KR20150041637A - B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법 - Google Patents

B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150041637A
KR20150041637A KR20157004996A KR20157004996A KR20150041637A KR 20150041637 A KR20150041637 A KR 20150041637A KR 20157004996 A KR20157004996 A KR 20157004996A KR 20157004996 A KR20157004996 A KR 20157004996A KR 20150041637 A KR20150041637 A KR 20150041637A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
primer
seq
hbv
pcr product
Prior art date
Application number
KR20157004996A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101918342B1 (ko
Inventor
시우-펭 황
차우-팅 예
야-팅 첸
Original Assignee
내셔날 헬스 리서치 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트 filed Critical 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트
Publication of KR20150041637A publication Critical patent/KR20150041637A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101918342B1 publication Critical patent/KR101918342B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/103—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties luminescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

단리된 핵산 샘플에서 소형 S 단백질을 암호화하는 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재를 시험관내 검출하는 방법이 개시되어 있다. 상술한 방법에 사용하기 위한 시험관내 진단 키트도 또한 개시되어 있다.

Description

B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법{Methods for detecting hapatitis B virus surface gene non-sense muations}
본 발명은 일반적으로 간암(hepatocellular carcinoma)에 관한 것이고, 또 더욱 자세하게는 B형 간염 바이러스-관련 간암에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)의 유전자 S는 표면 항원(HBsAg)을 암호화하는 유전자이다. HBsAg 유전자는 1개의 긴 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이지만, 상기 유전자를 3개 부분, 즉 프리-S1, 프리-S1 및 S로 나누는 3개의 "개시" 코돈(ATG)을 프레임 내에 함유한다. 다수의 개시 코돈 때문에, 대형 S, 중간 S 및 소형 S로 불리는 3개의 상이한 크기의 폴리펩티드(각각, 프리-S1 + 프리-S2 + S, 프리-S2 + S, 및 S)가 생성된다. 만성 B형 간염 감염 동안, 상기 바이러스 게놈은 흔히 돌연변이를 유발할 것이다. 이들 돌연변이는 숙주 면역 감시로부터 탈출하기 위한 바이러스의 시도를 나타낸다.
HBV-관련 HCC의 간암형성(hepatocarcinogeneis)은 대부분의 외과적으로 제거된 암 HCC 조직이 자유롭게 복제가능한 바이러스를 거의 함유하지 않는다는 점에서 "히트-앤드-런" 이벤트로 생각된다. 그러므로, 특정 바이러스 돌연변이가 발암 과정의 개시에 관여하는 것으로 추정되면, 돌연변이 바이러스는 간암형성의 후속 과정에서 상실되기 때문에 이들을 확인할 수 없었다.
일개 요지에서, 본 발명은 단리된 핵산 샘플에서 소형 S 단백질을 암호화하는 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재를 시험관내 검출하기 위한 방법으로서,
a) 제1 세트 프라이머쌍 및 제2 세트 프라이머쌍을 제공하는 단계, 이때 상기 제1 세트 프라이머쌍은 제1 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하고, 상기 제2 세트 프라이머쌍은 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
(i) 상기 제1 정방향 프라이머는 S 유전자의 5'-말단에 어닐링하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 또 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열(tag sequence)에 의해 라벨링(labelled)되며, 상기 역방향 프라이머는 상기 S 유전자의 3'-말단 서열에 어닐링하는 특징을 갖고, 또 상기 제1 세트 프라이머쌍은 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR) 산물을 생성하는 특징을 갖고, 상기 제1 PCR 산물은 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열을 포함함;
(ii) 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→ 3' 방향으로, T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열(Kozak sequence) 및 제1 PCR 산물의 5'-말단에 위치한 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함하고, 또 상기 제2 세트 프라이머쌍은 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, 및 FLAG 태그 서열을 포함하는 제2 PCR 산물을 생성하는 특징을 갖고, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함;
b) 상기 단리된 핵산 샘플 및 제1 세트 프라이머쌍을 포함하는 제1 반응 혼합물에서 제1 PCR을 실시하여 제1 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 단리된 핵산 샘플은 HBV 보균자 또는 HBV 보균자로 의심되는 사람으로부터 얻음;
c) 상기 제1 PCR 산물 및 제2 세트 프라이머쌍을 포함하는 제2 반응 혼합물에서 제2 PCR을 실시하여 제2 PCR 산물을 생성하는 단계;
d) 상기 제2 PCR 산물을 단백질로 번역하는 단계;
e) 상기 단백질의 크기를 대조용 또는 야생형 소형 S 단백질의 크기와 비교하는 단계; 및
f) 대조용 또는 야생형 소형 S 단백질과 비교하여 단백질의 크기에서 감소가 있을 때, 핵산 샘플 내에 B형 간염 바이러스 S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이(truncation mutation)가 존재한다고 결정하는 단계를 포함한다.
다른 요지에서, 본 발명은 핵산 샘플에서 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 적어도 하나의 C-말단 절단 돌연변이의 시험관내 검출 방법에 관한 것으로,
a) 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하는 단계, 이때 상기 제1 정방향 프라이머는 S 유전자의 5'-말단에 어닐링하기 위한 서열을 포함하고 또 그의 5'-말단에 FLAG 태그 서열을 가지며, 상기 역방향 프라이머는 S 유전자의 3'-말단에 어닐링하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 포함함;
b) 상기 핵산 샘플, 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 제1 반응 혼합물에서 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하여 제1 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 제1 PCR 산물은 그의 5'말단에 FLAG 태그 서열을 포함하며,상기 핵산 샘플은 HBV 보균자이거나 또는 HBV 보균자로 의심되는 사람으로부터 얻음;
c) 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하는 단계, 이때 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→3' 방향으로 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 스페이서를 갖는 코자크 서열 및 상기 제1 PCR 산물의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함함;
d) 상기 제1 PCR 산물, 제2 정방향 프라이머, 및 역방향 프라이머를 포함하는 제2 반응 혼합물에서 제2 PCR을 실시하여 제2 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 제2 PCR 산물은 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, FLAG 태그 서열을 포함하며, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함;
e) 상기 제2 PCR 산물을 단백질로 번역하는 단계;
f) 상기 제2 PCR 산물의 크기를 야생형 소형 S 단백질의 크기와 비교하는 단계; 및
(g) 상기 단백질의 크기가 야생형 소형 S 단백질의 크기보다 작을 때, 핵산 샘플 내에 B형 간염 바이러스 S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이가 존재한다고 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 요지에서, 본 발명은 핵산 샘플에서 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재 검출에 사용하기 위한 시험관내 진단 키트에 관한 것으로,
(a) 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR) 산물을 생성하기 위한 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 상기 핵산 샘플 중의 HBV S 유전자에 어닐링하는 특징을 갖는 제1 세트 프라이머쌍, 이때 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호: 2의 적어도 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐(spanning)있게 하고 또 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 의해 라벨링됨; 및
(b) 제2 PCR 산물을 생성하기 위한 제2 PCR에서 제1 PCR 산물에 어닐링하는 특징을 갖는 제2 세트 프라이머쌍, 이때 상기 제2 PCR 산물은 제1 PCR 산물의 서열에 걸쳐있고 또 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, 및 FLAG 태그 서열을 포함하며, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함;을 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에서, HBV S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이는 sL15*, sL21*, sS61*, sC69*, sL95*, sW156*, sW163*, sW172*, sW182*, sW196*, 및 sL216*으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 비교 단계는 웨스턴 블럿(Western blot) 또는 화학발광 검출 시스템(chemiluminescent detection system)에 의해 실시된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 핵산 샘플은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 또는 간암이 의심되는 환자 또는 비정상적 간 기능을 갖거나 또는 간경화증이 있는 환자로부터 얻는다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 핵산 샘플은 신선한 냉동 간 조직 또는 포르말린-고정된 파라핀 조직 부분, 또는 혈액 샘플로부터 추출된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호:2의 적어도 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐 있게 하고 또 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 의해 라벨링된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호: 2의 아미노산 위치 30 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐, 또는 서열번호: 2의 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐 있게 한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 코자크 콘센서스 서열(Kozak consensus sequence)은 서열번호: 5 또는 서열번호: 6이다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상술한 시험관내 진단 키트 중의 제1 세트 프라이머쌍은 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 제2 세트 프라이머쌍은 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
(i) 상기 제1 정방향 프라이머는 그의 5'-말단에 FLAG 태그 서열을 포함하고; 및
(ii) 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→3' 방향으로 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열 및 상기 제1 PCR 산물의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상술한 프라이머들은 다음과 같다:
a) 상기 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 또및c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제2 정방향 프라이머는 다음으로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
(a) 서열번호: 8 및 10;
(b) 서열번호: 11 및 12;
(c) 서열번호: 8 및 12;
(d) 서열번호: 13 및 12;
(e) 서열번호: 13 및 10;
(f) 서열번호: 14 및 12;
(g) 서열번호: 14 및 15;
(h) 서열번호: 14 및 10; 및
(i) 서열번호: 16 및 17.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 정방향 프라이머의 서열은 서열번호: 14이고, 또 상기 제2 정방향 프라이머의 서열은 서열번호: 15이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상술한 프라이머들은 다음과 같다:
a) 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다;
b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다; 및
c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
이들 및 기타 요지는 이하의 도면을 참조하여 바람직한 실시양태의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이지만, 본 발명의 개시내용의 정신과 범위로부터 벗어나지 않는 한 변형과 변이가 가능하다.
