KR20150024607A - 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀 또는 리모시트린 3-루티노시드를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물 - Google Patents

오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀 또는 리모시트린 3-루티노시드를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 아드리아마이신에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다. 이렇게 섬유아세포 또는 제대정맥혈관내피세포의 세포노화 과정을 억제함으로써 노화관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암 등과 같은 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 세포노화를 저해할 수 있는 항노화 기능성 식품, 항혈관노화 약물 개발, 화장품 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀 또는 리모시트린 3-루티노시드를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물{Composition for inhibiting cellular senescence comprising extracts of Evodia officinalis or rutaecarpine or limocitrin 3-O-rutinoside isolated from the same}
본 발명은 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물에 관한 것이다.
정상 체세포는 일정 횟수 분열하면 더 이상 분열할 수 없게 되면서 세포노화 상태가 된다. 이는 염색체 말단의 텔로미어가 세포분열 과정에서 점점 짧아지면서 DNA 손상이 생기기 때문에 일어나는데, 이를 복제노화라고 한다. 텔로미어의 단축뿐만 아니라, 암유전자 및 암 억제 유전자의 기능 이상, 염증반응, 산화스트레스, 항암제, 자외선 및 방사선 등에 의해서도 세포노화가 유도된다. 노화 세포는 크기가 크고 모양이 더 편평해지며, 세포성장이 멈추고, 핵에 DNA 손상 흔적이 많으며, 다양한 염증성 단백질을 분비한다. 그리고 생화학적으로 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 다양한 인자들에 의해 노화가 유도되지만 p53과 Rb/p16 암억제 유전자 신호전달 경로를 통하여 노화가 조절되는 것으로 밝혀져 있다.
세포노화 현상은 암을 억제하거나 촉진하기도 하며, 조직 재생과 복구, 조직/개체 노화와 노화관련 질환의 중요한 기전으로 제시되고 있다. 아울러 세포노화는 암, 동맥경화, 피부노화, 퇴행성 신경질환, 근감소증, 골다골증, 전립선비대증 등과 같은 다양한 노화관련 질환의 병인에 기여한다. 최근의 연구결과들은 세포노화를 선택적으로 조절하면 조직, 장기의 노화, 건강 수명, 노화관련 질환의 발생을 조절할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 텔로머라제 결핍 생쥐는 노화가 빨리 오는 것으로 알려져 있는데, 늙은 텔로미어 결핍 생쥐에서 텔로머라제 발현을 증가시키면 노화에 따른 조직 또는 장기의 퇴행성 변화를 역전시킴을 확인하였다. 노화가 빨리 오는 생쥐 모델에 있어서 노화세포에서 발현이 증가하는 것으로 알려진 p16을 발현하는 세포를 선택적으로 제거한 결과 노화로 인한 조직 병변이 억제되며, 노화관련 질환의 발생이 감소하는 것을 확인하였다. 생쥐에서 간 섬유화가 일어나는 과정에서 간 성상세포의 노화가 나타나는데, 간성상세포의 노화가 과다한 간 섬유화를 억제하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. p53 활성이 적절하게 조절되지 않은 상태에서 지나치게 높아지면 노화가 빨리 나타나지만, 적절한 p53의 활성은 오히려 노화를 억제하는 것으로 알려져 있다.
그리고 세포노화를 억제하는 효능이 있는 물질들에 대한 연구 결과도 보고되고 있다. 비타민 C, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), NS398 및 에피프리에데라놀(epifriedelanol)과 같은 약물 또는 단일 성분들이 이 세포노화를 억제한다. 그리고 라파마이신(rapamycin)이 생쥐모델에서, 4,4'-디아미노디페닐설폰(4,4'-diaminodiphenylsulfone)이 꼬마선충에서 노화관련 질환의 발생을 억제하며, 건강수명을 늘리는 것으로 보고되었다.
오수유는 중국 원산으로 경주지방에서 심고 있으며, 높이가 5m에 달하고 어린 가지에 털이 있다. 한방에서는 열매를 약재로 이용한다. 성분은 휘발성 정유를 함유하고 있는데, 주성분은 에보덴(evoden), 오시멘(ocimene), 에보딘(evodin)이며, 알칼로이드 성분으로 에보디아민(evodiamine), 루타에카르핀(rutaecarpine)이 들어 있다. 건위, 구충, 해독 및 이뇨제로 사용한다고 알려져 있으며, 항암활성, 항염증작용, 심혈관계질환관련 효능, 간경화 억제 효능 등이 보고되었다.
한편, 한국등록특허 제10-11812164호에서는 오수유(Evodia fructus)로부터 유래된 퀴놀론 알칼로이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 감기증상의 개선 또는 감기의 예방 또는 치료 효과에 대해 개시하고 있으나, 본원 발명과 같이 제대정맥혈관내피세포나 섬유아세포 노화를 저해한다는 언급은 없다.
본 발명의 목적은 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 오수유 추출물과 오수유에서 분리한 8가지 단일성분들을 사람 혈관내피세포와 섬유아세포에서 세포노화 저해 효능이 있는지 조사하였다. 결과적으로 사람 혈관내피세포에서는 오수유 에틸아세테이트 추출물이, 사람 섬유아세포에서는 오수유 메탄올 추출물과 EO-1 (rutaecarpine), EO-8 (limocitrin 3-O-rutinoside)이 세포노화 저해 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 화학식 2로 표시되는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 약학 조성물을 제공한다. 상세하게는, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 한다.
