 간 허혈-재관류 손상 시험 동물은 4개 그룹으로 무작위화하였다. 그룹 1: 비히클 처리됨; 그룹 2: 0.3mg/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리; 그룹 3: 1.0mg/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리 및 그룹 4: 3.0mg/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리. 도 11에 도시된 바와 같이, AST 수준은 최고 시험 농도(3.0mg/kg)에서 통계적으로 상당히 감소되었다. ALT 수준은 비히클에 비해, 3개의 처리 그룹(0.3mg/kg, 1.0mg/kg 및 3.0mg/kg)에서 감소되었다.

실시예 9

설파이드의 액체 약제학적 조성물은 뮤린 심근 허혈 재관류 모델에서 심장보호 이익을 제공한다.

심근 허혈-재관류(I/R) 손상 모델에서 심장보호 이점을 제공하는 설파이드의 액체 약제학적 조성물의 능력을 마우스에게 시험하였다. 이 연구에서, 허혈후 및 24시간 재관류 5분 전에 좌심실 내강에 액체 약제학적 조성물 IV(95mM, pH 7.65)의 볼루스 투여가 심근 허혈을 감소시키고, 위험 면적 퍼센트로서 심근 경색 크기를 감소시킨다는 것을 보여준다. 관련 연구에서, 연구 개시 24시간 전에 액체 약제학적 조성물 IV의 컨디셔닝전 볼루스 투여량 투여가 심근경색 크기(위험 영역의 퍼센트로서)(심근경색)를 감소시켰다(도 16). 대조적으로, 비히클에 의한 처리는 심근 I/R 손상에 어떤 보호 이점도 제공하지 않았다.

이 연구에 사용된 마우스는 C57-BL6/J 마우스, 8 내지 10주령(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)이었다. 음식 및 물을 무제한 제공하였다. 시험 동물을 실험 절차 개시전에 온도 및 습도 조절 환경에 순응하도록 하였다.

마우스를 케타민 및 펜타바르비탈 나트륨으로 마취시키고, 수술 절차 동안 가온된 채로 유지시켜 심근 허혈-재관류(I/R) 손상을 유도하였다. 마우스를 수술판 위에 복면 위치시키고, 경구 인튜베이션하고, 모델 683 잠식성 호흡기(호흡 용적: 2.2mLs, 호흡 속도: 호흡기 측면 배출구를 통해 산소 공급으로 1분당 122회 호흡)(Harvard Apparatus)에 결합시켰다. 가슴을 개방하고, 기저 좌주 간부 관동맥을 노출시키고 결찰시켰다. 심근 및 관상동맥 폐색을 30분 동안 유지시키고, 봉합 제거 및 24시간 재관류시켰다.

24시간 재관류 후, 허혈후 마우스를 마취시키고, 인튜베이션하고 잠식성 호흡기에 결합시켰다. 에반스 블루 염료를 통상의 목동맥에 실로 꿰어진 카테터에 주입하였다. 정중 흉골절개술을 수행하고, 좌주 간부 관동맥을 이전과 동일한 위치에서 재결찰시켰다. 비허혈 영역으로부터 허혈 영역의 분리는 에반스 블루 염료로 가시화하였고, 심장을 절제하고, 단축을 따라 5개의 1mm 단락으로 연속 절개하고, 이를 37℃에서 5분 동안 1.0% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(Sigma-Aldrich)에서 배양하여 위험 영역 내에서 가시 심근 및 비가시 심근을 분리하였다. 5개의 심근 조각(1mm)을 각각 칭량하고, 위험 영역(AAR)인 심근 면적 및 비허혈 좌심실을 샘플 확인에 무감각한 관찰자에 의해 컴퓨터 보조된 측면법으로 평가하였다. 좌심실 위험 면적(AAR) 및 경색 크기 측정에 대한 모든 절차는 문헌(참조: Jones, S. P. et al. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (2004)). 286:H276- H282)을 참조한다.

데이터는 StatView software version 5.0(SAS Institute)를 사용하여 사후 본페로니 분석을 사용하는 2원 배치 분산 분석(2-way ANOVA)으로 분석하였다. 데이터는 평균±SEM으로서 기록한다. 0.05 미만의 p 값은 유의적인 것으로 간주한다.