첨부한 도면은 적시된 설명과 함께 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 예시하며, 본 발명의 원리를 설명하는 작용을 한다. 도면에서 동일 참조번호가 사용되는 것은 실시양태의 동일 또는 유사한 요소를 지칭하는 것이다.
도 1은 HBV S 유전자 서열 및 그의 단백질(소형 S) 서열을 도시한다. .
도 2는 제1 프라이머쌍(1F 및 1R) 및 제2 프라이머쌍(2F 및 2R)의 디자인을 예시한다. 상기 제1 프라이머쌍(1F 및 1R)에서, 여기서 예시된 상기 정방향 프라이머(1F)는 짧은 형태 유형이다. 상기 제2 프라이머쌍(2F 및 2R)에서, 상기 정방향 프라이머는 T7 프로모터 또는 S6 프로모터를 함유할 수 있다. 상기 1R 및 2R은 동일하다(즉, 동일한 서열을 갖는다).
도 3은 제1 프라이머쌍(1F 및 1R) 및 제2 프라이머쌍(2F 및 2R)의 디자인을 예시한다. 상기 제1 프라이머쌍에서, 상기 정방향 프라이머(2F)는 긴 형태 유형이고, 또 상기 제2 프라이머쌍에서, 상기 정방향 프라이머(2F)는 T7 프로모터 또는 S6 프로모터를 함유할 수 있다. 상기 1R 및 2R은 동일하다(즉, 동일한 서열을 갖는다).
도 4a-b는 간암(HCC) 종양 조직에서 확인된 B형 간염 바이러스(HBV)를 도시한다. a. 1개 HBcAg(+) HCC 조직 부분(면역조직화학 염색, 100X)에서 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 및 B형 간염 코어 항원(HBcAg)의 확산적으로 양성 염색. b. 19 HBcAg(+) HCC 종양 조직의 서던 블럿 분석(Southern blot analyses)은 HBV DNA의 풍부한 단쇄(SS) 형태 및 RC(relaxed-circular) 형태를 나타내며, 이는 자유로이 복제가능한 바이러스의 존재와 일치한다. HepG2-HBV가 양성 대조군으로 사용되었다. T: 종양 간 조직, N: 비-종양 간 조직. 상이한 환자로부터 얻은 샘플은 표시된 바와 같이 아라비아 숫자로 라벨링하였다
도 5a-c는 야생형(WT)과 비교한 3개의 HBs 돌연변이체(L98, W182 및 L216)의 작용 연구를 도시한다. a. 세포 증식 에세이에 의해 3개의 HBs 돌연변이체 모두 숙주 세포 성장을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. b. 세포 고정 독립능 연구에 의해 W182가 최고 콜로니 개수(colony counts)를 가졌음이 밝혀졌다. c. 야생형 및 3개의 돌연변이체 모두는 모의 시험에 비하여 현저하게 더 높은 콜로니 개수를 가졌다. 모의시험은 음성 대조군을 나타낸다.
도 6a-b는 3개의 HBV S 절단 돌연변이체(L95, W182-1, W182-2 및 L216), 야생형(WT-1, WT-2), 및 모의군(음성 대조군을 나타냄)을 포함하는 적합한 클론으로부터 세포의 피하 주사에 의한 누드 마우스 이종이식(xenograft) 연구의 결과를 도시한다. a. W182 돌연변이체는 종양의 최고 발생(100%)과 최대 종양 크기를 나타내었다. b. W182 돌연변이체 만이 모의시험군과 비교하여 통계적으로 유의한 높은 종양 성장 속도를 나타내었다.
도 7a는 HBV S 유전자의 m-RNA 발현이 야생형(WT), 및 3개의 절단 돌연변이체: L95, L216, W182-1 및 W182-2를 포함한 HBV S 유전자의 5개의 안정한 클론에서 모두 양성임을 도시한다.
도 7b는 WT 및 2개의 W182 안정한 클론으로부터 이종이식 연구의 종양이 HBV S 유전자의 m-RNA 발현을 가짐을 도시한다.
도 7c는 WT 및 3개의 HBS 절단 돌연변이체 모두로부터의 이종이식 연구에서 종양들이 모두 면역조직화학적(IHC) 염색(HBsAg에 대한 IHC 염색, 100 X)에 의해 HBS 단백질 발현을 나타냄을 도시한다.
도 8은 3개의 상이한 HBV C-말단 절단 돌연변이체에 대한 적용을 도시한다. 트랜센드(transcend) 화학발광 검출 시스템에 의해 검출 결과를 도시한다. 신호는 강하고 또 3개 돌연변이체 모두의 단백질 크기는 모두 정확하다.
도 9는 트랜센드 화학발광 검출 시스템을 이용하여 4명의 HBV 환자의 HCC 조직 샘플(500 ng)에 대한 적용을 도시한다. 상이한 절단 돌연변이가 성공적으로 확인되었다. 그 세기는 조직 중의 돌연변이체 클론의 양과 직접적으로 관련된다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 내용 내에서 및 각 용어가 사용된 특정 내용에서 당해 분야에서의 통상의 의미를 가진다. 본 발명을 설명하기 위해 이용된 특정 용어는 이하에 또는 명세서의 다른 곳에서 설명하며, 본 발명의 기재에 관하여 사용자에게 부가적 안내를 제공한다. 편의상, 특정 용어는 예를 들어 이탤릭 및/또는 따옴표를 이용하여 강조될 수 있다. 강조의 이용은 용어의 범위나 의미에는 아무런 영향을 주지 않는다; 동일한 분야에서 어떤 용어의 범위와 의미는 강조되든 것에 상관없이 동일하다. 동일한 것은 1개 이상으로 말해질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 명세서에 논의된 하나 이상의 용어에 대해 다른 언어 및 동의어를 이용할 수 있거나, 용어가 정교하거나 논의된 것에 여부에 상관없이 특수한 중요성을 주지 않는다. 특정 용어에 대한 동의어도 제공된다. 하나 이상의 동의어의 반복은 다른 동의어의 사용을 배제하지 않는다. 논의된 용어의 예를 비롯하여 명세서에서 임의 예의 이용은 예시적인 목적을 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명 또는 예시된 용어의 범위나 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 명세서에 제시된 다양한 실시양태에 한정되지 않는다.
다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 본 정의를 비롯한 본 명세서가 주도권을 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대략", "약" 또는 "거의"는 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 본 명세서에 제시된 숫자 양은 대략적인 것이고, 상기 용어 "대략", "약" 또는 "거의"의 의미는 분명히 말하지 않으면 추정될 수 있다.
대형 S 단백질은 프리S1, 프리S2 및 S 유전자를 포함한 대형 S 유전자에 의해 암호화된다. 소형 S 단백질에 대한 유전자 서열은 S 유전자라 불리며, 나머지 2개는 프리S1 유전자 및 프리S2 유전자(대형 S 및 중간 S 단백질 암호화)라 불린다.