< 화학식 1 >
Figure pat00001
< 화학식 2 >
Figure pat00002
R1 = OH 이고, R2 = OCH3 임.
상세하게는, 상기 오수유 추출물은 오수유 메탄올 추출액에 증류수, 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올을 첨가하고 분획화하여 추출된 에틸아세테이트(EtOAc) 분획 추출물이고, 보다 상세하게는 상기 세포는 제대정맥혈관내피세포인 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 세포 노화는 아드리아마이신에 의해 유도되는 것을 특징으로 하고, 세포 노화 억제는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 억제를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학적 조성물인 경우, 상기 약학적 조성물은 상기 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside) 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 세포 노화의 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.
한편, 상기 약학적 조성물은 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)가 아드리아마이신에 의한 세포 노화를 억제하고, 아울러 세포 분열로 인한 복제노화를 저해함을 확인하였다. 이렇게 세포노화 과정을 억제함으로써 노화관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암 등과 같은 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 혈관내피세포 및 섬유아세포의 세포노화를 저해할 수 있는 항노화 기능성 식품, 항혈관노화 약물 개발, 화장품 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 오수유 추출물의 분리 모식도를 나타낸다.
도 2는 오수유로부터 분리된 단일성분의 화학구조를 나타낸다.
도 3은 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 추출물의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 추출물의 세포독성 효과. 각 추출물을 10, 100ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 오수유 추출물을 10, 100ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 4는 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 에틸아세테이트 추출물의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 에틸아세테이트 추출물의 세포독성 효과를 나타낸다. 각 추출물을 1-10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B 및 C, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 오수유 에틸아세테이트 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후, 평균과 표준편차로 나타냈다. D, p53, 인산화 S6K, p21의 발현을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 웨스턴 블랏법으로 각 단백질의 발현 정도를 조사하였다. NT, 미처리; Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 5는 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 에틸아세테이트 추출물의 복제 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 복제노화 세포에 대한 오수유 에틸아세테이트 추출물의 세포독성 효과를 나타낸다. 각 추출물을 1-10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B 및 C, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 복제노화 세포에 오수유 에틸아세테이트 추출물을 1-10ug/ml 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Old, 늙은 세포(Old cells); DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 vs DMSO.
도 6은 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 단일 성분의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 단일 성분의 세포독성 효과. 각 성분을 10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-4를 10ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine).
도 7은 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 단일 성분의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 단일 성분의 세포독성 효과. 각 성분을 10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-3과 EO-7을 1ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 8은 사람 제대정맥혈관내피세포에서 오수유 단일 성분 EO-1의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, EO-1의 세포독성 효과. EO-1을 0.1ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-1을 0.1ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine).
도 9는 사람 섬유아세포에서 오수유 추출물의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 추출물의 세포독성 효과. 각 추출물을 10, 100ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 오수유 추출물을 10, 100ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 10은 사람 섬유아세포에서 오수유 메탄올 추출물의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 메탄올 추출물의 세포독성 효과를 나타낸다. 각 추출물을 1-10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B 및 C, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, 오수유 메탄올 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후, 평균과 표준편차로 나타냈다. D, p53, 인산화 S6K, p21의 발현을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, 추출물을 1-10 ug/ml로 처리하고, 웨스턴 블랏법으로 각 단백질의 발현 정도를 조사하였다. NT, 미처리; Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 11은 사람 섬유아세포에서 오수유 메탄올 추출물의 복제 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 복제노화 세포에 대한 오수유 메탄올 추출물의 세포독성 효과를 나타낸다. 각 추출물을 1-10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B 및 C, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 복제노화 세포에 오수유 메탄올 추출물을 1-10ug/ml 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Old, 늙은 세포(Old cells); DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 12는 사람 섬유아세포에서 오수유 단일 성분의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, 오수유 단일 성분의 세포독성 효과. 각 성분을 10ug/ml 처리 후, 3일 동안 배양하여 MTT법으로 세포독성 효과를 조사하였다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-4 및 EO-8을 10ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 13은 사람 섬유아세포에서 오수유 단일 성분 EO-8 [리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)]의 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A 및 B, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-8을 1-10ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. C, p53, 인산화 S6K, p21의 발현을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, EO-8을 1-10 ug/ml로 처리하고, 웨스턴 블랏법으로 각 단백질의 발현 정도를 조사하였다. NT, 미처리; Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 14는 사람 섬유아세포에서 활성산소 생성에 미치는 EO-8 [리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)]의 효과를 나타낸다. A, 활성산소 유세포분석. B, 평균 활성산소량 비교. 섬유아세포에 아드리아마이신을 처리하고, EO-8을 10 ug/ml 처리하여, 세포내 활성산소 정도를 유세포분석기로 조사하였다. 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행 한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. ADR, 아드리아마이신(adriamycin); Y, 젊은 세포(young cells); Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or ** p<0.01 vs DMSO.
도 15는 사람 섬유아세포에서 EO-8 [리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)]의 복제세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색 사진을 나타낸다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율을 나타낸다. C, EO-8의 세포독성 효과를 나타낸다. 복제노화 세포에 EO-8을 1-10 ug/ml 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 세포독성은 MTT법으로 조사하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. Old, 늙은 세포(Old cells); DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 16은 사람 섬유아세포에서 오수유 단일 성분 EO-1 [루타에카르핀(rutaecarpine)]의 세포독성 및 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효과를 나타낸다. A 및 B, EO-1의 세포독성 효과. C 및 D, SA-β-gal 활성 염색 사진 및 SA-β-gal 활성 염색 백분율. 아드리아마이신 처리 후, EO-1을 0.1ug/ml로 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. E, p53, 인산화 S6K, p21의 발현을 나타낸다. 아드리아마이신 처리 후, EO-1을 0.1 ug/ml로 처리하고, 웨스턴 블랏법으로 각 단백질의 발현 정도를 조사하였다. NT, 미처리; Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or **p<0.01 vs DMSO.