10 내지 13마리 동물의 뮤린 심근 허혈 재관류 모델 시험 그룹은 4개의 시험 처리 그룹으로 무작위화하였다. 그룹 1: 비히클 처리됨; 그룹 2: 50㎍/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리; 그룹 3: 100㎍/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리; 및 그룹 4: 500㎍/kg 액체 약제학적 조성물 IV 처리. 이 연구에서, 30분 허혈 및 24시간 재관류 5분 전에 좌심실 내강에 액체 약제학적 조성물 IV(97mM, pH 7.65)의 볼루스 투여는 50㎍/kg 및 100㎍/kg의 투여량이 투여된 처리 그룹에서 위험 면적 퍼센트로서 심근 경색 크기를 감소시킨다(도 12). 4마리의 동물이 최고 시험 농도(500㎍/kg)로 처리후 생존하였다. 비히클은 심근 I/R 손상에 어떤 보호 이점도 제공하지 못하였다.

제2 실험에서, 동물을 수술 및 허혈 24시간 전에 액체 약제학적 조성물 IV의 볼루스 투여량으로 전처리하였다(컨디셔닝 전 투여). 액체 약제학적 조성물에 의한 전처리는 상당한 경색 크기의 감소로 측정된 바와 같이 심근 괴사(100㎍/kg)에 대한 보호를 제공하였다(도 16).

실시예 10

거대 포유동물에서 경도의 저체온증을 유도하는 액체 약제학적 조성물 IV의 방법 및 용도

액체 약제학적 조성물 I, II, III 및 IV가 설치류의 중심 체온을 억제한다는 것이 이미 입증되었다(실시예 7). 경도 저체온증의 유도는 심장 수술 중인 환자의 완전 허혈로부터의 신경보호제로서 및 재관류 손상을 감소시키기 위해 심장 마비에 사용되어 왔다(참조: Nolan et al., Circulation. (2003), 108:118-1210). 이 연구에서, 액체 약제학적 조성물 IV가 경도 저체온증 모델에서 거대 동물의 체온을 감소시킨다는 가설이 확립되었다. 액체 약제학적 조성물 IV를 60분 동안 자성 피그의 두 코호트에 투여하고, 체온 변화율을 경시적으로 측정하였다.

자성 피그(20 내지 25kg)를 실험동물의 관리와 사용에 대한 지침에 기술된 바와 같이 적절하게 보호하면서 수용하였다. 온도 61 내지 81℉ 및 상대습도 30 내지 70%를 유지하도록 환경 조절을 설정하였다. 12시간 명/암 주기를 사용하고, 방은 시간당 최소 10회 신선한 공기 변화를 수행하였다.

동물은 근육내(IM) 투여된 케타민(20mg/kg)과 크실라진(2.0mg/kg)의 배합물로 마취시켰다. 이어서, 각 동물을 즉시 인튜베이션하고, 흡입성 이소플루란(0.5 내지 2.5%)에 의한 마취작용하에 유지시켰다. 흡입성 마취제를 용적 조절 호흡기 또는 재호흡 장치를 통해 전달하였다. 락테이트화 링거 용액(10 ml/kg/hr) 및 임의의 필수 비상 약물(약물, 투여량, 경로 및 투여 위치는 수술 파일에 기재되어 있다) 투여용 정맥 카테터를 경정맥에 위치시켰다. 이소플루란 농도, 산소 비율, SaO₂%, 맥박수, 호흡 속도 및 모세혈관 회복 시간을 15분마다 손으로 기록하였다. 혈압 및 EKG를 연구내내 모니터하였다. 중심 체온은 중심 체온을 습득하기 위해 동물의 식도에 삽입된 식도 온도 프로브를 사용하여 모니터하였다.

5 내지 6마리 동물의 두 코호트를 상기한 바와 같이 마취시켰다. EKG, 동맥 혈압 및 중심 (복부) 온도를 측정하였다. 동물을 30분 기준 시간 동안 마취하에 유지시켰다. 30분 기준 시간 후, 시험 피그를 60분 동안 링거 용액을, 개별적인 정맥 라인을 통해 비히클 또는 링거 용액 및 개별적 정맥 라인을 통해 액체 약제학적 조성물 IV를 주입하였다(2.5mg/kg/hr). 동물을 60분 주입 시간 동안 관찰하였다. 중심 온도는 1초 간격으로 측정하였다. 60분 말기에, 동물을 마취로부터 회복되기 전 30분 동안 관찰하였다.

