KR20150014943A - 쌍둥이의 타입을 확인하는 방법과 시스템 - Google Patents
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Abstract
쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 확인하는 방법과 시스템이 제공되고, 이 방법은, 태아 다형성 타입을 얻기 위해 쌍둥이 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석하는 단계와, 태아 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형성 타입과 비교하는 단계와, 상기 비교 결과를 기초로 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지 확정하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명의 실시예는 일반적으로 생물정보학(bioinformatics)의 분야에 관한 것이고, 구체적으로는, 쌍둥이(twins)의 유전자형(genotype)을 확정하는 방법과 그 시스템에 관한 것이며, 더 구체적으로는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이(fraternal twins)인지 아닌지를 검정하는 방법과 그 시스템에 관한 것이다.
일반적으로, 정상 여성은 한 번에 하나의 난자(egg)를 배란하고, 이 난자는 정상 수정(normal fertilization) 후 배아(embryo)로 발생한다. 그러나, 때로는 단일의 수정된 난자가 두 개의 부분으로 분리되고, 이 분리된 부분이 어떤 알려지지 않은 원인으로 두 개의 배아, 즉, 쌍둥이로 별도로 발생한다. 단일의 수정된 난자로부터 유래하는 이러한 쌍둥이는, 동일한 성별, 동일한 외모 등을 갖는 동일한 유전적 배경(genetic background)을 가지고 있다. 이러한 쌍둥이 중 하나의 태아(fetus)가 특정한 유전병(genetic disease)에 걸리면, 다른 태아 또한 동일한 특정 유전병에 걸리게 되어 있다. 일반적으로, 서로 다른 분리 시간(segregation time)을 기초로, 동일한 쌍둥이의 태반(placenta)은, 단융모막(mono-chorionic) 및 단양막(mono-amnionic) 타입, 단융모막 및 이양막(di-amnionic) 타입, 및 이융모막(di-chorionic) 및 이양막 타입일 수 있다. 어떤 경우, 여성은 한 번에 하나를 초과하는 난자를 배란한다. 두 개의 배란된 난자 모두가 정상적으로 수정되면 두 개의 배아, 즉 이란성 쌍둥이로 추가 발생(發生)한다. 이란성 쌍둥이의 태아는 멘델 법칙(Mendelian)에 따라 부모의 게놈(parental genomes)을 무작위로 물려받아서, 동일 타입에 있지 않은 유전자를 갖게 되고, 이로 인해서 이란성 쌍둥이는 서로 다른 성별과 서로 다른 외모를 가질 수 있고, 또한 서로 다른 유전병을 가질 수 있다. 전세계의 쌍둥이는 1:89의 평균 출생률을 갖는다. 태어난 쌍둥이가 일란성(monozygotic)인지는, 혈액형 등과 같이 다른 유전 인자에 의한 추가 결정을 또한 필요로 하는 불확실한 결과로, 이들의 성별과 외모를 기초로 예비 결정될 수 있다. 그러나, 이란성 쌍둥이는 또한 이융모막 및 이양막 타입 또는 단융모막 및 이양막 타입일 수 있어서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인가 하는 것은 이융모막 및 이양막 타입을 보여주는 B 초음파 결과를 기초로 해서만 결정되지 않을 수 있다. 쌍둥이의 태아가 각각 양수진단 결과(amniocentesis result)를 기초로 하여 출산 전 진단(prenatal diagnosis)을 받을 수 있어도, 그 샘플링 방법은 특정한 낙태 가능성을 일으킬 수 있다. 동시에, 쌍둥이의 두 태아를 양수진단을 받게 하는 방법은 매우 어려워서, 쉽게 실패한다.
현재, 출산 전 진단에서 이란성 쌍둥이를 결정하는 방법은 여전히 개선될 필요성이 있다.
본 발명의 실시예는 관련 기술에 존재하는 문제점 중 적어도 하나를 적어도 어느 정도까지 해결하고자 한다.
따라서, 본 발명은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 수단을 제공한다.