용어 "코자크 콘센서스 서열", "코자크 콘센서스" 및 "코자크 서열"은 상호교환가능하다.
T7 RNA 중합효소는 5'→3' 방향으로 RNA의 형성을 촉진하는 T7 박테리오파아지로부터의 RNA 중합효소이다. T7 중합효소는 극히 프로모터-특이적이고 또 T7 프로모터의 DNA 하류만을 전사한다. T7 중합효소는 또한 DNA 주형 및 RNA 합성을 위한 보조인자(cofactor)로서 Mg2+ 이온을 필요로 한다.
Sp6 RNA 중합효소는 5'→3' 방향으로 RNA 형성을 촉진하는 Sp6 박테리오파아지로부터의 RNA 중합효소이다. Sp6 중합효소는 극히 프로모터-특이적이고 또 Sp6 프로모터의 DNA 하류만을 전사한다. Sp6 중합효소는 또한 DNA 주형 및 RNA의 합성에 대한 보조인자로서 Mg2 + 이온을 필요로 한다.
용어 프라이머 또는 PCR 산물의 "5'-말단"은 일반적으로 프라이머의 5'-말단부 또는 PCR 산물의 프라이머의 5'-말단부를 의미한다.
넌센스 돌연변이는 전사된 mRNA에서 조기성숙(premature) 정지 코돈 또는 넌센스 코돈을 초래하는 DNA의 서열에서 점 돌연변이(point mutation)이며, 그 결과는 단백질의 번역의 조기 종료이다. 이러한 유형의 단백질을 C-말단 절단 단백질이라 칭하며, 또 이러한 DNA 돌연변이를 C-말단 절단 돌연변이라 칭한다. 상기 C-말단 절단 단백질은 보통 불안정하다.
용어 "L95" 및 "sL95*"는 상호 교환가능하다; 용어 "W182" 및 "sW182*"는 상호 교환가능하다; 용어 "L216" 및 "sL216*"는 상호 교환가능하다.
본 발명은 HCC와 관련된 HBV S 유전자 돌연변이의 검출에 관한 것이다. HCC 조직에서 자유로이 복제가능한 바이러스로부터 유도된 S 유전자 C-말단 절단 돌연변이체(sW182*, sL95*, 및 sL216*)는 모두 발암 활성을 보유함이 발견되었다. 본 발명은 HBV-관련 발암에 관련된 단백질의 발견에 관한 것이다. HBV의 S 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1(입수번호 AY167089로 입수가능한 S 유전자 서열)에 수록되어 있다. HBV 소형 S 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2(도 1 참조)에 수록되어 있다.
HBV S 유전자 C-말단 절단 돌연변이의 예는 다음과 같다:
sL15*는 S 유전자에서 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 L15에서 정지 코돈을 초래한다.
sL21*은 S 유전자에서 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 L21에서 정지 코돈을 초래한다.
sS61*은 S 유전자(서열번호: 1)의 뉴클레오타이드 182 C에서 G로 또는 C에서 A로 치환을 나타내며, 소형 S 단백질(서열번호: 2)의 아미노산 위치 S61에서 정지 코돈을 초래한다.
sC69*는 S 유전자의 뉴클레오타이드 207 T에서 A로의 치환을 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 C69에서 정지 코돈을 초래한다.
sL95*는 S 유전자의 뉴클레오타이드 284 T에서 A로의 치환을 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 L95에서 정지 코돈을 초래한다.
sW156*은 S 유전자의 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 W156에서 정지 코돈을 초래한다.
sW163*은 S 유전자의 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 W163에서 정지 코돈을 초래한다.
sW172*는 S 유전자의 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 W172에서 정지 코돈을 초래한다.
sW182*는 S 유전자의 뉴클레오타이드 546 G에서 A로의 치환이며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 W182에서 정지 코돈을 초래한다.
sW196*은 S 유전자의 점 돌연변이를 나타내며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 W196에서 정지 코돈을 초래한다.
sL216*은 S 유전자의 뉴클레오타이드 647 T에서 A로의 치환이며, 소형 S 단백질의 아미노산 위치 L216에서 정지 코돈을 초래한다.
시험용 종으로부터 DNA 샘플의 준비
모든 HBV 보균자는 시험에 적합하다. 지속적인 염증 활성(비정상적 간 기능 시험) 또는 간 경화증이 있는 HBV 보균자는 HCC를 발병할 위험성이 있는 주요 집단이다. 따라서 이들 환자들은 시험에 대한 주요 환자 집단이다. 환자의 DNA 샘플은 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예컨대, DNA는 환자의 혈청 또는 혈장으로부터 추출될 수 있거나, 또는 신선한 냉동 간 조직(생검 또는 수술적 시편)으로부터 추출되거나, 또는 포르말린-고정된 파라핀 부분으로부터 절개된 간 조직으로부터 추출될 수 있다. 조직 시편은 수술적 시편 또는 생검 시편으로부터 얻을 수 있다.
프라이머의 고안
도 2 및 도 3은 프라이머의 디자인을 도시한다. 본 발명을 실시하는데에는 프라이머 쌍의 2개 세트(상기 제1 세트 프라이머쌍 및 제2 세트 프라이머쌍)가 필요하다. 각 세트는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된다. 상기 제1 세트 프라이머쌍 중의 상기 역방향 프라이머는 제2 세트 프라이머쌍 중의 역방향 프라이머와 동일하다.
상기 제1 세트 프라이머쌍(정방향 프라이머 1F 및 역방향 프라이머 IR 포함)은 HBV 표면 유전자를 걸쳐있게(span) 설계되고 또 제1 세트 프라이머쌍에 의해 증폭된 PCR 산물은 PCR 산물의 N-말단 영역(또는 단부)에서 FLAG 서열을 포함한다.
또한, 상기 제1 세트 프라이머쌍은 2개 유형, 즉 짧은 형태 유형(IShort) 및 긴 형태 유형(ILong)을 갖도록 설계될 수 있다. 이들 2개 유형은 정방향 프라이머의 어닐링 부위에서 상이할 수 있지만, 역방향 프라이머에 대해서는 동일한 어닐링 부위를 갖는다. IShort의 PCR 산물은 S 유전자의 더 짧은 영역(즉, 아미노산 123 내지 아미노산 227)(도 2)에 걸쳐 존재하지만, ILong의 PCR 산물은 S 유전자의 더 긴 영역(예컨대, 아미노산 30 내지 아미노산 227)(도 3)에 걸쳐 존재한다.
제2 세트 프라이머쌍은 제2 세트에 의해 증폭된 PCR 산물이 T7 또는 Sp6 프로모터, 스페이서 서열, 및 PCR 산물의 N-말단부에 코자크 서열을 포함하도록 설계된다. 제2 세트 프라이머쌍은 또한 2개 유형을 가질 수 있다: IIA 및 IIB. 제2 세트 프라이머쌍 IIA로부터 초래된 PCR 산물은 PCR 산물의 N-말단부에 T7 프로모터를 포함한다. 제2 세트 프라이머쌍 IIB로부터 초래된 PCR 산물은 PCR 산물의 N-말단부에 Sp6 프로모터를 포함한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 제1 세트 프라이머쌍은 생성된 제1 PCR 산물이 HBV S 유전자의 영역을 암호화하는 소형 S 단백질의 C-말단(아미노산 123에서부터 출발해서 아미노산 227 까지)의 적어도 1/2에 걸쳐 존재하고 또 제1 PCR 산물의 N-말단에 FLAG 서열을 갖도록 설계된다. 더 많은 절단 돌연변이체를 얻기 위하여 상기 제1 PCR 산물이 소형 S 단백질의 C-말단의 더 넓은 영역에 걸쳐 존재하게 하기 위하여, 제1 세트 프라이머쌍의 다른 정방향 프라이머는 S 단백질의 N-말단(아미노산 30에서부터 출발하여 아미노산 227까지)에 아주 근접한 개시점을 갖도록 설계된다(도 3). 제1 세트 프라이머쌍(환자로부터 얻은 DNA 샘플 중에서 HBV 소형 S 단백질-암호화 유전자를 증폭)으로부터 초래한 PCR 산물을 "제1 PCR 산물"이라 한다.