중심 온도를 간 바로 아래 복부에 위치된 온도 프로브로 기록하였다. 데이터를 PowerLab 데이터 습득 장치 및 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터에서 직접 습득하였다. 차거운 링거 락테이트의 1시간 주입 동안 기록된 데이터 점은 회귀 분석용 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)로 보냈다.

총 온도 변화 및 변화 속도(회귀선 경사)에 대한 그룹 평균을 계산하고, 스튜던츠 T-시험(Student's T-test)으로 비교하였다.

이들 실험은 피그(20 내지 25kg)에서, 액체 약제학적 조성물 IV가 저체온증 유도 치료에 의해 유도되는 저체온증 정도를 향상시킨다는 것을 입증한다. 액체 약제학적 조성물의 투여는 비히클과 비교시 중심 체온에 통계적으로 유의적 변화를 생성한다(도 13a 및 13b). 데이터는 액체 약제학적 조성물 IV가 거대 동물에게서 저체온증을 유도하는데 효과적임을 입증한다.

실시예 11

액체 약제학적 조성물 IV는 피그에서 심근경색 모델 중의 국소허혈을 감소시킨다.

심근 허혈-재관류(I/R) 손상 모델에서 심장보호 이점을 제공하는 설파이드의 액체 약제학적 조성물의 능력은 피그에서 시험하였다. 이 연구에서, 허혈후(120분 재관류 시간 5분 전에 개시) 좌심실 내강으로 액체 약제학적 조성물 IV(100mM, pH 7.80, 292mOsm)의 60분 주입에 따른 볼루스 투여가 심근 허혈을 감소시키고, 위험 면적 퍼센트로서 심근경색 크기를 감소시킨다는 것을 보여준다. 대조적으로, 비히클에 의한 처리는 심근 I/R 손상 모델에 어떤 보호 이점도 제공하지 못하였다.

동물을 개별적으로 수용하였다. 음식과 물을 무제한 제공하였다. 모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을 규제하는 미국 국립 건강 연구소 지침에 따른다.

여섯마리(35 내지 45kg)의 피그를 케타민 하이드로클로라이드(20mg/kg)로 근육내 진정시키고, 나트륨 펜토바르비탈(25mg/kg)로 정맥내 마취시켰다. 이소플루란으로 구성된 일반적 마취작용을 실험 내내 유지시켰다. 용적 순환 통풍기를 사용하여 기관내 인튜베이션을 통해 환기(산소 40%; 호흡 용적 1000mL; 환기 속도, 12회 호흡/분; 양성 말단 호기압, 3cm H₂O; 흡입 대 호기 시간 비, 1/2)를 제공하였다. 우측 대퇴정맥에 정맥내 접근 및 IV 주입을 위해 삽관하고, 우측 총 또는 표재성 대퇴동맥에 동맥 혈액 샘플링 및 동맥간 혈압 모니터를 위해 삽관하였다. 헤파린 나트륨 및 1% 리도카인을 개흉술 전에 투여하였다. 헤파린을 실험 말기까지 30분마다 투여하였다. 심낭을 정중 흉골절개술을 통해 노출시키고, 절개하여 심막요람을 형성하였다. LV 압력을 기록하기 위해 카테터 팁화 압력계를 끝을 통해 좌심실(LV)에 도입하였다. 혈관 루프를 관상동맥을 내려가는 좌측 전방의 3번째 말단 주위에 또는 적합한 혈관 노출 후 이의 거대한 사선 분지로 장착시켰다. 관상동맥은 혈관 루프를 팽팽하게 하여 폐색시킨 다음, 모스키토 클램프로 고정시켜 안전하게 하였다. 심근 허혈은 심근 표면의 국소적 청색증에 의해 가시적으로 확인하였다.