본 발명의 넓은 제 1 양상의 실시예는 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따라, 이 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: 태아의 다형성 타입(polymorphism type)을 얻기 위해, 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트(polymorphic site)를 유전형분석(genotyping)하는 단계; 태아의 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형 사이트와 비교하는 단계; 및 비교 결과를 기초로 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 확정하는 단계. 이 방법을 사용하여, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 효과적으로 결정될 수 있다. STR을 일례로 사용하여, 부계 유전 STR 유전자형은 임신 STR 유전자형을 고려하여 플라스마에서 결정되고, 특정 자리에서 부계 유전 STR 유전자형이 이질접합적(heterozygous)이고 임신 STR 유전자형(pregnant STR genotype)의 유전자형과 완전히 다르고, 양쪽 두 개의 부계 유전자형이 플라스마에서 검출될 수 있으면, 다음으로, 쌍둥이는 이란성 쌍둥이로 결정될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 상기 방법은 다음의 추가적인 기술적 특징을 또한 가질 수 있다:
본 발명의 일 실시예에서, 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석하는 단계는, 임산부 샘플(pregnant sample)로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하는 단계; 태아의 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리(sequencing library)를 구축하는 단계; 시퀀싱 결과를 얻기 위해, 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계; 및 시퀀싱 결과를 기초로 태아의 다형성 타입을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다음으로, 임산부로부터 샘플링하여 태아의 다형성 타입을 효과적으로 얻을 수 있고, 이로부터 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지는 추가로 효과적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 임산부 샘플은 말초 혈액, 임산부 소변, 모유로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 그래서, 임산부로부터 비침습적 샘플링(noninvasive sampling)에 의해 태아의 다형성 타입을 효과적으로 얻을 수 있고, 이로부터 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지는, 태아 생장에 역효과를 내지 않고, 추가로 효과적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 단계 전에, 이 방법은, 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물(amplification product)을 얻도록, 태아의 핵산 샘플에 대해 증폭하는, 얻은 증폭물이 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 사용되는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭 생성물은 150 bp 미만의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 추가로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다형성(polymorphism)은 STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시예에서, 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, 펜타(Penta) E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트이다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 추가로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아의 핵산 샘플은 PCR에 의해 증폭을 거치게 되고, vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 PCR 프라이머(primer)로 사용되고; TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; 펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용된다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 추가로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 넓은 제 2 양상의 실시예는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따라, 시스템은, 태아의 다형성 타입을 얻기 위해, 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석을 거치도록 하기 위한 유전형분석 장치(genotyping apparatus); 유전형분석 장치와 연결되어 있고, 태아의 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형 사이트와 비교하고, 비교 결과를 기초로 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 확정하는데 적합한 분석 장치(analyzing apparatus)를 포함한다. 시스템을 사용하는 것은, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 상기 방법을 효과적으로 이행할 수 있다. 그래서, 시스템은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 효과적으로 결정할 수 있다. STR을 일례로 사용하여, 부계 유전 STR 유전자형은 임신 STR 유전자형을 고려하여 플라스마에서 결정되고, 특정 자리에서 부계 유전 STR 유전자형이 이질접합적이고 임신 STR 유전자형의 유전자형과 완전히 다르고, 양쪽 두 개의 부계 유전자형이 플라스마에서 검출될 수 있으면, 다음으로, 쌍둥이는 이란성 쌍둥이로 결정될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 상기 시스템은 다음의 추가적인 기술적 특징을 더 포함할 수 있다:
본 발명의 일 실시예에 따라, 유전형분석 장치는, 임산부 샘플로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하기 위한 핵산 추출 유닛(nucleic acid extracting unit); 핵산 추출 유닛에 연결되어 있고, 태아의 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 적합한 라이브러리 구축 유닛(library constructing unit); 라이브러리 구축 유닛에 연결되어 있고, 시퀀싱 결과를 얻기 위해, 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는데 적합한 시퀀싱 유닛(sequencing unit); 및 시퀀싱 유닛에 연결되어 있고, 태아의 다형성 타입을 확정하는데 적합한 유전자형 확정 유닛(genotype determining unit)을 더 포함할 수 있다. 그래서, 이것은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유전형분석 장치(genotyping apparatus)는, 핵산 추출 유닛과 라이브러리 구축 유닛에 각기 연결되어 있고, 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물을 얻도록 태아의 핵산 샘플을 증폭을 거치도록 하고, 얻은 증폭 생성물을 상기 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 적합한 증폭 유닛(amplifying unit)을 더 포함할 수 있다. 그래서, 이것은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다형성은, STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 그래서, 이것은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, Penta E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트이다.
본 발명의 일 실시예에서, 증폭 유닛은, PCR에 의해 증폭을 거치도록 하기 위하여 태아의 핵산 샘플에 프라이머가 갖추어져 있고, vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; 펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용된다. 그래서, 이것은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예의 추가 양상과 이점은 다음의 설명에서 부분적으로 제공될 것이고, 다음 설명으로부터 부분적으로 분명해지거나, 또는 본 발명의 실시예의 실행으로부터 알 수 있게 될 것이다.
본 발명은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 수단을 제공하는 효과를 갖는다.
본 발명의 실시예의 이들 및 이와 다른 양상과 이점이 분명해질 것이고 다음 첨부된 도면을 참조로 이루어진 다음 설명으로부터 보다 용이하게 이해될 것이다:
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 도시하는 순서도;
도 2는, 본 발명의 다른 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 도시하는 순서도;
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템을 도시하는 개략도;
도 4는, 본 발명의 다른 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템을 도시하는 개략도;
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 겔 전기 영동법(gel electrophoresis)에 의한 유전형분석 결과(genotyping result).
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 겔 전기 영동법에 의한 유전형분석 결과.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 도시하는 순서도;
도 2는, 본 발명의 다른 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 도시하는 순서도;
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템을 도시하는 개략도;
도 4는, 본 발명의 다른 실시예에 따라 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템을 도시하는 개략도;
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 겔 전기 영동법(gel electrophoresis)에 의한 유전형분석 결과(genotyping result).