제2 세트 프라이머쌍은 제2 PCR 산물의 N-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터를 포함하는 제2 PCR 증폭 산물을 생성하기 위하여 설계된다. 제2 세트 프라이머쌍에 의해 사용된 주형은 상술한 제1 세트 프라이머쌍에 의해 생성된 제1 PCR 산물이다. 제2 세트 프라이머쌍으로부터 초래된 PCR 산물을 여기서 "제2 PCR 산물"이라 칭한다. 상기 제2 PCR 산물은 시험관내 번역 키트를 이용하여 단백질로 번역된다. 번역된 단백질은 웨스턴 블럿 또는 TRANSCENDTM 화학발광 번역 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다.
상기 환자가 소형 S 단백질-암호화 유전자(S 유전자)에서 정지 코돈 돌연변이를 가지면, 상기 번역된 단백질은 C-말단 절단으로 인하여 야생형 소형 S 단백질(대조군)에 비하여 더 작은 크기를 가질 것이다. 대조군(야생형) 소형 S 단백질의 크기는 22.8 kDa이다.
상기 제1 PCR 산물도 상기 제2 PCR 산물도 그 자체는 소형 S 단백질 C-말단 절단 돌연변이가 존재하는지 여부를 평가하기 위해 사용될 수 없는데, DNA 샘플 중의 S 유전자에는 오직 하나의 뉴클레오타이드 돌연변이 만이 존재하였기 때문이다. 이러한 상황하에서, 돌연변이체 DNA 주형을 함유하는 PCR 반응으로부터의 PCR 산물의 크기는 야생형(또는 대조군) DNA 주형을 함유하는 PCR 반응으로부터의 PCR 산물의 크기와 동일하게 잔존할 것이다. 그러나, 소형 S 단백질의 돌연변이체는 절단된 형태이고 또 그의 크기는 야생형 S 단백질보다 더 작다. 따라서, 본 발명은 C-말단 절단된 소형 S 단백질(즉, S 유전자의 C-말단 절단된 돌연변이)의 관찰과 검사를 허용하는 2 세트의 프라이머쌍을 설계하는 것에 의해 C-말단 절단 돌연변이의 존재를 평가 또는 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 단백질 절단을 검출한다(또는 절단된 단백질을 검출한다). 이 시험은 PCR 산물의 서열결정화를 필요로 하지 않기 때문에 비용 효과적이다. 또한, 상기 방법은 정지 코돈의 위치를 알 필요를 제거한다.
T7 프로모터(TAATACGACTCACTATAGG; 서열번호: 3);
Sp6 프로모터(TATTTAGGTGACACTATAG; 서열번호: 4);
짧은 스페이서를 갖는 코자크 콘센서스 서열: GAGCCACCATG(서열번호: 5) 또는 긴 스페이서를 갖는 코자크 콘센서스 서열: AACAGCCACCATG(서열번호: 6);
FLAG(GACTATAAAGACGACGACGACAAA; 서열번호: 7).
시험관내 번역 키트는 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation System(프로메가 코포레이션 제조, 미국 와이오밍 소재)과 같이 시중에서 입수가능하다.
표적 DNA를 증폭하기 위한 PCR 조건
본 발명에 따르면, 2개의 PCR 반응을 실시하였다. 제1 PCR 반응은 1㎕의 DNA 샘플을 사용하여 총 부피 50 ㎕로 실시하였다. PCT 프로파일은 다음과 같았다: 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초간의 변성 단계를 35주기, 55℃에서 45초간 어닐링 단계 및 72℃에서 1분간 연장 단계, 및 72℃에서 7분간 최종 연장 단계. 제2 PCR 반응은 제1 PCR과 동일한 프로파일을 이용하여 제1 PCR 반응의 말기에 샘플의 2㎕를 취하는 것에 의해 실시하였다.
단백질 검출 방법:
웨스턴 블럿 과정 및 TRANSCENDTM 화학발광 검출 시스템과 같은 기타 검출 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 또 번역된 단백질을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. HBV의 DNA 뉴클레오타이드 서열은, 아미노산 서열이 동일하다고 하더라도 기준 서열로서 HBV의 상이한 유전형을 사용할 때 매우 상이할 수 있다. 그러나, 설계된 프라이머의 위치는 상이한 유전형 사이에서 콘센서스이고, 따라서 상기 프라이머는 HBV DNA 주형의 상이한 유전형에 어닐링할 수 있다. 상기 단백질의 크기는 막 위에 마커에 따라 평가될 수 있었다.
실시예
본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니나, 본 발명의 실시양태에 따른 예시적 도구, 장치, 방법 및 이들의 관련 결과를 아래에 나타낸다. 독자의 편의를 위해 실시예에 제목 또는 소제목이 이용될 수 있으나, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 특정 이론이 제시되고 본 명세서에 개시된다; 그러나, 이들이 바르건 틀리건, 본 발명이 어떠한 특정 이론 또는 계획없이 본 발명에 따라 실시되는 한 본 발명의 범위를 한정하지 않아야 한다.
재료 및 방법
HBsAg(Virostat, 미국 포틀랜드 메인) 및 HBcAg(Dako, 미국 캘리포니아 소재)의 통상의 면역조직화학적(IHC) 염색은, 장래의 항바이러스 치료를 위해 창궁 미모리얼 병원(CGMH)에서 HBV 감염된 환자로부터 외과적으로 제거된 HCC 간 조직 부분 상에서 2000년부터 2002년에 걸쳐 실시하였다. 이 연구 수법은 Institutes of Reviewing Board of Chang-Gung memorial Hospital and National Health Research Institutes로부터 승인을 받았다. 동물 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee of National Health Research Institutes에 의해 승인을 받았다.
HBV 돌연변이의 확인
DNA 추출은 Hirt 추출 과정에 이어 Quiagen DNA 추출(QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 실시하였다. 전장(full-length) HBV 게놈의 직접적 서열결정을 실시하였다. 제조자의 지시에 따라서 ABI3730 유전자 분석기(Applied Biosystems, 캐나다 포스터 씨티 소재) 상에서 PCR 증폭을 위해 동일 프라이머 및 ABI BigDye Terminator kit v3.1를 이용하여 실시하였다. 서열 변이는 B형 간염 바이러스 기준 서열(유전형 B의 경우 AY167089 및 유전형 C의 경우 AY167095, National Center for Biotechnology Information)과 함께 Seqscape 소프트웨어(Applied Biosystems, 캐나다 포스터 씨티 소재, USA)를 이용하여 결정하였다.
S 유전자 C-말단 절단 돌연변이체의 형질전환 활성
1. 플라스미드 작성 및 부위 특이적 돌연변이
HBV의 야생형(wt) 프리S/S 영역은 1 카피보다 더 긴 HBV 게놈(GenBank 입수 번호 X02763)을 함유하는 pCMV-HBV 플라스미드로부터 프리SF 및 SR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 상기 PCR 산물을 pIRESbleo 플라스미드(BD Biosciences Clontech, NJ, USA)에 삽입하여 pIRES-프리S/S-wt의 작성물(대형 S 단백질-암호화 유전자의 야생형 서열을 의미하며, 프리S1 유전자, 프리S2 유전자 및 S 유전자 포함)을 생성하였다. CMV 프로모터를 사용하였다. 3개의 넌센스 돌연변이, S 유전자의 sL95*, sW182* 및 sL216* 각각을 함유하는 절단된 대형 S 단백질을 암호화하는 플라스미드를 작성하기 위하여, PCR-계 방법에 따라서 부위 특이적 돌연변이 실험을 실시하였다. 모든 플라스미드는 자동 DNA 서열결정기(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아 소재)를 이용하여 서열 확인하였다.
2. 3개의 S 절단 돌연변이체의 안정한 클론의 확립을 위한 세포 배양 및 플라스미드 형질감염( transfection )
NIH3T3 세포는 10% 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 100단위/ml 페니실린 및 100ug/ml 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변성 이글 배지에서 유지하였다. 이들 세포를 5% CO2 배양기 중, 37℃에서 유지하였다. 야생형 또는 절단된 대형 S 단백질을 암호화하는 pIRESbleo 플라스미드에 의한 형질감염은 리포펙타민(Lipofectamin) 2000 시약(Invitrogen 제조, 미국 캘리포니아 소재)을 이용하여 실시하였다.
