CN106539818A - 硫化氢及其供体硫氢化钠在制备促造血药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制药领域，涉及硫化氢(H₂S)及其供体在制药中的新的用途，具体涉及硫化氢及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备促造血和抗骨髓抑制药物中的用途。本发明经实验结果显示，所述的H₂S具有促造血作用，可促进造血干细胞的增值和分化，从而促进巨核细胞和血小板的形成，提高凝血功能，从而治疗骨髓抑制所造成的内出血；H₂S具有促进白细胞生成的作用，可用于治疗骨髓抑制所造成的白细胞减少症，具有抵抗骨髓抑制所造成的免疫功能障碍的作用。所述的硫化氢及其供体硫氢化钠可用于制备抗骨髓抑制产生的造血功能障碍等疾病的药物。

Description

硫化氢及其供体硫氢化钠在制备促造血药物中的用途

技术领域

本发明属药物制药领域，涉及硫化氢(H₂S)及其供体在制药中的新的用途，具体涉及硫化氢及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备促造血和抗骨髓抑制药物中的用途。

背景技术

研究公开了硫化氢(H2S)是人体内半胱氨酸的代谢产物，以及其作为体内一种新型的气体活性分子，在心血管系统中抑制心肌收缩，舒张血管平滑肌而降低血压，抑制平滑肌细胞增殖，减轻缺血再灌注心肌损伤，缓解高血压进程和肺动脉高压症状，及其心血管生理、病理和心血管疾病治疗中的作用。迄今尚未见有关硫化氢及其供体在制备促造血药物中的用途。

目前，临床实践中针对癌症的治疗的主要方式是采用外科手术、以及化疗放疗等方式，但对某些具有特殊侵蚀性，以及与周围组织没有明显的分界，或者该疾患本身就没有明确定位的恶性肿瘤，如血液系统的疾病，则外科手术治疗的可能性很小，主要采用放疗、化疗的干预方式，然而，化疗药物、放疗照射在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有很大损伤，尤其是血液细胞中白细胞和血小板最为敏感。临床治疗方案中，对于白细胞降低有若干治疗方法，如对白细胞降低引起的感染可以通过抗生素进行治疗，但是对血小板降低的治疗药物却很少，而血小板降低会降低血液的凝固功能，甚至引起致命性大出血，因此，血小板降低严重影响原发疾病的治疗效果。

外源性输注血小板制品是临床治疗血小板降低的主要方式，但实践显示，长期大量的输注血小板会使机体产生抗血小板抗体，最终导致治疗无效；而且，输入血液制品在治疗疾病同时可能产生与输血相关的疾病或者传染病。

血小板生成素(TPO)曾被临床上用来治疗血小板减少性疾病，如，TPO以及经过聚二乙醇修饰的PEG-MGDF可以较快地恢复患者外周血中的血小板水平，但长期临床观察发现，长期应用TPO和PEG-MGDF会刺激机体产生抗体，并与内源性TPO产生交叉反应，导致不仅不能升高外周血中的血小板水平，反而降低内源性血小板生成。TPO虽不会刺激机体产生抗体，但其升高血小板水平显著有促发血栓形成的风险，同时有可能刺激形成肿瘤。另外，升高外周血中的血小板药物还包括：肽类模拟物、非肽类模拟物以及抗体类c-mpl激动剂，所述药物均可激活、促进血小板的生成，但存在有头痛、恶心、呕吐以及增加血栓形成的风险等副作用。因此本领域技术人员始关注促血小板生成药物的研究。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供硫化氢(H₂S)及其供体在制药中的新的用途，尤其是硫化氢及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备促造血和抗骨髓抑制药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是提供硫化氢(H₂S)及其供体在制药中的新的用途，具体涉及硫化氢及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备促造血和抗骨髓抑制药物中的用途；尤其是在制备抗骨髓抑制产生的造血功能障碍等疾病药物中的用途。

本发明的硫氢化钠(NaHS)在水中溶解后可产生硫化氢H₂S，是本技术领域公认的H₂S的供体。

本发明经实验，结果显示，所述的H₂S具有促造血作用，可促进造血干细胞的增值和分化，从而促进巨核细胞和血小板的形成，提高凝血功能，从而治疗骨髓抑制所造成的内出血；结果还显示H₂S具有促进白细胞生成的作用，可用于治疗骨髓抑制所造成的白细胞减少症，具有抵抗骨髓抑制所造成的免疫功能障碍的作用。