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 겔 전기 영동법에 의한 유전형분석 결과.
본 발명의 실시예가 상세하게 참조될 것이고, 같거나 유사한 기능을 갖는 같거나 유사한 요소는 상세한 설명 전반에서 유사한 도면 번호로 표시될 것이다. 본 발명에 기술된 실시예는 도면을 참조로 설명적, 예시적이고, 일반적으로 본 발명을 이해하기 위해 사용된다. 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않을 것이다.
"제 1" 및 "제 2"와 같은 용어는, 설명의 목적으로 본 명세서에서 사용되고, 상대적인 중요성 또는 중대성을 가리키거나 암시하는 것으로 의도되지 않는다. 그래서, "제 1" 및 "제 2"로 한정된 특징은 명백하게 또는 암시적으로 하나 이상의 특징을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 설명에서, 별도 기재되지 않으면, "복수의"는 두 개 이상을 의미한다.
쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법
본 발명의 넓은 제 1 양상의 실시예는 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따라, 도 1을 참조하면, 이 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
S100 유전형분석 단계(genotyping step): 태아의 다형성 타입을 얻기 위해, 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석하는 단계.
본 발명의 실시예에 따라, 태아의 다형성 타입을 얻는 방법은 임의의 특별한 제한을 받지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에 따라, 임산부로부터 임산부 샘플을 분리할 수 있고, 태아의 핵산 샘플은 임산부 샘플로부터 추가로 추출될 수 있다. 태아의 표적 다형성 사이트(targeting polymorphism site)를 함유하는 임의의 핵산 샘플일 수 있는, "태아의 핵산 샘플"이라는 표현은 넓게 이해되어야 함을 주의해야 한다. 한편, 태아의 핵산 샘플은 태아의 게놈(genome) 핵산 샘플이거나, 또는 태아의 핵산 절편(nucleic acid fragment)을 함유하는 핵산 샘플일 수 있고; 다른 한편으로, 태아의 핵산 샘플은 태아의 유전 물질(fetal genetic material)로 완전히 이루어지거나, 또는 태아의 유전 물질과 임신 유전 물질(pregnant genetic material)의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따라, 도 2를 참조하면, 태아의 다형성 타입을 얻는 단계는 다음을 더 포함할 수 있다:
단계(Step) 101: 임산부 샘플로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하는 단계로서, 임산부로부터 샘플을 채취하여(sampling) 태아의 다형성 타입을 효과적으로 얻고, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 더 효과적으로 결정할 수 있는, 단계. 본 발명의 실시예에 따라, 핵산 샘플이 추출된 임산부 샘플의 타입(type)은 임의의 특별한 제한을 받지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에 따라, 임산부 샘플은, 말초 혈액, 임산부 소변, 및 모유로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나이고, 임산부 샘플은 말초 혈액인 것이 바람직하다. 그래서, 임산부로부터 비침습적 샘플링에 의해 태아의 다형성 타입을 얻을 수 있고, 이로부터 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지는, 태아 생장에 역효과를 내지 않으면서, 효과적으로 결정될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 임산부 샘플로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하기 위한 방법과 장치는 임의의 특별한 제한을 받지 않고, 이는 핵산을 추출하기 위한 상업용 키트를 사용할 수 있다.
단계 102: 단계(101) 다음에, 태아의 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 단계. 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 방법과 공정에 대해서, 당업자는 서로 다른 시퀀싱 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상세한 공정은, 일루미나 컴퍼니(Illumina Company)와 같은 서열분석기(sequencer) 제조업체에 의해 제공된 절차, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되어 있는, 일루미나 컴퍼니의 멀티플렉싱 샘플 조제 가이드(Multiplexing Sample Preparation Guide)(Part#1005361; 2010년 2월) 또는 쌍을 이룬 말단부 샘플 조제 가이드(Paired-End SamplePrep Guide)(Part#1005063; 2010년 2월)를 참조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 단계 이전에, 이 방법은, 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물을 얻도록, 태아의 핵산 샘플에 대해 증폭하는, 얻은 증폭 생성물이 상기 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 사용되는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭 생성물은 150 bp 이하의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 다형성은, STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시예에서, 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, 펜타 E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트이다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 태아의 핵산 샘플은 PCR에 의한 증폭을 거치게 되고, vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; 펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용된다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다. 사용된 PCR 프라이머는 아래 표 1에 나타나 있다:
[표 1]
*프라이머 명칭은 자리 명칭 + 프라이머 타입의 주석 패턴(annotating pattern)으로 사용된다. D19S433-F 및 D6S1043-R을 일례로 사용하면, D19S433-F는 D19S433의 전방 프라이머(forward primer)를 나타내는 반면, D6S1043-R은 D6S1043의 역 프라이머(reverse primer)를 나타낸다.