피그를 무작위로 그룹으로 나누고, 45분 국소 허혈(폐색) 후 120분 재관류시켰다. 동맥압(수축기압, 확장기압, 평균 혈압), 심박수, 단편 단축률(LV dP/dt) 및 심근 조직 유량을 Acquire Plus processor board 및 좌심실 압력 분석 소프트웨어 및 Gould ECG/Biotach를 사용하는 실험(PO-NE-MAH 디지탈 데이터 획득 시스템, Gould, Valley View, OH)을 통해 연속적으로 획득하였다. 액체 약제학적 조성물 IV 또는 비히클을 재관류 시간 동안 60분 동안 계속 주입하면서 관상동맥 클램프 제거 시작 5분 전에 개시 투여(볼루스(100mcg/kg) 및 1mg/kg/h 주입)하였다.

국소 심근 기능은 심장의 단축에 평행하게 위치되어 폴리프로필렌 스티치(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)로 외막에 고정된 2개의 쌍을 갖는, 허혈 면적 내에서 약 10mm 떨어진 심장내막밑 층에 이식된 초음파 프로브(2.0mm)를 사용하여 초음파미세측정법(Sonometrics Corp., London, ON, Canada)으로 평가하였다. 프로브를 실험 말기까지 적소에 두었다. 후처리 소프트웨어(SonoView, Sonometrics Corp., London, ON, Canada)를 사용하여 말단-확장기 및 말단-수축기 지점의 올바른 확인을 위해 디지탈 데이터를 조사하였다.

3개 이상의 심장 주기에 대해 정상 동성 리듬으로 측정한 다음 평균하였다. 호흡 효과를 제거하기 위해 데이터 습득 동안 통풍기를 정지시켰다. 말단 확장기 단편 길이(EDL)를 양성 LV dP/dt 개시시에 측정하고, 말단-수축기 단편 길이(ESL)를 피크 네가티브 dP/dt에서 측정하였다. 국소 수축성은 단편 단축화(SS)로 평가하였다. 벽 운동 이상성은 확장기 말기 후 심근의 팽창으로서 규정된 수축기 팽창(SB)로서 평가하였다. 수축기후 단축화(PSS)는 수축기 방출 말기 후 단축화이다. %SS에서의 경시 변화율은 4 내지 5개의 독특한 가로 및/또는 세로의 평균±SEM으로부터 계산되고, 개개 동물 사이의 변이성을 최소화하는 기준선의 퍼센트로서 제시된다. SS에서의 경시 변화율은 개개 동물 사이의 변이성을 최소화하는 평형 값의 퍼센트로서 제시하였다.

혈액 가스 및 헤마토그릿은 코닝(Corning) 238 pH/혈액 가스 분석기 및 코닝 270 CO-산소 농도계를 사용하여 10 내지 15분마다 모니터하였다. 혈액 가스 및 산-염기 파라미터를 PO₂ > 100mmHg; pH 7.3±0.3; 온도 37℃에서 유지시켰다.

허혈 위험 면적은 실험 말기 이후에 관련 동맥의 결찰 후 대동맥으로 모나스트릴 블루 안료 주입에 의해 묘사하였다. 경색 크기는 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드 염색(Sigma Chemical Co.)으로 측정하였고 위험 면적 퍼센트로서 제시하였다. 위험 면적 및 경색 영역 면적은 컴퓨터화 측면법(Scion Image, Scion Corp., Frederick, MD)으로 측정하였다.

위험 면적(허혈 영역)으로부터의 심근 조직 샘플(약 0.5g) 및 좌심실의 비허혈 면적(대조군 영역)은 각 실험 말기에 제거되어 2개의 샘플로 분리되는 심장외막, 심근 및 심장내막으로 이루어진다. 허혈 및 비허혈 영역 샘플은 모나스트릴 블루 염료 주입으로 확인하였다. 샘플을 경우에 따라 스냅 동결시키거나 매립시켰다.

