KR20150041719A

KR20150041719A - 핵산 함량이 증대된 효모 변이주 및 이의 배양방법

Info

Publication number: KR20150041719A
Application number: KR1020130120156A
Authority: KR
Inventors: 김경한; 윤일선; 윤희선; 박영석
Original assignee: 주식회사 태경식품
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-04-17
Also published as: KR101572140B1

Abstract

본 발명은 칸디다 속(Candida sp.) 효모 변이주인 Candida utilis TK20(기탁번호 KFCC 11558P) 및 이의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명을 통해 핵산을 15% 이상 함유하는 돌연변이 효모 균주를 제공하여, 저렴한 산업용 배지를 통해 고농도 균체 배양을 실시하여 효율적인 효소분해 공정을 통해 IG함량 20% 이상이며 동시에 풍부한 글루타민산을 함유하는 강한 지미를 가진 효모취가 없는 고핵산 효모엑기스 및 엑기스 분말 제조 방법을 제공할 수 있다.

Description

핵산 함량이 증대된 효모 변이주 및 이의 배양방법{Yeast mutant with high content of nucleic acid and a culturing method thereof}

본 발명은 핵산 함량이 증대된 효모 변이주 및 이의 용도에 관한 것이다.

일반적으로 효모는 GRAS(Generally recognized as safe)의 범주에 들어가는 안전한 미생물로 식품 및 음료에 있어서 알코올 발효에 이용될 뿐만 아니라, 단백질, 핵산, 아미노산, 비타민, 미량의 무기성분 등이 풍부하여 효모 세포 자체를 보강하거나 변형시켜 얻어낸 추출물 등이 다양하게 이용되고 있다. 효모를 천연조미소재로 널리 사용하게 된 것은 같은 강도의 풍미를 내는 다른 소재들과 비교하여 가격이 싸기 때문이며 이러한 효모엑기스 분말은 정미성이 있는 IMP와 GMP의 함량을 높임으로써 부가가치를 높일 수 있다.　

효모 균체에서 RNA를 추출하기 위한 공정으로는 산가수분해 공정, 열수추출, 자기소화를 이용한 공정, 마지막으로 효소분해 공정이 있다. 산가수 분해 공정의 경우 염산가수분해에 의한 MCP 안정성 문제를 가지고 있고, 열수추출의 경우 수율이 낮은 문제, 자기소화의 경우 그에 대한 연구가 많으나 산업적으로 고농도의 효모엑기스를 제조하는 경우에는 수득율이 낮고 유용 성분의 활용이 미흡하거나 추출 잔사의 여과성이 좋지 않은 등의 문제를 수반한다. 효소 분해법은 기본적으로 세포벽 용해효소, 단백질 분해효소 및 핵산 분해효소 등을 순차적으로 첨가하는 방법으로 자기소화법에 비하여 수율이 높으며 자기소화, 열수 추출, 산분해공정에서보다 정미성이 높은 핵산을 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있다.

국내 공개특허 10-2011-0108518에서는 Candida utili를 EMS(ethyl methanesulfonate) 처리하여 기존 균주보다 RNA함량이 높은　 Candida utilis M35를 개발하여 IG함량 15% 이상인 효모 추출물을 얻을 수 있었다. 하지만, 균체량은 24g/L에 불과하며 IG함량도 20% 이상을 만족하지 못하여 연구가 더 필요한 실정이다.

따라서, 본 발명은 UV light 처리를 통해 핵산 함량이 증대된 Candida utilis 변이주의 개발 및 그를 산업적으로 생산 가능한 배지 조성을 확보하여 발효 공정을 개발함으로써 균체량을 증가시키고, 효율적인 효소분해 공정을 개발하여 IG 함량이 20% 이상이며 글루타민산 함량이 풍부한 강한 지미를 가진 효모취가 없는 고핵산 효모엑기스 분말의 개발에 목적이 있다.