단계 103, 단계(102) 다음에, 시퀀싱 결과를 얻기 위해, 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계. 시퀀싱 라이브러리를 얻은 후, 얻어진 시퀀싱 라이브러리는 시퀀싱를 위한 서열분석기(sequencer)에 적용되어, 복수의 시퀀싱 데이터로 이루어진 대응하는 시퀀싱 결과를 얻는다. 본 발명의 실시예에 따라, 시퀀싱(sequencing)를 위해 사용된 방법과 장치(device)는, 연쇄 종결 방법(chain termination method), 바람직하게는, 고 처리량 시퀀싱 방법(high-throughput sequencing method)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 특별한 제한을 받지 않는다. 그래서, 이러한 시퀀싱 장치의 특징을 사용하면, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율은 추가 향상될 수 있고, 이에 의해 시퀀싱 데이터를 이용한 차후 분석, 특히, 통계 시험에 의한 분석의 정확도(accuracy)와 정밀도(precision)를 향상시킬 수 있다. 고 처리량 시퀀싱 방법은 차세대 시퀀싱 기술(Next-Generation sequencing technology) 또는 단일 분자 시퀀싱 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 차세대 시퀀싱 플랫폼{메츠커(Metzker) ML. 시퀀싱 기술 - 차세대. Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11(1):31-46}은 일루미나-솔렉사(Illumina-Solexa)(GATM, HiSeq2000TM 등), ABI-솔리드(Solid), 및 로체(Roche)-454 {파이로시퀀싱(pyrosequencing)} 시퀀싱 플랫폼을 포함하지만, 이에 제한되지 않고; 단일 분자 시퀀싱 플랫폼(기술)은, 헬리코스 컴퍼니(Helicos Company)의 실제 단일 분자 DNA 시퀀싱(True Single Molecule DNA sequencing), 퍼시픽 바이오사이언스 컴퍼니(Pacific Biosciences Company)의 단일 분자 실시간(single molecule real-time)(SMRTTM), 및 옥스포드 나노포어 테크놀러지스 컴퍼니(Oxford Nanopore Technologies Company)의 나노포어 시퀀싱 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 {러스크(Rusk), 니콜(Nicole) (2009-04-01). 저렴한 제 3 세대 시퀀싱. 네이처 방법(Nature Methods) 6(4): 244-245}. 시퀀싱 기술의 점진적인 발달로, 이 기술 분야의 당업자는 다른 시퀀싱 방법을 이해할 수 있고, 전체 게놈 시퀀싱를 위해 장치가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정한 예에 따라, 전체 게놈 시퀀싱 라이브러리는, 일루미나-솔렉사, ABI-솔리드, 로체-454, 및 단일 분자 시퀀싱 장치로부터 선택된 적어도 하나에 의해 시퀀싱될 수 있다.
단계 104: 단계(103) 다음에, 시퀀싱 결과를 기초로 태아의 다형성 타입을 결정하는 단계.
시퀀싱 결과는 태아의 다형 사이트의 유전자형을 결정하기 위해, 종래의 정보 분석 방법에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 시퀀싱 결과는, 다형 사이트에서 태아의 다형성 유전자형을 결정하기 위해, 정렬 소프트웨어를 사용하여 기준 서열(reference sequence)로 정렬될 수 있다. 예를 들어, SOAP 소프트웨어는 정렬을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 사용된 기준 서열은 인간의 게놈 서열일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 사용된 자리의 개수는 필요한 만큼 선택될 수 있고; 유전형분석 방법은 유연하고, 이는 서열 길이를 기초로 하거나 염기 서열을 기초로 할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 태아가 일란성인지 아닌지를 검정하는 방법은 결정된 결과가 정확하고 신뢰성이 있는 유전 정보에 직접 기초한다. 본 발명의 실시예에 따라, 유전형분석 방법은, PCR 및 서열 포획(sequence capture) 후 절편을 기초로 한 전기영동 검출에 의해서 또한 수행될 수 있다. 결과에 의한 결정은, 특정한 유전형분석 결과에 의해 결정될 뿐만 아니라, 전체 유전자형 가운데 각 유전자형의 비율에 의해 결정된다.
태아의 다형 사이트의 유전자형이 결정된 후, 태아의 다형 사이트의 얻어진 유전자형은 그 부모의 다형 사이트의 대응하는 유전자형에 맞게 정렬될 수 있다 (단계 200, 정렬 단계). 예를 들어, 부모의 전체 게놈 샘플은, 후속 분석을 위해 그 부모의 다형 사이트의 유전자형을 결정하도록, 동시 또는 미리 시퀀싱될 수 있다. 다음으로, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지는 정렬 결과를 기초로 확정된다 (단계 300, 확정 단계). 태아에서 다형 사이트의 유전자형이 결정된 후, 특정 자리에서 부모 유전자형이 이질접합적이고 모계 자리와 다르고, 동시에 임산부 샘플에서, 예를 들어, 양쪽 두 개의 부모 유전자형이 플라스마에서 검출될 수 있으면, 다음으로, 쌍둥이는 이란성 쌍둥이로 결정될 수 있다. 예를 들어, STR을 일례로 사용하여, 부모의 게놈 DNA와 임신 플라스마 DNA는 다형 사이트의 유전형분석을 각각 거치고, 임신 STR 유전자형을 고려해서 결정된 부계 유전 STR 유전자형은 플라스마에서 발견되며, 만일 특정 자리에서 부계 유전 STR 유전자형이 이질접합적이고 임신 STR 유전자형의 유전자형과 완전히 다르며, 양쪽 두 개의 부계 유전자형이 플라스마에서 검출될 수 있으면, 다음으로, 쌍둥이는 이란성 쌍둥이로 결정될 수 있다.
쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템
본 발명의 넓은 제 2 양상의 실시예는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하기 위한 시스템(1000)을 제공한다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따라, 시스템은, 유전형분석 장치(genotyping apparatus)(100)와 분석 장치(analyzing apparatus)(200)를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 태아의 다형성 타입을 얻기 위해, 쌍둥이 태아의 적어도 하나의 다형 사이트가 유전형분석을 거치도록, 유전형분석 장치가 사용된다. 본 발명의 실시예에 따라, 분석 장치는 유전형분석 장치와 연결되고, 태아의 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형 사이트와 비교하고, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 비교 결과를 기초로 결정하는데 적합하다. "연결된" 및 "서로 연결된"과 같이, 부착, 연결 등에 관한 용어는, 별도로 분명하게 설명되어 있지 않으면, 개재 구조를 통해 직접 또는 간접적으로 구조가 고정 또는 부착되어 있는 관계뿐만 아니라, 모두 이동 가능하거나 고정된 부착 또는 관계를 나타낸다. "연결된"이라는 용어는 넓게 이해되어야만 하고, 이는, 상기 기능적인 연결을 이루는 한, 직접 연결 또는 간접 연결을 나타낼 수 있다. 시스템을 사용하는 것은, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 상기 방법을 효과적으로 실행할 수 있다. 그래서, 시스템은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 효과적으로 결정할 수 있다. STR을 일례로 사용하여, 부계 유전 STR 유전자형은 임신 STR 유전자형을 고려하여 플라스마에서 결정되고, 특정 자리에서 부계 유전 STR 유전자형이 이질접합적이고 임신 STR 유전자형의 유전자형과 완전히 다르고, 양쪽 두 개의 부계 유전자형이 플라스마에서 검출될 수 있으면, 다음으로, 쌍둥이는 이란성 쌍둥이로 결정될 수 있다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에서, 유전형분석 장치(100)는, 핵산 추출 유닛(101), 라이브러리 구축 유닛(102), 시퀀싱 유닛(103), 및 유전자형 확정 유닛(104)을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따라, 핵산 추출 유닛(101)은 임산부 샘플로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하기 위해 사용된다. 라이브러리 구축 유닛(102)은 핵산 추출 유닛(101)에 연결되고, 태아의 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 적합하다. 시퀀싱 유닛(103)은 라이브러리 구축 유닛(102)에 연결되고, 시퀀싱 결과를 얻기 위해, 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는데 적합하다. 유전자형 확정 유닛(104)은 시퀀싱 유닛에 연결되고, 태아의 다형성 타입을 결정하는데 적합하다.
핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 방법과 공정에 관해서, 이 기술 분야의 당업자는 서로 다른 시퀀싱 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상세한 공정은, 일루미나 컴퍼니와 같은 서열분석기 제조업체에 의해 제공된 절차, 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되어 있는, 일루미나 컴퍼니의 멀티플렉싱 샘플 조제 가이드(Part#1005361; 2010년 2월) 또는 쌍을 이룬 말단부 샘플 조제 가이드(Part#1005063; 2010년 2월)를 참조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 유전형분석 장치는 증폭 유닛(도면에 미도시)을 더 포함한다. 증폭 유닛은 핵산 추출 유닛과 라이브러리 구축 유닛에 각기 연결되어 있고, 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물을 얻도록, 태아의 핵산 샘플을 증폭을 거치도록 하고, 얻은 증폭 생성물을 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 사용하는데 적합하다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 단계 이전에, 이 방법은, 시퀀싱 라이브러리를 구축하기 위해, 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물을 얻도록, 태아의 핵산 샘플이 증폭을 거치도록 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭 생성물은 150 bp 이하의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 다형성은, STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, 펜타 E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트이다. 본 발명의 일 실시예에서, 증폭 유닛은, PCR에 의해 증폭을 거치도록 하기 위하여 태아의 핵산 샘플에 프라이머가 갖추어져 있고, vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; 펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고; D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며; D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용된다. 그래서, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 효율을 더 향상시킬 수 있다.