具体的，本发明采用外源性硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)通过整体动物模型如骨髓抑制模型实验；整体腹腔注射NaHS，TPO、c-mpl基因敲除小鼠，C57BL/6小鼠造血干细胞进行培养，用NaHS进行诱导分化等的细胞分子实验；结果显示所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)能促进造血干细胞定向分化为巨核细胞，通过激活c-mpl促进巨核细胞分化血小板；所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)可作为TPO受体激动剂，显著提高血小板水平减轻出血，提高生存率并不会引起血栓形成，进一步可用于制备治疗骨髓抑制类疾病的药物。

本发明的一个实施例中，所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)用于治疗肿瘤等疾病放疗化疗后骨髓抑制引起的血小板降低等一系列症状，结果显示，能降低出血，提高生存率；本发明的另一个实施例中，所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)通过作用于TPO受体，能促进造血干细胞分化成巨核细胞促血小板生成，可进一步制备作为治疗血小板降低TPO受体激动剂药物。

本发明的提供了硫化氢(H₂S)及其供体在制药中的新的用途，尤其是硫化氢及其供体硫氢化钠(NaHS)在制备促造血和抗骨髓抑制药物中的用途；本发明所述的H₂S可用于制备抗骨髓抑制产生的造血功能障碍等疾病的药物。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1中，图1A显示了在进行放疗7、14、21d后的小鼠的血小板水平，放疗造成骨髓抑制，血小板减少，与未放疗组相比，放疗7、14d后组的血小板水平降低至最低，28d后血小板水平恢复，之后保持稳定；

图1B显示了放疗小鼠模型经NaHS治疗同时放疗7d后的血小板水平，治疗组剂量为NaHS 10、20、50、100、150μmol/kg/d，TPO15μg/kg，腹腔注射；

图1C显示了放疗小鼠模型经NaHS治疗同时放疗7d后的形态学结果，表明,NaHS(100μmol·/kg/·d)组骨髓巨核细胞的数量显著增加；

图1D显示了与对照组相比，NaHS(100μmol·/kg/·d)组动物经放疗7d后出血时间显著降低；

图1E显示了大便隐血情况，与对照组相比，NaHS(100μmol·/kg/·d)组动物放疗7d后大便隐血显著低于对照组；

图1F显示了对照组经放疗后，血浆TPO水平显著提高，而NaHS(100μmol·/kg/·d)组与对照溶剂组无明显变化；

图1G显示了对照组放疗14、21d时死亡率分别为50％和71％，所有组28d后死亡率无进一步增加，NaHS(100μmol·/kg/·d)组放疗14、21、28、35、42d生存率显著提高；TPO15μg/kg组也明显提高；

图1H显示了放疗使内源性H₂S生成减少，表明放疗7d后血浆H₂S含量减少，NaHS(100μmol·/kg/·d)组血浆H₂S恢复水平相与未放疗组基本相同。

图2中，图2A显示了在流式细胞方法检测下用CD61标记的巨核细胞，NaHS10、20、50、100、150μmol/kg/d组与对照组相比明显增多，表明H2S能明显促进造血干细胞分化成巨核细胞的体内效应；

图2B显示了在流式细胞方法检测下用CD41、7-ADD标记的血小板，NaHS10、20、50、100、150μmol/kg/d组与对照组相比明显增多；

图2C显示了激光共聚焦方法检测下CD41、61共同表达；

图2D显示了在电镜检测方法下经NaHS诱导后有向巨核细胞分化的趋势。

图3中，图3A显示了生理状态下TPO受体敲除小鼠与野生型小鼠分别给予NaHS 20μmol/kg/d，14d，野生型小鼠血小板数量有显著性差异，而TPO受体敲除小鼠给予NaHS后血小板数量无差异；

图3B显示了TPO受体敲除小鼠胚胎肝细胞在流式细胞法检测下用CD61标记巨核细胞，NaHS 100μmol/L、TPO10ng/L组无明显变化；

图3C显示了在放疗7d后小鼠的血小板水平，野生型小鼠与TPO受体敲除小鼠分别给予NaHS(100μmol·/kg/·d)，与对照溶剂组相比，野生型小鼠血小板明显增加，而TPO受体敲除小鼠血小板无明显变化；