3. 형질전환 및 종양형성 ( tumorigenesis ) 에세이
I. 세포 증식 에세이
세포 증식 에세이에는 WST-1 시약을 사용하였다. 이것을 배양 배지에서 희석(1:10)하였다. 1000개 세포(4개의 NIH3T3 안정한 세포주로부터 입수: 모의시험용, Wt, sL95*, sL216*, 및 sW182*)를 96웰 배양판의 각 웰에 파종하고, 12시간 동안 배양하였다. 세포 부착 후, 배양 배지를 혈청을 갖지 않는 배지로 교환한 다음, 24시간 동안 동시에 배양하였다. 0일 후 데이터를 수집하고, 배지를 다시 완전 배지로 변경하며 이틀마다 새롭게 하였다. 배양한지 4시간 후, 파장 450 nm의 광학 밀도를 판독하였다. 각 검출 지점은 5개의 독립적인 실험으로 분석하였다. 성장 곡선은 시험된 안정한 클론의 0일에서의 흡수치에 대하여 N일에서 흡수치의 비율로 서 산출하였다.
II. 세포 고정 독립능
세포 고정 독립성 에세이는 6웰 플레이트에서 실시하였다. 바닥층은 완전 배양배지를 갖는 1.5 ml 0.7% 아가로오스(SeaPlaque)이었다. 상부층(upper layer)은 완전 배양배지 및 5000개의 세포(4개의 NIH3T3 안정한 세포주로부터 입수: 모의시험용, Wt, sL95*, sL216*, 및 sW182*)와 혼합된 2 ml 0.5% 아가로오스이었다. 최상층은 1 ml 완전 배양 배지였고 이틀마다 새롭게 하였다. 콜로니는 0.1% p-아이오도니트로 테트라졸륨 바이올렛(INT) 염색에 의해 가시화되었다. 각 안정한 클론 실험은 3회 반복하여 실시하였고 각 웰에 대해 3개의 임의로 선택된 것을 동일 대물 배율(20X)로 콜로니 개수 산출처리하였다. 콜로니 개수는 소프트 이미지제이(Soft ImageJ(NIH)에 의해 산출하였다.
III. 종양형성에 대한 이종이식 에세이
국립 동물실험센터(타이완, 타이페이 소재)로부터 웅성 BALB/c 마우스를 입수하였다. 이들 마우스를 특정의 무-병원균 조건에서 유지시켰다. 4주된 무흉선(athymic) 마우스(그룹당 4-5마리)에 1x106 세포(4개의 NIH3T3 안정한 세포주로부터 입수: 모의시험용, Wt, sL95*, sL216*, 및 sW182*)를 피하 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하고 13주 될 때까지 매주 측정하였다. 이들 마우스를 치사시켰다. 종양 성장이 있었으면, 종양 및 간을 절개해내고, 조직병리 검사를 위해 포르말린-고정 및 파라핀-매립시켰다. 상기 종양 및 간 조직의 일부를 DNA, RNA 및 단백질 추출용으로 냉동시켰다. 종양 성장이 대량으로 없으면, 조직 병리 확인을 위해 주사 부위의 피부 및 그의 피하 조직을 절개하였다.
결과
2000년부터 2002년까지, 본 발명자들은 창궁 미몰리얼 병원에서 300개의 HBV-관련된 외과적으로 제거된 HCC 시편에 대해 면역조직화학 염색을 실시하여 암적 부분에서 B형 간염 코어 항원(HBcAg) 발현에 대해 양성이었던 28개의 HCC 조직을 확인하였고, 이는 HBV가 HCC 조직에서 여전히 생존가능함을 제시한다. IHC 염색에 의해 분석된 300개의 HCC 간 조직 부분 중, 106개의 종양 조직(35.3%)이 HBsAg에 대해 양성이었고, 또 오직 28개 종양(9.3%)이 HBcAg에 대해 양성이었다(도 4a). 이들 중, 암적 부분에서의 25개의 HBcAg-양성 HCC는 유용한 신선한 냉동 종양 조직을 가졌고 또 이후의 연구를 위해 CGMH의 종양 뱅크에 있는 양성(benign) 간조직과 쌍을 이루었다. 25개 HBcAg-양성 종양 중 총 19개는 서던 블럿 분석에 충분한 양의 DNA 샘플(>100㎍)을 가졌다(도 4b). 이들 데이터는 HBV의 충분한 단쇄(SS) 형태 및 RC(relaxed-circular) 형태를 나타내며, 이는 자유로이 복제가능한 HBV 바이러스의 존재와 일치한다. 상기 SS 및 RC 형태를 확인하고 19명의 환자 모두에 있는 HBcAg-양성 HCC 조직으로부터 단리하였다. HepG2-HBV가 양성 대조군으로 사용되었다. T: 종양 조직, N: 비-종양 간 조직.
HBcAg -양성 HCC 조직을 갖는 HCC 환자의 임상병리적 특징
HCC 조직 중의 양성 HBcAg의 임상적 중요성을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 25명의 HBcAg-양성 HCC 환자의 임상병리학적 특징을 동일 시기 동안 처리된 25명의 성별 및 연령-매칭된 HBcAg-음성 HCC 환자의 특징과 비교하였다. HBcAg-양성 HCC 환자는 경화증(p<0.001) 및 소형 종양 크기(≤2 cm)(p=0.039)와 관련이 있었다. HBcAg-양성 HCC 환자에 있어서 평균 무 질병 생존(DFS) 및 전체 생존(OS)(각각 21.2 개월 및 72.2 개월)은 HBcAg-음성 환자(각각 9.8 개월 및 44.0 개월)보다 모두 더 길었지만, 통계적으로 유의하지 않았다(각각 P=0.686 및 0.793).
전체 게놈 HBV DNA 서열 분석에 의한 암적 HCC 조직과 관련된 바이러스성 돌연변이의 확인
전체 게놈 HBV DNA 서열결정화는 암적 부분 및 비암 부분을 비롯하여 25쌍의 HBcAg-양성 HCC 전체에 대해 실시하였다. 4개의 HBV 유전자(S, C, X 및 P) 모두는 HBcAg-양성 HCC 종양 조직에서 성공적으로 서열결정화되었다. 25개의 HBcAg-양성 HCC 종양 및 쌍을 이룬 비-종양 조직의 완전한 HBV 서열 데이터는 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스(EU487256-EU487257, EU522066-EU522075, EU564820-EU564826, EU660224-EU660233, EU881995-EU882006, EU919161-EU919176) 상에 2008년 업로드되었고, 또 2009년 및 2010년에 공개되었다. 이 연구에서 발견된 모든 돌연변이는 이형접합성(heterolozyous)이었는데, 이는 야생형이 언제나 함께 존재하기 때문이다(상기 서열 데이터는 동일 영역에서 상이한 서열의 동시존재를 나타내었다). S 유전자의 3개의 조기성숙 정지 코돈 돌연변이는 4개의 종양(sL95*, 2개 종양 중의 sW182*, 및 sL216*)의 암적 부분에서 확인되었고, 오직 1개의 돌연변이(sW182*)는 쌍을 이룬 양성 조직에서 발견되었다.
25개의 성별 및 연령-매칭된 HBcAg-음성 HCC의 전체 HBV 게놈의 부가적 서열결정화도 실시하였다. 암적 부분(cancerous parts)에서는 총 12개의 돌연변이가 존재하였고, 또 쌍을 이룬 비암적 부분에서는 오직 3개의 돌연변이(p= 0.004)가 존재하였다. sW182*를 반복해서 확인하고, 50개 종양 중 6개에서 발견되었다.
HCC에서 sW182*의 빈도를 이해하기 위하여, HBV-관련 HBcAg-음성 HCC에서 HBV S 유전자의 서열분석을 더 실시하였다. 부가적으로 55개의 HCC 종양 조직 및 쌍을 이룬 양성 간 조직을 조사하였지만, 오직 33개의 HCC 종양 조직 및 46개의 양성 간 조직이 서열결정화에 성공적이었다. 부가적으로 6개의 HBV S 조기성숙 정지 코돈 돌연변이가 종양에서 발견되었고, 이는 sW182*를 갖는 3개 종양을 포함하지만, 양성 간 조직에서는 발견되지 않았다. sW182* 돌연변이를 갖는 9개 종양 중, 이들의 5개가 다른 S 절단 돌연변이를 가지고 있었다. 25개의 HBcAg-양성 HCC에서 발견된 3개 절단 돌연변이(sL95*, sW182* 및 sL216*)의 기능 연구를 실시하였다.