이란성 쌍둥이를 결정하는 기존의 다른 방법과 비교해서, 본 발명의 실시예에 따른 기술적인 해법은, 비침습적 샘플링으로, 정확도 및 얻어질 수 있는 유전 정보량을 구현하는 다음의 기술적 이점을 갖는다:
1) 본 발명의 실시예에 따른 기술적인 해법은, 종래의 양수 또는 융모막(chorion) 샘플링에 의해 발생하는 불편함과 유산 위험을 피할 수 있는, 임산부 말초 혈액 또는 소변 채취와 같이 가능한 한 많은 비침습적 또는 최소한으로 침습적인 샘플 방법을 사용하고;
2) 본 발명의 실시예에 따른 기술적인 해법은, 자리 개수가 필요한 만큼 선택될 수 있는 하나 이상의 다형 사이트의 유전형분석 결과를 기초로 이란성 쌍둥이를 결정하고; 유전형분석 방법은 유연하고, 이는 서열 길이를 기초로 하거나 염기 서열을 기초로 할 수 있으며, 태아가 일란성인지 아닌지를 검정하는 방법은 검정된 결과가 정확하고 신뢰성이 있는 유전 정보에 직접 기초하며;
3) 본 발명의 실시예에 따른 기술적인 해법은, 임상 질병을 진단하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 이란성 쌍둥이가 갖는 유전 물질이 서로 완전히 동일하지 않기 때문에, 쌍둥이의 각 태아는 특정 질병을 결정할 때 개별적으로 결정되어야 하고; 만일 쌍둥이가 동일 쌍둥이로 결정되면, 오진(misdiagnosis) 가능성이 있을 수 있으며, 이에 의해, 더 나은 유전학적 발달과 관련된 연구, 임산부 말초 혈액과 그 기존 상태에서 유리된(free) 태아 DNA의 유전 메커니즘에 대한 더 나은 연구, 비침습적인 출생 전 진단을 위한 더 나은 안내에 사용될 수 있다.
본 발명의 예에 대한 참조가 상세히 이루어질 것이다. 다음 예는 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석될 수 없음이 이 기술 분야의 당업자에 의해 인지될 것이다. 만일 특정 기술 또는 조건이 예에 특정화되지 않으면, 이 기술 분야의 문헌{예를 들어, 제이. 샘브룩 등의 (후앙 피티 번역), 분자 복제(Molecular Cloning): 실험실 메뉴얼(A Laboratory Manual), 제 3판, 사이언스 프레스 참조}에 기술되어 있는 기술 또는 조건을 따르거나, 또는 제품 설명서에 따라, 단계가 수행될 것이다. 만일 시약 또는 기기의 제조업자가 특정화되지 않으면, 시약 또는 기기는, 예를 들어, 일루미나 컴퍼니로부터 상업적으로 이용 가능할 수 있다.
예:
일반 방법:
본 발명의 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법은:
1. 태아 유전 물질을 함유하는 임산부 샘플의 비침습적 샘플링, 태아 유전 물질을 추출하는 단계;
2. 태아의 부모의 게놈 DNA를 추출 및 정제하는 단계;
3. 부모의 유전자형 및 임산부와 그 태아로부터의 혼합물 샘플링을 다형 사이트 유전형분석을 거치도록 하는 단계;
4. 임산부와 그 태아로부터의 혼합물 샘플링에 새로이 나타나는 다형 사이트 유전자형을 부계 게놈의 유전형분석 결과에 맞게 정렬하여, 태아의 유전자형을 결정하는 단계. 태아 유전자형의 타입을 정렬하여, 만일 태아가 다른 부계 유전자형을 가지면, 태아는 이란성 쌍둥이이다.
예 1
쌍둥이를 임신한 임산부의 플라스마 샘플이 채취되고, 커플로부터 각각 게놈 DNA가 채취되었다. 쌍둥이, 즉, 이식된 시험관 아기(implanted test-tube baby)는 이란성 쌍둥이로 임상 진단되었다. 친자 확인 시험(paternity test)에서 일반적으로 사용되는 STR 자리 중 17쌍(vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, Penta E, D12S1064, D12S391, D6S1043, D19S433)이 선택되었다. 표 1에 도시된 PCR 프라이머가 설계되었다. 증폭 생성물은 150 bp 이하의 길이를 갖는 것이 요구되었다. 먼저, 부모의 게놈 DNA는, 부모의 게놈 DNA를 주형(template)으로 택하고, 프라이머의 14쌍을 아래 증폭 시스템을 갖는 Phusion® 고 충실도(high-fidelity) DNA 폴리메라아제(polymerase)를 각기 사용하여 PCR 증폭을 거치도록 하는 것에 의해 STR 유전형분석을 거치게 되었다:
2×Phusion PCR 마스터 믹스(Master Mix) 25㎕
전방 프라이머 5㎕
역 프라이머 5㎕
DNA 주형 15㎕
전체 부피 50㎕
PCR 생성물은, 2시간 동안 18볼트로, 12%PAGE 전기영동 유전형분석을 거치게 되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 유전형분석 결과는, 세 개의 자리(D6S1043, D19S433, 및 D12S391)를 제외하고, 비교적 강한 비특이적 증폭을 나타내고, 다른 자리의 유전형분석 결과는 성공적이었음을 예시했다. 부모 유전자형은 이질접합적이고 두 개의 모계 유전자형과 달랐음을 보여주는 4쌍의 자리가 있었다(D8S1179, vWA, D16S539, 및 D11S2368).