본 발명은 RNA 함량이 높은 Candida utilis 변이주를 얻기 위하여, UV를 이용한 Canida utilis 변이주 및 이를 이용한 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 배양에 사용하는 배지에 탄소원으로는 당밀, 글루코스, 전분, 감자전분, 변성전분, 옥수수 전분, 자당(수크로스), 에탄올, 초산 등을 1종 또는 2종 이상 이용된다. 질소원으로는 효모추출물, 맥아추출물, 펩톤, 옥수수 침지액(CSL), 아미노산류, 아미노산액(HVP, EVP), 카세인, 암모니아, 요소, 인산암모늄 등 1종 혹은 2~3종 이상이 이용된다. 고농배 균체 배양시에는 아미노산액 5~10%, 메티오닌 1~3%, 인산암모늄 1~5%를 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 배양에 사용되는 배지에 무기염류로는 통상의 미생물의 배양에 이용되는 황산마그네슘, 황산구리, 염화칼륨, 염화나트륨. 염화망간, 황산제이철 등을 단독 혹은 혼합으로 사용한다. 무기염류는 0.0001~0.01%로 종류에 따라 혼합 사용한다.

성장 인자로는 Vit A, 리보플라빈, B6, 니코틴산, 판토텐산, 엽산, B12, 아스코르브산, 토코페롤, 바이오틴 등을 1종 혹은 혼합으로 사용한다.

종래의 효모를 발효하는 방법으로서는 회분식, 연속식, 연가식 등의 방법이 알려져 있는데 회분식 배양은 연속식에 비해 균체 생산성이 낮고 연속식은 설비투자비가 비싸고 배양시간이 길어 오염에 대한 위험이 높아 본 배양에서는 회분식 및 연가식 배양을 사용하였다.

본 배양은 5L 발효기를 이용하여 실험 부피 2L, pH는 암모니아수와 염산을 이용하여 5.0으로 유지시켰으며, 온도 30℃, 교반 속도 500rpm, 산소공급은 3L/min으로 실시하였다. 초기 배양은 배지 1L에서 시작하였으며 균주 접종 4% 실시 후 2시간부터 62.5ml/hr의 속도로 연속적으로 배지를 추가하여 주었다. 24hr 배양 종료 후 원심분리기를 이용하여 균체를 생리식염수로 5회 세척하여　 165~185g/L의 습식효모균체(건조중량 33~37g)를 얻었다. 이와 같이 얻어진 습식효모균체에 물을 1:1 비율로 가하여 80~100℃에서 10~30분간 열처리를 실시한다. 이때, 균체에 3‘-RNase가 불활성화되어 RNA가 정미성이 없는 핵산으로 분해되는 것을 방지되며 효모의 세포벽과 세포막이 부분적으로 파괴되어 균체 내 단백질과 핵산을 추출할 수 있다. 열처리 후, pH를 7~8로 조정하고 세포벽분해효소 0.1~0.5%(w/w)를 첨가하여 50~60℃에서 4~6시간 동안 효소분해를 실시한다. 세포벽분해효소 처리 후 90~100℃에서 5~10분간 효소를 실활시키고 pH를 5.5~6.5로 조정하고 핵산분해효소를 0.1~0.5%(w/w)를 첨가하여 65~75℃에서 2~5시간 동안 효소분해를 실시한다. 이 때 추출된 RNA가 정미성이 있는 핵산으로 분해된다. 핵산분해효소 처리 후 90~100℃에서 5~10분간 효소를 실활시키고 pH를 5~6으로 조정하고 디아미나제를 0.1~0.5%(w/w) 첨가하여 45~55℃에서 2~5hr 동안 효소분해를 실시한다. 이 때 정미성이 없는 핵산 AMP가 정미성이 있는 IMP로 바뀌게 된다. 디아미나제 처리 후 90~100℃에서 5~20분간 효소를 실활시킨다. 이 후 원심분리를 하여 잔사를 제거하여 고핵산 효모효소분해액을 얻는다. 위와 같은 방법으로 얻은 고핵산 효모효소분해액을 90℃에서 20분간 열처리하여 효소를 모두 실활시킨 후　 활성탄 0.1~3%를 첨가하여 60~80℃에서 한시간 동안 탈색, 탈취를 실시하여 효모취가 제거된 효소분해액을 얻는다. 효모취가 제거된 효소분해액을 40brix로 농축하고 80℃에서 30분간 살균처리를 한 후 스프레이 건조기를 이용하여 분말화하여 고핵산 효모엑기스 분말을 얻었다. 건조조건은 초기 온도 180℃, 최종온도 80~100℃, 공급 속도 15~20ml/min을 유지한다. 이 후 핵산의 정량은 고핵산 효모엑기스 분말을 필요에 따라 적당한 농도로 희석한 후 IG 정량 곡선에 따라 260nm에서 흡광도를 측정하여 핵산정량을 실시하였다. 글루타민산 정량은 식품첨가물공전 L-글루타민산 정량 방법에 준하여 실시하였다.