도 17은 사람 섬유아세포에서 활성산소 생성에 미치는 EO-1 [루타에카르핀(rutaecarpine)]의 효과를 나타낸다. A, 활성산소 유세포분석. B, 평균 활성산소량 비교. 섬유아세포에 아드리아마이신을 처리하고, EO-1을 0.1 ug/ml 처리하여, 세포내 활성산소 정도를 유세포분석기로 조사하였다. 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. ADR, 아드리아마이신(adriamycin); Y, 젊은 세포(young cells); Cont, 대조군; DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin). *p<0.05 or ** p<0.01 vs DMSO.
도 18은 사람 섬유아세포에서 EO-1 [루타에카르핀(rutaecarpine)]의 복제세포노화 저해 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색 사진을 나타낸다. B, SA-β-gal 활성 염색 백분율을 나타낸다. C, EO-1의 세포독성 효과를 나타낸다. 복제노화 세포에 EO-1을 0.1 ug/ml 처리하고, 3일 후 SA-β-gal 활성 염색을 시행하였다. 세포독성은 MTT법으로 조사하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 평균과 표준편차로 나타냈다. DMSO, 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide); NAC, N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine); Rap, 라파마이신(rapamycin).
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 오수유 추출물 분리 및 단일성분의 화학구조
1. 오수유 추출물 및 단일성분 분리
오수유 9.0 kg을 MeOH (12ℓ)로 약 60 ℃에서 12 시간 환류 냉각하여 추출하고 감압 농축하여 MeOH 추출물 1.23 kg을 얻었다. 이 MeOH 추출물에 H2O 1.5 L을 가하고 진탕하여 현탁액으로 한 후, 동량의 n-헥산(n-Hexane), EtOAC, n-BuOH를 가하여 용매분획을 하여 n-헥산(n-Hexane) 분획 73.0 g, EtOAC 분획 308.68 g, n-BuOH 분획 198.89 g, 물층 630.62 g을 얻었다.
70 × 6 cm 사이즈의 Silica-gel (230-400mesh) column을 만든 후, EtOAC 분획 26.4 g을 로딩하고, 이동상 용매로 기울기 용리 [n-Hexane: EtOAC]하여 TLC로 확인하였으며 22개의 서브 분획(sub fraction) (EOE1~22)을 얻었다. fraction EOE-9 (1.2 g), fraction EOE-10 (110.0 mg), fraction EOE-14 (35.0 mg), fraction EOE-15 (48.0 mg)을 재결정하는 방법으로 EO-1 (890 mg), EO-2 (26.0 mg), EO-3 (10.0 mg), EO-4 (31.0 mg)얻었다. fraction EOE-18 과 fraction EOE-16을 60 × 2.0 cm 사이즈의 RP-18 column 에 각각 로딩하고, 이동상 용매로 기울기 용리 [MeOH : H2O]하여 EO-5 (12.0 mg), EO-6 (12.0 mg), EO-7 (20.0 mg)을 얻었다.
80 × 10 cm 사이즈의 diaion column을 만든 후, H2O 분획 130.0 g을 로딩하고, 이동상 용매로 기울기 용리 [H2O:MeOH]하여 TLC로 확인하였으며 5개의 서브 분획(sub fraction) (EOW1~5)을 얻었다. fraction EOE-4 (2 g)을 75 × 4.0 cm 사이즈의 RP-18 column 에 로딩하고, 이동상 용매로 기울기 용리 [MeOH : H2O]하여 15개의 서브 분획(sub fraction) (EOW4-1~15)을 얻었다. fraction EOE-4-8 (200.0 mg)을 60 × 2.0 cm 사이즈의 RP-18 column 에 로딩하고, 이동상 용매로 기울기 용리 [MeOH : H2O]하여 EO-8 (10.0 mg)을 얻었다 (도 1). 분리된 8종의 단일 물질들은 MS, NMR (1H, 13C, DEPT, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC) 등 분광학적 분석방법을 이용하여 화합물의 화학구조를 결정하고 문헌과 비교하여 동정하였다.
2. 분리된 물질의 물리화학적 특성
오수유의 EtOAC 분획과 물층에서 분리한 8 종의 화합물은 기지물질로서 MS, NMR (1H, 13C, DEPT, 1H-1H COSY, HMQC, HMBC) 등 각종 분광학적 분석방법으로 분석하고 문헌과 비교하여 EO-1 [루타에카르핀(rutaecarpine)], EO-2 [에보디아민(evodiamine)], EO-3 [7-하이드록시루타에카르핀(7-hydroxyrutaecarpine)], EO-4 [우추유아미드 1(wuchuyuamide 1)], EO-5 [1-메틸-2-[(Z)-9-펜타데세닐]-4(1H)-퀴놀론)(1-Methyl-2-[(Z)-9-pentadecenyl]-4(1H)-quinolone)], EO-6 [에보카르핀(evocarpine)], EO-7 [디하이드로에보카르핀(dihydroevocarpine)], EO-8 [리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)]로 확인하였다 (도 2).