형질전환 및 종양형성 에세이
1) 세포 증식 에세이
4개의 안정한 클론: 야생형(WT), L95, W182 및 L216의 증식 에세이는 3개의 S 절단 돌연변이체 모두가 Wt 및 모의시험용과 비교하여 세포 성장을 향상시킬 수 있음을 나타내었다(도 5a).
2) 세포 고정 독립능
연질 한천 중에 있는 4개의 안정한 세포 클론: 모의시험용, WT, L95, L216, 및 W182의 콜로니는 0.1% p-아이오도니트로 테트라졸륨 바이올렛(INT) 염색에 의해 가시화하였다. 소프트 이미지제이 (Soft ImageJ)(NIH)에 의해 산출한 평균 콜로니 개수를 나타낸다(도 5b). Wt 및 3개의 돌연변이체는 모두 모의시험용에 비하여 현저하게 높은 콜로니 개수를 가졌다. 3개의 돌연변이체 중, W182는 최고의 콜로니 개수를 가졌다(도 5c).
3) 이종이식 연구
4주된 웅성 무흉선 BALB/c 누드 마우스를 이용하여 1x106 pIRES-프리S/S-wt 및 모의시험용, WT-1, WT-2, 및 3개의 HBV S 절단 돌연변이체: L95, L216, W182-1, 및 W182-2를 포함하는 pIRES-프리S/S-mut 안정한 클론 세포를 동시에 피하주사하는 것에 의해 이종이식 연구를 실시하였다. 종양 성장을 모니터링하고 또 13주에 걸쳐 매주 측정하였다. Wt 및 3개의 모든 돌연변이체는 일부 또는 모든 마우스에서 종양 성장을 가졌다. W182-1(100%) 및 W182-2 클론(100%) 만이 모의시험용과 비교하여 현저하게 더 높은 종양 성장율을 가졌고, 또 W182 클론의 종양 크기는 Wt 및 나머지 2개의 돌연변이체와 비교하여 가장 컸다(도 6a 및 6b). HBS 유전자의 RNA 발현은 모의시험용 및 이종이식 연구의 종양을 제외하고는 안정한 클론에서 모두 양성이었다(도 7a 및 7b). 누드 마우스 이종이식 연구로부터 종양 조직의 면역조직화학적(IHC) 염색은 모두 HBS 단백질 발현을 가졌다(도 7c). 종양 중에서, HBS 단백질의 발현은 IHC 염색에 의한 L216 돌연변이체에서 가장 낮았고, 이는 종양 크기와 일부 관련이 있는데, L216은 가장 작은 종양을 가졌기 때문이다(도 6a).
시험관내 번역에 의한 HBV S 유전자의 넌센스 돌연변이(C-말단 절단 돌연변이체) 검출
본 발명자들은 HCC와 상당히 관련이 있는 일련의 HBV 표면(S) 유전자 넌센스 돌연변이를 확인하였고, 또 이들 돌연변이는 동물 연구에 의해 발암성인 것으로 확인되었다. 상기 결과는 HBV S 유전자 넌센스 돌연변이가 HCC에 대한 예측 인자일 수 있음을 나타낸다. 다수의 HBV S 유전자 넌센스 돌연변이가 존재하고, 또 이들이 한 종양에 공동존재할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 돌연변이를 하나씩 직접 서열결정화하는 대신 시험관내 번역에 의해 HBV S 유전자 넌센스 돌연변이를 검출하기 위해 특이적 프라이머 세트를 사용하는 수법을 개발하였다. 전체적으로, 본 발명자들은 시험관내 번역에 의한 HBV S 유전자의 넌센스 돌연변이(C-말단 절단 돌연변이체)를 검출하기 위한 9 세트의 프라이머쌍을 고안하였다. HBV S 유전자 넌센스 돌연변이 검출용의 이들 프라이머쌍은 표 1에 나타낸다. 본 발명에 따르면, 절단된 돌연변이체의 존재를 시험하기 위하여, 2세트의 프라이머쌍이 필요하며, 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된다(예컨대, 표 1 중, 제1 세트 프라이머쌍은 1F 및 1R로 이루어지고, 제2 세트 프라이머쌍은 2F 및 2R로 이루어진다).
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
TRANSCENDTM 화학발광 검출 시스템에 의한 3개의 상이한 HBV C-말단 절단 돌연변이체(안정한 클론 세포주로부터 유도된 DNA)의 성공적인 검출은 도 8에 도시한다. 신호는 강하였고 또 3개 돌연변이체 모두의 단백질 크기는 모두 정확하였다.
상기 시험은 4명의 HBV 환자로부터 얻은 HCC 조직 샘플(500 ng) 상에서도 실시하였다(도 9). 상이한 절단 돌연변이가 성공적으로 확인되었다. 세기는 간 조직에서 돌연변이체의 양과 관련이 있었다.
요컨대, 본 발명자들은 IHC 염색에 의해 종양 조직 중의 HBcAg의 양성 염색에 의해 HCC의 작은 퍼센트를 확인하였다. 이들 결과는 통상 HBV의 활발한 복제를 제시하므로, 본 발명자들은 서던 블럿 분석을 실시하여 암적 조직에서 자유로이 복제가능한 HBV의 존재를 확인하였고, 이는 이전에서 거의 알려지지 않았던 것이다. 암적 조직에서 자유로이 복제가능한 HBV의 존재 및 이들 HBcAg-양성 종양의 보다 작은 크기로 인하여, 이들 조직이 간암형성의 초기 단계에 기여하는 HBV 돌연변이체를 지니고 있을 것이라고 믿어졌다. 3개의 S 유전자 C-말단 절단 돌연변이체(L95, L216 및 W182)의 발암 활성은 이종이식 연구 및 체내(in vivo) 이동 에세이에 의해 밝혀졌다. 이들 중에서, W182는 가장 강력한 발암 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 형질전환 활성을 갖는 다른 4개의 상이한 HBV S 절단 돌연변이체도 또한 발견되었다. 상기 결과는 S 유전자 절단 돌연변이의 대부분이 형질전환 활성을 가지고 있음을 제시한다. 임상 분석에 의하면 sW182*-양성 환자는 작은 종양 크기(≤2 cm)와 상당히 관련이 있고 또 병리 단계에서 더욱 흔히 발견됨이 밝혀졌고, 이는 발암성 바이러스 돌연변이체가 초기 발암형성과 관련될 수 있다는 가정과 일치한다. 따라서, 만성 B형 간염 환자에서 특정 HBV S 유전자 절단 돌연변이체의 스크리닝은 HCC의 예측 또는 조기 진단에 도움을 줄 것이다. HBV 유전자의 직접적 서열결정화는 돌연변이의 복잡성 및 다수의 돌연변이의 공존으로 인하여 어렵기 때문에, 본 발명은 1개 시험으로 HBV S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이 모두를 검출하는데 유용하다.
본 발명의 예시적 실시양태의 상술한 기재는 예시와 설명을 위해 제공된 것이고 본 발명을 명세서에 개시된 특정 형태에 제한하려는 의도가 아니다. 상기 가르츰의 범위에서 많은 변형과 변이가 가능하다.
상기 실시양태 및 실시예는 본 발명의 원리를 설명하고 또 당업자의 통상의 지식을 가진 사람이 본 발명을 이용하여 실질적으로 적용할 수 있도록 선택하여 기재한 것이고 또 다양한 실시양태 및 다양한 변형이 특정 용도에 맞게 구성될 수 있다.본 발명이 속하는 분야의 당업자들은 본 발명의 정신과 범위로 벗어나지 않고도 대안적 실시양태를 익히 잘 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명과 예시적 실시양태에 의해서가 아니라 첨부된 특허청구 범위에 의해서 규정된다.