혈액 샘플을 수집하고, 원심분리시키고/시키거나 얼음에 저장하였다. 통계 분석을 SAS(SAS Institute, Inc., Cary, NC)를 사용하여 수행하였다. 평균±SEM을 모든 변수에 대해 제시한다. 통계학적 유의성은 "대상 사이" 인자로서의 그룹 및 "대상 내" 인자로서의 시간을 사용하여 변수의 반복 척도 분석(ANOVA)으로 측정하였다. 평균 효과 모두 및 개별 시간 지점에서의 그룹 간의 사후 비교를 시험의 다양성을 조정하기 위해 본페로니 보정을 사용하여 수행하였다. 경색 크기에서 그룹 간의 통계학적 차이는 ANOVA에 의해 평가하였다. 선형 회귀 분석을 수행하여 단편 단축화, 경색 크기 및 각 그룹에서의 국소 허혈 시간 사이의 관계를 측정하였다. 각 그룹에서 회귀선 차이를 일반 선형 모델을 사용하여 비교하였다. 일반 선형 모델을 또한 사용하여 중요한 비선형(예: 2차) 효과에 대해 시험하였다. 통계학적 유의성은 p <0.05에서 청구되었다.

이 연구에서, 45분 허혈 및 120분 재관류 기간 5분 전 좌심실 내강으로 60분 주입에 이어 액체 약제학적 조성물의 볼루스 투여가 위험 면적 퍼센트로서 심근 경색 크기를 감소시킨다(도 14). 비히클은 심근 I/R 손상에서 어떤 보호 이점도 제공하지 못하였다.

실시예 12

액체 약제학적 조성물 IV는 개에서 심폐 우회술에 다른 심장 기능을 유지한다.

지금까지, 통상적인 심장 수술의 주요 파트는 심장마비 정지를 갖는 체외순환을 사용하여 수행하였다. 심장 기능장애가 임상적으로 입증되지 않았지만, 심근 수축성 감소가 압력-용적 관계를 사용하는 인간 연구에서 기술되는 바와 같이 발생할 수 있다. 또한, 관상 내피 및 말초 혈관 기능장애가 또한 수술후 과정을 복잡하게 할 수 있다. 체외 순환은 또한 2차 기관 손상을 유도하는 유리 라디칼 방출로 전신 염증성 반응을 유도하는 것으로 공지되었다.

황화수소가 배양된 근육세포, 재관류된 심장 및 심근 경색 설치류 모델에서 심장보호 효과를 발휘할 수 있다는 새로운 증거가 있다(참조: Pan, T. T. et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 40:119-30 (2006); Bian, J.S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 316:670-8 (2006); Johansen, D. et al., Basic Res. Cardiol. 101:53-60 (2006); and Zhu, Y.Z. et al., J. Appl. Physiol. 102:261-8 (2007)). 설파이드 보호 메카니즘은 세포성 에너지의 보호, 염증 경로의 하향 조절, 산화방지제 효과에 기인한 세포보호성을 포함한다. 당해 연구에서, H₂S의 액체 약제학적 조성물의 강력한 심장보호 효과는 화합물이 우회로 수술의 만성 관련 모델에서 심혈관 기능에 영향을 미치는지를 측정하기 위해 심폐 우회술의 개 모델로 시험하였다. 또한, 혈관 기능 및 심근 에너지 상태에 대한 황화수소의 효과를 측정하였다.

심폐 우회술 동안 심장보호 이점을 제공하는 설파이드의 액체 약제학적 조성물의 능력은 설정된 심장 마비 모델을 사용하여 개의 두 코호트에서 시험하였다(참조: ischemia; Szabo, G. et al., Eur. J. Cardiothorac. Surg. 25:825-32 (2004)). 이 연구에서, 각 동물은 90분 심폐 우회술(CBP)(60분 심장 마비에 따르는 30분 CBP) 및 동맥 유동의 회복에 의한 60분 재관류를 경험한다. 심장 마비 및 재관류 동안 액체 약제학적 조성물 IV의 주입은 전부하 동원성 박출 작업량(PRSW)으로 측정된 바와 같이 심장 기능을 유지시킨다. 대조적으로, 비히클에 의한 치료는 심장 마비(허혈) 모델에 심장보호 이점을 전혀 제공하지 않았다.