EO -1 ( Rutaecarpine ): Pale yellow amorphous solid; 1H-NMR (CDCI3, 250 MH z) 9.80 (1H, s, NH), 8.30 (1H, dd, J= 8.0,1.2 Hz, H-19), 7.77 (1H, ddd, J= 8.2, 7.0, 1.2 Hz, H-17), 7.70 (1H, brd, J= 8.0 Hz, H-9), 7.64 (1H, brd, J= 8.2 Hz, H-16), 7.42 (1H, brd, J = 8.2 Hz, H-12), 7.32 (1H, brdd, J= 8.0, 7.0 Hz, H-18), 7.27 (1H, brdd, J = 8.2, 7.0 Hz, H-11), 7.15 (1H, brdd, J = 8.0, 7.0 Hz, H-10), 4.56 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-5), 3.22 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-6); 13C-NMR (CDCI3, 62.9 MHz) 161.5 (C-5), 147.2 (C-la), 145.3 (C-14a), 138.5 (C-12a), 134.4 (C-2), 127.3 (C-4), 127.2 (C-3a), 126.9 (C-1), 126.2 (C-3), 125.6(C-9a), 125.4 (C ), 112.2 (C-12), 41.2 (C-7), 19.6 (C-8); Positive FAB-MS m/z 288 [M+H]+.
EO -2 ( Evodiamine ): Pale yellow plates; 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz) 2.48 (NCH3,s), 2.94 (2H, m), 3.25 (1H, m), 4.87 (1H, m), 7.19 (4H, m), 7.43 (2H, m), 7.58 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.10 (1H,dd, J = 1.4, 7.8 Hz), 8.32 (1H, s); 13C-NMR (CDCI3, 62.9 MHz) 164.8 (C-21), 150.7 (C-15), 136.7 (C-13), 133.0 (C-17), 129.0 (C-9), 128.2 (C-2), 126.2 (C-8), 124.0 (C-10), 123.7 (C-20), 123.0 (C-11), 122.3 (C-16), 120.0 (C-18), 118.9 (C-19), 113.6 (C-7), 111.3 (C-12), 68.8 (C-3), 39.5 (C-5), 37.2 (N-CH3), 20.1(C-6); Positive FAB-MS m/z 304 [M+H]+.
EO -3 (7- Hydroxyrutaecarpine ): Pale yellow powder (10.0 mg); 1H-NMR (pyridine-d 5 , 250 MHz) 13.3 (1H, s, 1-NH), 9.3 (1H, br, 5-OH), 8.4 (1H, dd, J = 8, 1.5 Hz, H-19), 7.7 (1H, ddd, J= 8, 7.5, 1.5 Hz, H-17), 7.6 (1H, d, J= 7.5 Hz, H-9), 7.6 (1H, d, J = 8 Hz, H-16), 7.5 (1H, dd, J = 5.5, 1.5 Hz, H-5), 7.4 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-12), 7.4 (1H, dd, J = 8, 7.5 Hz, H-18), 7.3 (1H, ddd, J = 8.5, 7, 1 Hz, H-11),7.2 (1H, ddd, J= 8, 7, 1 Hz, H-10), 3.77 (1H, dd, J= 16.8, 1.5 Hz, H-6eq), 3.4 (1H, dd, J= 16.8, 5.5 Hz, H-6ax); 13C-NMR (pyridine-d 5 , 62.9 MHz) 161.6 (C-21), 148.6 (C-15), 145.1 (C-3), 139.9 (C-13), 134.6 (C-17), 127.7 (C-19), 127.5 (C-16), 127.2 (C-18), 127.1 (C-2), 126.0 (C-11),125.2 (C-8), 122.0 (C-20), 120.4 (C-10), 120.3 (C-9), 115.5 (C-7), 112.8 (C-12), 74.6 (C-5), 28.5 (C-6); Positive FAB-MS m/z 304 [M+H] +.
EO -4 ( Wuchuyuamide 1): Amorphous powder; 1H-NMR (pyndlne-d 5 , 250 MHz) 11.66 (1H, s, 1-NH), 8.26 (1H, dd, J= 6.4, 1.6 Hz, H-19), 7.77 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-9), 7.50 (1H, m, H-17), 7.211 (1H, m, H-11), 7.15 (1H, t, J= 7.6 Hz, H-18), 7.07 (1H, d, J= 8.4 Hz, H-16), 7.02 (1H, t, J= 7.4 Hz, H-10), 6.99 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-12), 5.05 (1H, br., 7-OH), 4.84, 4.76 (each 1H, m, H-5), 3.36 (3H, s, H-22), 2.90, 2.82 (each 1H, m, H-6); 13C-NMR (pyridine-d 5 , 62.9 MHz) 180.8 (C-2), 161.6 (C-21), 150.8 (C-3), 142.9 (C-13), 140.8 (C-15), 134.7 (C-17), 133.3 (C-8), 129.4(C-11), 128.5 (C-19), 124.8 (C-9), 122.6 (C-18), 122.2(C-10), 115.9 (C-20), 114.1 (C-16), 110.2 (C-12), 75.7(C-7), 37.5 (C-5), 36.3 (C-6), 30.4 (C-22). Positive FAB-MS m/z 352 [M+H] +.