본 발명의 일 구체예에서, 기탁번호 KFCC 11558P인 Canida utilis 변이주를 제공하는 한다. 상기 구체예에서, 상기 변이주는 핵산 함량이 증가된 것을 특징으로 하는 Canida utilis 변이주를 제공하고, 상기 변이주는 RNA를 건조 균체당 18~20 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 Canida utilis 변이주를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 기탁번호 KFCC 11558P인 Canida utilis 변이주를 탄소원으로 글루코스 및 질소원으로 아미노산액을 포함하는 배지에서 배양하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 상기 배지가 추가 질소원으로 메티오닌 및 인산암모늄을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양하는 방법을 제공하고, C/N 비율이 1 내지 2.5인 배양하는 방법을 제공하며, 상기 배지는 무기염류 및 성장 인자를 추가로 포함하는 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 기탁번호 KFCC 11558P인 Canida utilis 변이주를 탄소원으로 글루코스 및 질소원으로 아미노산액을 포함하는 배지에서 배양하는 방법에 의해 제조된 균체를 준비하는 단계; 및 상기 준비된 균체를 세포벽분해효소, RNA 분해효소 및 디아미나제을 첨가하는 단계; 프로테아제 및 글루타미나아제를 추가로 첨가하여 효소분해하는 단계를 포함하는 효모추출물의 제조방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 효모추출물의 회수율이 50%이상인 제조방법을 제공한다.

본 발명을 통해 핵산을 15% 이상 함유하는 돌연변이 효모 균주를 제공하여, 저렴한 산업용 배지를 통해 고농도 균체 배양을 실시하여 효율적인 효소분해 공정을 통해 IG함량 20% 이상이며 동시에 풍부한 글루타민산을 함유하는 강한 지미를 가진 효모취가 없는 고핵산 효모엑기스 및 엑기스 분말 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구체에서의 다양한 탄소원에 따른 균체의 O.D.값이다.
도 2는 본 발명의 일구체에서의 다양한 질소원에 따른 균체의 O.D.값이다.
도 3은 본 발명의 일구체에서의 다양한 성장인자에 따른 균체의 O.D.값이다.
도 4는 본 발명의 일구체에서의 시간에 따른 Candida utilis TK20 고농도 배양 결과이다.
도 5는 본 발명의 일구체에서의Candida utilis TK20를 효소분해한 경우 IG함량도이다.
도 6은 본 발명의 일구체에서의Candida utilis TK20를 효소분해시 회수율이다.
도 7은 본 발명의 일구체에서의Candida utilis TK20를 효소분해시글루타민산 함량이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있도록 실시예를 들어 설명한다. 그러나 다음의 실시예로써 본 발명의 취지를 제한하는 것은 아니다.

돌연변이 균주 선별

RNA 함량이 높은 균주를 개발하기 위해서 EMS나 MNNG 등 유독성 물질이 아니라UV를 이용하여 돌연변이를 진행하였다. 모균주는 미생물보존센터에서 KCCM 12245 균주를 분양받아 이용하였다. 분양받은　Candida utilis 의 배양액(생균수 1.6x10⁸)을 10³으로 희석하여 245nm 파장의UV로 10cm 거리에서 1시간 동안 조사하여 치사율 99.9%이상 될 때까지 처리하였다. UV 를 조사한 배양액을 YM 평판배지에 도말하여 30℃에서 18hr동안 배양하여 콜로니를 얻었다. 그 콜로니들은 각각 다시 YM 평판배지에 단일 콜로니를 분리하여 1차 변이주 29개 균주를 획득하였다. 29개의 변이주를 액체배양 후 건조하여 STS 방법을 이용하여 총핵산 함량의 정량분석을 실시하여 원균주 대비 10%이상 핵산함량이 증가된 변이주 1m1, 4m1, 7m1, 16m1, 17m1, 18m1, 24m1 총 7개를 선별하였다.