图3D显示了TPO受体敲除小鼠放疗7天后骨髓切片巨核细胞数量情况，与对照溶剂组相比NaHS(100μmol·/kg/·d)巨核细胞数量无明显变化；

图3E显示了TPO受体敲除小鼠放疗7天后出血时间的情况，与对照溶剂组相比，NaHS(100μmol·/kg/·d)组出血时间无明显变化；

图3F显示了TPO受体敲除小鼠放疗7天后大便潜血的情况，与对照溶剂组相比NaHS(100μmol·/kg/·d)大便潜血情况无改善；

图3G显示了放疗后小鼠各组的生存率曲线，TPO受体敲除小鼠NaHS(100μmol·/kg/·d)组与对照溶剂组相比未能改善小鼠生存率。

图4中，图4A显示了放疗后小鼠红细胞水平情况，NaHS 10、20、50、100、150μmol/kg/d组，TPO15μg/kg组在放疗后7、14d后红细胞水平无明显变化；

图4B显示了放疗后小鼠白细胞水平情况，NaHS 100μmol/kg/d组在放疗后14d后白细胞水平与对照溶剂组相比有明显升高。

具体实施方式

实施例1、NaHS对骨髓抑制模型小鼠外周血中血小板生成的影响实验

1.检测骨髓抑制状态下硫化氢对巨核细胞及血小板生成的影响

1.1 5-FU 200mg·kg^-1腹腔注射

1.1.1实验动物分组

野生型6-8w雌性小鼠随机分为7组：1)放疗NaHS 0μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 0μmoL·kg^-1·d^-1；2)放疗NaHS 10μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 10μmoL·kg^-1·d^-1；3)放疗NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；4)放疗NaHS 50μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 50μmoL·kg^-1·d^-1；5)放疗NaHS100μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1；6)放疗TPO组：腹腔注射TPO 15μg·kg^-1，仅在第1d注射；7)正常对照组：腹腔注射等体积生理盐水；

1.1.2给药

每天新鲜配制不同浓度的NaHS溶液(用无菌生理盐水配制)，以及1份生理盐水，每日腹腔注射一次100μL。分别于7d、14d、21d、28d、35d、42d眼内眦取血150μL，进行血细胞分析；

2. ¹³⁷CS全身照射7.5Gy

2.1实验动物分组

野生型6-8w雌性小鼠随机分为7组：1)放疗生理盐水组：腹腔注射等体积生理盐水；2)放疗NaHS 10μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 10μmoL·kg^-1·d^-1；3)放疗NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；4)放疗NaHS50μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 50μmoL·kg^-1·d^-1；5)放疗NaHS 100μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1；6)放疗TPO组：腹腔注射TPO 15μg·kg^-1，仅在第一天注射；7)正常对照组：腹腔注射等体积生理盐水；

2.2给药

每天新鲜配制不同浓度的NaHS溶液(用无菌生理盐水配制)，以及1份生理盐水，每日腹腔注射一次100μL，别于7d、14d、21d、28d、35d、42d眼内眦取血150μL，进行血细胞分析；

2.3骨髓切片

C57BL/6小鼠连续给药7d后，6％水合氯醛麻醉，500U·mL^-1的肝素钠注射液抗凝。取小鼠下肢，10％甲醛固定1d后，流水冲洗1d，10％的EDTA脱钙5-7d，待骨质柔软，切片刀可顺利切动时70％酒精3h，95％酒精I 2h，95％酒精II过夜，无水乙醇I 1h，无水乙醇II 30min行梯度脱水，二甲苯I 10min，二甲苯II 10min透明处理，然后低熔点(56-58℃)石蜡I 10min，石蜡II 20min，石蜡III 30min行浸蜡处理，低熔点石蜡包埋后切片(厚5μm)；

2.4HE染色

1)脱蜡：二甲苯I 5min，二甲苯II 5min，95％酒精I 4min，95％酒精II 2min，自来水洗片刻，蒸馏水洗片刻；

2)染色：苏木素浸染3min，自来水冲洗片刻，1％盐酸酒精分色3-5s，自来水冲洗数分钟，0.5％氨水返蓝1-2min，自来水冲洗10min，0.5％伊红酒精浸染2min；

3)脱水：95％酒精I 2min，95％酒精II 2min，100％酒精I 2min，100％酒精II 2min；

4)透明：二甲苯－石炭酸混合液2min，二甲苯I 2min，二甲苯II 2min，二甲苯III 2min；

5)中性树胶封固；

6)显微镜观察组织病理改变及计数巨核细胞数量；

2.5血浆中TPO水平检测(Elisa)

1)小鼠眼内眦取血200μL,4℃离心，3500rpm,15min；

2)取上清，用Calibrator Diluent RD5-3稀释血浆5倍后备用；

3)2mL Calibrator Diluent RD5-3稀释the Mouse TPO Standard，使其浓度为4000pg·mL^-1，6个离心管每管中加入200μL Calibrator Diluent RD5-3，产生一个2倍稀释的浓度梯度；Calibrator Diluent RD5-3做为空白对照，TPO浓度为0pg·mL^-1；

4)取出96孔板中不用的孔，避光保存；

5)每孔中加入50μL ofAssay Diluent RD1-23，分别加入50mL Standard、control、样本，轻微震动混匀1min。铝箔纸封孔避光，室温保存2h；

6)去离子水稀释Wash Bufer 25倍后备用；

7)稀释后的Wash Bufer洗板4次后，去除所有液体；

8)每孔中加入100μL of Mouse Tpo Conjugate，铝箔纸封孔避光，室温保存2h；

9)稀释后的Wash Bufer洗板4次后，去除所有液体；

10)Color Reagent A和B等体积混匀，避光放置；

11)每孔中加入100μL Color ReagentA和B的混合液，室温避光放置30min；

12)每孔中加入100μLStop Solution，轻微震动混匀；

13)在30min内检测每孔的光密度，波长设定为450nm，矫正波长540nm或者570nm，将前者测到的光密度减去后者测到的光密度，得到每个孔的光密度值，根据标准曲线得出TPO的浓度；

2.6出血时间(Bleedingtime)

1)¹³⁷CS 7.5Gy放疗野生型小鼠,从第二天起开始每天腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1和生理盐水，正常野生型小鼠做为对照；

2)持续注射7d和14d后，剪去小鼠尾巴末端3mm，将其尾端置于37℃生理盐水溶液中，观察其从出血开始到出血停止的时间；

2.7大便隐血(Fecal occult blood)

2.7.1操作步骤

1)¹³⁷CS 7.5Gy放疗野生型小鼠,从第二天起开始每天腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1和生理盐水，正常野生型小鼠做为对照；

2)持续注射7d和14d后，在检测Bleeding time的同时，收集小鼠粪便于1.5mL的EP管中；

3)每个EP管中加入200μL生理盐水，使粪便成液态状；

4)20μL粪便悬液滴于试纸上，将测试卡背面朝上，并打开印有“DevelopmentWindow”的封盖；

5)在方格内左右两侧各滴一滴显色剂A，待试剂完全渗透之后，再各滴一滴显

示剂B；

6)当加入显色剂B后，于2min内判读完毕；

2.7.2检验结果的解释

1)当加入显色剂B后，立即产生紫蓝色，报告为(4+)；

2)当加入显色剂B后，10s内产生紫蓝色，报告为(3+)；

3)当加入显色剂B后，1min内产生紫红色，报告为(2+)；

4)当加入显色剂B后，1～2min内才逐渐产生紫红色，报告为(1+)；

5)当加入显色剂B后，于判读时间内无任何紫蓝或紫红的颜色反应，报告为阴性(－)；

2.8高压液相色谱(HPLC)检测血浆中H₂S浓度

1)1.3mg MBB溶于1.86mL的乙腈中，配成浓度为2.6mM的MBB溶液；

2)野生型C57BL/6小鼠¹³⁷CS 7.5Gy放疗，NaHS处理7d后，眼内眦取血。4000rpm,4℃离心10min；

3)收集黄色上清，-80℃保存备用；

4)检测H₂S浓度时，将血浆置于室温溶解，备用；

5)1.5mL离心管中加入10μL浓度为0.1％的氨水；

6)向离心管中加入30μL的血浆；

7)加入80μL的MBB溶液；

8)涡旋使反应体系充分混匀，10min涡旋一次，共需要涡旋4次；

9)12000rpm,4℃离心10min；

10)收集上清，加入液相色谱专用的检测管中，每管中加入40μL；

11)上机检测；

2.9生存分析

在实验的整个过程中，记录出现小鼠死亡的时间，通过Graphpad Prism 5作图，分析各个实验组的生存率；

结果显示，所述的H₂S能促进巨核系细胞的分化，差异具有显著性，并且存在浓度依赖现象，其中NaHS 100μmol·L_-1作用最为显著，约为阳性对照(TPO)组的3倍；但是H₂S在促进血小板生成作用却远不及TPO；据文献报道ROS可以促进巨核细胞分化和血小板的生成，但是，本实验的结果显示：所述的H₂S可以降低细胞内的ROS水平，同时可以促进巨核细胞分化和血小板生成；

本发明的整体实验的结果显示，H₂S持续腹腔注射14d和28d可以显著的提高外周血中血小板的水平；并且，实验小鼠处理14d时的骨髓中巨核细胞的数量变化，其中，NaHS 20μmol·kg_-1·d_-1处理组骨髓中的巨核细胞数量显著高于对照组(NaHS 0μmol·kg_-1·d_-1)；以及血浆中TPO含量的检测结果显示，NaHS 20μmol·kg_-1·d_-1处理14d，血浆中的TPO含量显著高于对照组。

实施例2、H₂S对c-mpl和TPO基因敲除的造血干细胞分化和小鼠外周血中血小板生成的影响实验

实验方法：

1.c-mpl基因敲除小鼠的鉴定

1.1提取小鼠基因组

1)取4w左右的C57BL/6小鼠，用剪指法对小鼠进行编号，并记录小鼠性别；

2)剪鼠尾约0.5cm长，放入对应的去RNA酶的EP管中；

按200μL/tail将裂解液加入管中(以浸没鼠尾最宜)，56℃-57℃水浴12h；

3)将裂解后的液体轻弹，4℃，13,000rpm离心15min，取上清；

4)上清中加入等体积的异丙醇，轻弹，有絮状沉淀后，4℃，2000～6000rpm离心2min，弃上清；

5)500μL的70％乙醇洗涤沉淀，4℃，2000-6000rpm离心2min，弃上清；

6)沉淀重悬，4℃，2000-6000rpm离心2min，弃上清；

7)烘干约15min，至管壁上为透明的白色物质；

8)向EP管中加30～50μL PCR水溶解，备用；

1.2小鼠基因组PCR

1)根据PCR扩增反应体系，以c-mpl特异引物对小鼠基因组进行PCR扩增，扩增长度为386bp。扩增条件为94℃预变性3min，然后94℃变性30s，62℃退火60s，72℃延伸60s进行35次循环；72℃延伸2min；4℃维持10min；反应体系为：

2)扩增后的产物进行酶切，反应体系为：

37℃反应6h。

3)4℃保存

1.3PCR产物电泳

1)取1g Argrose于锥形瓶中，加入100mL 1×TAE电泳缓冲液，加热溶解为透明溶液，制备1％凝胶；

2)洗净电泳凝胶盘并插上样品梳；

3)取20mL凝胶，待胶冷却至50℃，加入1/1000体积的绿如蓝染液，混匀，倒入凝胶盘中；

4)胶凝固后，拔出样品梳，将凝胶盘放入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液浸没；

5)取6μL样品和上样缓冲液的混合物，加入样品槽中，以500bp marker作为参照；

6)将靠近样品槽一端接负极，另一端接正极，连接电源，在80V～100V电压下进行电泳；

7)当溴酚蓝迁移至1/2凝胶时，停止电泳，取出凝胶；

8)将凝胶放到紫外观察台上，拍照记录电泳图谱，分析小鼠基因型；

9)c-mpl基因敲除的纯合子小鼠会出现两条带，分别为196bp和190bp；c-mpl基因敲除的杂合子小鼠会出现三条带，分别为386bp、196bp和190bp；野生型小鼠会出现一条带，为386bp；

2.TPO基因敲除小鼠的鉴定

2.1提取小鼠基因组(同1.1)

2.2小鼠基因组PCR(同1.1-1)

2.3PCR产物电泳(同1.3)

2.4血常规检测

1)5w小鼠眼内眦取血150μL，10μL 15％EDTA抗凝，血常规检测分析血小板水平；

2)TPO敲除杂合子小鼠外周血中血小板数量与野生型小鼠没有区别，TPO敲除的纯合子小鼠外周血中血小板为野生型小鼠的10％，借此，区别杂合子小鼠和纯合子小鼠；

3.胚胎肝细胞的原代分离及培养

3.1胚胎肝细胞分离和培养

1)取怀孕14.5-15.5d的雌性小鼠，称重后腹腔注射6％水合氯醛(5mL·kg^-1)进行全麻，待角膜反射、翻正反射和夹趾反射消失后，将小鼠浸入75％的酒精中5～10min，注意将小鼠的口鼻置于液面之上。随后将小鼠用酒精棉球擦干，放入事先灭菌好的平皿内，移入超净台中，放至冰上；

2)无菌条件下取小鼠子宫，放入预冷的D-Hank’s溶液中；

3)分别用剪刀剪开羊膜，取出胚胎，放入预冷的D-Hank’s溶液中；

4)在胎鼠腹部肝的部分剪开，取出肝脏，放入预冷的D-Hank’s溶液中；

5)将胚胎肝用预冷的D-Hank’s溶液冲洗干净，剪刀剪碎，加入37℃预热的0.125％的胰酶消化，用1mL移液器吹打促进消化；

6)将以上液体用400目的不锈钢筛网过滤，再将单细胞悬液小心移至15mL离心管中，4℃水平离心，1500g，10min；

7)弃上清液，用含10％FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞团块，将细胞接种于60mm的培养皿中。37℃，5％CO₂培养箱培养；

3.2胚胎肝细胞的培养及向巨核细胞的诱导分化

1)-7)步骤同1.1

8)实验共分为三组：NaHS 0μmol·L^-1、NaHS 100μmol·L^-1和TPO 10ng·mL^-1。NaHS每隔6h加药一次，TPO只在接种时加入一次；

9)5d后收集悬浮细胞，1000g离心10min。弃上清，预冷的PBS重悬细胞，1000g,10min。100μL PBS重悬细胞，加入兔抗小鼠PE标记抗CD61的抗体，4℃孵育30min；

10)离心1000g，10min，弃上清，预冷的PBS洗涤细胞两遍。500μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测巨核细胞表面标记；

4.检测生理状态下硫化氢对巨核细胞及血小板生成的影响

4.1实验动物分组

6-8w雌性小鼠随机分为5组：1)野生型C57BL/6小鼠生理盐水组：腹腔注射等体积生理盐水；2)c-mpl基因敲除小鼠生理盐水组：腹腔注射等体积生理盐水；3)TPO基因敲除小鼠生理盐水组：腹腔注射等体积生理盐水；4)c-mpl基因敲除小鼠NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；5)TPO基因敲除小鼠NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；

4.2给药

每天新鲜配制不同浓度的NaHS溶液(用无菌生理盐水配制)，以及1份生理盐水，持续腹腔注射14d，眼内眦取血150μL，进行血细胞分析；

实验结果显示：所述的H2S能促进TPO受体c-mpl的磷酸化，显著促进胚胎肝细胞向巨核系细胞分化，并且提高外周血中血小板的水平；H2S对c-mpl基因敲除的胚胎肝细胞失去了促分化作用，同时c-mpl基因敲除的小鼠外周血中的血小板水平对外源性注射的H2S没有任何反应；但是TPO基因敲除的胚胎肝细胞在H2S的影响下，可向巨核系细胞分化；并且，腹腔注射NaHS溶液可以显著地升高TPO敲除小鼠外周血中血小板的水平；实验结果表明，H2S可以通过c-mpl这一信号通路促进巨核细胞分化和血小板生成，而且这一作用并不是TPO依赖性的，H2S外源性腹腔注射后，可以使野生型小鼠外周血中血小板水平升高20％，且不至于升高得太多引起血栓栓塞；因此，所述的H2S可以作为新的治疗血小板减少性疾病的药物，而且不会引起血栓的发生。

实施例3、H2S对骨髓抑制模型小鼠外周血中血小板生成的影响实验

实验方法

1.检测骨髓抑制状态下硫化氢对巨核细胞及血小板生成的影响

1.1 5-FU 200mg·kg^-1腹腔注射

1.1.1实验动物分组

野生型6-8w雌性小鼠随机分为7组：1)放疗NaHS 0μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 0μmoL·kg^-1·d^-1；2)放疗NaHS 10μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 10μmoL·kg^-1·d^-1；3)放疗NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；4)放疗NaHS 50μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 50μmoL·kg^-1·d^-1；5)放疗NaHS100μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1；6)放疗TPO组：腹腔注射TPO 15μg·kg^-1，仅在第1d注射；7)正常对照组：腹腔注射等体积生理盐水；

1.1.2给药

每天新鲜配制不同浓度的NaHS溶液(用无菌生理盐水配制)，以及1份生理盐水，每日腹腔注射一次100μL。分别于7d、14d、21d、28d、35d、42d眼内眦取血150μL，进行血细胞分析；

2. ¹³⁷CS全身照射7.5Gy

2.1实验动物分组

野生型6-8w雌性小鼠随机分为7组：1)放疗生理盐水组：腹腔注射等体积生理盐水；2)放疗NaHS 10μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 10μmoL·kg^-1·d^-1；3)放疗NaHS 20μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 20μmoL·kg^-1·d^-1；4)放疗NaHS50μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 50μmoL·kg^-1·d^-1；5)放疗NaHS 100μmoL·kg^-1组：腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1；6)放疗TPO组：腹腔注射TPO 15μg·kg^-1，仅在第一天注射；7)正常对照组：腹腔注射等体积生理盐水；

2.2给药

每天新鲜配制不同浓度的NaHS溶液(用无菌生理盐水配制)，以及1份生理盐水，每日腹腔注射一次100μL。分别于7d、14d、21d、28d、35d、42d眼内眦取血150μL，进行血细胞分析；

2.3骨髓切片

C57BL/6小鼠连续给药7d后，6％水合氯醛麻醉，500U·mL^-1的肝素钠注射液抗凝。取小鼠下肢，10％甲醛固定1d后，流水冲洗1d。10％的EDTA脱钙5-7d；待骨质柔软，切片刀可顺利切动时70％酒精3h，95％酒精I 2h，95％酒精II过夜，无水乙醇I 1h，无水乙醇II 30min行梯度脱水；二甲苯I 10min，二甲苯II 10min透明处理，然后低熔点(56-58℃)石蜡I 10min，石蜡II 20min，石蜡III 30min行浸蜡处理，低熔点石蜡包埋后切片(厚5μm)；

2.4HE染色

1)脱蜡：二甲苯I 5min，二甲苯II 5min，95％酒精I 4min，95％酒精II 2min，自来水洗片刻，蒸馏水洗片刻；

2)染色：苏木素浸染3min，自来水冲洗片刻，1％盐酸酒精分色3-5s，自来水冲洗数分钟，0.5％氨水返蓝1-2min，自来水冲洗10min，0.5％伊红酒精浸染2min；

3)脱水：95％酒精I 2min，95％酒精II 2min，100％酒精I 2min，100％酒精II 2min；

4)透明：二甲苯－石炭酸混合液2min，二甲苯I 2min，二甲苯II 2min，二甲苯III 2min；

5)中性树胶封固；

6)显微镜观察组织病理改变及计数巨核细胞数量；

2.5血浆中TPO水平检测(Elisa)

1)小鼠眼内眦取血200μL,4℃离心，3500rpm,15min；

2)取上清，用Calibrator Diluent RD5-3稀释血浆5倍后备用；

3)2mL Calibrator Diluent RD5-3稀释the Mouse TPO Standard，使其浓度为4000pg·mL^-1，6个离心管每管中加入200μL Calibrator Diluent RD5-3，产生一个2倍稀释的浓度梯度，Calibrator Diluent RD5-3做为空白对照，TPO浓度为0pg·mL^-1；

4)取出96孔板中不用的孔，避光保存；

5)每孔中加入50μL ofAssay Diluent RD1-23，然后分别加入50mL Standard、control、样本，轻微震动混匀1min。铝箔纸封孔避光，室温保存2h；

6)去离子水稀释Wash Bufer 25倍后备用；

7)稀释后的Wash Bufer洗板4次，最后一遍去除所有液体；

8)每孔中加入100μL of Mouse Tpo Conjugate，铝箔纸封孔避光，室温保存2h；

9)稀释后的Wash Bufer洗板4次，最后一遍去除所有液体；

10)Color Reagent A和B等体积混匀，避光放置；

11)每孔中加入100μL Color Reagent A和B的混合液，室温避光放置30min；

12)每孔中加入100μL Stop Solution，轻微震动混匀；

13)在30min内检测每孔的光密度，波长设定为450nm，矫正波长540nm或者570nm，将前者测到的光密度减去后者测到的光密度，得到每个孔的光密度值，根据标准曲线得出TPO的浓度；

2.6出血时间(Bleedingtime)

1)¹³⁷CS 7.5Gy放疗野生型小鼠,从第二天起开始每天腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1和生理盐水，正常野生型小鼠做为对照；