EO -5 (1- Methyl -2-[(Z)-9- pentadecenyl ]-4(1H)- quinolone ): Colorless oil; 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz) 8.5 (1 H, dd, J =1.5 Hz, 8.0 Hz, H-5), 7.7 (1H, m, H-7), 7.6 (1H, d, J= 8.0 Hz, H-8), 7.4 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-6), 6.4 (1H, s, H-3), 5.3 (2H, m, olefinic proton), 3.8 (3H, s, N-Me), 2.8 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-I'), 2.0 (4H, m, allyl proton), 1.7 (2H, m, H-2'), 1.25-1.47 (16H, m), 0.9 (3H, J = 7.0 Hz, H-15'); 13C-NMR (CDCI3, 62.9 MHz) 177.5 (C-4), 154.7 (C-2), 141.7 (C-8a). 131.9 (C-7), 129.9 (C-10), 129.5 (C-9), 126.3 (C-5), 126.2 (C-4a), 123.1 (C-6), 115.3 (C-8), 110.8 (C-3), 34.6 (C-1'), 34.0 (N-CH3), 31.8 (C-13'), 29.1 (C-7'), 28.9 (C-6'), 28.5 (C-4'), 27.0 (C-5'), 26.9 (C-11'), 26.8 (C-12'), 22.5 (C-2',3',6',8'), 22.2 (C-14'), 14.0 (C-15'). Positive FABMS m/z 367 [M+H]+.
EO -6 (Evocarpine): Colorless oil; 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz) 8.28 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-5), 7.51 (1H, m, H-7), 7.33 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8), 7.21 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-6), 6.03 (1H, s, H-3), 5.20 (2H, m, olefinic proton), 3.56 (3H, s, N-Me), 2.52 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-I'), 1.92 (4H, m, allyl proton), 1.49 (2H, m, H-2'), 1.31-1.21 (12H, m), 0.82 (3H, J = 7.0 Hz, H-15'); 13C-NMR (CDCI3, 62.9 MHz) 177.5 (C-4), 154.5 (C-2), 141.8 (C-8a), 131.7 (C-7), 129.7 (C-8'), 129.3 (C-9'), 126.1 (C-5), 126.1 (C-4a), 122.9 (C-6), 115.2 (C-8), 110.6 (C-3), 34.4 (C-1'), 33.9 (N-CH3), 31.7 (C-11'), 29.4 (C-2'), 29.1 (C-3'), 28.9 (C-4'), 28.6 (C-5'), 28.1 (C-6'), 26.9 (C-7'), 26.6 (C-10'), 22.1 (C-12'), 13.8 (C-13'); Positive FAB-MS m/z 340 [M+H] +.
EO -7 (Dihydroevocarpine): Colorless powder; 1H-NMR (CDCI3, 250 MHz) 8.38 (1H, dd, J= 1.5, 8.0 Hz, H-5), 7.60 (1H, m, H-7), 7.43 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8), 7.30 (1H, t, J = 8.0 Hz, H-6), 6.15 (1H, s, H-3), 3.67 (3H, s, N-Me), 2.63 (2H, t, J = 7.6 Hz, H-I'), 1.60 (2H, m, H-12'), 1.21-1.36 (20H, m), 0.83 (3H, J = 7.0 Hz, H-13'); 13C-NMR (CDCI3, 62.9 MHz) 177.6 (C-4), 154.7 (C-2), 141.8 (C-8a), 131.9 (C-7), 126.4 (C-5), 126.4 (C-4'), 123.1 (C-6), 115.3 (C-8), 110.9 (C-3), 34.6 (C-1'), 34.0 (N-CH3), 31.8 (C-11'), 29.5-28.8 (C-3'~10'), 28.4 (C-2'), 22.6 (C-12'), 14.0 (C-13'); Positive FAB-MS m/z 342[M+H] +.
EO -8 ( Limocitrin 3-O- rutinoside ): Yellow solid; 1H-NMR (CD3OD, 250 MHz) 8.0 (1H, d, J= 2.5 Hz, H-2'), 7.8 (1H, dd, J = 2.5, 8.5 Hz, H-6'), 7.7 (1H, d, J= 8.5 Hz, H-5'), 6.3 (1H, s, H-6), 5.3 (1H, dd, J= 7 Hz, H-glu-l"), 4.5 (1H, s, H-rham-l'"), 4.0 (3H, s, 3'-OCH3), 3.9 (3H, s, 8-OCH3), 1.1 (3H, d, J = 6.5 Hz, rham-CH3); 13C-NMR(CD3OD, 62.9 MHz) 179.5 (C-4), 158.6 (C-7, 2), 157.9 (C-5), 151.0 (C-4'), 150.4 (C-9), 148.4 (C-3'), 135.5 (C-3), 129.1 (C-8), 124.0 (C-6'), 123.0 (C-1'), 116.2 (C-5'), 114.3 (C-2'), 105.6 (C-10), 104.4 (C-glu-l"), 102.6 (C-rham-l"'), 100.1 (C-6), 76.6 (C-3"), 76.2 (C-5"), 74.5 (C-2"), 72.0 (C-4'"), 70.8 (C-3'"), 70.6 (C-2'"), 70.3 (C-4"), 68.5 (C-5'"), 67.1 (C-6"), 62.1 (8-OCH3), 56.7 (3'-OCH3), 17.9 (C-6'"); Positive FAB-MS m/z 654.5 [M+H]+.