7개 균주에 대하여 같은 방법으로 2차 변이를 실시하여 표 1과 같이 25개의 변이주를 획득하였다. 이와 같이 획득된 32개 변이주를 STS 방법을 이용하여 총핵산 함량의 정량분석을 하여 비교한 결과 원균주 대비 약 14% 이상 핵산함량이 증가된 균주 18m1, 18m2-3, 17m2-3을 선별하였다. 건조중량 및 총핵산 함량을 고려하여 18m1이 가장 좋은 생육과 핵산함량을 나타내어 Candida utilis TK20이라 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM, 기탁번호 KFCC11558P)에 기탁하였다.

2차 변이주의 핵산 증가량 비교

시료 건조중량 총핵산 증감량 (g) (%) (%)	시료 건조중량 총핵산 증감량 (g) (%) (%)
원균주 0.19 16.06 0 1m1 0.169 17.74 10.47 1m2-1 0.179 16.6 3.4 1m2-2 0.183 15.45 -3.76 1m2-3 0.159 14.58 -9.19 1m2-4 0.17 14.4 -10.3 4m1 0.174 17.52 9.09 4m2-1 0.172 17.92 11.59 4m2-2 0.17 16.72 4.14 4m2-3 0.188 16.1 0.25 7m1 0.18 15.52 -3.36 7m2-1 0.188 16.42 2.29 7m2-2 0.184 17.17 6.95 16m1 0.181 17.71 10.29 16m2-2 0.188 16.18 0.74 17m1 0.178 17.57 9.44	17m2-1 0.191 16.35 1.84 17m2-2 0.18 16.9 5.25 17m2-3 0.176 18.35 14.27 17m2-4 0.183 15.44 -3.84 17m2-5 0.178 17.08 6.37 18m1 0.181 18.45 14.93 18m2-1 0.189 15.31 -4.62 18m2-2 0.191 15.7 -2.23 18m2-3 0.167 18.8 15.66 24m1 0.168 17.84 11.12 24m2-1 0.152 17.51 9.04 24m2-2 0.184 15.44 -3.87 24m2-3 0.172 16.9 5.26 24m2-4 0.181 16.75 4.34 24m2-5 0.148 16.4 2.16

배지조성 검토 및 발효 실험

탄소원 종류별로 각각 1% 수용액을 만들어 배지로 사용하였으며, 배양은 진탕 배양기에서 온도 30℃, pH 5, 배양시간 18hr, 교반속도 180rpm, Candida utilis TK20 종균 첨가량은 0.1%로 실시하였다. 생육은 분광광도계를 이용하여 610nm에서 OD값을 측정하여 확인하였다.

탄소원으로는 글루코스, 저당, 수크로스, 락토오스, 과당, DE10, DE20, 감자전분, 옥수수전분, 변성전분 등을 사용하여 결정하였으며 도 1에 나타내었다.

질소원으로는 펩톤, 트립톤, 요소, 황산암모늄, 인산암모늄, 암모니아수, 아미노산액, 대두단백 등을 사용하였으며 각각의 질소원을 C/N 비율 10으로 첨가하여 생육을 확인하였다. 배양 조건은 앞과 동일하게 진탕배양기에서 온도 30℃, pH 5, 배양시간 18hr, 교반속도 180rpm, Candida utilis TK20 종균 첨가량은 0.1%로 실시하였다. 610nm에서 OD값으로 생육수치를 확인하여 도 2에 나타난 것과 같이 아미노산액에서 가장 좋은 생육을 확인하였다.

또한, 추가 질소원으로 각각의 아미노산을 첨가 실험을 실시한 결과 메티오닌에서 가장 좋은 생육을 나타내어 추가 질소원으로 사용하였다.

무기염류는 황산구리, 염화망간, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산아연, 황산제이철, 황산마그네슘, 인산암모늄, 황산암모늄, 인산칼륨 등을 사용하여 생육 비교를 실시하여 염화나트륨, 염화칼륨, 황산아연, 황산제이철, 황산마그네슘에서 생육이 증진되는 것을 확인하였다.

성장 인자를 종류별로 각각 첨가하여 생육을 확인한 결과 판토텐산칼슘, 바이오틴, Vit B12, Vit E에서 생육이 증진되는 것을 확인하였으며, 각각 혼합 효과를 확인하여 도 3에 나타난 것과 같이 판토텐산칼슘과 비오틴 혼합시 생육이 더욱 증진되는 것을 확인하였다.