개들을 무작위로 두 그룹으로 하였고, 의학 연구를 위한 국가 협회 및 국립 보건원의 지침에 따라 인도적 관리를 받았다. 개들을 프로피오닐 프로마진으로 예비의약처리하고, 펜토바르비탈로 마취시키고, 판쿠로늄 브로마이드로 유지시키고, 기관내 인튜베이트하였다. 환기는 12 내지 15/분의 빈도에서 실내 공기 및 O₂의 혼합물을 포함하고, 호흡 용적은 분당 15ml/kg에서 출발한다. 동맥 부분 이산화탄소 압력 수준은 35 내지 40mmHg로 유지시켰다. 대퇴부 동맥 및 정맥에 대동맥압(AoP)을 기록하고 생화학적 분석용 혈액 샘플을 취하기 위해 삽관하였다. 염기성 정맥내 용적 치환은 링거 용액(1ml/분/kg)으로 수행하였다. 칼륨, 비카보네이트 및 염기 과량 값에 따라, 치환은 염화칼륨 및 중탄산나트륨(8.4%)의 투여를 포함한다. 카테콜아민 및 기타 호르몬 또는 기능항진 물질은 투여하지 않았다.

액체 약제학적 조성물 IV(100mM, pH 7.71, 292mOsm) 또는 비히클을 포함하는 시험 제품을 60분 심장 마비 및 60분 재관류 시간(1mg/kg/h 주입) 동안 주입하였다.

거대 혈관은 좌측 전측 개흉술에 따라 해부하였다. 좌측 쇄골하 동맥은 동맥 관류를 위해 삽관하였고, 항응고를 유지시키기 위해 헤파린을 투여하였다. 정맥 캐뉼라를 우심방에 위치시켰다. 체외 회로(우회술)는 열 교환기, 정맥 저장소, 롤러 펌프 및 헤파린 및 중탄산나트륨을 갖는 링거 락테이트가 주입된 멤브레인 산소발생기로 구성된다. 심폐 우회술(CPB)의 개시후, 동물 체온을 28℃로 냉각시켰다. 대동맥을 교차 고정시키고, 심장을 25ml/kg HTK 용액(mmol: 15 NaCl, 9 KCl, 4 MgCl₂ 6 H₂O, 18 히스티딘 하이드로클로라이드 일수화물, 180 히스티딘, 2 트립토판, 30 만니톨, 0.015 CaCl₂, 1 칼륨-수소-2-옥소펜탄디오트, H₂O)으로 마비시켰다.

심장 마비/관류 동안, 펌프 유동을 조정하여 관류 압력을 35 내지 40mmHg로 유지시켰다. 40분 후고정 및 60분 심장 마비 후, 재가온을 개시하고, 대동맥을 탈고정시키고, 심장을 우회술 회로에서 혈액으로 재관류시켰다. 필요할 경우, 심실세동은 40J의 DC 심박정상화로 방해되었다.

연구에 이어, 100% 산소로 환기를 다시 시작하였다. 대동맥 교차 클램프의 방출 20분 후 모든 동물에게서 탄력성 지지체가 없는 CPB를 제거하였다. 기초 측정을 수행하고, CBP 전 및 60분 재관류 후 기록하였다. 또한, 실험 말기에 고에너지 포스페이트 분석을 위해 심근 프로브를 수집하였다.

좌측 말단 우심실 수축기(LVESP) 및 확장기 압력(LVEDP) 및 용적을 각각 폐동맥을 통해 배합된 압력-전도성 카테터에 의해 측정하였다. 1회 박출량(SV)을 계산하였다. 병렬 컨덕턴스는 폐동맥 또는 상위 대정맥으로 과긴장성 염수 1ml를 신속하게 주입하여 계산하였다. 대정맥 폐색을 수행하여 일련의 압력-용적 루프를 수득하였다. 좌심실 및 우심실 말단-수축기 압력-용적 관계와 전부하 동원성 박출 작업량(PRSW)의 경사 및 절편을 심근 수축성의 부하량 독립적 지수로서 계산하였다.

관상 혈류를 혈관주위 초음파 유동 프로브로 좌측 전방 낙하 동맥 상에서 측정하였다. 관상 내피 의존성 혈관확장을 아세틸콜린(ACH, 10^-7M)의 단일 볼루스의 관상내 투여 후에 평가하고, 내피 독립적 혈관확장은 나트륨-니트로프루사이드(SNP, 10^~4M) 후 평가하였다. 혈관반응은 기준선 관상 혈관 내성의 변화율로서 제시하였다.