특허, 특허출원 및 다양한 문헌을 비롯한 몇몇 참고문헌을 인용되고 본 명세서의 상세한 설명에 논의되어있다. 이러한 참고문헌의 인용 및/또는 논의는 본 발명의 설명을 명확하게 하기 위한 것이고 이러한 참고문헌이 본원 발명에 대한 종래 기술임을 인정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참고문헌은 참조에 의해 본 명세서에 포함되며 각 참고문헌은 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것과 동일한 정도로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> National Health Research Institutes <120> METHODS FOR DETECTING HEPATITIS B VIRUS SURFACE GENE NON-SENSE MUTATIONS <130> 10008-00021 <150> 61/684,766 <151> 2012-08-19 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 681 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 atggagaaca tcgcatcagg actcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60 ttgttgacaa aaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120 tttctagggg gaacacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtcccaaat ctccagtcac 180 tcaccaacct gttgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240 atcatcttcc tctgcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat 300 caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caacaaccag caccggacca 360 tgcaaaacct gcacaactcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcatg ttgctgtaca 420 aaacctacgg acggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcttgggc tttcgcaaaa 480 tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt 540 cagtggttcg tagggctttc ccccactgtc tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600 tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttatgc cgctgttacc aattttcttt 660 tgtctttggg tatacatttg a 681 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 promoter <400> 3 taatacgact cactatagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp6 promoter <400> 4 tatttaggtg acactatag 19 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak consensus sequence with a short spacer <400> 5 gagccaccat g 11 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak consensus sequence with a long spacer <400> 6 aacagccacc atg 13 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG <400> 7 gactataaag acgacgacga caaa 24 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1-1F primer <400> 8 atggactata aagacgacga cgacaaaacc tgcacgactc ctgctcaa 48 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer 1-1R <400> 9 ttaaatgtat acccaaagac aaaag 25 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 1-2F <400> 10 ggatcctaat acgactcact atagggagcc accatggact ataaagacga cgac 54 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 2-1F <400> 11 ccatggacta taaagacgac gacgacaaaa cctgcacgac tcctgctcaa 50 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 2-2F <400> 12 ggatcctaat acgactcact ataggaacag ccaccatgga ctataaagac gacg 54 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 4-1F <400> 13 ccatggacta taaagacgac gacgacaaac agagtctaga ctcgtggtgg 50 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 6-1F <400> 14 ggactataaa gacgacgacg acaaacagag tctagactcg tggtgg 46 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 7-2F <400> 15 ggatcctatt taggtgacac tatagaacag accaccatgg actataaaga cgacg 55 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 9-1F <400> 16 ggactataaa gacgacgacg acaaaacctg cacgactcct gctcaa 46 <210> 17 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer 9-2F <400> 17 gatcctattt aggtgacact ataggagcca ccatggacta taaagacgac gac 53

Claims (18)

  1. 단리된 핵산 샘플에서 소형 S 단백질을 암호화하는 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재를 시험관내 검출하기 위한 방법으로서,
    a) 제1 세트 프라이머쌍 및 제2 세트 프라이머쌍을 제공하는 단계, 이때 상기 제1 세트 프라이머쌍은 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 제2 세트 프라이머쌍은 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
    (i) 상기 제1 정방향 프라이머는 S 유전자의 5'-말단에 어닐링하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 의해 라벨링되며, 상기 역방향 프라이머는 상기 S 유전자의 3'-말단 서열에 어닐링하는 특징을 갖고, 상기 제1 세트 프라이머쌍은 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR) 산물을 생성하는 특징을 갖고, 제1 PCR 산물은 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열을 포함함;
    (ii) 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→ 3' 방향으로, T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열 및 제1 PCR 산물의 5'-말단에 위치한 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함하고, 상기 제2 세트 프라이머쌍은 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, 및 FLAG 태그 서열을 포함하는 제2 PCR 산물을 생성하는 특징을 갖고, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함;
    b) 상기 단리된 핵산 샘플 및 제1 세트 프라이머쌍을 포함하는 제1 반응 혼합물에서 제1 PCR을 실시하여 제1 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 단리된 핵산 샘플은 HBV 보균자 또는 HBV 보균자로 의심되는 사람으로부터 얻음;
    c) 상기 제1 PCR 산물 및 제2 세트 프라이머쌍을 포함하는 제2 반응 혼합물에서 제2 PCR을 실시하여 제2 PCR 산물을 생성하는 단계;
    d) 상기 제2 PCR 산물을 단백질로 번역하는 단계;
    e) 단백질의 크기를 대조용 또는 야생형 소형 S 단백질의 크기와 비교하는 단계; 및
    f) 대조용 또는 야생형 소형 S 단백질과 비교하여 단백질의 크기에서 감소가 있을 때, 핵산 샘플 내에 B형 간염 바이러스 S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이가 존재한다고 결정하는 단계를 포함하는,
    B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재를 시험관내 검출하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, HBV S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이가 sL15*, sL21*, sS61*, sC69*, sL95*, sW156*, sW163*, sW172*, sW182*, sW196*, 및 sL216*으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 핵산 샘플은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 또는 간암이 의심되는 환자 또는 비정상적 간 기능을 갖거나 또는 간경화증이 있는 환자로부터 얻는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 샘플은 신선한 냉동 간 조직 또는 포르말린-고정된 파라핀 조직 부분, 또는 혈액 샘플로부터 추출되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호:2의 적어도 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐 있게 하고 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 의해 라벨링되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호: 2의 아미노산 위치 30 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐있게하거나, 또는 서열번호: 2의 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐 있게 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 코자크 콘센서스 서열이 서열번호: 5 또는 서열번호: 6인 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    a) 상기 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 및
    c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 제1 정방향 프라이머 및 상기 제2 정방향 프라이머는 다음으로 이루어진 군으로부터 각각 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법:
    (a) 서열번호: 8 및 10;
    (b) 서열번호: 11 및 12;
    (c) 서열번호: 8 및 12;
    (d) 서열번호: 13 및 12;
    (e) 서열번호: 13 및 10;
    (f) 서열번호: 14 및 12;
    (g) 서열번호: 14 및 15;
    (h) 서열번호: 14 및 10; 및
    (i) 서열번호: 16 및 17.
  10. 제8항에 있어서, 상기 제1 정방향 프라이머의 서열은 서열번호: 14이고, 상기 제2 정방향 프라이머의 서열은 서열번호: 15인 방법.
  11. 핵산 샘플에서 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 적어도 하나의 C-말단 절단 돌연변이의 시험관내 검출 방법으로서,
    a) 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하는 단계, 이때 상기 제1 정방향 프라이머는 S 유전자의 5'-말단에 어닐링하기 위한 서열을 포함하고, 그의 5'-말단에 FLAG 태그 서열을 가지며, 상기 역방향 프라이머는 S 유전자의 3'-말단에 어닐링하기 위한 뉴클레오타이드 서열을 포함함;
    b) 상기 핵산 샘플, 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는 제1 반응 혼합물에서 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하여 제1 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 제1 PCR 산물은 그의 5'말단에 FLAG 태그 서열을 포함하며,상기 핵산 샘플은 HBV 보균자이거나 또는 HBV 보균자로 의심되는 사람으로부터 얻음;
    c) 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 제공하는 단계, 이때 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→3' 방향으로 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 스페이서를 갖는 코자크 서열 및 상기 제1 PCR 산물의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함함;
    d) 상기 제1 PCR 산물, 제2 정방향 프라이머, 및 역방향 프라이머를 포함하는 제2 반응 혼합물에서 제2 PCR을 실시하여 제2 PCR 산물을 생성하는 단계, 이때 상기 제2 PCR 산물은 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, FLAG 태그 서열을 포함하며, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함;
    e) 상기 제2 PCR 산물을 단백질로 번역하는 단계;
    f) 상기 제2 PCR 산물의 크기를 야생형 소형 S 단백질의 크기와 비교하는 단계; 및
    (g) 단백질의 크기가 야생형 소형 S 단백질의 크기보다 작을 때, 핵산 샘플 내에 B형 간염 바이러스 S 유전자의 C-말단 절단 돌연변이가 존재한다고 결정하는 단계를 포함하는,
    B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 적어도 하나의 C-말단 절단 돌연변이의 시험관내 검출 방법.