TIANamp 마이크로(Micro) DNA 키트(Kit)(TIANGEN)는 후속하는 종래 라이브러리 구축을 위한 플라스마 샘플 DNA를 추출하는데 사용되고, 다음 상세한 절차를 가졌다:
말단부 수리(End-reparing):
10×T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 완충액 10㎕
dNTPs (10 mM) 2㎕
T4 DNA 폴리메라아제 1㎕
클레노브 절편(Klenow fragment) 0.1㎕
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 1㎕
DNA 85㎕
ddH2O 100㎕ 이하
20℃에서 30분 동안 반응한 후, 말단부 수리 생성물(end-repaired products)을 재생하는데 PCR 정제 키트(QIAGEN)가 사용되었다. 다음으로, 재생된 말단부 수리 생성물은 34㎕의 EB 완충액에 최종 용해되었다.
말단부에서 염기 A를 첨가하기 위한 반응 시스템:
10×클레노브 완충액 5㎕
dATP (1 mM) 10㎕
클레노브 (3'-5'exo-) 1㎕
DNA 34㎕
37℃에서 30분 동안 배양한 후, 얻어진 생성물은 MinElute® PCR 정제 키트(QIAGEN)에 의해 정제되고 45㎕의 EB 완충액에 용해되어, 말단부에 염기 A가 첨가된 DNA 샘플을 얻었다.
결찰 어댑터(Ligating adaptor):
2×신속한 DNA 결찰 완충액(Rapid DNA ligating buffer) 50㎕
PEI 어댑터 올리고 믹스(oligo-mix)(20μM) 1㎕
T4 DNA 리가아제(ligase) 4㎕
말단부에 염기 A가 첨가된 DNA 샘플 45㎕
20℃에서 15분 동안 반응한 후, 결찰 생성물(ligated product)을 재생하는데 PCR 정제 키트(QIAGEN)가 사용되었다. 결찰 생성물은 15㎕의 EB 완충액에 최종 용해되었다.
PCR 반응 시스템:
결찰 생성물 15㎕
Phusion DNA 폴리메라아제 믹스 25㎕
PCR 프라이머 (10 pmol/㎕) 2.5㎕
인덱스(Index) N (10 pmol/㎕) 2.5㎕
초순수(UltraPure) TM 수 5㎕
반응 절차는 아래 도시되었다:
20㎕의 EB 완충액에 최종 용해된 PCR 생성물을 재생하는데 PCR 정제 키트(QIAGEN)가 사용되었다.
구성된 플라스마 라이브러리를 주형으로 사용하여, 4개 타입의 후보 STR 자리가 유전형분석을 거치게 되고, 사용된 유전형분석 방법은 상기의 것과 일치했다. 그 결과는 도 6에 도시되어 있고, 플라스마 샘플에서 성공적으로 증폭된 vWA 자리는 부모 게놈이 이질접합적이고 두 개의 모계 유전자형과 다름을 보여주었으며, 이것은 부모의 두 개의 대립유전자(allele)의 플라스마 유전형분석 결과로부터 알 수 있고, 다음으로, 쌍둥이의 두 태아는 이란성 쌍둥이로 결정된 그 생물학적 부(父)의 두 개의 서로 다른 대립유전자를 각각 물려받는 간주되었다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 실시예에 따른 기술적인 해법은 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 효과적으로 결정할 수 있다.
예시적인 실시예가 도시되고 기술되었지만, 상기 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석될 수 없고, 변화, 대안, 및 변형은 본 발명의 사상, 원리, 및 범위에서 벗어나지 않으면서 실시예에서 이루어질 수 있음이 이 기술 분야의 당업자에 의해 인지될 것이다.