심장 수축 기능은 재관류에 따르는 압력-용적 루프 분석으로 측정하였다. 비히클 또는 액체 약제학적 조성물 IV의 주입은 CBP 30분 후에 개시하였고 실험 종결시까지 계속하였다(1mg/kg/시간의 투여량으로 총 2시간 정맥내 주입). 모든 동물은 60분 심장 마비(허혈) 및 90분의 총 심폐 우회술에 적용하였다. 전부하 동원성 박출 작업량(PRSW)은 허혈에 대한 반응에서 비히클로 처리된 그룹에서 감소된다. 심장마비 및 재관류 동안 액체 약제학적 조성물 IV의 주입은 기준선과 비교하여 전부하 동원성 박출 작업량(PRSW)을 변화시켜 측정된 바와 같이 심장보호성이다(도 15).

아데노신 트리포스페이트(ATP), 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아데노신 모노포스페이트(AMP) 함량을 효소-키네틱 분석을 사용하여 표준 측광법으로 평가하였다. 또한, 내피 의존성 및 내피 독립성 이완은 분리된 관상 환으로 조사하였다. 생체내 실험 종결 후, 심장을 절개하고, 관상 동맥을 분리하여 차거운(+4℃) 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 용액(118mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.2mM KH₂PO₄, 1.2mM MgSO₄, 1.77mM CaCl₂, 25mM NaHCO₃, 11.4mM 글루코스; pH=7.4)에 위치시켰다. 관상 동맥을 제조하고, 혈관외막주위 및 주위 결합 조직으로부터 청소하고, 작업 현미경을 사용하여 4mm 너비 환으로 횡단 절단하였다. 분리된 대동맥 환을 37℃에서 25ml의 크렙스-헨셀라이트 용액을 함유하는 개별적 기관 욕(Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA, USA) 중의 스테인레스 강 후크 상에 탑재하고, 95% O₂ 및 5% CO₂로 기포화하였다. 내피 손상을 피하기 위해 제제화 동안 특별히 주의하였다. 등척성 수축을 등척성 힘 변환기(Radnoti Glass Technology, Monrovia, CA, USA)를 사용하여 기술하고, 디지털화하고, 저장하고 IOX 소프트웨어 시스템(EMKA Technologies, Paris, France)으로 나타낸다. 환을 휴지 장력 2g하에 위치시키고, 60분 동안 평형화시켰다. U46619(5x10^-7M)를 사용하여 안정한 플래토에 도달할 때까지 환을 예비수축시키고, 완화 반응은 내피 의존성 확장제 아세틸콜린(ACh, 10^-9 내지 10^-4M) 및 내피 독립성 확장제 나트륨 니트로프루사이드(SNP, 10^-10 내지 10^-5M)의 누적 농축물을 첨가하여 시험하였다. 완화는 U46619로 유도된 수축률로서 제시된다.

심박수(HR), MAP, CO 및 CBF를 표 2에 제시한다. 기준선 심박수는 치료 그룹에서 다소 높았지만, 어떤 차이도 증명할 수 없었다. MAP는 CPB후 3개 그룹 모두에서 감소 경향을 나타냈고, 이는 두 처리 그룹(p<0.05) 모두에서 유의적이었다. CO는 그룹 사이에 경시적으로 주된 차이가 없음을 나타냈다. CBF는 기준선에서 3개 그룹 모두 필적할 만하였다. CPB 후 대조군에서는 상당히 감소되었지만, 두 처리 그룹에서는 변하지 않고 유지되었다. 그룹 사이에 경시적으로 혈류역학적 변수는 상이하지 않았다.

좌심실 기능에 관련된 기준값은 그룹 사이에서 상이하지 않았다. CPB 후, 좌심실 dP/dt 및 PRSW 모두 대조군에서 상당히 감소되었고, 이는 H₂S에 의해 부분적으로 역전되었다(도 15 및 17).

CPB 전에, 생체내 내피 기능에서는 어떤 차이도 관찰되지 않았다. CPB 후, 아세틸콜린에 대한 반응은 대조군에서 상당히 감소했고, 이는 H₂S에 의해 부분적으로 폐지되었다(도 19.). SNP에 대한 반응은 그룹 사이에 경시적으로 상이하지 않았다.