앞에서 결정된 배지를 이용하여 본배양을 실시한 결과 배양한 결과 약 7.5g/L 수준의 건조균체를 얻었다. Candida utilis TK20의 고농도 배양을 위해 배지의 농도를 10배로 설정하여 무기염류 및 성장 인자를 검토하여 본배양 배지농도를 결정하였다.

본 배양에 사용된 배지는 포도당 7~15 중량%, 아미노산액 5~10 중량10%, 메티오닌 1~3 중량%, 인산암모늄 0.1~1 중량%, 황산마그네슘 0.05~0.1 중량%, 염화칼륨 0.01~0.1 중량%, 염화나트륨 0.01~0.1 중량%, 황산제이철 0.001~0.005 중량%, 황산아연 0.001~0.005 중량%, 판토텐산칼슘 0.01~0.02 중량%, biotin 0.0003~0.0004 중량%를 혼합하여 사용하였다.

회분식 방법을 이용한 배양

회분식 배양에 이용한 배지는 포도당 8 중량%, 아미노산액 6 중량%, 메티오닌 1 중량%, 인산암모늄 0.2 중량%, 황산마그네슘 0.05 중량%, 염화칼륨 0.02 중량%, 염화칼륨 0.02 중량%, 염화나트륨 0.05 중량%, 황산제이철 0.003 중량%, 황산아연 0.002 중량%, 판토텐산칼슘 0.01 중량%, biotin 0.0003 중량%의 조성을 갖는다.

본 배양은 5L 발효기를 이용하여 실험 부피 2L, pH는 암모니아수와 염산을 이용하여 5.0으로 유지시켰으며, 온도 30℃, 교반 속도 500rpm, 산소공급은 3L/min으로 실시하였다. 본 배양은 회분 배양방법을 이용하였으며 초기 배지 2L에 YM 배지에서 14hr동안 배양한 Candida utilis TK20의 종균을 5 중량%를 접종하였다.　 4hr~6hr에 생육이 좋았으며 이후 완만히 증가하다가 12~14hr부터 생육이 떨어져 정지기에 이르렀다.

결과적으로 24hr 배양한 결과 생육수치는 OD값 3.222를 증가되었으며 원심분리기를 이용하여 균체를 생리식염수로 5회 세척하여 효모건조균체 약 15g/L를 얻을 수 있었다(도 4참조).

연속적 연가식 배양

본배양에서 사용된 배지는 실시예 3과 같으며, 5L 발효기를 이용하여 실험 부피 2L, pH는 암모니아수와 염산을 이용하여 5.0으로 유지시켰으며, 온도 30℃, 교반 속도 500rpm, 산소공급은 3L/min으로 실시하였다. 초기 배양은 배지 1L에서 시작하였으며 종균 접종 4 중량% 접종하였으며 배지는 2hr부터 24hr까지 50~100ml/hr의 속도로 feeding pump를 통해 연속적으로 추가하여 주었다. 24hr 배양을 통해 OD값은 기존 3.222에서 4.327까지 증가하였으며 건조중량은 15g/L에서 25g/L으로 증가하였다(도 4 참조).

간헐적 연가식 배양

가격경쟁력을 갖는 40g 이상의 건조균체를 얻기 위하여 간헐적 연가식 배양을 실시하였다. 본배양에서 사용된 배지는 실시예 3과 같으며, 5L 발효기를 이용하여 실험 부피 2L, pH는 암모니아수와 염산을 이용하여 5.0으로 유지시켰으며, 온도 30℃, 교반 속도 500rpm, 산소공급은 3L/min으로 실시하였다.

실시예 3 실시 중 6hr~8hr 사이에 증식속도가 제한 받는 현상이 반복적으로 관찰되었다. 이를 개선한다면 초반 생육이 향상될 것이라 생각되어 추가 접종 및 배지를 추가하는 방법을 공정에 추가하였다.

본 배양은 초기에는 회분 배양방법을 이용하였으며 초기 배지 1L에 YM 배지에서 14hr동안 배양한 Candida utilis TK20의 종균을 최종 부피 2L에 대하여 4 중량%를 접종하였고 6hr에 3 중량% 종균을 추가 접종하였다. 또한 6hr, 9hr에 500ml씩 2차례 배지를 추가해줌으로써 총 부피 2L 발효를 실시하였다.