이 명세서 전반에서 "실시예", "일부 실시예", "일 실시예", "다른 예", "일례", "특정한 예", 또는 "일부 예"에 대한 참조는, 실시예 또는 예와 관련해서 기술된 특별한 특징, 구조, 물질, 또는 특질이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예에 포함되었음을 의미한다. 그래서, 이 명세서 전반의 여러 위치에서 "일부 실시예에서", "일 실시예에서", "실시예에서", "다른 예에서", "예에서", "특정 예에서", 또는 "일부 예에서"와 같은 문구의 등장은 반드시 본 발명의 동일한 실시예 또는 예를 가리키지는 않는다. 또한, 특별한 특징, 구조, 물질, 또는 특질은 하나 이상의 실시예 또는 예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> ?柏빽댕샘凜옰세唐掘무鱇
?柏빽댕샘凜桔씩牘
<120> 순땍崗곽怯잚謹돨렘랬뵨溝固
<130> PIDC120705P
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<170> PatentIn version 3.3
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atcttctctc tttcttcct 19
Claims (15)
- 쌍둥이가 이란성 쌍둥이(fraternal twins)인지 아닌지를 검정하는 방법에 있어서,
태아의 다형성 타입(polymorphism type)을 얻기 위해, 상기 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트(polymorphic site)를 유전형분석(genotyping)하는 단계와,
상기 태아의 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형 사이트와 비교하는 단계와,
비교 결과를 기초로 상기 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지 확정하는 단계를
포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석하는 단계는,
임산부 샘플로부터 상기 태아의 핵산 샘플을 추출하는 단계,
상기 태아의 상기 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리(sequencing library)를 구축하는 단계와,
시퀀싱 결과를 얻기 위해, 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는 단계와,
상기 시퀀싱 결과를 기초로 상기 태아의 다형성 타입을 확정하는 단계를
더 포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 임산부 샘플은, 말초 혈액, 임산부 소변, 및 유즙으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 3항에 있어서,
상기 임산부 샘플은 말초 혈액인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 시퀀싱 라이브러리를 구축하는 단계 이전에,
상기 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물(amplification product)을 얻도록, 상기 태아의 핵산 샘플에 대해 증폭(amplifying)하는, 얻은 증폭 생성물이 상기 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 사용되는 단계를 더 포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 5항에 있어서,
상기 증폭 생성물은 150 bp 이하의 길이를 갖는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 다형성은, STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 7항에 있어서,
상기 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, 펜타(Penta) E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 제 8항에 있어서,
상기 태아의 상기 핵산 샘플은 PCR에 의해 증폭을 거치고,
vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 PCR 프라이머(primer)로 사용되고;
TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 방법. - 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템에 있어서,
태아의 다형성 타입을 얻기 위해, 상기 쌍둥이의 태아의 적어도 하나의 다형 사이트를 유전형분석을 거치도록 하기 위한 유전형분석 장치(genotyping apparatus)와,
상기 유전형분석 장치와 연결되어 있고, 상기 태아의 상기 다형성 타입을 그 부모의 대응하는 다형 사이트와 비교하고, 비교 결과를 기초로 상기 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 확정하는데 적합한 분석 장치(analyzing apparatus)를 포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템. - 제 10항에 있어서,
상기 유전형분석 장치는,
임산부 샘플로부터 태아의 핵산 샘플을 추출하기 위한 핵산 추출 유닛(nucleic acid extracting unit)과,
상기 핵산 추출 유닛에 연결되어 있고, 상기 태아의 상기 핵산 샘플에 대하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 적합한 라이브러리 구축 유닛(library constructing unit)과,
상기 라이브러리 구축 유닛에 연결되어 있고, 시퀀싱 결과를 얻기 위해, 상기 시퀀싱 라이브러리를 시퀀싱하는데 적합한 시퀀싱 유닛(sequencing unit)과,
상기 시퀀싱 유닛에 연결되어 있고, 상기 시퀀싱 결과를 기초로 상기 태아의 상기 다형성 타입을 확정하는데 적합한 유전자형 확정 유닛(genotype determining unit)을 더 포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템. - 제 10항에 있어서,
상기 유전형분석 장치는,
상기 핵산 추출 유닛과 라이브러리 구축 유닛에 각기 연결되어 있고, 상기 다형 사이트를 포함하는 증폭 생성물을 얻도록 상기 태아의 상기 핵산 샘플을 증폭을 거치도록 하고, 얻은 증폭 생성물을 상기 시퀀싱 라이브러리를 구축하는데 사용하는데 적합한 증폭 유닛(amplifying unit)을 더 포함하는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템. - 제 12항에 있어서,
상기 다형성은, STR, VNTR, RFLP, STS, SSCP, CAPS, 및 SNP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템. - 제 13항에 있어서,
상기 다형 사이트는, vWA, TPOX, D3S1358, D16S539, D5S818, CSF1PO, D11S2368, D2S1338, D8S1179, D13S317, D21S1437, D16S3391, 펜타 E, D12S1064, D12S391, D6S1043, 및 D19S433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나인 STR 다형 사이트인, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템. - 제 14항에 있어서,
상기 증폭 유닛은, PCR에 의해 증폭을 거치도록 하기 위하여 태아의 핵산 샘플에 프라이머가 갖추어져 있고,
vWA에 대해서, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
TPOX에 대해서, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D3S1358에 대해서, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D16S539에 대해서, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 8로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D5S818에 대해서, SEQ ID NO: 9 및 SEQ ID NO: 10으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
CSF1PO에 대해서, SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D11S2368에 대해서, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D2S1338에 대해서, SEQ ID NO: 15 및 SEQ ID NO: 16으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D8S1179에 대해서, SEQ ID NO: 17 및 SEQ ID NO: 18로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D13S317에 대해서, SEQ ID NO: 19 및 SEQ ID NO: 20으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D21S1437에 대해서, SEQ ID NO: 21 및 SEQ ID NO: 22로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D16S3391에 대해서, SEQ ID NO: 23 및 SEQ ID NO: 24로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
펜타 E에 대해서, SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D12S1064에 대해서, SEQ ID NO: 27 및 SEQ ID NO: 28로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D12S391에 대해서, SEQ ID NO: 29 및 SEQ ID NO: 30으로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되고;
D6S1043에 대해서, SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되며;
D19S433에 대해서, SEQ ID NO: 33 및 SEQ ID NO: 34로 도시된 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로 사용되는, 쌍둥이가 이란성 쌍둥이인지 아닌지를 검정하는 시스템.
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