아세틸콜린(Ach)에 대한 예비수축된 관상 동맥 환의 내피 의존성 혈관이완은 대조군 환(CPB 부재 동물, 역사적 대조군)과 비교하여 상당히 손상되었고, H₂S 처리된 그룹에서는 완전히 억제되었다(도 19). SNP 후, 내피 의존성 혈관이완은 그룹 사이에 상이하지 않았다.

실험 말기에 수행된 심근 ATP 측정은 대조군 비히클에 비해 황화수소의 존재하에 상당히 증가되었다. 그러나, ADP 및 AMP 수준은 필적할 만하게 유지되었다(표 3).

이들 데이터는 H₂S의 액체 제형에 의한 처리가 거대한 동물 모델에서 심폐 우회술 설정시 심장마미 정지 후 허혈후 심근 및 내피 기능을 향상시킴을 입증한다. 이들 유리한 효과는 H₂S의 산화방지성, 소염성, 혈류역학적 및 세포보호성 효과 또는 이의 조합 상태에 기인할 수 있다.

실시예 13

황화수소는 대동맥 폐색 유도된 허혈-재관류 손상으로부터 DNA 손상을 감소시킨다.

가슴 대동맥 폐색 유도된 허헐/재관류(I/R) 손상의 임상적 관련 돼지 모델에서 H₂S-공여체 NaHS 주입의 세포보호 효과를 시험하였다.

NaHS(n=6; 대동맥 폐색 2시간 전에 개시되어 8시간 재관류까지 계속된 2mg/kg x h) 또는 비히클(n=6)에 무작위로 정렬 후, 마취시키고, 환기시키고, 쇄골하동맥 바로 하부 및 대동맥 분기 상부에 위치된 팽창식 기구를 사용하여 30분 대동맥 폐색을 경험하도록 하였다. 대동맥 폐색 동안, 평균 대동맥압(MAP)을 정맥내 에스몰롤, 니트로글리세린 및 ATP를 사용하여 폐색전 수준의 80 내지 120%로 유지시켰다. 초기 재관류 기간 동안 연속 정맥내 노르아드레날린을 적정하여 MAP를 기준 수준의 80% 초과로 유지시켰다. 전혈 샘플에서의 DNA 손상을 단일 세포 겔 전기이동(알칼리성 혜성형 분석)으로 평가하였다. 표 4에 지시된 데이터는 평균(범위)이고, 그룹내에서 차이는 순위 상에서 프리드만(Friedman) ANOVA로 시험했고, 그룹간 차이는 이표본 순위합 검정으로 시험하였다.

NaHS-주입은 상당히 낮은 심박수 및 심박출량을 유도한다. 그러나, 혈압 및 1회심박출량은 영향받지 않고 유지되었다. NaHS는 혈류역학적 표적을 달성하는데 필요한 노르아드레날린 요건을 감소시키고, 글루코스 전환을 저하시키고, I/R-유도 DNA 손상을 완전히 둔감하게 한다(혜성형 분석에서의 꼬리 모멘트, 주입 전에 대해 # p<0.05, 비히클에 대해 § p<0.05).

이들 데이터는 H₂S-공여체 NaHS의 주입이 대동맥 폐색 유도 I/R 손상 동안 유리함을 입증하고, 액체 설파이드 제형에 의한 처치가 허혈 손상을 억제한다는 것을 확증한다. 유리한 효과는 이 화합물의 대사 조절 및 세포보호 효과의 조합에 기인할 수 있다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 1c]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

상기로부터, 본 발명의 특정 양태가 예시 목적으로 본원에서 기술되었지만, 각종 변형이 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있음이 인지된다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구의 범위에 의한 제한을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (1)

1. 안정한 액체 약제학적 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 이의 염 또는 전구체를 약제학적으로 허용되는 담체 속에 포함하는 조성물로서, 상기 칼코게나이드 또는 칼코게나이드 화합물 또는 염의 농도, pH 및 산화 생성물이 상기 액체 약제학적 조성물의 저장 후에 허용 기준 범위 내로 존재하는 조성물.
   

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