< 실시예 2 > 오수유 추출물 및 단일 성분의 세포 독성 및 세포 노화 저해 효능 조사
1. 실험 재료
사람 섬유아세포와 제대정맥혈관내피세포는 Lonza (Walkersville, MD, 미국)에서 구입하였다. 둘베코스-변형 이글스 배지(Dubeccos-Modified Eagle's medium; DMEM), 우태아혈청, 항생제 용액 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)은 WelGene (Daegu, Korea), 내피세포성장 배양액-2(endothelial cell growth medium-2, EGM-2)는 Lonza (Walkersvill, MD, 미국)에서 구입하였다. p53에 대한 항체는 SantaCruz Biotech, Inc. (SantaCruz, CA, 미국)에서 구입하였으며, p21과 pS6에 대한 항체는 Cell Signaling Technology Inc.(Beverly, MA, 미국)에서 구입하였다. GAPDH 항체는 한국생명공학연구원 권기선 박사로부터 분양받았다. 아드리아마이신은 일동제약주식회사 제품을 사용하였다.
2. 세포 배양
사람 섬유아세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제 [페니실린(penicillin) 10,000unit/ml, 스트렙토마이신(stretomycin) 10,000ug/ml)가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 100 mm 배양접시에 세포를 1 × 105개로 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 세포가 80-90% 정도 자라면, 트립신-EDTA 용액 (2.5X) 을 넣어 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 제대혈관내피세포는 EGM-2를 배양액으로 사용하여 사람 섬유아세포와 같은 방법으로 세포를 배양하였다. 세포를 계대할 때마다 세포 수를 측정하여 세포가 몇 회 분열하였는지 분열 횟수를 조사하였다. 세포의 분열 횟수 (population doubling, PD)는 PD= log2F/log2I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)의 식을 이용하여 계산하였다. 실험에 사용한 세포들은 분열횟수가 사람 섬유아세포의 경우 PD<35 또는 PD>75, 제대혈관내피세포는 PD<30 또는 PD>50회의 것을 사용하였다.
3. 아드리아마이신 처리에 의한 세포노화 유도
직경 100mm 배양접시에 사람 섬유아세포, 제대정맥혈관내피세포를 1.5x105개 분주하였다. 3일간 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하였다. 세포에 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리한 후, 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 3회 세척하였다. 사람 섬유아세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로, 사람 제대정맥혈관내피세포는 EGM-2 배양액으로 배양하였다. 4일 후, 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색으로 세포노화가 유도됨을 확인하였다.
4. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 측정 방법
오수유 추출물과 화합물이 세포의 성장속도에 미치는 영향은 MTT법으로 조사하였다. 0.1% MTT 용액을 96 웰(well) 배양용기의 각 웰(well) 당 50 ul씩 넣고 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시켰다. 배양액과 MTT 용액을 제거 한 후, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide) 100 ul를 첨가하여 형성된 결정을 녹였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 성장속도를 측정하였다.
5. 아드리아마이신에 의한 세포노화에서 오수유 추출물 및 단일성분의 효과 조사
아드리아마이신에 의해 노화된 세포에 오수유 추출물과 이 추출물로부터 분리된 단일 화합물들이 효과가 있는지 조사하였다. 아드리아마이신을 4시간 처리한 세포들을 트립신-EDTA로 배양접시에서 분리하여 96well, 12well, 24well 세포배양용기로 분주하였다. 96well 세포배양용기에 각 well당 섬유아세포는 500개, 제대혈관내피세포는 1,000개씩 분주하였다. 24well에는 섬유아세포는 3000개/well, 제대혈관내피세포는 5000개/well로 분주하였으며, 12well은 섬유아세포 5000개/well, 재대혈관내피세포 7000개/well을 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 96well에는 각 well에 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액과 EGM-2배양액을 100ul씩 더 넣어 주고 12well과 24well은 배양액을 교환한 후, 추출물은 100ug/ml, 단일 화합물은 10 ug/ml로 처리하였다. 음성 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를, 양성 대조군으로 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5mM과 라파마이신(rapamycin) 500nM을 첨가하였다. 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도는 MTT법으로, 세포노화 정도는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색법으로 조사하였다.
6. 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색
세포노화에 대한 효과는 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 24 well 또는 12 well 배양용기에 단일 화합물을 3일 동안 처리한 후, 세포를 인산완충액으로 세척하였다. 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정한 후, 고정액을 제거하고 다시 인산완충액으로 세척하였다. SA-β-gal 염색 용액 [40 mM 시트릭산(citric acid)/포스페이트(phosphate); pH 5.8, 5 mM 포타슘 페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 5 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal 1 mg/ml]을 24 well 배양용기에는 각 well 당 250 ul, 12 well 배양용기에는 각 well 당 500ul를 넣어 주었다. 은박지로 싸서 37℃에서 17시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액(PBS)으로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액으로 1분간 염색하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50~100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율 (%)로 표시하였다.
7. 세포 단백질 추출
각 세포를 60 mm 배양접시에 1x105개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 오수유 추출물과 단일성분을 농도 별로 1시간 전 처리하고, 아드리아마이신 500 nM을 4시간 동안 처리하였다. 배양액을 제거한 후, 인산완충액으로 2회 세척하였다. 배양접시 당 세포 용해 용액 [25mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM Nacl, 1% 트리톤(Tryton) X-100, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 0.1% SDS, 1mM 소듐 바나데이트(Sodium vanadate), 5mM NaF, 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 또는 1mM PMSF]을 50 ul를 넣었다. 세포 긁개를 이용하여 배양접시를 긁어 용액과 세포를 모은 후 미세원침관으로 옮겼다. 얼음에서 30분간 반응시키면서 매 10분마다 용액을 진탕하였다. 12,000 rpm에서 15분간 원침하여 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 용액 속의 단백질 양은 우혈청알부민을 표준단백질로 사용하여 바이신코니닉산(bicinchoninic acid; BCA) 법 (Pierce Biotechnology Inc., Rockford IL, 미국)으로 정량하였다.
8. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석
단백질 (30μg)을 10% SDS-폴리아크릴아미드(SDS-polyacrylamide) 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 이동시킨 후, 5% 전지분유가 포함된 트윈-20-트리스 완충된 식염수(Tween-20-Tris buffered saline; TTBS)에서 30분 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스 막을 p53 또는 p21에 대한 일차항체가 포함된 5% 전지분유-TTBS 용액에서 밤새도록 반응시켰다. TTBS 용액으로 10분씩 3회 세척 한 후, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 1시간 30분 동안 반응시켰다. TTBS로 막을 7분씩 5회 세척 한 후, 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence) 용액을 이용하여 p53, 또는 p21의 양을 측정하였다. 각 항체와 반응한 특정 단백질의 양은 LAS-3000 영상장치 (Fujifilm Corp., Stanford, CT, 미국)을 사용하여 측정하였다. 각 실험에 동일한 양의 단백질이 사용되었음은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease; GAPDH) 항체를 이용해 비교하였다.
9. 세포 내 활성산소(ROS) 농도 측정
세포를 100mm 배양접시에 1.5x105개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 아드리아마이신 500 nM을 4시간 동안 처리하였다. 인산완충액으로 한 번 세척하고, 트립신-EDTA 용액 (2.5%) 을 처리하여 세포를 분리한 후, 60mm 배양접시에 1 X 105개로 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 배양액을 갈아주고 단일화합물을 각각의 농도로 처리하였다. 음성 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 양성 대조군으로 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine) 5mM과 라파마이신(rapamycin) 500nM을 첨가하였다. 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하고 H2DCFDA 250uM을 20분 동안 처리하였다. 인산완충용액으로 1회 세척하고 트립신-EDTA 용액을 넣어 세포를 분리하여 미세원침관으로 옮겼다. 5,000×g 에서 1분간 원침하여 상청액을 버리고 2% 우태아혈청을 포함한 인산완충용액을 1ml 넣어 세포를 세척하고 다시 5,000×g에서 1분간 원침하였다. 세척과정을 2회 반복한 후, 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 1ml 넣어 주었다. 세포 내 ROS 양은 BD FACS CantoⅡ 유세포 분류기 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 측정하였다.
10. 결과
(1) 사람 제대혈관내피세포에서 오수유 추출물의 세포독성과 세포 노화 저해 효능 조사
사람 제대혈관내피세포에서 오수유 추출물 5가지에 대한 세포독성을 먼저 조사하였다. 물 추출물, 부탄올, 메탄올 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타나지 않았으나, 에틸아세테이트, 헥산 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타났다 (도 3A). 그러나 이들 추출물을 10 ug/ml로 처리하였을 때는 모두 세포독성이 나타나지 않았다 (도 3A).
오수유 추출물이 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화를 억제하는지 조사하였다. 물 추출물과 부탄올, 메탄올 추출물은 100과 10 ug/ml, 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물은 10 ug/ml로 각각 처리하였다. 에틸아세테이트 추출물을 처리하였을 때 아드리아마이신 처리에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성이 감소되었다 (도 3B). 그러나 다른 추출물은 SA-β-gal 활성을 저해하지 않았다. 에틸아세테이트 추출물의 농도를 증가시키면서, 세포노화 저해 효능을 조사한 결과, 농도의존적으로 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성을 저해함을 관찰하였다 (도 4A, 4B 및 4C).
에틸아세테이트 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화 과정에서 증가되는 p53, p21, 인산화S6K와 같은 단백질의 발현에 어떤 영향이 있는지 조사하였다. 그 결과 아드리아마이신에 의해 증가되는 p53의 발현을 억제하는 것을 확인하였다 (도 4D).
에틸아세테이트 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화 뿐만 아니라, 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 조사한 결과, 농도의존적으로 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성을 감소시켰다 (도 5).
이상의 결과로부터 오수유 에틸아세테이트 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화와 세포 분열로 인한 복제노화를 저해하는 효능이 있음을 확인하였다.
(2) 사람 제대혈관내피세포에서 오수유 단일성분의 세포독성 효과와 세포노화 저해 효능 조사
사람 제대혈관내피세포에서 오수유 단일성분 8가지에 대한 세포독성을 조사하였다. 화합물을 각각 10 ug/ml 처리하였을 때, EO-4와 EO-8만 세포독성이 관찰되지 않았다 (도 6A). 이 중 EO-4가 세포노화를 억제하는지 조사하였고 아드리아마이신에 의한 세포노화를 저해하지 않는 것을 확인하였다 (도 6B).
단일성분의 농도를 낮추어 1 ug/ml 처리하였을 때, EO-1을 제외한 나머지 화합물은 세포독성이 나타나지 않았다 (도 7A). EO-3, EO-7이 세포노화를 억제하는지 조사하였고 아드리아마이신에 의한 세포노화를 저해하지 않는 것을 확인하였다 (도 7B).