배양 중 종균 3 중량%를 6hr에 추가해 주었을 시 도 4에서 볼 수 있듯이 실시예 3에서 6~8hr사이에 증식이 억제되는 현상이 개선되어 높은 생육을 유지할 수 있었으며 500ml씩 배지를 6hr, 9hr에 추가하여 대수증식기가 16~18hr까지 늘일 수 있었다.

결과적으로, 실시예 3과 비교하여 OD값 3.222에서 5.302까지 높일 수 있었으며 건조중량은 15g/L에서 35g/L으로 증가하였다. 또한 IG 함량을 측정한 결과 20.5%로 기존 특허의 균체량보다 높으면서 IG 함량 역시 20% 이상인 것으로 나타났다.

세포벽 분해효소 및 프로테아제 NP 첨가하여 효소분해

실시예 3, 4, 5를 통해 얻은 습식효모균체에 1:1 비율로 물을 추가하여 90℃에서 10분간 열처리를 하였다. 이후 pH를 8로 조정하여 세포벽 분해효소(Amano, YL-T)와 프로테아제 NP를 각각 0.2% 첨가하여 60℃에서 6시간 동안 180rpm으로 진탕배양기를 이용하여 효소분해하였다.

이 후 90℃에서 10분간 효소를 실활시키고 pH를 5로 조정하고　 RNase(Amano, nuclease RP-1)를 0.2% 첨가하여 70℃에서 3시간 동안 180rpm으로 진탕배양기에서 효소분해를 실시하였다. RNase 처리 후 90℃에서 10분간 효소를 실활시키고 pH를 5.5로 조정하고　디아미나제(Amano, deaminase)를 0.1% 첨가하여 55℃에서 5시간 동안 180rpm으로 진탕배양기에서 효소분해를 실시하였다.

이 후 핵산의 정량은 효소분해액을 필요에 따라 적당한 농도로 희석한 후 IG 정량 곡선에 따라 260nm에서 흡광도를 측정하여 핵산정량을 실시하였다. 글루타민산 정량은 식품첨가물공전 L-글루타민산 정량 방법에 준하여 실시하였다.

결과는 도 5, 6, 7에서 볼 수 있듯이 회수율은 39.6%, IG 함량은 20.3%, 글루타민산은 4.6%를 나타내었다.

*세포벽 분해효소 및 데보라아제 첨가하여 효소분해

실시예 3, 4, 5를 통해 얻은 습식효모균체에 1:1 비율로 물을 추가하여 90℃에서 10분간 열처리를 하였다. 이후 pH를 8로 조정하여 세포벽 분해효소(Amano, YL-T)와 데보라아제를 각각 0.2% 첨가하여 60℃에서 6시간 동안 180rpm으로 진탕배양기를 이용하여 효소분해를 실시하였다.

결과는 회수율 42.75%, IG 함량은 20.4%, 글루타민산 함량은 4.2%로 측정되었으며 프로테아제 NP를 사용한 실시예 6보다 회수율이 약 3% 정도 높은 수치를 나타내었다(도 5, 6, 7 참조).

세포벽 분해효소, 데보라아제 , 프로테아제 NP 및 글루타미나아제 첨가하여 효소분해

실시예 3, 4, 5를 통해 얻은 습식효모균체에 1:1 비율로 물을 추가하여 90℃에서 10분간 열처리를 하였다. 이후 pH를 8로 조정하여 세포벽 분해효소(Amano, YL-T), 프로테아제 NP, 데보라아제를 각각 0.2% 첨가하였으며 또한, 글루타민산 함량을 증가시키기 위해 글루타미나아제 역시 0.01% 추가하여 60℃에서 6시간 동안 180rpm으로 진탕배양기를 이용하여 효소분해를 실시하였다. 또한, 글루타민산 함량을 증가시키기 위해 글루타미나아제 역시 0.01% 첨가하였다.

이후 핵산의 정량은 고핵산 효모엑기스 분말을 필요에 따라 적당한 농도로 희석한 후 IG 정량 곡선에 따라 260nm에서 흡광도를 측정하여 핵산정량을 실시하였다. 글루타민산 정량은 식품첨가물공전 L-글루타민산 정량 방법에 준하여 실시하였다.

결과는 도 5, 6, 7에 나타내었다. 회수율은 실시예 5, 6보다 7~10% 증가하여 50.6%로 세포벽 분해효소, 프로테아제 NP, 데보라아제를 병용하였을 시 회수율이 크게 증가하였다. IG 함량은 20.6%를 나타내었으며 글루타민산 함량은 5.1%로 측정되었다.

탈색, 탈취

효소분해액을 90℃에서 20분간 열처리 한 후 원심분리기를 이용하여 잔사를 제거하여 고핵산 효모효소분해액을 얻었다. 이 후 65℃에서 활성탄 0.2%를 넣어 1시간 동안 탈색, 탈취를 실시하여 감압필터하여 활성탄을 제거하였다. 이렇게 얻은 효모취가 제거된 효소분해액을 진공농축기를 사용하여 40brix로 농축하여 고핵산 효모엑기스를 얻었으며, 고핵산 효모엑기스를　80℃에서 30분간 살균처리 한 후 스프레이 건조기로 분말화하여 고핵산 효모엑기스 분말을 얻었다. 이와 같이 얻은 고핵산 효모엑기스 및 엑기스 분말을 관능평가를 실시하여 표 2에 나타내었다. 효모취가 강하게 느껴졌으며 효모 특유의 맛과 함께 쓴 맛이 느껴졌다. 맛의 조화는 강한 효모취와 이취로 인해 조화롭지 못하였다. 색은 연한 갈색을 나타내었다.

이어서, 효소분해액을 90℃에서 20분간 열처리 한 후 원심분리기를 이용하여 잔사를 제거하여 고핵산 효모효소분해액을 얻었다. 이 후 65℃에서 활성탄 1.5%를 넣어 1시간 동안 탈색, 탈취를 실시하여 감압필터하여 활성탄을 제거하였다. 이렇게 얻은 효모취가 제거된 효소분해액을 진공농축기를 사용하여 60brix로 농축하여 고핵산 효모엑기스를 얻었으며, 고핵산 효모엑기스를 80℃에서 30분간 살균처리 한 후 스프레이 건조기로 분말화하여 고핵산 효모엑기스 분말을 얻었다. 이와 같이 얻은 고핵산 효모엑기스 및 엑기스 분말을 관능평가를 실시하여 표 2에 나타내었다. 특유의 효모취가 사라졌으며 지미가 좋고 맛이 구수하고 조화롭게 깔끔하게 느껴졌다. 색도 또한 연한 아이보리색을 띄었다.

탈색, 탈취 관능 연구

활성탄함량	효모취	지미	맛	색
실시예9	강함	좋음	쓴맛, 효소분해 특유의 이미	연한 갈색
실시예9	없음	좋음	지미가 좋으며 깔끔하고 구수함.	연한 아이보리

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11558P

20130923

Claims

기탁번호 KFCC 11558P인 Canida utilis 변이주.
제 1항에 있어서,
상기 변이주는 핵산 함량이 증가된 것을 특징으로 하는 Canida utilis 변이주.
제 2항에 있어서,
상기 변이주는 RNA를 건조 균체당 18~20 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 Canida utilis 변이주.
제 1항의 변이주를 탄소원으로 글루코스 및 질소원으로 아미노산액을 포함하는 배지에서 배양하는 방법.
제 4항에 있어서,
상기 배지가 추가 질소원으로 메티오닌 및 인산암모늄을 포함하는 것을 특징으로 하는 배양하는 방법.
제 5항에 있어서,
C/N 비율이 1 내지 2.5인 배양하는 방법.
제 5항에 있어서,
배지는 무기염류 및 성장 인자를 추가로 포함하는 배양하는 방법.
제 4항의 방법에 의해 제조된 균체를 준비하는 단계; 및
상기 준비된 균체를 세포벽분해효소, RNA 분해효소 및 디아미나제을 첨가하는 단계;
프로테아제 및 글루타미나아제를 추가로 첨가하여 효소분해하는 단계를 포함하는 효모추출물의 제조방법.
제 8항에 있어서,
효모추출물의 회수율이 50%이상인 제조방법.