2)持续注射7d和14d后，剪去小鼠尾巴末端3mm，将其尾端置于37℃生理盐水溶液中，观察其从出血开始到出血停止的时间；

2.7大便隐血(Fecal occult blood)

2.7.1操作步骤

1)¹³⁷CS 7.5Gy放疗野生型小鼠,从第二天起开始每天腹腔注射NaHS 100μmoL·kg^-1·d^-1和生理盐水，正常野生型小鼠做为对照；

2)持续注射7d和14d后，在检测Bleeding time的同时，收集小鼠粪便于1.5mL的EP管中；

3)每个EP管中加入200μL生理盐水，使粪便成液态状；

4)20μL粪便悬液滴于试纸上，将测试卡背面朝上，并打开印有“DevelopmentWindow”的封盖；

5)在方格内左右两侧各滴一滴显色剂A，待试剂完全渗透之后，再各滴一滴显示剂B；

6)当加入显色剂B后，于2min内判读完毕；

2.7.2检验结果的解释

1)当加入显色剂B后，立即产生紫蓝色，报告为(4+)；

2)当加入显色剂B后，10s内产生紫蓝色，报告为(3+)；

3)当加入显色剂B后，1min内产生紫红色，报告为(2+)；

4)当加入显色剂B后，1～2min内才逐渐产生紫红色，报告为(1+)；

5)当加入显色剂B后，于判读时间内无任何紫蓝或紫红的颜色反应，报告为阴性(－)；

2.8高压液相色谱(HPLC)检测血浆中H₂S浓度

1)1.3mg MBB溶于1.86mL的乙腈中，配成浓度为2.6mM的MBB溶液；

2)野生型C57BL/6小鼠¹³⁷CS 7.5Gy放疗，NaHS处理7d后，眼内眦取血。4000rpm,4℃离心10min；

3)收集黄色上清，-80℃保存备用；

4)检测H₂S浓度时，将血浆置于室温溶解，备用；

5)1.5mL离心管中加入10μL浓度为0.1％的氨水；

6)向离心管中加入30μL的血浆；

7)加入80μL的MBB溶液；

8)涡旋使反应体系充分混匀，10min涡旋一次，共需要涡旋4次；

9)12000rpm,4℃离心10min；

10)收集上清，加入液相色谱专用的检测管中，每管中加入40μL；

11)上机检测；

2.9生存分析

在实验的整个过程中，记录出现小鼠死亡的时间，通过Graphpad Prism 5作图，

分析各个实验组的生存率；

结果显示：NaHS 100μmol·kg_-1·d_-1可以缩短放疗小鼠外周血中血小板的恢复时间，显著提高出血危险期的血小板水平，降低出血，提高小鼠生存率；但是，其升高血小板水平的持续时间不长，也不会使外周血中血小板水平显著高于正常对照组，结果表明，放疗后使用H₂S供体NaHS，在其升高血小板水平的同时，不会引起血栓形成；

实验显示，白细胞对放疗非常敏感，在放疗照射后7d，白细胞水平显著降低，约为正常对照组的10％，随着时间的延长，白细胞水平缓慢上升，在放疗21d时，NaHS 100μmol·kg_-1·d_-1处理组外周血中白细胞数量显著升高；血小板是机体血液凝固过程中最为重要的成分之一，当外周血中血小板水平显著降低，同时在诱因存在的情况下，会发生大出血，严重时危及生命，本实验过程中，观察到放疗小鼠外周血中血小板显著降低，NaHS处理组放疗小鼠出血时间明显缩短，大便隐血现象得到改善，并且，骨髓中巨核细胞数量显著增加；由此表明，所述的NaHS可以促进巨核细胞分化和血小板生成，具有临床应用价值。

Claims (7)

1.硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在用于制备促造血药物中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物是治疗抗骨髓抑制产生的造血功能障碍疾病的药物。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)促进造血干细胞分化成巨核细胞继而促进血小板的生成。

4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物减轻所述的造血功能障碍疾病造成的出血。

5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物用于制备促白细胞生成药，抵抗骨髓抑制引起的白细胞降低导致的继发感染。

6.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)作为TPO受体激动剂，促进巨核细胞和血小板生成。

7.硫化氢(H₂S)及其供体硫氢化钠(NaHS)在用于制备治疗骨髓抑制疾病的药物中的用途。