EO-1의 농도를 더 낮추어 0.1 ug/ml로 처리하였을 때 세포독성은 나타내지 않았으나 세포노화 억제 효능도 관찰할 수 없었다 (도 8A, 8B)
(3) 사람 섬유아세포에서 오수유 추출물의 세포독성과 세포 노화 저해 효능 조사
사람 섬유아세포에서 오수유 추출물 5가지에 대한 세포독성을 먼저 조사하였다. 물 추출물, 부탄올, 메탄올 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타나지 않았으나, 에틸아세테이트, 헥산 추출물은 100 ug/ml에서 세포독성이 나타났다. 그러나 이들 추출물을 10 ug/ml로 처리하였을 때는 모두 세포독성이 나타나지 않았다 (도 9A).
오수유 추출물이 아드리아마이신에 의해 유도되는 세포노화를 억제하는지 조사하였다. 물 추출물과 부탄올, 메탄올 추출물은 100과 10 ug/ml, 에틸아세테이트 추출물, 헥산 추출물은 10 ug/ml로 각각 처리하였다. 메탄올 추출물 10 ug/ml 처리하였을 때 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성이 감소되었다 (도 9B). 그러나 다른 추출물은 SA-β-gal 활성을 저해하지 않았다. 따라서 낮은 농도의 메탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화를 억제하는 효능이 있음을 확인하였다. 메탄올 추출물 농도에 따른 세포노화 저해 효능을 더 조사하였다. 그 결과 농도의존적으로 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성을 저해함을 관찰하였다 (도 10A, 10B 및 10C). 메탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화 과정에서 증가되는 p53, p21, 인산화S6K와 같은 단백질의 발현에 어떤 영향이 있는지 조사하였으나 큰 변화가 없는 것을 확인하였다 (도 10D).
메탄올 추출물이 아드라이마아신에 의한 세포노화 뿐만 아니라, 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 조사하였더니 농도의존적으로 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성을 감소시켰다 (도 11).
이상의 결과로부터 오수유 메탄올 추출물이 아드리아마이신에 의한 세포노화와 세포 분열로 인한 복제노화를 저해하는 효능이 있음을 확인하였다.
(4) 사람 섬유아세포에서 오수유 단일성분의 세포독성 효과와 세포노화 저해 효능 조사
사람 섬유아세포에서 오수유 단일성분 8가지에 대한 세포독성을 조사하였다. 화합물을 각각 10 ug/ml 처리하였을 때, EO-1, EO-5, EO-6만 세포독성이 관찰되었다 (도 12A). 이 중 EO-4, EO-8이 아드리아마이신에 의한 세포노화를 억제하는지 조사하였고 EO-8이 아드리아마이신에 의해 증가되는 SA-β-gal 활성을 저해하였다 (도 12B, 12C). EO-8 농도에 따른 세포노화 저해 효능을 조사하였다. 그 결과, EO-8 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성이 감소되었다 (도 13A, 13B). 하지만 p53, p21, pS6단백질 발현에는 변화가 없었다 (도 13C). EO-8 처리 후 아드리아마이신에 의해 증가된 세포 내 ROS 변화를 조사한 결과, EO-8에 의해 ROS의 양이 감소하나 통계적인 유의성은 없었다 (도 14A, 14B). EO-8이 아드리아마이신에 의한 세포노화 뿐만 아니라, 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 조사하였다. EO-8 농도 의존적으로 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성이 감소됨을 관찰하였다 (도 15A, 15B 및 15C).
EO-1는 농도를 낮추어 1, 0.1 ug/ml로 처리하였을 때, 1 ug/ml에서는 세포독성이 관찰되었으나 (도 16A), 0.1 ug/ml에서는 세포 독성이 없었다 (도 16B). EO-1 0.1 mg/ml을 처리하여 아드리아마이신에 의한 세포노화 저해 효능을 조사하였다. 그 결과 아드리아마이신에 의해 증가된 SA-β-gal 활성과 p53, 인산화 S6K의 발현이 감소되었다. 1 ug/ml로 더 낮추어 처리하였더니 독성이 나타나지 않았고 아드리아마이신에 의한 세포노화를 억제하였다 (도 16C, 16D 및 16E). 아울러 EO-1은 아드라이마이신 처리에 의해 증가되는 ROS 양도 감소시켰다 (도 17A, 17B). EO-1이 아드리아마이신에 의한 세포노화뿐만 아니라, 복제노화가 유도된 세포에서도 세포노화를 억제하는지 조사한 결과, 복제노화에 의해 증가된 SA-β-gal 활성이 감소됨을 관찰하였다 (도 18).
이상의 결과로부터 10 ug/ml의 농도에서는 EO-8 (Limocitrin 3-O-rutinoside)이, 0.1 ug/ml의 농도에서는 EO-1 (rutaecarpine)이 사람 섬유아세포에서 아드리아마이신에 의한 세포노화와 세포 분열로 인한 복제노화를 저해하는 효능이 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 오수유 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 루타에카르핀(rutaecarpine) 또는 화학식 2로 표시되는 리모시트린 3-루티노시드(limocitrin 3-O-rutinoside)를 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
    < 화학식 1 >
    Figure pat00003

    < 화학식 2 >
    Figure pat00004

    R1 = OH 이고, R2 = OCH3 임.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 오수유 추출물은 오수유 메탄올 추출액에 증류수, 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올을 첨가하고 분획화하여 추출된 에틸아세테이트(EtOAc) 분획 추출물인 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 제대정맥혈관내피세포인 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 노화는 아드리아마이신에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 노화 억제는 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 억제를 측정하는 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 세포 노화 억제용 약학 조성물.
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