  12. (a) 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR) 산물을 생성하기 위한 제1 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 핵산 샘플 중의 HBV S 유전자에 어닐링하는 특징을 갖는 제1 세트 프라이머쌍, 이때 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호: 2의 적어도 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐있게 하고, 그의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 의해 라벨링됨; 및
    (b) 제2 PCR 산물을 생성하기 위한 제2 PCR에서 제1 PCR 산물에 어닐링하는 특징을 갖는 제2 세트 프라이머쌍, 이때 상기 제2 PCR 산물은 제1 PCR 산물의 서열에 걸쳐있고, 그의 5'-말단에 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열, 및 FLAG 태그 서열을 포함하며, 상기 코자크 서열은 T7 또는 Sp6 프로모터 서열과 FLAG 태그 서열 사이에 위치함; 를 포함하는,
    핵산 샘플에서 B형 간염 바이러스(HBV) 표면(S) 유전자의 C-말단 절단 돌연변이의 존재 검출에 사용하기 위한 시험관내 진단 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 PCR 산물은 소형 S 단백질을 암호화하는 HBV S 유전자의 서열을 서열번호:2의 아미노산 위치 30 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐 있게 하거나, 또는 서열번호: 2의 아미노산 위치 123 내지 아미노산 위치 227에 걸쳐있게 하는, 시험관내 진단 키트.
  14. 제12항에 있어서, 시험관내 진단 키트 중의 제1 세트 프라이머쌍은 제1 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 제2 세트 프라이머쌍은 제2 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며,
    (i) 상기 제1 정방향 프라이머는 그의 5'-말단에 FLAG 태그 서열을 포함하고; 및
    (ii) 상기 제2 정방향 프라이머는 5'→3' 방향으로 T7 또는 Sp6 프로모터 서열, 코자크 서열 및 상기 제1 PCR 산물의 5'-말단에서 FLAG 태그 서열에 어닐링하는 특징을 갖는 3'-말단 서열을 포함하는, 시험관내 진단 키트.
  15. 제13항에 있어서,
    a) 상기 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14, 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 및
    c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는,
    시험관내 진단 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    a) 상기 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고;
    b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며; 및
    c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는, 시험관내 진단 키트.
  17. 제1항에 있어서,
    a) 상기 제1 세트 프라이머쌍의 제1 정방향 프라이머는 서열번호: 8, 11, 13, 14 및 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고;
    b) 상기 제2 세트 프라이머쌍의 제2 정방향 프라이머는 서열번호: 10, 12, 15 및 17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며; 및
    c) 상기 역방향 프라이머는 서열번호: 9의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 비교 단계는 웨스턴 블럿 또는 화학발광 검출 시스템에 의해 실시되는 방법.
KR1020157004996A 2012-08-19 2013-06-06 B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법 KR101918342B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261684766P 2012-08-19 2012-08-19
US61/684,766 2012-08-19
PCT/US2013/044619 WO2014031211A2 (en) 2012-08-19 2013-06-06 Methods for detecting hepatitis b virus surface gene non-sense mutations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150041637A true KR20150041637A (ko) 2015-04-16
KR101918342B1 KR101918342B1 (ko) 2019-01-29

Family

ID=50100291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157004996A KR101918342B1 (ko) 2012-08-19 2013-06-06 B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9163290B2 (ko)
EP (1) EP2885433A4 (ko)
KR (1) KR101918342B1 (ko)
CN (2) CN104937114A (ko)
TW (1) TWI565802B (ko)
WO (1) WO2014031211A2 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201051B (zh) * 2021-04-27 2022-08-02 复旦大学 一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用
CN116732243A (zh) * 2023-04-04 2023-09-12 赛立安生物技术(广州)有限公司 一种用于检测hbv前s/s区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014071A1 (en) * 1999-08-25 2004-01-22 Ambergen, Inc. Methods for the detection, analysis and isolation of nascent proteins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6969583B2 (en) * 2000-02-03 2005-11-29 Melbourne Health Method for detecting variant HBV
CA2351018A1 (en) * 2001-07-09 2003-01-09 Universite De Sherbrooke Dna vaccine against staphylococcus aureus
WO2004031729A2 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Georgetown University Diagnostic for long term response of hbv carrier to 3tc therapy
CA2557761A1 (en) 2004-03-05 2005-09-15 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of detecting carcinogenesis caused by hepatitis b virus
US8211443B2 (en) * 2005-04-08 2012-07-03 Melbourne Health Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof
US20080044438A1 (en) * 2006-03-17 2008-02-21 Ostroff Gary R Yeast Cell Particles As Oral Delivery Vehicles For Antigens
WO2009037266A2 (en) * 2007-09-17 2009-03-26 Universite Louis Pasteur Method for detecting or quantifying a truncating mutation
WO2009042956A1 (en) * 2007-09-26 2009-04-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Control of spore germination
US20090264298A1 (en) * 2007-11-06 2009-10-22 Ambergen, Inc. Methods for enriching subpopulations
US20090280474A1 (en) * 2008-05-08 2009-11-12 Abbott Laboratories Method for detecting a virus
JP2012090571A (ja) * 2010-10-27 2012-05-17 Sekisui Chem Co Ltd 動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、並びに、ハイブリドーマの製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014071A1 (en) * 1999-08-25 2004-01-22 Ambergen, Inc. Methods for the detection, analysis and isolation of nascent proteins

Also Published As

Publication number Publication date
US20140051065A1 (en) 2014-02-20
EP2885433A2 (en) 2015-06-24
EP2885433A4 (en) 2016-04-06
TWI565802B (zh) 2017-01-11
CN104937114A (zh) 2015-09-23
CN111850163B (zh) 2024-08-06
TW201416455A (zh) 2014-05-01
US9163290B2 (en) 2015-10-20
KR101918342B1 (ko) 2019-01-29
WO2014031211A3 (en) 2014-10-16
CN111850163A (zh) 2020-10-30
WO2014031211A2 (en) 2014-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2740742A1 (en) Fusion gene of kif5b gene and ret gene, and method for determining effectiveness of cancer treatment targeting fusion gene
JP2015109806A (ja) 新規ｒｅｔ融合体の検出法
KR102138131B1 (ko) 뇌 종양 동물 모델 및 이의 제조 방법
JP2020536560A (ja) Ｐｎｐｌａ３ ｉ１４８ｍの変異を発現している患者の肝疾患の治療におけるｈｓｄ１７ｂ１３の阻害
JP2008043337A (ja) 乳癌の処置および診断のための組成物および方法
WO2015093557A1 (ja) 胃がんの責任因子としての新規融合遺伝子
WO2017073619A1 (ja) 悪性リンパ腫又は白血病の罹患の有無の判別方法並びに白血病の治療及び／又は予防のための薬剤
KR101918342B1 (ko) B형 간염 바이러스 표면 유전자 넌센스 돌연변이의 검출 방법
CN106636444B (zh) Fam78a基因的用途
CN111154883B (zh) 一种乳腺癌相关基因PIK3CA位点g.179220986A＞T突变体及其应用
EP1726646A1 (en) Method of detecting carcinogenesis caused by hepatitis b virus
EP1905780B1 (en) Cancer suppressing agent
JP2014054185A (ja) 新規ｂｒａｆ融合体の検出法
WO2013151505A1 (en) Method of making a prognosis for lung cancer
CN102758011A (zh) 用于检测ERCC1mRNA的核酸检测试剂盒
CN110714081B (zh) 定量检测oc-stamp基因表达水平的成套试剂及其应用
CN106702003B (zh) Hsdl1在诊治骨肉瘤中的应用
CN112941187A (zh) 一种乳腺癌相关基因pik3ca-q928h突变体及其特异性引物
WO2015129655A1 (ja) Ｄｎａｊｂ１－ｐｒｋａｃａ遺伝子の検出方法
CA2496048A1 (en) Use of murine genomic regions identified to be involved in tumor development for the development of anti-cancer drugs and diagnosis of cancer
CN105886626A (zh) Bpifb1在制备舌鳞癌诊治制剂中的新用途
EP1723424A2 (en) Gene expression and polymorphisms that influence lung cancer susceptibility
JP2006254830A (ja) Ｓｅｐｔ１１遺伝子発現抑制物質
JP2013226074A (ja) 新規ｄｄｒ２融合体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant