KR20150005996A - 크로마토그래피 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연속 친화성 크로마토그래피 방법 및 이러한 방법에서 사용하고자 하는 장치에 관한 것이다. 본 방법은 높은 결합력을 유지하면서 높은 작업 속도의 사용을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 연속 크로마토그래피 방법 및 이러한 방법에서 사용하고자 하는 장치에 관한 것이다. 본 방법은 높은 결합력을 유지하면서 높은 작업 속도의 사용을 가능하게 한다.
생물약학 분자의 정제에는 널리 정립된 기술 중 하나로서 크로마토그래피 분리 방법을 사용하는 것이 수반된다. 통상의 적용에는 표적 분자의 포획 및 폴리싱 (polishing) 이 수반된다. 다양한 크로마토그래피 방법 및 수지가 상기 과제를 수행하기 위해 적용될 수 있다 (예를 들어, 정상상, 역상, 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피 모드). 특정 영역에서, 이것은 친화성 크로마토그래피와 같은 더욱 특이적이고 더욱 효과적인 분리 방법을 개발하는 것이다. 항체 정제 업계의 현 상태는 대부분의 가장 풍부한 불순물 (숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 당, 아미노산, 성장 인자 등) 로부터 표적 분자를 결합하고 분리하기 위한 ProtA 개질된 친화성 크로마토그래피 지지체 물질의 사용이다. 다양한 특성을 가진 30 개가 넘는 크로마토그래피 수지가 오늘날 시장에서 이용가능하여, 소비자에게 그의 적용에 최적으로 적합한 것을 찾을 수 있는 기회를 제공한다. 상기 제품의 주된 차이는 결합력, 물질 전달 특성, 압축성 및 견고성에 영향을 주는, 물리적 (지지체 물질, 입자 크기, 입자 형상 및 공극 크기) 뿐 아니라 화학적 특성 (ProtA 리간드, 리간드 밀도, 지지체 매트릭스 유형) 이다.
결합력은 친화성 리간드, 표면에 대한 이의 밀도 및 이의 접근성에 크게 의존한다. 개질 기술의 향상으로 인해, 30 g/L 초과의 높은 결합력이 지지체 매트릭스 화학과 독립적으로 3 분 초과의 잔류 시간에 도달할 수 있게 한다.
반면에, 물질 전달 특성은 꽤 가변적이어서, 적용시 근본적인 차이를 야기한다. 필름 물질 전달 및 공극 확산은 2 가지 주요 파라미터이고, 이것은 흡착 부위에 대한 표적 분자 확산율에 영향을 준다. 필름 물질 전달은 주로 입자 크기 및 형상에 의해 영향을 받는다. 입자 및 입자간 부피가 작을수록 물질 전달 및 흐름 저항력이 크다. 그러므로, 분석 규모 적용을 위해 작은 입자 크기가 빠른 물질 전달 및 높은 효율을 확보하기 위해 사용된다. 그러나 압력 저항력 문제로 인해, 산업적 규모 작업은 3 bar 미만의 작업 압력에서 수행된다. 큰 입자 (60 ㎛ 내지 120 ㎛) 가 통상 선택된다.
상기 언급된 문제로 인해, 공극 확산이 물질 전달을 규정하는 가장 영향력있는 특성 중에 하나이다. 일부 물질이 빠른 물질 전달을 가능하게 하는 넓은 공극 (50 내지 500 nm) 을 나타낸다는 것이 제시되었다. 그러나 상기 물질은 낮은 표면적으로 인해, 낮은 결합력 (~20 g/L) 을 나타낸다. 결합력을 향상시키기 위해, 통상 작은 공극 크기를 통해 달성되는, 높은 표면적이 필요하다. ~100 nm 공극 크기를 나타내는 물질은 40 g/L (Prosep-vA High Capacity (Millipore Bioprocessing, Consett, UK) 결합력을 나타내고, 심지어 더욱 ~70 nm 공극 크기를 나타내는 물질은 56 g/L (Prosep-vA Ultra (Millipore Bioprocessing, Consett, UK) 결합력을 나타낸다. 필적하는 범위 내에 넓은 공극 크기 분포를 가진 지지체 물질은 또한 유사한 결합력 (MabSelect Sure ® (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 나타낸다. 작은 공극 크기로 인해, 표적 분자의 확산이 느려져, 40 g/l 초과의 결합력을 달성하기 위해 특정 표적 분자 잔류 시간을 필요로 한다. 사용된 잔류 시간의 통상의 범위는 표적 분자가 결합 부위에 대해 확산하는 것을 확보하기 위해 3 내지 6 분의 범위이다. 이것은 지지체 물질이 표적 분자를 함유하는 용액으로 처리되는 크로마그래피 방법 로딩 상에서 중요하다. 필요한 친화성 크로마토그래피 방법 단계의 나머지 (예컨대, 세정, 용리, 스트립 (Strip), 제자리 세척, 재평형화 등) 이 짧은 프로세싱 시간을 확보하기 위해 더욱 빠르게 수행될 수 있다. 이 경우 작업 속도는 지지체 물질 강성에 의해 영향을 받는다.
그럼에도 불구하고, 상기 특이적인, 매우 선택적인 방법의 적용 후 약 20 년 동안, 높은 경제적 효능 및 생산성 (g (표적 분자)/ml (정지상)/ h (작업 시간) 을 추구하는 추가의 방법 최적화에 대한 필요성이 증가하고 있다. 현행 상태는 많은 수지 양에 대해 높은 투자 비용으로 많은 처리량을 위한 큰 컬럼을 사용하는 것이다. 종종 1.2 미터 직경 및 10 내지 20 cm 층 높이의 컬럼이 mAb 정제를 위해 사용된다. 경제적인 프로세싱을 가능하게 할 대안적인 기술, 즉 연속 크로마토그래피가 있다는 것이 인지되었다. 상기 방법의 기본은 생성물 손실 없이 표준 배치에서와 같은 60% 대신에 80% 의 수지 결합력에 대한 로딩을 하면서 높은 수지 이용, 순차적인 배치 공정을 다수의 컬럼에 대해 평행한 작업으로 나누어 작은 컬럼의 사용을 가능하게 하는 것을 통한 짧은 작업 시간이다.
연속 크로마토그래피에서, 여러 개의 동일한 컬럼은, 방법 요구사항에 따라, 컬럼을 연속으로 및/또는 평행으로 작동시키는 것을 가능하게 하는 배열로 연결된다. 따라서, 모든 컬럼은 원칙적으로 동시에 실행될 수 있으나, 방법 단계에 살짝 이동이 있을 수 있다. 절차는 반복될 수 있어 각각의 컬럼이 공정 중 수 회 로딩, 용리 및 재생되도록 할 수 있다. 단일 크로마토그래피 사이클이 여러 연속 단계 (예컨대 로딩, 세정, 용리 및 재생) 에 기반하는 "통상의" 크로마토그래피와 비교하여, 다중 동일 컬럼에 기반하는 연속 크로마토그래피에서는 모든 상기 단계가 동시에, 그러나 상이한 컬럼 각각에 대해서 일어난다. 연속 크로마토그래피 작업이 크로마토그래피 수지의 더욱 양호한 이용, 프로세싱 시간 감소 및 감소된 완충액 요구사항을 야기하고, 이들 모두가 공정 경제에 이득을 준다. 연속 크로마토그래피의 하나의 예는 모의 이동층 (Simulated Moving Bed: SMB) 크로마토그래피이다.
올해, 상기 모의 이동층 (SMB) 기술이 생물약학 시장에도, 특히 항체의 정제를 위해 도입되었다. 이전에 정상 배치 크로마토그래피에서 크로마토그래피 컬럼의 로딩이 특정 % 의 표적 분자 관류 (breakthrough) 에서 정지되는 경우, 로딩은 표적 분자 손실 없이 결합력을 증가시키기 위해 연속될 수 있는데, 관류 분획이 첫번째 것 이후에 컬럼 상에 로딩되기 때문이다.
그럼에도 불구하고, 더욱 양호한 경제적 효율을 위해 프로세싱 시간이 주된 중요성을 갖는데 이것이 생산성에 직접 영향을 주기 때문이다. 결합력의 증가는 이미, 얼마나 많은 더 많은 물질이 표면에 결합될 수 있는지에 대한 수준에 의해 생산성을 향상시키고 있으나 (~ 20 내지 40 %), 개질된 표면 상에 결합되는 표적 분자에 필요한 잔류 시간의 감소는 경제적 효율을 훨씬 더 향상시킬 것이다. 아마도, 0.3 분으로의 잔류 시간의 감소는 3 분 잔류 시간에 비교하는 경우 10 배 증가된 생산성을 야기할 것이다. 불행히도, 표적 분자 흡착 상 동안의 잔류 시간의 감소는 동적 결합력의 감소를 야기하는데, 물질 전달의 속도가 감소하기 때문이다. 따라서, 컬럼 로딩은 전형적으로 US 20090209736 에 기재된 바와 같이 약 600 cm/h 이하의 진행 속도로 수행된다. 그러나 또한 [E. Mahajan et el., Journal of Chromatography A, 1227 (2012) 154-162] 에 실제로 언급된 바와 같이, 높은 유속에서 컬럼 결합력이 감소하여 높은 유속이 컬럼 로딩에 대해 실현가능하지 않다.
놀랍게도 본 출원인은 특정 연속 크로마토그래피 방법과 연결된 적합한 지지체 물질 물리적 특성 (입자 크기, 공극 크기) 선택이 800 cm/h 초과의 로딩 속도를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
발명의 상세한 설명
로딩 동안 적은 5% 미만의 표적 분자 손실 없이 또는 함께 친화성 수지의 60% 초과의 총 결합력은 침출된 표적 분자를 로딩 동안 첫번째 포획 친화성 컬럼으로부터 두번째 포획 친화성 컬럼 상으로 효과적으로 이동시킴에 의한 800 초과, 심지어 1000 cm/h 초과의 속도를 사용하여 달성될 수 있다. 평행 유닛 작업을 가능하게 하기 위해 동시에 적어도 세번째 컬럼을 다른 크로마토그래피 공정 단계에 대해 사용한다. 이것은 배치 유닛 작업과 직접 비교하는 경우 (동일한 유닛 작업 조건) 20% 초과의 결합력 증가 및 작업 시간 (통상의 배치 유닛 작업은 300 cm/h 에서 수행된다) 에서의 3 배 초과의 감소를 야기한다. 이것은 친화성 크로마토그래피 적용 뿐 아니라 이온 교환 크로마토그래피 적용에 대해서도 작동한다.
본 발명은 따라서, 공급물 흐름이 전혀 중단되지 않으며, 800 cm/h 초과의 속도를 갖고, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스가 30 내지 200 ㎛ 의 평균 직경 및 40 nm 내지 300 nm 의 범위의 평균 공극 직경을 갖는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는, 샘플 내의 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 정제하는 방법에 관한 것이다:
a) 적어도 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하는, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛을 제공하는 단계
b) 샘플을 첫번째 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 분리 유닛에 결합하도록 하는 첫번째 pH 및 전도성에 있음), 상기 분리 유닛이 다음 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 첫번째 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하는, 용리하는 및/또는 재평형화하는 동시에, 다음 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 단계
c) 공급물을 다음 분리 유닛으로 전환시키는 단계
d) 샘플을 상기 다음 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 다음 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 다음 분리 유닛에 결합하도록 하는 첫번째 pH 및 전도성에 있음), 상기 다음 분리 유닛이 다음 이후 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 다음 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하는, 용리하는 및/또는 재평형화하는 동시에, 다음 이후 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 단계
e) 상기 단계 c) 및 d) 를 1 회 이상 반복하는 단계.
바람직한 구현예에서, 공급물은 1000 cm/h 초과의 속도를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개, 4 개 또는 5 개의 분리 유닛이 단계 a) 에서 제공된다. 매우 바람직한 구현예에서, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 오직 3 개의 분리 유닛이 단계 a) 에서 제공된다.
바람직한 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 친화성 크로마토그래피 매트릭스이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스는 40 내지 120 ㎛, 더욱 바람직하게는 55 내지 100 ㎛ 의 평균 입자 크기 직경 (d50) 을 갖는 입자를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스는 40 nm 내지 300 nm 의 범위의 평균 공극 직경을 갖는 입자를 포함한다. 더욱 바람직하게는 분리 유닛 내에 존재하는 입자의 공극은 50 내지 150 nm 의 범위의 평균 공극 직경을 갖는 공극을 갖는다. 더욱 바람직한, 입자의 공극은 60 nm 내지 100 nm 의 범위의 평균 공극 직경을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 단계 b), c) 및 d) 에서, 로딩되고 있는 분리 유닛은 로딩 시간의 일부일 뿐 아니라 원형 내에서 다음 분리 유닛과의 유체 소통 중인 전체 로딩 시간을 넘는다.
또다른 바람직한 구현예에서, 단계 b), c) 및 d) 에서, 원형 내에서 로딩되고 있는 분리 유닛과 다음 분리 유닛 사이의 유체 소통이 로딩 시간의 후반에서 시작된다.
또다른 구현예에서, 로딩된 분리 유닛을 세정할 때, 상기 로딩된 분리 유닛으로부터 용리되는 세정 액체를 또다른 분리 유닛의 입구로 유도한다.
또다른 구현예에서, 로딩된 분리 유닛을 세정할 때, 상기 로딩된 분리 유닛으로부터 용리되는 세정 액체를 공급원료로 유도한다.
바람직한 구현예에서, 샘플은 정화된 샘플이다. 정화된 샘플은 이전에 정화에 적용된 샘플이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 분리 유닛으로부터의 용리액인, 그러므로 본 발명에 따른 방법으로부터의 결과인 정제된 표적 분자를 하나 이상의 관류 (flow through) 정제 단계에 추가로 적용한다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 장치에 관한 것이다:
- 연결 라인으로 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하며, 2 개의 분리 유닛 사이의 각각의 연결 라인이 하나 이상의 온/오프 밸브를 포함하는, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛
- 각각의 분리 유닛의 입구에 가까운 분리 유닛 사이에 연결 라인 내의 분지를 통해 각각의 분리 유닛의 출구와 유체 연결상태에 있는 용매 전달 시스템
- 2 개 이상의 분지를 갖는 라인을 포함하는 분리 유닛의 출구에 가까운 분리 유닛 사이에 각각의 연결 라인으로부터 분지된 유체 출구 라인으로서, 각각의 분지는 온/오프 밸브를 갖는 유체 출구 라인.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 포함하는 표적 분자의 정제 공정, 전형적으로는 생물약학 제조 공정에 관한 것이다. 생물약학 제조 공정은 생물반응기 내 세포 배양물에서 제조되는 표적 분자를 정제하여 약학 적용에서 사용할 수 있게 하는 공정이다.
바람직한 구현예에서, 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 부가적으로 포함한다:
- 정화 (예컨대 원심분리 및/또는 여과 및/또는 침강)
- 바이러스 불활성화
- 하나 이상의 관류 정제, 또한 관류 폴리싱으로 불림
- 멸균 여과.
바람직한 구현예에서, 상기 방법의 2 개 이상의 단계가 그의 지속기간의 적어도 일부에서 중복된다.
도 1 은 본 발명에 따른 장치의 바람직한 구현예의 도식을 보여준다. 이것은 3 개의 포획 분리 유닛 (ProtA, 또는 IEX), 용매 저장소 A, B, C, D, E, F 에 대한 연결 뿐 아니라 연결 라인, 밸브 및 펌프를 나타낸다.
도 2a-e 는 3 개 컬럼 연속 공정의 일부를 도식적으로 보여주며, 첫번째 및 두번째 분리 유닛이 로딩상 (공급물) 동안 유체 소통에 있으며, 적제되는 분리 유닛 및 적제되는 분리 유닛과 유체 소통으로 있는 유닛과 상이한 세번째 분리 유닛은 다양한 공정 서브-단계를 겪고 있다: a) 용액 A 를 이용한 세정, b) 용액 B 를 이용한 세정, c) 결합된 표적 분자의 용리, d) 제자리 세척 및 e) 분리 유닛의 재생.
도 3a-c 는 로딩상 동안 강조된 유체 소통을 위한 3 개 컬럼 연속 공정의 선택된 일부를 도식적으로 보여주며, a) 분리 유닛 1 은 로딩 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 3 은 세정상 내에 있고, b) 분리 유닛 2 는 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 1 은 세정상 내에 있고, c) 분리 유닛 3 은 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 2 는 세정상 내에 있다.
도 4 는 3 개의 분리 유닛 및 2 개의 용매 전달 시스템의 필수적 특징에 주로 제한된 설정 (setup) 을 보여준다.
도 5a-d 는 로딩상 동안 강조된 유체 소통을 위한 4 개 컬럼 연속 공정의 선택된 일부를 도식적으로 보여주며, a) 분리 유닛 1 은 로딩 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 4 는 세정상 동안 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고, b) 분리 유닛 2 는 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고, 분리 유닛 1 은 세정상 동안 분리 유닛 4 와 유체 소통에 있고, c) 분리 유닛 3 은 분리 유닛 4 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 2 는 세정상 동안 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고, d) 분리 유닛 4 는 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 3 은 세정상 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있다.
도 6a-e 는 4 개 컬럼 연속 공정의 일부를 도식적으로 보여주며, 첫번째 및 두번째 분리 유닛이 로딩상 (공급물) 동안 유체 소통에 있으며, 적제되는 분리 유닛 및 적제되는 분리 유닛과 유체 소통으로 있는 유닛과 상이한 네번째 분리 유닛은 다양한 공정 서브-단계를 겪고 있다: a) 용액 A 를 이용한 세정 및 상기 세정 용액의 상기 분리 유닛으로부터 세정되고 있는 분리 유닛과 유체 소통에 있는 이전의 것으로의 이동, b) 용액 B 를 이용한 세정, c) 결합된 표적 분자의 용리, d) 제자리 세척 및 e) 분리 유닛의 재생.
도 7a 는 상기 분자의 다른 분리 유닛으로의 이동을 명확하게 하는 약하게 또는 미결합된 표적 분자의 세정을 위한 대안적인 흐름 경로를 도식적으로 보여준다. 반면 도 7b 는 불순물의 세정을 위한 흐름 경로를 보여준다.
도 8 은 ProSep vA Ultra Plus 수지의 경우 잔류 시간에 대한 결합력으로 표현되는, 표준 배치 방법에 비해 연속 크로마토그래피의 강력한 장점을 보여준다.
도 9 는 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 mAbA 정제 실험 중의 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 UV 신호 추적의 중복을 보여준다.
도 10 은 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 mAbA 투입 농도 및 mAb 용리 농도를 보여준다.
도 11 은 mAbA 의 정제를 위해 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 용리 풀 (elution pool) 내 HCP 농도를 보여준다.
도 12 는 배치 및 연속 작업 모드에서 다양한 Prot A 수지 및 다양한 mAb 농도에 대한 동적 결합력을 보여준다. 물질을 제시하지 않은 범례는 PUP 물질을 나타내는 것에 주의한다. 모든 컬럼은 0,8 * 10 cm 의 동일한 치수를 가졌다.
도 13 은 Eshmuno S 수지의 경우 잔류 시간에 대한 결합력으로 표현되는, 표준 배치 방법에 비해 연속 크로마토그래피의 강력한 장점을 보여준다.
도 14 는 Eshmuno S 컬럼을 적용하는 mAbA 정제 실험 중의 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 실행에 대한 UV 신호 추적의 중복을 보여준다.
도 15 는 결합-및 용리 크로마토그래피 (포획) 단계를 위해 본 발명의 방법을 사용하는 표적 분자의 정제를 위한 공정을 보여준다. 제시된 정제 공정은 세포 배양을 위한 생물반응기 이후 하기 공정 단계를 사용한다: 정화; 단백질 A 결합 및 용리 크로마토그래피 (포획); 바이러스 불활성화; 관류 정제; 및 제형화. 제시되는 바와 같이, 각각의 공정 단계는 공정 단계의 의도되는 결과를 달성하는데 사용되는 하나 이상의 장치를 사용한다. 제시되는 바와 같이, 정화는 침전 및 심층 여과를 사용하며; 단백질 A 결합 및 용리 크로마토그래피가 본 발명의 공정을 사용하여 수행되며; 바이러스 불활성화는 2 개의 인-라인 (in-line) 정적 혼합기를 사용하고; 관류 정제는 활성탄 (AC) 이후 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 이후 인-라인 정적 혼합기 및 서지 탱크를 사용하는 pH 변화 이후 관류 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 사용하고; 제형화는 정용여과/농축 접선 유동 여과 장치 이후 멸균 여과를 사용한다. 하나 이상의 멸균 필터가 또한 본 공정을 통틀어 사용된다.
도 2a-e 는 3 개 컬럼 연속 공정의 일부를 도식적으로 보여주며, 첫번째 및 두번째 분리 유닛이 로딩상 (공급물) 동안 유체 소통에 있으며, 적제되는 분리 유닛 및 적제되는 분리 유닛과 유체 소통으로 있는 유닛과 상이한 세번째 분리 유닛은 다양한 공정 서브-단계를 겪고 있다: a) 용액 A 를 이용한 세정, b) 용액 B 를 이용한 세정, c) 결합된 표적 분자의 용리, d) 제자리 세척 및 e) 분리 유닛의 재생.
도 3a-c 는 로딩상 동안 강조된 유체 소통을 위한 3 개 컬럼 연속 공정의 선택된 일부를 도식적으로 보여주며, a) 분리 유닛 1 은 로딩 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 3 은 세정상 내에 있고, b) 분리 유닛 2 는 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 1 은 세정상 내에 있고, c) 분리 유닛 3 은 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 2 는 세정상 내에 있다.
도 4 는 3 개의 분리 유닛 및 2 개의 용매 전달 시스템의 필수적 특징에 주로 제한된 설정 (setup) 을 보여준다.
도 5a-d 는 로딩상 동안 강조된 유체 소통을 위한 4 개 컬럼 연속 공정의 선택된 일부를 도식적으로 보여주며, a) 분리 유닛 1 은 로딩 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 4 는 세정상 동안 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고, b) 분리 유닛 2 는 분리 유닛 3 과 유체 소통에 있고, 분리 유닛 1 은 세정상 동안 분리 유닛 4 와 유체 소통에 있고, c) 분리 유닛 3 은 분리 유닛 4 와 유체 소통에 있고 분리 유닛 2 는 세정상 동안 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고, d) 분리 유닛 4 는 분리 유닛 1 과 유체 소통에 있고 분리 유닛 3 은 세정상 동안 분리 유닛 2 와 유체 소통에 있다.
도 6a-e 는 4 개 컬럼 연속 공정의 일부를 도식적으로 보여주며, 첫번째 및 두번째 분리 유닛이 로딩상 (공급물) 동안 유체 소통에 있으며, 적제되는 분리 유닛 및 적제되는 분리 유닛과 유체 소통으로 있는 유닛과 상이한 네번째 분리 유닛은 다양한 공정 서브-단계를 겪고 있다: a) 용액 A 를 이용한 세정 및 상기 세정 용액의 상기 분리 유닛으로부터 세정되고 있는 분리 유닛과 유체 소통에 있는 이전의 것으로의 이동, b) 용액 B 를 이용한 세정, c) 결합된 표적 분자의 용리, d) 제자리 세척 및 e) 분리 유닛의 재생.
도 7a 는 상기 분자의 다른 분리 유닛으로의 이동을 명확하게 하는 약하게 또는 미결합된 표적 분자의 세정을 위한 대안적인 흐름 경로를 도식적으로 보여준다. 반면 도 7b 는 불순물의 세정을 위한 흐름 경로를 보여준다.
도 8 은 ProSep vA Ultra Plus 수지의 경우 잔류 시간에 대한 결합력으로 표현되는, 표준 배치 방법에 비해 연속 크로마토그래피의 강력한 장점을 보여준다.
도 9 는 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 mAbA 정제 실험 중의 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 UV 신호 추적의 중복을 보여준다.
도 10 은 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 mAbA 투입 농도 및 mAb 용리 농도를 보여준다.
도 11 은 mAbA 의 정제를 위해 ProSep vA Ultra Plus 컬럼을 적용하는 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 103 회 사이클 실행에 대한 용리 풀 (elution pool) 내 HCP 농도를 보여준다.
도 12 는 배치 및 연속 작업 모드에서 다양한 Prot A 수지 및 다양한 mAb 농도에 대한 동적 결합력을 보여준다. 물질을 제시하지 않은 범례는 PUP 물질을 나타내는 것에 주의한다. 모든 컬럼은 0,8 * 10 cm 의 동일한 치수를 가졌다.
도 13 은 Eshmuno S 수지의 경우 잔류 시간에 대한 결합력으로 표현되는, 표준 배치 방법에 비해 연속 크로마토그래피의 강력한 장점을 보여준다.
도 14 는 Eshmuno S 컬럼을 적용하는 mAbA 정제 실험 중의 3 개의 분리 유닛 연속 크로마토그래피 시스템 상에서의 실행에 대한 UV 신호 추적의 중복을 보여준다.
도 15 는 결합-및 용리 크로마토그래피 (포획) 단계를 위해 본 발명의 방법을 사용하는 표적 분자의 정제를 위한 공정을 보여준다. 제시된 정제 공정은 세포 배양을 위한 생물반응기 이후 하기 공정 단계를 사용한다: 정화; 단백질 A 결합 및 용리 크로마토그래피 (포획); 바이러스 불활성화; 관류 정제; 및 제형화. 제시되는 바와 같이, 각각의 공정 단계는 공정 단계의 의도되는 결과를 달성하는데 사용되는 하나 이상의 장치를 사용한다. 제시되는 바와 같이, 정화는 침전 및 심층 여과를 사용하며; 단백질 A 결합 및 용리 크로마토그래피가 본 발명의 공정을 사용하여 수행되며; 바이러스 불활성화는 2 개의 인-라인 (in-line) 정적 혼합기를 사용하고; 관류 정제는 활성탄 (AC) 이후 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 이후 인-라인 정적 혼합기 및 서지 탱크를 사용하는 pH 변화 이후 관류 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 사용하고; 제형화는 정용여과/농축 접선 유동 여과 장치 이후 멸균 여과를 사용한다. 하나 이상의 멸균 필터가 또한 본 공정을 통틀어 사용된다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 특정 조성물 또는 공정 단계에만 제한되지 않으며, 보통 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수형은 문맥상 명확하게 다르게 표시되지 않는 한 복수 참조를 포함하는 것으로 명시되어야만 한다. 따라서, 예를 들어 "리간드" 에 대한 참조에는 다수의 리간드가 포함되며, "항체" 에 대한 참조에는 다수의 항체 등이 포함된다.
다르게 정의되지 않는 경우, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련되는 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 기재되는 바와 같이 용어 "표적 분자" 또는 "표적 화합물" 은 샘플 내 하나 이상의 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 할 임의의 분자, 성분 또는 화합물 또는 이의 혼합물을 말한다. 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 단백질 또는 2 개 이상의 단백질의 혼합물이다. 매우 바람직한 구현예에서, 표적 분자는 항체이다. 대안적으로는 "표적 분자" 또는 "표적 화합물" 은 하나 이상의 원하는 화합물로부터 제거되어야 할 원치 않는 화합물일 수 있다.
용어 "항체" 는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 말한다. 전형적으로는, 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄로 이루어지고, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 디술피드 결합에 의해 안정화되는, 기본 4 개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖고 있다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있다 (예를 들어, 5량체 형태로 존재하는 IgM 항체 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체). 항체에는 또한 다중특이적 항체 (예를 들어, 이특이적 항체), 및 항체 단편 (이들이 리간드-특이적 결합 도메인을 보유하는 한, 또는 이를 포함하도록 개질되는 한) 이 포함될 수 있다. 용어 "단편" 은 미손상 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 말한다. 단편은 미손상 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해서 수득될 수 있다. 재조합으로 제조되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질이라고 불리는 큰 단백질의 일부로서 발현될 수 있다. 예시적 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편이 포함된다. 예시적 융합 단백질에는 Fc 융합 단백질이 포함된다. 본 발명에 따르면, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 에 의해 포함된다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 함유 단백질, 예를 들어, 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 함유 단백질은 또다른 폴리펩티드 또는 이의 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드에는, 예를 들어, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 ⅧC, 인자 Ⅸ, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시 조절됨, 정상적으로 T-세포 발현성이며 분비성임); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러리안-억제 물질; 릴랙신 α-사슬; 릴랙신 β-사슬; 프로릴랙신; 마우스 성샘자극호르몬 연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 연관 항원 (CTLA) (예를 들어, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘 인자; 뼈-유래 신경 영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT- 6) 과 같은 신경 영양성 인자, 또는 NGF-β 와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 표피 성장 인자 (EGF); TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 를 포함하는, TGF-β 와 같은 형질전환 성장 인자 (TGF); 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -Ⅱ (IGF-I 및 IGF-Ⅱ); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-I 내지 IL-IO; 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 예를 들어, AIDS 외피의 일부와 같은 바이러스성 항원; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 임의의 상기 나열된 폴리펩티드의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 특히 임의의 상기 나열된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 다르게 언급되지 않는 경우, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 함유한 임의의 조성물 또는 혼합물을 말한다. 샘플은 생물학적 또는 다른 공급원으부터 유래될 수 있다. 생물학적 공급원은 식물 및 동물 세포, 조직 및 기관과 같은 진핵생물 및 원핵생물 공급원을 포함한다. 샘플은 표적 분자와 혼합된 것으로 발견되는 희석제, 완충제, 세제, 및 오염 종, 부스러기 등을 또한 포함할 수 있다. 샘플은 "부분적으로 정제" 될 수도 있고 (즉, 여과 단계와 같은 하나 이상의 정제 단계에 적용되었음) 또는 표적 분자를 생성하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득될 수도 있다 (예를 들어, 샘플은 수확된 세포 배양 유체를 포함할 수 있음).
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물질" 은, 본 발명의 공정을 사용해 하나 이상의 외래의 또는 부적당한 분자로부터 분리되고 있는 표적 분자를 함유한 샘플 내에 존재할 수 있는 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 내독소, 지질 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대분자를 포함하는 임의의 외래의 또는 부적당한 분자를 말한다.
부가적으로, 이러한 불순물은 본 발명의 방법 전에 발생할 수도 있는 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "정제", "분리" 또는 "단리" 는 표적 분자와 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 표적 분자의 순도 정도를 증가시키는 것을 말한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도 정도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 공정" 은 샘플에 함유된 하나 이상의 생성물 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 이 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합하고 이어서 용리되는 생성물 분리 기법을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "저장소" 는 본 발명의 방법을 수행할 때 사용하고자 하는 임의의 완충액 또는 본 발명의 방법에 사용할 샘플 또는 기타 다른 액체를 저장하는데 사용될 수 있는 임의의 컨테이너, 탱크 또는 백을 말한다. 부가적으로는 "저장소" 는 공정 단계의 산출물 (예를 들어, 컬럼으로부터의 용리액) 을 수집하는데 사용되는 임의의 컨테이너, 탱크 또는 백이다.
용어 "크로마토그래피" 는 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심의 분석물질 (예를 들어, 표적 분자) 을 분리하는 임의의 종류의 기법을 말한다. 보통, 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에 또는 결합 및 용리 공정에서 고정 매질을 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로서 표적 분자는 다른 분자로부터 분리된다.
용어 "매트릭스" 또는 "크로마토그래피 매트릭스" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 분리 공정에서 혼합물 중 존재하는 다른 분자로부터 표적 분자 (예를 들어, 면역 글로불린과 같은 Fc 영역 함유 단백질) 를 분리하는 임의의 종류의 입자성 흡수제, 수지 또는 고체상을 말한다. 보통, 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향하에 또는 결합 및 용리 공정에서 매트릭스를 통해 이동하는 속도의 차이의 결과로서 표적 분자는 다른 분자로부터 분리된다. 수지 입자로 이루어지는 매트릭스를 컬럼 또는 카트리지 내에 넣을 수 있다. 매트릭스를 형성하기 위한 재료의 예에는 다당류 (예컨대, 아가로오스 및 셀룰로오스); 및 다른 기계적으로 안정된 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어, 제어된 기공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 전술한 임의의 물질의 유도체를 포함한다. 전형적으로, 매트릭스는 하나 이상의 유형의 리간드를 갖는다.
"리간드" 는 크로마토그래피 매트릭스에 부착되고 매트릭스의 결합 특성을 결정하는 관능기이다. "리간드" 의 예에는 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 황친화성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 및 혼합 모드기 (전술한 것의 조합물) 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드에는 강한 양이온 교환기, 예컨대 술포프로필, 술폰산; 강한 음이온 교환기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환기, 예컨대 카르복실산; 약한 음이온 교환기, 예컨대 N5N 디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용기, 예컨대 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성기, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L 이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "친화성 크로마토그래피" 는 표적 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 관심의 단백질 또는 항체) 이 표적 단백질에 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 기법을 말한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생물특이적 리간드로서 불린다. 일부 구현예에서, 생물특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 이의 기능성 변이체) 는 크로마토그래피 매트릭스 재료에 공유결합으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 매트릭스에 접촉함에 따라 용액 중 표적 단백질에 접근가능하다.
표적 단백질은 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생물특이적 리간드에 대해 이의 특이적인 결합 친화성을 보유하나, 혼합물 중 다른 용질 및/또는 단백질은 뚜렷이 또는 특이적으로 리간드에 결합하지 않는다. 고정화 리간드에 대한 표적 단백질의 결합은 오염 단백질 또는 단백질 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통과하는 것을 허용하는 반면, 표적 단백질은 고체상 재료 상의 고정화 리간드에 특이적으로 결합된 채로 유지된다. 특이적으로 결합된 표적 단백질은 그 후 적합한 조건 (예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등) 하에 고정화 리간드로부터 활성 형태로 제거되고, 앞서 컬럼을 통과하도록 허용된 오염 단백질 또는 단백질 불순물 없이, 용리 완충액과 함께 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 임의의 성분은 각각의 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 다양한 방법에서, 단백질 A 는 Fc 영역 함유 표적 단백질에 대한 리간드로서 사용된다. 표적 단백질 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 의 생물특이적 리간드 (예를 들어, 단백질 A) 로부터의 용리 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 이의 기능성 변이체가 생물특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 A 와 같은 생물특이적 리간드는 Fc 영역 함유 단백질에 대한 결합, 세정 또는 생물특이적 리간드/표적 단백질 콘쥬게이트 재평형화를 위해 5 내지 9 의 pH 범위에서 사용되고, 하나 이상의 염을 함유하는 약 4 이하의 pH 를 가지는 완충액을 이용한 용리가 뒤따른다.
용어 "이온 교환" 및 "이온 교환 크로마토그래피" 는, 관심의 용질 또는 분석물질 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 이 혼합물 중 용질 불순물 또는 오염물질보다 더 많이 또는 더 적게 대전된 화합물과 비특이적으로 상호작용하도록, 관심의 용질 또는 분석물질 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 이 혼합물에서 고체상 이온 교환 재료에 연결된 (예컨대 공유 부착에 의함) 대전 화합물과 상호작용하는 크로마토그래피 공정을 말한다. 혼합물 중 오염 용질은 관심의 용질보다 더 빠르게 또는 더 느리게 이온 교환 재료의 컬럼으로부터 용리되거나 또는 관심의 용질에 대해 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다. "이온 교환 크로마토그래피" 에는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피가 포함된다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 에 결합한 후 용리 (양이온 교환 결합 및 용리 크로마토그래피 또는 "CIEX") 될 수 있고 또는 표적 분자가 컬럼 (양이온 교환 관류 크로마토그래피 FT-CIEX) 을 "관류" 하는 동안 불순물에 확실히 결합할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 에 결합한 후 용리될 수 있고 또는 표적 분자가 컬럼을 "관류" 하는 동안 불순물에 확실히 결합할 수 있다. 일부 구현예에서 그리고 본원에 언급된 실시예에서 입증되듯이, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 관류 모드로 수행된다.
구절 "이온 교환 매트릭스" 는 음전하를 띠거나 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양전하를 띠는 (즉, 음이온 교환 수지) 크로마토그래피 매트릭스를 말한다. 예를 들어, 공유 연결에 의해 하나 이상의 대전된 리간드를 매트릭스에 부착함으로써 전하가 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 전하는 매트릭스의 고유 특성 (예를 들어, 실리카의 경우, 전체적인 음전하를 가짐) 일 수 있다.
"양이온 교환 매트릭스" 는, 음전하를 띠고 고체상을 통하여 또는 위로 통과하는 수용액 중 양이온과 교환을 위해 유리 양이온을 가지는 크로마토그래피 매트릭스를 말한다. 양이온 교환 수지를 형성하도록 고체상에 부착되는 음전하 리간드는, 예를 들어, 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지는 아가로스에 고정된 카르복시-메틸-셀룰로오스, 술포프로필 (SP) (예를 들어, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, Pharmacia 사제) 및 아가로스에 고정된 술포닐 (예를 들어, S-SEPHAROSE FAST FLOW™, Pharmacia 사제) 을 포함한다. Fractogel® EMD SO3, Fractogel® EMD SE Highcap, Eshmuno ® S 및 Fractogel ® EMD COO (Merck) 가 바람직하다.
"혼합 모드 이온 교환 매트릭스" 는, 양이온 및/또는 음이온 및 소수성 모이어티와 공유결합으로 변경된 크로마토그래피 매트릭스를 말한다. 시판되는 혼합 모드 이온 교환 수지는 약한 양이온 교환기, 낮은 농도의 음이온 교환기, 및 실리카 겔 고체상 지지 매트릭스에 부착된 소수성 리간드를 함유한 BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) 이다. 혼합 모드 양이온 교환 재료는 전형적으로 양이온 교환기 및 소수성 모이어티를 갖는다. 적합한 혼합 모드 양이온 교환 재료는 Capto® MMC (GE Healthcare) 및 Eshmuno ® HCX (Merck) 이다.
혼합 모드 양이온 교환 재료는 전형적으로 음이온 교환기 및 소수성 모이어티를 갖는다. 적합한 혼합 모드 음이온 교환 재료는 Capto ® Adhere (GE Healthcare) 이다.
용어 "음이온 교환 매트릭스" 는, 예를 들어, 4 차 아미노기와 같은 하나 이상의 양전하 리간드가 부착된, 양전하를 띠는 크로마토그래피 매트릭스를 말하기 위해서 본원에서 사용된다. 시판되는 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEX™ 및 FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia) 를 포함한다. 바람직한 재료는 Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno ® Q 및 Fractogel® EMD DEAE 이다.
용어 "단백질 A" 및 "Prot A" 는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 천연 (native) 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 (예컨대, 펩티드 합성 또는 재조합 기법에 의해) 생성된 단백질 A, 및 Fc 영역과 같은 CH2/CH3 영역을 가지는 단백질을 결합할 수 있는 능력을 보유하는 변이체를 포함한다. 단백질 A 는 Repligen, Pharmacia 및 Fermatech 로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 단백질 A 는 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스에 고정된다. 용어 "ProA" 는 또한 친화성 크로마토그래피 매트릭스 또는 단백질 A 가 공유결합으로 부착된 크로마토그래피 고체 지지체 매트릭스를 함유하는 컬럼을 말한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 단백질 A 의 기능성 유도체, 단편 또는 변이체는 마우스 IgG2a 또는 인간 IgGl 의 Fc 영역에 대해 적어도 K=IO"8M, 바람직하게 K=IO"9M 의 결합 상수를 특징으로 할 수 있다. 결합 상수에 대한 이런 값에 부합하는 상호작용은 본문에서 "고 친화성 결합" 으로 칭한다. 바람직하게는, 단백질 A 의 이러한 기능성 유도체 또는 변이체는 IgG 결합 기능성을 보유하는 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 상기 천연 도메인의 조작된 돌연변이체로부터 선택되는, 야생형 단백질 A 의 기능성 IgG 결합 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
또한, 단일 지점 부착을 허용하도록 조작된 단백질 A 유도체 또는 변이체는 주장된 방법에서 친화성 크로마토그래피 단계에 또한 사용될 수 있다.
일반적으로, 단일 지점 부착은, 단일 공유 결합을 통하여 단백질 모이어티가 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지체 물질에 부착되는 것을 의미한다. 이런 단일 지점 부착은, 또한 단백질 접힘의 외주연에서 N- 또는 C-말단 또는 그 밖의 위치 등에 가깝게, 즉 루프에서, 노출된 아미노산 위치에 배치된 적합한 반응성 잔기의 사용에 의해 또한 발생할 수도 있다. 적합한 반응기로는 예를 들어, 술프히드릴 또는 아미노 관능기가 있다.
용어 "친화성 크로마토그래피 매트릭스" 는 친화성 크로마토그래피에 적합한 리간드를 지닌 크로마토그래피 매트릭스를 지칭하기 위해서 본원에 사용된다. 전형적으로, 리간드 (예를 들어, 단백질 A 또는 이의 기능성 변이체) 는 크로마토그래피 매트릭스 재료에 공유결합으로 부착되고 용액이 크로마토그래피 매트릭스에 접촉함에 따라 용액 중 표적 분자에 접근가능하다. 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 한 가지 예는 단백질 A 매트릭스이다.
친화성 크로마토그래피 매트릭스는 전형적으로 항원/항체 또는 효소/수용체 결합과 같은 좌물쇠/열쇠 메카니즘에 근거하여 높은 특이성을 가지고 표적 분자에 결합한다.
친화성 매트릭스의 예는 단백질 A 리간드를 가진 매트릭스, 예컨대 Protein A SEPHAROSE™ 또는 PROSEP®-A 이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 와 매트릭스에 부착된 리간드 (예를 들어, 고체상 매트릭스 또는 수지에 결합된 단백질 A) 사이의 상호작용을 설명하는 용어 "결합" 은, 일반적으로 결합 부위에서 정전력, 수소 결합, 소수력, 및/또는 반데르발스 힘으로 연결된 결합 부위에서의, 예를 들어 단백질 및 리간드 구조의 공간 상보성의 조합된 효과를 통한 리간드에 대한 표적 분자의 가역 결합을 말한다. 일반적으로, 공간 상보성이 더 클수록 그리고 결합 부위에서 다른 힘이 더 강할수록, 각각의 리간드에 대한 단백질의 결합 특이성이 더 클 것이다. 특이적 결합의 비제한적인 예는 항체-항원 결합, 효소-기질 결합, 효소-조인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 이상적으로, 친화성 크로마토그래피에서 유리 용액에서 약 10"4 ~ 10"8 M 의 친화성을 가지고 특이적 결합이 발생한다.
용어 "세제" 는, 이온 및 비이온 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어, 폴록사머 188); Triton; 도데실 황산나트륨 (SDS); 나트륨 라우릴 술페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카마이도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQU AT™ 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.) 를 지칭한다. 유용한 세제로는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (TWEEN 20®.) 또는 폴리소르베이트 80 (TWEEN 80®.) 또는 다양한 산, 예컨대 옥탄산이 있다.
"완충액" 은 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의한 pH 변화에 저항하는 용액이다. 완충액의 원하는 pH 에 따라, 이용될 수 있는 다양한 완충액이 예를 들어 문헌 [Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)] 에 기재된다. 완충액의 비제한적인 예로는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충액 뿐 아니라 이들의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "완충액" 또는 "용매" 는 분리 유닛을 로딩, 세정, 용리 및 재평형화하는데 사용되는 임의의 액체 조성물에 대해 사용된다.
분리 컬럼에 "로딩" 할 때 완충액은 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 친화성 컬럼 또는 이온 교환 컬럼) 상에 로딩하는데 사용된다. 완충액은 이상적으로 모든 불순물이 결합되지 않고 컬럼을 관류하는 동안 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되도록 하는 전도성 및/또는 pH 를 갖는다.
표적 분자를 "관류" 하도록 분리 유닛에 "로딩" 할 때, 완충액은 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 표적 단백질) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 친화성 컬럼 또는 이온 교환 컬럼) 에 로딩하는데 사용된다. 완충액은 이상적으로 모든 불순물이 컬럼에 결합되는 동안 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않고 컬럼을 관류도록 하는 전도성 및/또는 pH 를 갖는다.
용어 "재평형화" 는 표적 분자를 로딩하기 전 크로마토그래피 매트릭스를 재평형화하는 완충액의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 로딩 완충액은 재평형화를 위해 사용된다.
크로마토그래피 매트릭스를 "세정" 한다는 것은, 매트릭스를 통해 또는 그 위로 적절한 액체, 예를 들어 완충액을 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로 세정은 표적 분자를 용리하기 전 매트릭스로부터 약하게 결합된 오염물질을 제거하는데 및/또는 로딩 후 비-결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 제거하는데 사용된다.
이 경우에, 전형적으로, 세정 완충액 및 로딩 완충액은 동일하다. 바이러스 불활성화 완충액이 사용되는 경우, 이것은 표적 분자를 용리하기 전에 특정한 존재하는 바이러스를 불활성화하는데 사용된다. 이 경우에, 전형적으로, 바이러스 불활성화 완충액은 이것이 세제(들)를 함유할 수도 있고 또는 상이한 특성 (pH/전도성/염 및 이의 양) 을 가질 수도 있으므로 로딩 완충액과 상이하다.
크로마토그래피 매트릭스로부터 분자 (예를 들어, 관심의 폴리펩티드 또는 불순물) 를 "용리" 한다는 것은, 완충액이 크로마토그래피 수지 상의 리간드 부위에 대해 관심의 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 바꾸어줌으로써 크로마토그래피 매트릭스로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 비제한적인 예로는, 완충액이 이온 교환 재료 상의 대전된 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 이온 교환 재료를 둘러싸는 완충액의 이온 강도를 바꾸어줌으로써 이온 교환 수지로부터 분자를 용리하는 것이다.
본 발명에 따르면, "분리 유닛" 은 크로마토그래피 분리 단계가 수행될 수 있는 장비이다. 분리 유닛은 전형적으로 흡수제 매트릭스로 충전되는 크로마토그래피 컬럼 또는 크로마토그래피 카트리지이다. 크로마토그래피 컬럼은 당업자에게 공지되어 있다. 크로마토그래피 컬럼은 전형적으로 유체-입구 및 유체-출구를 위한 말단 피팅 (end-fittings) 을 구비한 컬럼 튜브를 포함한다. 컬럼 튜브는 적합한 크로마토그래피 매트릭스로 충전된다.
본 발명에 따르면, "연속" 공정은 배치 모드로 가동되지 않는 공정이다. 본 발명에 따른 연속 공정에서, 새로운 샘플은 사이에 임의의 중단 없이 하나 이상의 분리 유닛 상에 연속적으로 로딩된다. 본 발명에 따른 연속 공정에서, 공급물은 절대 중단되지 않는다.
본 발명에 따르면, "반 연속 공정" 은 공급물이 순차적 방식에서 적어도 1 회, 전형적으로 수 회 중단되는 공정이다.
본 발명에 따르면, "순차적" 은 2 회 또는 2 회 초과이다.
본 발명에 따르면, "연결 라인" 은 그곳을 통과하는 흐르는 액체에 대해 적합한 임의의 튜브, 호스, 파이프 또는 채널이다. 연결 라인은 하나 이상의 밸브에 의해 중단될 수 있다. 연결 라인은 직선형 또는 분지형일 것이다.
본 발명에 따르면, 장치의 두 부품이 "유체 연결" 되어 있다면, 그것은 액체가 하나의 부품으로부터 다른 부품으로 유동할 수 있도록 장치의 두 부품 사이에 연결 라인이 있음을 의미한다. 상기 연결 라인은 직접적일 수 있거나 또는 이것은 하나 이상의 밸브, 분리 유닛 또는 장치의 다른 부품에 의해 중단될 수 있다. 용어 "유체 연결" 은 영구적인 유체 연결을 포함하지만 그것은 또한 영구적이지는 않지만 연결 라인을 통한 액체의 유동이 필요할 때마다 개시되고 정지될 수 있도록 예를 들어 하나 이상의 밸브에 의해 중단되는 연결 라인으로 만들어진 유체 연결을 포함한다. 전형적으로, 유체 연결되는 장치 부품의 대부분은 영구적이지 않은 유체 연결을 갖는다. 예를 들어, 완충액 저장소가 분리 유닛과 유체 연결되어 있다면 이것은 컬럼으로 완충액의 유동이 필요하다면 실현될 수 있지만 전형적으로 필요할 때 액체 유동이 정지될 수 있고 필요할 때 개시될 수 있도록 저장소와 분리 유닛 사이의 연결 라인에 하나 이상의 밸브가 위치해 있음을 의미한다.
액체 연결되는 장치의 두 부품 사이에서 액체 유동이 실제로 실현되어서 두 부품 사이의 연결 라인을 통하여 액체가 유동하고 있다면, 이 두 부품은 "유체 소통" 된다. 그 결과, 본 발명에 따른 "유체 소통" 은, 연결 라인을 통해 액체를 유동시킴으로써 "유체 연결" 이 실제로 사용되는 상태를 설명한다. 시스템의 두 부품이 부분적으로 유체 소통된다면 그것은 유체 소통이 영구적이지 않고 액체가 하나의 부품으로부터 다른 부품으로 영구히 유동하지 않고 시간 중 단지 일부동안 유동하는 것을 의미한다. 전형적으로, 시스템의 두 부품 사이에서 액체의 유동은 액체 유동을 지시하는 밸브의 보조로 개시 및/또는 정지된다.
"유체 입구" 또는 "입구" 는 액체 도입을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 분리 유닛 입구는, 예를 들어, 연결 라인이 연결될 수 있는 크로마토그래피 컬럼의 말단 피팅이다. 입구는 또한 연결 라인 내에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 입구는 또한 연결 라인의 말단일 수 있다.
"출구" 또는 "유체 출구" 는 액체의 배출을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 분리 유닛 출구는, 예를 들어, 연결 라인이 연결될 수 있는 크로마토그래피 컬럼의 말단 피팅이다. 출구는 또한 연결 라인 내에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 출구는 또한 연결 라인의 말단일 수 있다.
"유체 선택 밸브" 는 임의의 연결된 유체 및 시스템 부품간 선택적으로 유체 소통을 가능하게 하는 임의의 수단이다. 유체 선택 밸브는, 예를 들어, 분리 유닛 입구 앞의 밸브이고, 선택된 라인과 분리 유닛 입구 사이의 유체 소통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다. 유체 선택 밸브는, 예를 들어, 분리 유닛 출구 뒤의 밸브이고, 선택된 라인과 분리 유닛 출구 사이의 유체 소통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다. 유체 선택 밸브는 또한 연결 라인 내에 액체의 도입을 제공하는 밸브일 수 있다. 유체 선택 밸브는 또한 연결 라인의 말단일 수 있다.
"용매 선택 밸브" 는, 임의의 연결된 용매 저장소와 시스템 부품 사이에 선택적으로 유체 소통을 가능하게 하는 유체 선택 밸브이다. 용매 선택 밸브는, 예를 들어, 용매 펌프 앞의 밸브이고, 선택된 용매와 펌프 사이에 유체 소통을 가능하게 할 수 있는 연결 라인이 용매 저장소로부터 상기 밸브에 연결될 수 있고 선택적으로 정해질 수 있다.
"유체 선택 밸브" 와 "용매 선택 밸브" 는 동일한 유형 또는 상이한 유형일 수 있다.
용매 전달 시스템은 액체의 전달을 가능하게 하는 시스템이다. 전형적으로, 장치의 용매 전달 시스템은 하나 이상의 저장소, 및 저장소로부터 저장소와 액체 연결되는 장치의 또다른 부품까지 액체를 수송하는 하나 이상의 펌프를 포함한다. 액체가 저장소로부터 분리 유닛에 이송될 때마다 이것은 펌프의 보조로 수행된다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 펌프는 2 개 이상의 저장소로부터 유래하는 2 개 이상의 액체 스트림을 혼합하는데 또한 사용될 수 있다.
용어 "공급물" 은 분리되어야 하는 2 개 이상의 화합물을 함유하는 액체를 말한다. 본 문맥에서, 용어 "화합물" 은 넓은 의미에서 임의의 실체, 예컨대 분자, 화학적 화합물, 세포 등에 대해 사용된다. 전형적으로는, 공급물은 표적 분자를 함유하는 샘플이다.
용어 "관류 (break-through)" 는 크로마토그래피 매트릭스 또는 분리 유닛, 예컨대 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 대한 공급물 첨가 동안 매트릭스 상에 흡착된 화합물이 처음 유출에 나타나는 시점을 의미한다. 다른 말로는, "관류" 는 표적 화합물의 손실이 시작되는 시점이다.
용어 "재생" 은 본원에서 크로마토그래피 매트릭스를 크로마토그래피에서 다시 사용할 수 있게 만드는 크로마토그래피 매트릭스의 처리 공정을 의미한다. 따라서, "재생" 은 결합된 화합물의 방출 (또한 화합물의 용리라고도 알려짐) 뿐 아니라, 적절한 흡착 완충액으로의 재-평형을 포함할 것이다. 하기에 논의될 바와 같이, "재생" 은 또한 제자리 세척 (CIP) 을 포함할 수 있다.
용어 "흐름 프로그래밍" 은 크로마토그래피 컬럼에 대한 공급물의 적용 동안 공급물 유속의 의도적인 변화를 의미한다.
용어 "포획" 은 크로마토그래피 방법의 문맥에서 다량의 표적 화합물이 포획되는 첫번째 크로마토그래피 단계를 의미한다.
"완전한 결합" 은 크로마토그래피 매트릭스가 예를 들어, 패킹된 크로마토그래피 컬럼에서 제시된 조건 하에서 좀더 흡착할 수 없는 많은 표적 화합물을 흡착시키는 시점을 의미한다. 전형적으로는, 완전한 결합은 매트릭스가 상응하는 정적 결합력 측정 동안 추정된 이의 본래 용량의 60% 초과를 흡수하는 경우 도달한다.
로딩 시간은 흡착제 예컨대 패킹된 크로마토그래피 컬럼을 이의 "완전 결합" 상태로 포화시키는데 필요한 시간을 의미한다.
용어 "평균 입자 크기 직경" 또는 d50 은 누적 입자 크기 분포의 50% 에서의 평균 입자 크기 분포 값을 의미한다.
용어 "평균 공극 크기" 는 누적 공극 크기 분포의 50% 에서의 평균 공극 크기 분포 값을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정화하다," "정화," 및 "정화 단계" 는 현탁된 입자 및 또는 콜로이드를 제거하여, NTU (비탁분석 탁도 단위) 에서 측정된 바와 같이, 표적 분자 함유 용액의 탁도를 감소하기 위한 공정 단계를 말한다. 정화는 원심분리, 침강 또는 여과를 포함하는 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리는 배치 또는 연속 모드로 수행될 수 있을 것인 반면, 여과는 정상 흐름 (예를 들어, 심층 여과) 또는 접선 흐름 모드로 수행될 수 있을 것이다. 오늘날 업계에서 사용되는 공정에서, 원심분리는 전형적으로 원심분리에 의해 제거되지 않을 수 있는 불용성 불순물을 제거하기 위해 의도되는 심층 필터가 후속된다. 게다가, 정화 효율의 향상 방법은 예를 들어 침전이 사용될 수 있다. 불순물의 침전은 응집, pH 조정 (산 침전), 온도 이동, 자극-반응성 중합체 또는 소형 분자로 인한 상 변화, 또는 상기 방법의 임의의 조합과 같은 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 정화에는 원심분리, 여과, 심층 여과 및 침전 중 2 가지 이상의 임의의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 공정 및 시스템은 원심분리에 대한 필요성을 배제한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "침전하다," 침전하는" 또는 "침전" 은, 바람직하지 않은 불순물의 특성이, 예를 들어, 화합물의 침전을 가용성 상태에서 비-가용성 상태로 야기함으로써 또는 용액으로부터 미분자를 교착 및/또는 응집하여 이들의 침강 및/또는 여과 및/또는 원심분리가 개선되고 따라서 탁도 감소에 도달함으로써, 가용성 표적 분자로부터 더욱 쉽게 분리될 수 있도록 개질되는, 정화에서 사용되는 공정을 말한다. 이것은 전형적으로 원치않는 불순물을 함유하는 큰 응집 입자 및/또는 불용성 복합체를 형성함으로써 달성된다. 상기 입자는 예컨대 여과 또는 원심분리에 의해 가용성 표적 분자를 함유하는 액상으로부터 더욱 쉽게 분리될 수 있는 특성 (예를 들어, 밀도 또는 크기) 을 갖는다. 일부 경우에서, 원치않는 불순물이 가용성 표적 분자로부터 더욱 쉽게 분리될 수 있도록 상 변화가 발휘된다. 상 변화에 의한 침전은 침전제, 예컨대 중합체 또는 소형 분자의 첨가에 의해 발휘될 수 있다. 특정 구현예에서, 침전제는 자극 반응성 중합체 (또한 스마트 중합체로서 언급됨) 이다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 침전제는 응집제이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 응집은 성능이 사용되는 응집제 농도에 전형적으로 의존되는 ("용량 의존적") 침전을 수행하는 하나의 방식이다. 전형적인 응집제는 반대 전하의 불순물과 복합체를 이루는 고분자전해질, 예컨대 폴리양이온이다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 정화는 표적 분자 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 샘플에 대한 침전제의 첨가를 사용한다. 일부 경우에서, 용액 조건 (예컨대 온도, pH, 염분) 의 변화는 자극 반응성 중합체의 경우와 같이, 침전을 개시하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 불순물 뿐 아니라 침전제를 함유하는 침전된 물질을 제거하여 액상 내의 표적 분자를 제거하며, 여기서 액체는 이후 전형적으로 표적 분자를 추가로 정제하기 위해 추가의 공정 단계에 적용된다.
침전은 정제하고자 하는 표적 분자를 발현하는 세포 배양물을 함유하는 생물반응기에서 직접 수행될 수 있고, 침전제가 생물반응기에 직접 첨가된다. 대안적으로는, 침전제는 분리된 용기에서, 표적 분자를 전형적으로 함유하는 세포 배양물에 첨가될 수 있다.
침전된 물질을 제거하는 당업자에게 공지된 많은 방식 (예컨대 원심분리, 여과 또는 침강 또는 이의 임의의 조합) 이 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "침강" 은 침전된 물질이 중력의 영향 하에 용기의 바닥으로 움직이는 침강 공정을 말한다. 침강은 액상 또는 상청액의 상층분리 및/또는 여과가 후속될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "자극(들)" 은 자극 반응성 중합체에 의해 반응을 야기하는 환경에서 물리적 또는 화학적 변화를 말하는 것으로 의미한다. 따라서, 이러한 중합체는 자극에 반응성이고 이러한 자극은 중합체의 가용성의 변화를 야기한다. 본원에서 사용되는 하나 이상의 중합체가 반응성인 자극의 예에는 예를 들어, 온도의 변화, 전도성의 변화 및/또는 pH 의 변화가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 자극은 샘플에 대한 착화제 또는 착물 형성 염의 첨가를 포함한다. 다양한 구현예에서, 자극은 일반적으로 샘플에 대한 중합체의 첨가 후에 첨가된다. 그러나, 자극은 또한 샘플에 대한 중합체의 첨가 동안 또는 전에 첨가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "자극 반응성 중합체" 는 자극의 첨가 후 물리적 및/또는 화학적 특성의 변화를 나타내는 중합체 또는 공중합체를 말한다. 전형적인 자극 반응은 중합체의 가용성에서의 변화이다. 예를 들어, 중합체 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 는 약 35℃ 미만의 온도에서 수용성이나, 약 35℃ 의 온도에서는 물에 불용성이된다. 특정 구현예에서, 자극 반응성 중합체는 다가 이온 자극 (예를 들어, 포스페이트 자극) 에 대해 반응성인 폴리알릴아민 또는 폴리비닐아민 중합체이다.
일부 구현예에서, 세포 배양물을 심층 필터에 적용하여 하나 이상의 불순물을 제거한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "심층 필터" 또는 "심층 여과" 는 단지 필터 표면 상 보다는, 필터 매질을 통해 입자 물질을 보유할 수 있는 필터를 말한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 하나 이상의 심층 필터가 정화 공정 단계에 사용된다.
일부 구현예에서, 정화는 차후 정제 공정에서 공정 단계에 서용되는 필터 또는 장치의 오염을 야기할 수 있는 샘플 내 가용성 및/또는 불용성 불순물의 제거를 야기하여, 전반적인 정제 공정을 더욱 경제적으로 만든다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "관류 공정", "관류 모드", 및 "관류 작업" 은 하나 이상의 불순물과 함께 생물약학 제제 내에 함유된 하나 이상의 표적 분자 (예를 들어, Fc-영역 함유 단백질 또는 항체) 가, 표적 분자는 통상 결합하지 않는 (즉, 관류하는) 하나 이상의 불순물에 보통 결합하는 물질을 관류하는 것으로 의도되는 분리 기법을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 공정" 은 샘플 내에 함유된 하나 이상의 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 가 적합한 수지 또는 매질 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 매질 또는 양이온 교환 크로마토그래피 매질) 에 결합하고 이어서 용리되는 분리 기법을 말한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 처음으로 낮은 잔류 시간에 높은 결합력을 유지하게 하는 연속 크로마토그래피 공정 방법을 제공한다.
그러므로 이것은 2 초과의 인자에 의해 명명된 단계의 생산성을 보통 증가시키는, 빠를 뿐 아니라, 또한 경제적인 정제 (포획) 기술이다. 본 출원인의 신규하고, 진보적인 방법론에서, 생산성 (g (표적 분자)/ ml (패킹된 층)/ h (생산 시간) 은 보통, 배치 공정의 생산성보다 6-10 큰 범위이다.
방법
본 발명에 따른 방법은 특정 유형의 크로마토그래피 매트릭스와 특정 유형의 연속 크로마토그래피 공정의 조합에 기반한다.
본 발명에 따른 방법에서 사용하고자 하는 크로마토그래피 매트릭스는 입자 흡착제이다. 평균 흡착제 입자 크기 (d50) 는 30 내지 200 ㎛ 이다. 공극은 40 nm 내지 300 nm 의 평균 공극 크기를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 입자의 평균 크기는 40 내지 120 ㎛, 더욱 바람직하게는 55 내지 100 ㎛ 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 입자는 50 내지 150 nm, 가장 바람직하게는 60 내지 100 nm 범위의 평균 공극 크기의 공극를 갖는다.
평균 공극 크기 값 및 평균 입자 크기 값은 집단의 절반이 상기 지점 초과에 있고 절반이 상기 지점 미만에 있는 값으로서 정의된다. 입자 크기 분포에 대해 평균 공극 크기는 d50 로 불린다.
d50 은 상기 직경 초과에 절반 및 미만에 절반의 분포로 분할된 크기 (미크론) 이다. D50 은 누적 크기 분포의 50% 에 상응한다.
입자 크기 추정을 위한 표준 방법은 이미지화 및 이미지 분석, 광 산란 기술, 체질 기술, 침강 기술, 음향 분광학 기술 및 기타일 수 있다 (K.K. Unger et al. "Particled packed columns and monolithic columns in high-performance liquid chromatography - comparison and critical appraisal" J. Chrom. A. 1184 (2008) 393 - 415). 평균 입자 직경 값 추정을 위해 제시된 사용된 특징화 방법은 광 산란이었다. 본 발명에 따르면, 레이저 회절이 30 nm 이상의 직경을 가진 입자에 대해 사용되고, 단일-입자 광학 감지 (SPOS) 가 0.5 nm 내지 400 nm 의 직경을 가진 입자에 대해 사용된다.
공극 크기는 역 크기 배제 크로마토그래피, 수은 압입, 기체 흡착 기술 등에 의해 측정될 수 있다 (M. Thommes et al., "Textural characterization of native and n-alky-bonded silica monoliths by mercury intrusion/extrusion, inverse size exclusion chromatography and nitrogen sorption", J. Chrom. A, 2008).
공극 부피는 공극 크기 추정에 사용되는, 동일한 방법에 의해 추정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 평균 공극 크기 추정 및 평균 공극 부피 추정을 위해 역 크기 배제 크로마토그래피가 매트릭스가 건조될 때 이들의 물리적 특성이 변하면서 건조 상태에서 측정될 수 없는 매트릭스에 대해 사용된다. 건조 상태에서 측정될 수 있는 매트릭스의 경우, 질소 흡착 방법이 사용된다.
입자는 규칙적으로 또는 불규칙적으로 형성될 수 있다. 이들은 크로마토그래피 흡착제로서 적합한 임의의 물질, 예컨대 다당류 (예컨대 아가로오스 및 셀룰로오스); 및 기타 역학적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어, 조절 공극 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 세라믹 입자 또는 친수성적으로 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합체, 예컨대 1,2-에탄디올 모노비닐 에테르, 1,3-프로판디올 모노비닐 에테르, 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 1,6-헥산디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 가교제, 예컨대 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 또는 디비닐프로필렌우레아 (1,3-디비닐테트라히드로피리미딘-2-온) 및 상기 임의의 것의 유도체로 구성될 수 있다. 친수성적으로 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합체의 예는 EP 1910433 에 기재되어 있다. 바람직한 것은 1000 cm/h 초과의 속도가 적용될 수 있도록 높은 강성을 보이는 물질이다.
본 발명에 따른 방법이 바람직하게는 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피에 근거하기 때문에, 크로마토그래피 매트릭스로서 사용하고자 하는 입자는 전형적으로 친화성 리간드, 예컨대 단백질 A 또는 이의 기능적 변이체 또는 이온 교환 리간드를 갖는다.
본 발명에 따른 방법은 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛으로부터 후속 유닛으로 그리고 최종 유닛에서 첫번째 분리 유닛으로 적어도 흐를수 있게 하는, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛의 사용에 기반한다. 이것은, 시스템의 모든 분리 유닛이 원형으로 연결된다는 것을 의미한다 (도 1).
본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하는, 동일한 매트릭스, 바람직하게는 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛을 제공하는 단계;
b) 샘플을 첫번째 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 분리 유닛에 결합하도록 하는 pH 및 전도성에 있음), 상기 분리 유닛이 다음 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 첫번째 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 용리하는 (도 2c) 그리고 재평형화하는 (도 2e) 동시에, 다음 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 (도 2a) 단계. 이것은 크로마토그래피 분리 공정에 필요한 세정, 용리 및 재평형화와 같은 다른 공정 단계가 로딩되고 있는 분리 유닛(들) 과 유체 소통 중이지 않은 상기 분리 유닛 중 하나 이상 상에서 수행된다는 것을 의미한다.
c) 공급물을 다음 분리 유닛으로 전환시키는 단계. 이것은 방금 로딩되었던 분리 유닛이 완전히 로딩되었을 때, 상기 분리 유닛에 대한 샘플 공급이 중단되고, 원형 내 다음에 있는 분리 유닛에 대해 지시된 개입 없이 시스템의 밸브의 동시 취급에 의한 것임을 의미한다 (도 3b). 원형 내 다음에 있는 분리 유닛은 로딩되었던 분리 유닛의 출구에 연결된 로딩 시간의 적어도 일부 전에 있던 유닛이다. 따라서, 상기 분리 유닛은 첫번째 분리 유닛에 결합되지 않은 상기 표적 분자에 의해 이미 부분적으로 로딩된다.
d) 샘플을 다음 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 다음 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 다음 분리 유닛에 결합하도록 하는 pH 및 전도성에 있음), 상기 다음 분리 유닛이 다음 이후 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 다음 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 용리하는 그리고 재평형화하는 동시에, 다음 이후 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 단계
e) 상기 단계 c) 및 d) 를 1 회 이상 반복하는 단계.
본 발명에 따른 연속 방법이 수행되는 시간 동안, 공급물은 절대 중단되지 않으며, 800 cm/h 초과의 속도를 갖는다. 바람직하게는 이것은 1000 cm/h 초과의 속도를 갖는다.
그리고 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스는 30 내지 200 ㎛ 의 평균 입자 직경 및 40 nm 내지 300 nm 의 범위의 평균 공극 직경을 갖는 입자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 부가적인 세정 단계가 분리 유닛으로부터 오염물질을 세정하기 위해 수행될 수 있다 (도 2b).
바람직한 구현예에서, 세정은 2 개 이상의 상이한 세정 완충액을 이용해서 2 가지 이상의 단계에서 수행된다. 예를 들어, 첫번째 세정 완충액으로의 첫번째 세정 단계는 분리 유닛으로부터 미결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 세정하기 위해 사용될 수 있고 (도 2a), 두번째 세정 완충액을 사용하는 두번째 세정 단계는 분리 유닛으로부터 오염물질을 세정하기 위해 사용될 수 있다 (도 2b).
바람직한 구현예에서, 통상 세정상 동안 미결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 함유하는 용액은 공급원료 용액에 또는 전담 출구에 재전송될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 통상 세정상 동안 미결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 함유하는 용액은 또다른 분리 유닛에 재전송될 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에서, 제자리 세척은 결합된 표적 분자의 용리 후 재평형화 단계 전에 수행된다 (도 2d).
또다른 바람직한 구현예에서, 단일 용매 전달 시스템이 공급물 전달을 위해 전담화될 수 있다 (도 4).
바람직한 구현예에서, 표적 분자로 로딩되는 분리 유닛은 제시된 조건에서 최대로 로딩되며, 이것은 완전한 결합까지 로딩된다는 것을 의미한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 표적 분자로 로딩되는 분리 유닛은 또다른 분리 유닛과 유체 소통 중인 전체 로딩 시간을 넘는다.
또다른 구현예에서, 로딩되는 분리 유닛은 또다른 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 오직 일부이다. 바람직한 구현예에서, 상기 2 개의 분리 유닛은 로딩 시간의 후반의 전부 또는 일부 동안 오직 유체 소통 중에 있다. 이것은 로딩이 시작될 때, 전형적으로 모든 표적 분자가 로딩되는 분리 유닛에 결합된다는 사실 때문이다. 오직 상기 분리 유닛이 이미 부분적으로 로딩될 때, 표적 분자가 결합하지 않고 분리 유닛을 통과하는 일이 생길 수 있다. 배치 크로마토그래피에서 전형적으로, 로딩은 너무 많은 표적 분자들이 분리 유닛을 통과하기 시작할 때 중지된다. 본 발명에 따른 방법에서, 적어도 상기 로딩의 최종상 동안 표적 분자가 결합되지 않고 분리 유닛을 통과하기 시작될 때, 상기 분리 유닛의 출구는 또다른 분리 유닛의 입구와 연결되어 첫번째 분리 유닛에 결합되지 않은 표적 분자가 두번째 분리 유닛에 결합되도록 한다. 당업자는 로딩 동안 로딩되는 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자의 양이 상기 분리 유닛의 출구가 또다른 분리 유닛의 입구에 연결될 필요가 있을만큼 많아지는 때를 쉽게 결정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 세정되는 분리 유닛(들) 의 출구는 또다른 분리 유닛의 입구와 액체 소통 중에 있어, 상기 세정에 의해 제거되는 표적 분자가 상실되지 않으나 다른 분리 유닛 상에 로딩되도록 한다. 상기 접근법은 시스템이 4 개 이상의 분리 유닛을 포함하는 경우 특히 적합하다.
하나의 구현예에서, 세정되는 분리 유닛(들) 의 출구는 이전 분리 유닛과 액체 소통 중에 있어, 상기 세정에 의해 제거되는 표적 분자가 상실되지 않으나 이전 분리 유닛 상에 로딩되도록 한다.
하나의 구현예에서, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하는, 동일한 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 4 개 이상의 분리 유닛을 제공하는 단계;
b) 샘플을 첫번째 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 분리 유닛에 결합하도록 하는 pH 및 전도성에 있음), 상기 분리 유닛이 다음 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 첫번째 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 이전 분리 유닛과 액체 소통 중에 있는 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하여 상기 세정에 의해 제거되는 표적 분자가 상실되지 않으나 이전 분리 유닛 상에 로딩되도록 하는 (도 6a) 동시에, 다음 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 (도 5a) 단계. 이후 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 이어서 용리 (도 6c), 및 재평형화 (도 6e) 하는 단계. 이것은 크로마토그래피 분리 공정에 필요한 세정, 용리 및 재평형화와 같은 다른 공정 단계가 로딩되고 있는 분리 유닛(들) 과 유체 소통 중이지 않은 상기 분리 유닛 중 하나 이상 상에서 수행된다는 것을 의미한다.
c) 공급물을 다음 분리 유닛으로 전환시키는 단계. 이것은 방금 로딩되었던 분리 유닛이 완전히 로딩되었을 때, 상기 분리 유닛에 대한 샘플 공급이 중단되고, 원형 내 다음에 있는 분리 유닛에 대해 지시된 개입 없이 시스템의 밸브의 동시 취급에 의한 것임을 의미한다 (도 5b). 원형 내 다음에 있는 분리 유닛은 로딩되었던 분리 유닛의 출구에 연결된 로딩 시간의 적어도 일부 전에 있던 유닛이다. 따라서, 상기 분리 유닛은 첫번째 분리 유닛에 결합되지 않은 상기 표적 분자에 의해 이미 부분적으로 로딩된다.
d) 샘플을 다음 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 다음 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 다음 분리 유닛에 결합하도록 하는 pH 및 전도성에 있음), 상기 다음 분리 유닛이 다음 이후 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 첫번째 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 이전 분리 유닛과 액체 소통 중에 있는 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하여 상기 세정에 의해 제거되는 표적 분자가 상실되지 않으나 이전 분리 유닛 상에 로딩되도록 하는 동시에, 다음 이후 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 (도 6b) 단계. 이후 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 이어서 용리, 및 재평형화하는 단계. 이것은 크로마토그래피 분리 공정에 필요한 세정, 용리 및 재평형화와 같은 다른 공정 단계가 로딩되고 있는 분리 유닛(들) 과 유체 소통 중이지 않은 상기 분리 유닛 중 하나 이상 상에서 수행된다는 것을 의미한다.
e) 상기 단계 c) 및 d) 를 1 회 이상 반복하는 단계.
단계 b) 내지 e) 에서 상기 기재되고 도 6 에 설명된 공정은 또한 로딩을 위해 3 개의 분리 유닛을 연결함으로써 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어, 분리 유닛 1 이 로딩되는 경우, 이것이 분리 유닛 2 와 유체 소통 중에 있고, 분리 유닛 3 은 분리 유닛 2 와 유체 소통 중이나, 분리 유닛 1, 2 및 3 은 이 시간 동안 분리 유닛 4 와 유체 소통 중이지 않은 것을 의미한다. 분리 유닛 1, 2 및 3 이 유체 소통 중에 있고 로딩되는 경우, 분리 유닛 4 는 전형적으로 대기 모드에 있다. 당업자는 매트릭스의 유형, 샘플의 유형, 유속 등과 같은 특정 공정 파라미터에 근거하여, 로딩을 위해 3 개의 분리 유닛 또는 오직 2 개를 연결하는 것이 긍정적인 지를 결정할 수 있다. 도 1 은 하기 기재되는 연속 크로마토그래피 방법에 적합한, 3 개의 분리 유닛 시스템을 도식적으로 보여준다. 시스템은 용매 전달 시스템 (도 4 에 나타낸 바와 같이 2 개 이상), 3 개의 분리 유닛, 용매 전달 시스템과 분리 유닛 사이의 유체 소통 채널, 분리 유닛 입구 및 출구, 용매 흐름을 분리 유닛으로 그리고 분리 유닛으로부터 재지시하는 전환 밸브를 갖는다. 임의로 도 1 은 필요한 공정 단계 또는 부차-단계에 대해 필요한 용매를 선택하기 위한 용매 전달 시스템 이전의 용매 선택 밸브를 보여준다. 당업자는 선택되는 적용 및 그의 요구조건에 근거하여, 용매 전달 시스템의 유형, 분리 유닛 및 용매 흐름 조절 수단 등과 같은 특정 공정 파라미터에 근거하여 결정할 수 있다.
도 2a-e 는 3 개의 컬럼 시스템이 있는 본 발명에 따른 방법의 단계를 도식적으로 보여준다. 도 2a 에서 공급물은 분리 유닛 1 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 1 을 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 1 에 결합된다. 분리 유닛 1 의 출구는 분리 유닛 2 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 1 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 2 를 통과한다. 이것은 분리 유닛 1 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 2 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 2 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 1 및 2 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 3 은 예를 들어 세정 (도 2a 및 도 2b), 용리 (도 2c) 되고, 제자리 세척 (도 2d) 및 재평형화 (도 2e) 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 3 의 출구는 수집 탱크 또는 상기 세정에 의해 제거된 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결될 수 있다 (도 2a). 표적 분자가 분리 유닛 3 으로부터 용리된다면 분리 유닛 3 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 (도 2c 에서 "생성물" 로 표시됨) 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛 (도 2c 에 제시되지 않음) 에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 3 의 출구는 도 2b, 도 2d 및 도 2e 에 제시되는 바와 같은 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 3 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 도 2d 및 도 2e 에 제시되는 바와 같은 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
도 3b 에 제시되는 다음 단계에서, 공급물은 분리 유닛 2 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 2 를 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 2 에 결합된다. 분리 유닛 2 의 출구는 분리 유닛 3 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 2 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 3 을 통과한다. 이것은 분리 유닛 2 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 3 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 3 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 2 및 3 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 1 은 예를 들어 세정, 용리되고, 제자리 세척 및 재평형화 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 1 의 출구는 수집 탱크 또는 상기 세정에 의해 제거된 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결될 수 있다. 표적 분자가 분리 유닛 1 로부터 용리된다면 분리 유닛 1 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 1 의 출구는 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 1 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
도 3c 에 제시되는 다음 단계에서, 공급물은 분리 유닛 3 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 3 을 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 3 에 결합된다. 분리 유닛 3 의 출구는 분리 유닛 1 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 3 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 1 을 통과한다. 이것은 분리 유닛 3 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 1 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 1 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 3 및 1 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 2 는 예를 들어 세정, 용리되고, 제자리 세척 및 재평형화 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 2 의 출구는 수집 탱크 또는 상기 세정에 의해 제거된 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결될 수 있다. 표적 분자가 분리 유닛 2 로부터 용리된다면 분리 유닛 2 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 2 의 출구는 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 2 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
다음 단계에서, 공급물은 다시 분리 유닛 1 (도 3a) 로 전환되고, 도 2a-e 에 기재된 바와 같은 공정 단계가 다시 수행된다. 전형적으로, 공정 단계는 2 회 초과로 수행된다.
도 2a-e 및 도 3 a-c 에 제시된 공정의 기재로부터 볼수 있듯이, 공급물은 전혀 중단되지 않고 각각의 공정 단계에서 (하나의 공정 단계는 도 2a-e 에 제시됨), 표적 분자는 하나 이상의 분리 유닛으로부터 용리된다.
본 발명의 또다른 구현예에서 미결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 제거하기 위해 로딩된 분리 유닛을 세정하는데 사용되는 세정 액체는, 로딩된 분리 유닛으로부터 용리되는 경우, 선택된 시스템 출구가 아닌, 또다른 분리 유닛의 입구로 지시된다. 이것은 세정 동안 로딩된 분리 유닛으로부터 용리될 수 있는 표적 분자가 출구로 가지 않고 또다른 분리 유닛 상에 결합되는 것을 확실히 한다.
도 6a-e 는 4 개 컬럼 시스템이 있는 본 발명에 따른 방법의 단계를 도식적으로 보여준다. 도 6a 에서, 공급물은 분리 유닛 1 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 1 을 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 1 에 결합된다. 분리 유닛 1 의 출구는 분리 유닛 2 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 1 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 2 를 통과한다. 이것은 분리 유닛 1 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 2 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 2 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 1 및 2 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 4 는 예를 들어 세정 (도 6a 및 도 6b), 용리되고 (도 6c), 제자리 세척 (도 6d) 및 재평형화 (도 6e) 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 4 의 세정상 또는 세정상의 일부 동안, 분리 유닛 4 의 출구는 상기 세정에 의해 제거된, 그리고 분리 유닛 4 에 결합하지 않은 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 3 을 부가적으로 통과하는 분리 유닛 3 과 유체 소통 중에 있다. 이것은 분리 유닛 4 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 3 에 결합할 수 있게 한다 (도 6a). 부가적으로 분리 유닛 4 의 출구는 분리 유닛 3 의 입구와 (도 6a 에 제시되지 않음) 또는 분리 유닛 3 의 출구와 유체 소통 중에 있을 수 있다 (도 6a). 게다가, 분리 유닛 3 은 분리 유닛 2 와 유체 소통 중에 있을 수 있다 (도 6b-e). 표적 분자가 분리 유닛 4 로부터 용리된다면 분리 유닛 4 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 (도 6c 에서 "생성물" 로 표시됨) 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛 (도 6c 에 제시되지 않음) 에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 4 의 출구는 도 6b, 도 6d 및 도 6e 에 제시되는 바와 같은 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 4 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 도 4d 및 도 4e 에 제시되는 바와 같은 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
도 5b 에 제시되는 다음 단계에서, 공급물은 분리 유닛 2 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 2 를 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 2 에 결합된다. 분리 유닛 2 의 출구는 분리 유닛 3 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 2 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 3 을 통과한다. 이것은 분리 유닛 2 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 3 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 3 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 2 및 3 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 1 은 예를 들어 세정, 용리되고, 제자리 세척 및 재평형화 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 1 의 세정상 또는 세정상의 일부 동안, 분리 유닛 1 의 출구는 상기 세정에 의해 제거된, 그리고 분리 유닛 1 에 결합하지 않은 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 4 를 부가적으로 통과하는 분리 유닛 4 와 유체 소통 중에 있다. 이것은 분리 유닛 1 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 4 에 결합할 수 있게 한다. 부가적으로 분리 유닛 1 의 출구는 분리 유닛 4 의 입구와 또는 분리 유닛 4 의 출구와 유체 소통 중에 있을 수 있다. 게다가, 분리 유닛 4 는 분리 유닛 3 과 유체 소통 중에 있을 수 있다. 표적 분자가 분리 유닛 1 로부터 용리된다면 분리 유닛 1 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 1 의 출구는 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 1 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
도 5c 에 제시되는 다음 단계에서, 공급물은 분리 유닛 3 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 3 을 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 3 에 결합된다. 분리 유닛 3 의 출구는 분리 유닛 4 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 3 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 4 를 통과한다. 이것은 분리 유닛 3 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 4 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 4 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 3 및 4 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 2 는 예를 들어 세정, 용리되고, 제자리 세척 및 재평형화 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 2 의 세정상 또는 세정상의 일부 동안, 분리 유닛 2 의 출구는 상기 세정에 의해 제거된, 그리고 분리 유닛 2 에 결합하지 않은 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 1 을 부가적으로 통과하는 분리 유닛 1 과 유체 소통 중에 있다. 이것은 분리 유닛 2 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 1 에 결합할 수 있게 한다. 부가적으로 분리 유닛 2 의 출구는 분리 유닛 1 의 입구와 또는 분리 유닛 1 의 출구와 유체 소통 중에 있을 수 있다. 게다가, 분리 유닛 1 은 분리 유닛 4 와 유체 소통 중에 있을 수 있다. 표적 분자가 분리 유닛 2 로부터 용리된다면 분리 유닛 2 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 2 의 출구는 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 2 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
5d 에 제시되는 다음 단계에서, 공급물은 분리 유닛 4 의 입구로 전환되고, 분리 유닛 4 를 통해 흘러, 표적 분자의 적어도 일부가 분리 유닛 4 에 결합된다. 분리 유닛 4 의 출구는 분리 유닛 1 의 입구와 액체 소통 상태에 있어, 분리 유닛 4 에 결합되지 않은 공급물의 모든 부분이 부가적으로 분리 유닛 1 을 통과한다. 이것은 분리 유닛 4 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 1 에 결합할 수 있게 한다. 분리 유닛 1 의 출구가 폐기물에 연결된다. 분리 유닛 4 및 1 에 로딩하면서, 이전에 로딩되었던 분리 유닛 3 은 예를 들어 세정, 용리되고, 제자리 세척 및 재평형화 및 필요할 수 있고 로딩과는 상이한 모든 다른 공정 단계를 거친다. 분리 유닛 3 의 세정상 또는 세정상의 일부 동안, 분리 유닛 3 의 출구는 상기 세정에 의해 제거된, 그리고 분리 유닛 3 에 결합하지 않은 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 2 를 부가적으로 통과하는 분리 유닛 2 와 유체 소통 중에 있다. 이것은 분리 유닛 3 에 결합하지 않은 표적 분자가 분리 유닛 2 에 결합할 수 있게 한다. 부가적으로 분리 유닛 3 의 출구는 분리 유닛 2 의 입구와 또는 분리 유닛 2 의 출구와 유체 소통 중에 있을 수 있다. 게다가, 분리 유닛 2 는 분리 유닛 1 과 유체 소통 중에 있을 수 있다. 표적 분자가 분리 유닛 3 으로부터 용리된다면 분리 유닛 3 의 출구는 표적 분자 수집 탱크 또는 표적 분자가 추가로 프로세싱되는 또다른 유닛에 연결된다. 다른 공정 단계의 경우, 분리 유닛 3 의 출구는 출구 중 하나에 연결된다. 임의로, 분리 유닛 3 상의 제자리 세척 및 재평형화 단계는 역 흐름 모드를 수행할 수 있다.
다음 단계에서, 공급물은 다시 분리 유닛 1 (도 5a) 로 전환되고, 도 6a-e 에 기재된 바와 같은 공정 단계가 다시 수행된다. 전형적으로, 공정 단계는 2 회 초과로 수행된다.
3 개의 분리 유닛이 있는 시스템에서, 전형적으로는, 공정 중 특정 시간에, 하나의 분리 유닛 1 은 완전히 로딩되고 세정될 필요가 있고, 하나의 분리 유닛 2 는 완전히 로딩된 공급물에 연결되고 하나의 분리 유닛 3 은 용리되고 재평형화된다. 본 발명에 따르면, 분리 유닛 2 의 로딩 시간의 적어도 일부에, 분리 유닛 2 의 출구는 분리 유닛 3 의 입구와 유체 소통 중에 있어, 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 3 에 결합될 수 있을 것이다. 상기 유체 연결이 전형적으로 오로지 로딩의 일부 동안에만 필요하기 때문에, 로딩의 시작시 분리 유닛 1 의 출구와 분리 유닛 2 의 입구를 연결하는 것이 부가적으로 가능하다 (도 7a). 이러한 경우 2 개의 유체 소통은 분리 유닛 2 에 대해 가능할 것이다 (하나는 공급물스트림을 함유하고, 또다른 것은 상기 세정상 동안 분리 유닛 1 로부터 제거된 약하게 결합된 또는 미결합된 표적 분자를 함유함) (도 7a). 상기 유체 소통은 세정 동안 분리 유닛 1 로부터 용리될 수 있는 표적 분자가 분리 유닛 2 상에 포착될 수 있도록, 로딩된 분리 유닛 1 의 세정 동안 지속되어야만 한다. 세정이 완료된 후, 분리 유닛 1 과 2 사이의 유체 소통은 중단된다. 분리 유닛 1 이 부가적인 세정 (예를 들어, 표적 분자 이외의 분자의 제거) (도 7b), CIP, 용리, 재평형화와 같은 다른 단계를 거치는 동안, 분리 유닛 3 상의 입구는 분리 유닛 2 의 출구와 연결되어 로딩 시간의 적어도 일부에서, 분리 유닛 2 와 3 사이의 유체 소통으로 인해, 분리 유닛 2 로부터 용리된 미결합된 표적 분자가 분리 유닛 3 에 결합될 수 있도록 한다.
동일한 단계가 또한 공급물이 다음 분리 유닛으로 이동할 때 - 각각의 분리 유닛에 대해 수행될 수 있다는 것으로 쉽게 이해될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에 적용되는 샘플은 정화된 샘플이다. 이것은 본 발명에 따른 결합 및 용리 크로마토그래피 공정의 경우 샘플을 분리 유닛 상에 로딩하기 전에 정화 단계에 적용한다는 것을 의미한다.
정화 단계는 표적 분자로부터 하나 이상의 가용성 및/또는 불용성 불순물을 분리하도록 의도된다. 예를 들어, 세포 및 세포 부스러기와 같은 불용성 불순물이 샘플로부터 제거되어서 다른 가용성 불순물뿐만 아니라 용액 중 표적 분자를 함유하는 정화된 유체를 발생시킨다. 정화 단계는 다음과 같은 원심분리, 침강 및/또는 여과, 바람직하게는 접선 유동 여과 또는 심층 여과 중 하나 이상을 단독으로 또는 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 정화 단계는 원심분리를 포함하지 않고 단지 여과 및/또는 침강을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 여과는 심층 여과이다.
일부 구현예에서, 심층 필터가 하나 이상의 불용성 불순물을 제거하는데 사용된다. 심층 필터는 단지 배지의 표면에서보다는 매질 전체에 걸쳐 입자를 보유하도록 다공성 여과 매질을 사용하는 필터이다. 통상적인 종류의 이러한 심층 필터는, 복잡하고 구불구불한 미로의 유동 채널을 형성하도록 결합된 (또는 다르게는 고정된) 섬유의 랜덤 매트릭스를 포함하는 필터이다. 상기 필터 내의 입자 분리는 일반적으로 섬유 매트릭스의 포획 또는 흡착으로부터 유발된다. 세포 배양 브로스 (broth) 및 다른 공급원료의 바이오프로세싱을 위해 가장 빈번하게 사용되는 심층 필터 매질은 보통 셀룰로오스 섬유, DE (규조토) 와 같은 필터 보조제, 및 양전하 수지 결합제로 이루어진다.
다공성 심층 필터가 이방성인 경우 미립자 불순물의 일차 제거에 특히 양호한 결과가 달성될 수 있음을 발견하였다. 일부 구현예에서, 기공은 약 25 ㎛ 를 초과하는 공칭 공극 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 심층 필터는 적어도 부직 섬유의 2 그레이드 층을 포함하고, 그레이드 층은 약 0.3 cm ~ 약 3 cm 의 총 두께를 가지고 있다.
일부 구현예에서, 심층 필터는 부직 섬유의 그레이드 층, 셀룰로오스, 및 규조토의 복합물을 포함한다. 부직 섬유는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 나일론 또는 이의 혼합물을 포함한다.
예시적인 심층 필터는 본원에 참조로서 인용된 미국 가특허 출원 제 61/571994 호에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 원심분리 및/또는 접선 유동 여과 단계가 심층 여과 단계 전에 수행될 수 있다. 대안적으로, 심층 여과 단계는 원심분리 및/또는 접선 유동 여과 단계 필요없이 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 원심분리 및/또는 여과 및/또는 침강에 의한 정화 전에, 샘플로부터 원치 않는 오염물질을 침전시켜 제거하기 위해서 샘플은 침전 조성물로 전처리된다. 침전 조성물은 샘플로부터 HCP, DNA, 호르몬 등과 같은 오염물질을 침전시킬 수 있는 침전제를 적어도 포함한다. 침전제는 수성 및/또는 가용성 상태로부터 비수성 및/또는 불용성 상태로 화합물의 침전을 초래하거나 용액으로부터 미립자를 응집 및 교착시켜서, 액체상으로부터의 침강 및 용액 탁도 감소를 유발한다.
적합한 침전제의 예로는 유기 산 (예를 들어, 옥탄산), 무기 산 (예를 들어, HCl), 산성을 향하여 pH 를 실질적으로 낮추는 다른 산성제, 염 (예를 들어, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 차레이트, 나트륨 데옥시차레이트 등), 다른 1 가 염 또는 산성 매질에서 침전하는 유기 산이 있다. 침전제의 또다른 예로는 카프릴산과 같은 단쇄 지방산이 있다. 온화한 산성 조건에서, IgG 가 침전되지 않는 동안 카프릴산과 같은 단쇄 지방산의 첨가는 전형적으로 비 IgG 단백질을 침전시킨다.
다른 적합한 침전제로는 고분자전해질 중합체 (예컨대, 본원에 참조로 인용되는, 국제 PCT 특허 출원 제 WO2008/091740 호 참조) 가 있다.
바람직한 구현예에서, 자극 반응성 중합체는 하나 이상의 불순물을 침전시키는데 사용된다. 이러한 자극 반응성 중합체의 예로는, 본원에 참조로서 인용된, 예를 들어 미국 공개 제 20080255027 호, 제 20090036651 호, 제 20090232737 호 및 제 20110020327 호에서 발견될 수 있다. 자극 반응성 중합체는 pH, 온도 및/또는 염 농도와 같은 특정한 세트의 공정 조건 하에 수성 기반 용매에서 일반적으로 가용성이고 이러한 조건 중 하나 이상이 변할 때 불용성으로 되고 이어서 침전된다. 예시적인 자극 반응성 중합체는 폴리알릴아민, 벤질기로 개질된 폴리알릴아민 또는 폴리비닐아민 및 벤질기로 개질된 폴리비닐아민을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 자극제는 포스페이트 또는 시트레이트이다.
침전 조성물은 세제 (Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Tween-20, OTD, SDS, CHAPS, 및/또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (PEG-1000, PEG 10000) 및/또는 폴리비닐 알코올 및/또는 고분자전해질을 추가로 포함할 수 있다.
그 후, 침전된 오염물질은 분리 유닛 상에 샘플을 로딩하기 전 정화에 의해 샘플로부터 제거된다.
바람직한 구현예에서, 정화된 샘플을 제공하기 위해 원심분리 단계 없이 침전 후 심층 여과가 뒤따른다.
바람직한 구현예에서, 샘플의 정화는 그것의 지속기간의 적어도 일부 동안 본 발명의 방법에 따른 크로마토그래피 정제와 동시에 수행된다. 다시 말해서, 전체 샘플 부피가 정화되도록 대기하기 위해서 정화 후 표적 분자를 함유하는 액체 샘플은 풀 탱크에 저장되지 않고 정화 공정으로부터 정화된 샘플이 발생되자마자 그것은 본 발명의 방법을 위한 샘플 용액으로서 연속적으로 사용되고 분리 유닛 상에 로딩된다.
그 결과, 또한 정화된 샘플 용액을 사용할 때 본 발명의 방법은 샘플 용액의 전체 체적을 저장할 수 있는 풀 탱크의 사용을 필요로 하지 않는다. 바람직하게는 풀 탱크가 사용되지 않거나 샘플 용액의 총 체적의 25% 미만, 바람직하게는 10% 미만을 저장할 수 있는 풀 탱크만 사용된다.
또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 정제된 표적 분자를 바이러스 불활성화 및/또는 관류 정제와 같은 추가 공정 단계에 적용한다.
바이러스 불활성화는 바이러스를 불활성화시키거나 또는 감염시킬 수 없도록 하며, 이것은 특히 표적 분자가 치료적 용도에 대해 의도되는 경우 중요하다.
많은 바이러스는 화학적 변형에 의해 불활성화될 수 있는 지질 또는 단백질 외피를 함유한다. 단순히 바이러스를 불활성화시키기 보다는, 일부 바이러스 불활성화 공정은 바이러스를 완전히 변성시킬 수 있다. 바이러스를 불활성화하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 더욱 널리 사용되는 바이러스 불활성화 공정의 일부에는 예를 들어, 하기 중 하나 이상의 사용이 포함된다: 용매/세제 불활성화 (예를 들어, Triton X 100 사용); 저온살균 (가열); 산성 pH 불활성화; 및 자외선 (UV) 불활성화. 2 가지 이상의 상기 공정을 조합하는 것이 가능하다; 예를 들어, 승온에서 산성 pH 불활성화를 수행함.
완전하고 효율적인 바이러스 불활성화를 확보하기 위해, 바이러스 불활성화는 종종 바이러스 불활성화제와 샘플의 적합한 혼합을 확보하는 일정한 진탕과 함께 확장된 시간 기간에 걸쳐 수행된다. 예를 들어, 오늘날 산업에서 사용되는 많은 공정에서, 포획 단계로부터의 배출물 또는 유출물은 풀 탱크에 수집되고 연장된 시간 기간에 걸쳐 (예를 들어, >1 내지 2 시간, 종종 밤새 저장이 후속됨) 바이러스 불활성화에 적용된다.
바이러스 불활성화에 필요한 시간은 바이러스 불활성화 인-라인을 수행함으로써 또는 상기 단계를 위한 풀 탱크 대신 서지 탱크를 사용함으로써 유의하게 감소한다.
바람직한 구현예에서, 바이러스 불활성화는 산성 pH 를 사용하는데, 본 발명의 방법에 따른 결합 및 용리 크로마토그래피 단계로부터의 배출물이 서지 탱크 또는 인-라인을 사용하는, 바이러스 불활성화를 위해 산성 pH 에 대한 노출에 적용된다. 바이러스 불활성화에 사용되는 pH 는 전형적으로는 5.0 미만, 또는 바람직하게는 3.0 내지 4.0 이다. 일부 구현예에서, pH 는 약 3.6 이하이다. 인-라인 방법을 사용하는 바이러스 불활성화를 위해 사용되는 시간 기간은 10 분 이하, 5 분 이하, 3 분 이하, 2 분 이하, 또는 약 1 분 이하 사이의 임의의 지점일 수 있다. 서지 탱크의 경우, 불활성화에 필요한 시간은 전형적으로는 1 시간 미만, 또는 바람직하게는 30 분 미만이다.
임의로 바이러스 불활성화에 적용되었던 본 발명의 결합 및 용리 크로마토그래피 방법으로부터의 배출물은 이후 관류 정제에 적용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제 공정 단계는 하나 이상의 불순물을 제거하기 위해 의도되는, 관류 정제를 달성하기 위한 2 개 이상의 단계 또는 장치 또는 방법을 사용한다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제 공정에는, 본원에 기재된 바와 같이, 관류 모드로 수행되는 하기 단계 중 하나 이상이 포함된다: 활성탄; 음이온 교환 크로마토그래피; 양이온 교환 크로마토그래피, 믹스-모드 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제, 바이러스 여과 또는 이의 조합. 일부 구현예에서, 하나 이상의, 밸브, 인-라인 정적 혼합기 및/또는 서지 탱크가, 용액 조건을 변화시키기 위해 상기 단계 사이에서 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제는 표적 분자를 함유하는 샘플에 여전히 남아있는 하나 이상의 불순물은 음이온 교환 크로마토그래피 매트릭스에 결합하는 반면, 표적 분자는 관류하는, 하나 이상의 관류 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 단계를 사용한다.
사용될 수 있는 예시적인 음이온 교환 매트릭스에는 예컨대 4차 암모늄 이온 기재의 것들 뿐 아니라, 약한 음이온 교환체, 예컨대 일차, 이차, 및 삼차 아민 기재의 것이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
관류 정제 단계에 사용하고자 하는 매트릭스는 입자, 막, 섬유성 다공성 물질 또는 일체형 (monolithic) 물질의 형태일 수 있다. 활성탄의 경우, 이것은 다공성 물질, 예를 들어, 다공성 섬유성 물질 내로 침지될 수 있다. 상기 매트릭스를 담기 위한 적합한 분리 유닛, 예를 들어 컬럼 또는 카트리지는 당업자에게 공지되어 있다. 2 개 이상의 상이한 매트릭스, 예를 들어 양이온 교환 매트릭스 및 음이온 교환 매트릭스를, 하나의 분리 유닛에 조합하는 것이 또한 가능하다. 분리 유닛은 또한 일회용 제품, 예를 들어, Millistak® Pod 일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제 단계에 사용되는 매트릭스는 막 기재 매트릭스 (또한 막 흡착기로 불림) 이다. 막 흡착기는 바람직하게는 당업계에 잘 공지된 상 분리 방법에 의해 제조된 다공성 막 시이트이다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제 단계에는 적어도 음이온 교환 단계 및 활성탄 단계가 포함된다. 활성탄 단계는 이온-교환 크로마토그래피 전에, 음이온 교환 크로마토그래피와 조합으로 또는 이온-교환 크로마토그래피 후에 수행될 수 있고, 바람직하게는 이것은 음이온 교환 단계 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 활성탄은 셀룰로오스 매질과 함께 패킹된다. 대안적으로, 활성탄은 이온-교환 매트릭스 (예를 들어, 컬럼 또는 카트리지 내에) 와 함께 조합되어, 표적 분자를 함유하는 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 추가로 제거할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관류 정제에는 추가로 크기 배제에 기반한 응집물 제거 및/또는 바이러스 여과를 위한 하나 이상의 부가적인 관류 단계가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서, 샘플은 응집체 제거를 위해, 작업의 정상 흐름 여과 모드로, 흡착성 심층 필터, 또는 대전된 또는 개질된 마이크로공극층(들) 을 통과한다. 일부 구현예에서, 부가적인 관류 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX) 매트릭스를 사용한다.
관류 양이온-교환 단계 (CEX) 의 사용은 항체 응집체와 같은 불순물에 대한 친화성 및 수용력을 증가시키기 위해 용액 pH 의 감소가 필요할 수 있다. 이러한 pH 감소는 3방향 밸브, T-스타일 연결기, 정적 혼합기, 또는 당업계에 잘 공지된 다른 적합한 장치를 통한, 산을 함유하는 적합한 용액의 단순한 인-라인 첨가에 의해 수행될 수 있다. 또한, 작은 서지 용기가 샘플링을 위한 부가적인 혼합 및 접근을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 백, 컨테이너 또는 탱크의 형태일 수 있는 서지 용기의 체적은 통상 관류 설정에 의해 프로세싱된 유체의 부피보다 상당히 작다, 예를 들어 유체의 부피의 10% 이하이다.
전체 관류 정제 작업 (본원에 기재된 바와 같은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 하나 이상의 부가적인 단계를 포함) 은, 바람직하게는 관류 공정 단계 사이에 풀 탱크의 사용 없이 연속적으로 수행된다.
바람직한 구현예에서, 관류 단계는 샘플을 활성탄 매트릭스, 음이온 교환 매트릭스, 양이온 교환 매트릭스 및 크기 배제 매트릭스와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 완충액 교환은 이것을 양이온 교환 매트릭스를 통과시키기 전에 수행된다.
정화 단계가 본 발명에 따른 방법 전에 수행되는 경우 및/또는 관류 정제 단계가 본 발명에 따른 방법의 수행 후에 수행되는 경우, 바람직한 구현예에서, 적어도 정화 및 결합-및-용리 크로마토그래피 단계는 이들의 기간의 적어도 일부에서 중복된다. 매우 바람직한, 정화 단계 및 결합-및-용리 크로마토그래피 단계는 이들의 기간의 적어도 일부에서 중복되고, 결합-및-용리 크로마토그래피 단계 및 관류 정제 단계는 이들의 기간의 적어도 일부에서 중복된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 결합-용리 크로마토그래피 방법 뿐 아니라 모든 추가의 임의의 공정 단계는 시작시 공정에 적용되었던 샘플 부피의 25% 초과, 바람직하게는 10 % 이하를 갖는 공정 단계 동안 샘플 용액을 저장하기 위해 탱크를 사용하지 않고 수행된다.
시스템
본 발명은 또한 공급물로부터 하나 이상의 표적 분자를 분리하기 위한 액체 크로마토그래피 시스템 (도 1) 에 대한 것으로, 본 시스템은 원형 내 연결된 3 개 이상의 분리 유닛으로 구성되고, 각각의 분리 유닛은 컬럼 내에 패킹된 크로마토그래피 매트릭스를 포함한다. 각각의 분리 유닛은 액체의 입구 및 출구에 대한 수단과 함께 제공된다. 입구에 대한 상기 수단은 적어도 용매 전달 시스템 및 원형 내 이전 분리 유닛의 출구에 연결된다.
출구의 상기 수단은 적어도 저장소 또는 폐기물에 및 원형 내 다음 분리 유닛의 입구에 연결된다. 바람직한 구현예에서, 원형 내 각각의 분리 유닛의 출구는 원형 내 각각의 분리 유닛의 입구에 연결되어 유체 소통이 임의의 선택된 분리 유닛의 출구와 임의의 기타 선택된 분리 유닛의 입구 사이에서 가능하게 한다.
본 발명에 따른 시스템에서, 연결 라인은 바람직하게는 각각의 유체 입구 가까이에 그리고 각각의 유체 출구에 가까이에 분지된다.
하나의 분리 유닛의 출구와 원형 내 다음 분리 유닛의 입구 사이에 위치한 모든 연결 라인은 입구 스트림을 선택하기 위한 "온-오프" 밸브와 함께 제공되며, 입구 스트림은 용매 전달 시스템과 직접 연결될 수 있거나 또는 이전 컬럼의 출구와 직접 연결된다. 부가적으로는, 모든 출구는 용매 스트림 방향 사이를 선택하기 위한 "온-오프" 밸브와 함께 제공되며, 상기 용매는 폐기물 또는 용매 저장소를 향해 또는 또다른 분리 유닛의 입구를 향해 지시될 수 있다. 상기 설정은 두번째 분리 유닛 (단지 재평형화되고 포획 준비가 됨) 상의 첫번째 포획 분리 유닛 (로딩 종료시) 으로부터 침출된 생성물의 포획을 가능하게 한다. 이것은 표적 분자의 손실 없이 높은 처리량 및 결합력을 사용하는 것을 가능하게 한다.
부가적으로는, 용매 전달 시스템 전 용매의 선택은 2 개 이상의 출구 (그러나 좀더 4 개 이상) 를 가진 용매 선택 밸브와 함께 수행된다.
하나의 구현예에서, 바람직하게는, 온/오프 밸브는 상기 라인을 통해 용매의 흐름을 중지시키기 위해 연결 라인 상에 위치한다. 부가적으로는, 시스템은 단지 2 개의 용매 전달 시스템을 함유할 수 있으나, 여전히 상기 제시된 3 개의 컬럼 방법을 수행할 수 있다 (도 4).
또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 시스템은 4 개의 분리 유닛을 함유할 수 있다 (도 5a; 도 6a)
또다른 바람직한 구현예에서, 장치는 하나 이상의 검출기를 추가로 포함한다. 검출기는 샘플 품질의 분석, 모니터링 등을 위해, 컬럼 사이에 샘플 전달 조절을 위해 사용될 수 있다. 검출기는 어디든 적합한 곳에 위치할 수 있으며, 전형적으로 이들은 분리 컬럼의 유체 입구 전 및/또는 유체 출구 후에 위치한다. 적합한 검출기의 예는 pH 검출기, UV 검출기, 적외선 검출기 또는 전도성 측정 검출기이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 장치는 컴퓨터 시스템을 추가로 포함한다. 검출기 뿐 아니라 펌프 및 밸브는 컴퓨터 시스템에 연결된다. 상기 컴퓨터 시스템은 펌프 및 밸브 및 검출기의 통제를 가능하게 한다. 바람직하게는, 컴퓨터 시스템은 장치를 부분적으로 또는 완전히 자동화된 모드로 사용할 수 있게 하는 소프트웨어 및 알고리즘을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 장치는 사건 (예를 들어, 검출기 신호) 이 통제를 위한 유발장치로서 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템을 포함한다.
시스템은 크로마토그래피 분리 절차에 필요할 수 있거나 적합할 수 있는 필터 유닛, 검출 유닛 또는 다른 장비를 부가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 장치는 컬럼, 밸브, 저장소 및 크로마토그래피 시스템에 전형적으로 사용되는 다른 장비를 포함한다. 분리 유닛은 예를 들어 각각의 크로마토그래피 매트릭스로 채워지고 용매 입구 및 출구에 대해 적합한 말단-피팅을 갖는 스테인레스 스틸 컬럼, 플라스틱 컬럼 또는 유리 컬럼일 수 있다.
본 발명에 따른 장치는 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상, 바람직하게는 3, 4 또는 5 개의, 가장 바람직하게는 3 개의 분리 유닛을 포함한다.
장치는 또한 2 개 이상의 완충액 저장소 및 2 개 이상의 펌프 (또한 용매 전달 시스템이라고 불림) 를 포함하는데, 이것은 예를 들어, 표적 분자의 로딩, 세정 및 용리를 위해 필요한 완충액의 저장 및 공급을 위해 제공된다. 전형적으로는 모든 분리 유닛은 하나 이상의 완충액 저장소에 연결된 하나 이상의 유체 입구를 갖는다.
매우 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 장치는 3 개의 분리 유닛 및 2 개의 용매 전달 시스템을 갖는다.
하기에서 장치 및 방법의 설명은 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개의 포획 분리 유닛이 있는 장치에 대해 중점을 두고 있다. 이것은 제한이 아니라 설명을 더욱 이해할 수 있게 만드는 것으로 이해된다. 당업자는 해당 설명을 또한 상기 기재된 바와 같은 3 개 초과의 유닛을 가진 시스템에 대해 적용할 수 있다.
다른 구현예에서, 장치는 다른 완충액, 제자리 세척, 재평형화 등을 위한 부가적인 저장소를 포함할 수 있다.
전형적으로 저장소 및 분리 유닛은 연결 라인, 밸브 및 펌프를 통해 연결된다. 펌프 이전 용매의 선택을 위한 바람직한 용매 선택 밸브는 수 많은 용매 입구 및 펌프에 직접 연결될 수 있는 1 개의 용매 출구를 갖는 밸브이다. 필요한 입구의 양은 개별 적용에 특이적으로 사용되는 상이한 완충액의 양에 상응할 것이다. 연동 펌프, 등용매 펌프, 구배 펌프, 고압 펌프 ?, 저압 펌프 등을 비롯한 용매 흐름을 확보시키는 임의의 펌프가 사용될 수 있다. 시스템 일부 유체 입구 전 유체 도입의 선택을 위한 바람직한 유체 선택 밸브는 수 많은 유체 입구 및 시스템 일부 유체 입구에 연결될 수 있는 1 개의 출구를 갖는 밸브이다. 시스템 일부 유체 출구 후 유체 배출의 선택을 위한 바람직한 유체 선택 밸브는 수 많은 유체 출구 및 시스템 일부 유체 출구에 연결될 수 있는 1 개의 입구를 갖는 밸브이다.
바람직한 구현예에서, 하나 이상의 용매 전달 시스템은 일정한 공급원료 스트림을 장치에 대해 확보하는 공급원료 저장소에 연결된다. 이것은 연속 공급물 스트림에 대해 지속적인 작동을 가능하게 한다. 공급물 스트림의 범위는 제시된 시간 범위 내 필요한 컬럼 결합을 확보하기 위해 통제될 수 있을 것이다. 통상, 친화성 적용의 경우 공급물 스트림 내 표적 분자 양은 공급물 스트림에 대한 결정적인 기준이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 공급물의 유속은 각 컬럼의 생산성을 개선하기 위해 통제되며, 더욱 바람직하게는 이것은 공급물 스트림 내 표적 분자 양에 따라 다른 범위로 유지된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 부가적인 액체 스트림의 유속이 통제된다.
다른 문제
또다른 바람직한 구현예에서, 장치는 제자리 세척을 위한 부가적인 저장소를 추가로 포함한다. 제자리 세척 (Cleaning in place: CIP) 은 당업자에게 공지된 기술이다. 제자리 세척은 크로마토그래피 매트릭스로부터 매우 단단하게 결합된, 침전된 또는 변성된 성분의 제거이다. 이러한 오염물질이 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거되지 않는 경우 이들은 컬럼의 크로마토그래피 특성에 영향을 주어, 후속 실행에서 결합력 및 제거력을 감소시킬 수 있고, 사이클 간의 오염물질 또는 생성물의 잔재를 야기한다.
표준 CIP 프로토콜에는 전형적으로 하기와 같은 성분을 포함하는 수성 완충액의 1 내지 3 컬럼 부피로의 1 내지 5 회 세정이 포함된다:
- 6 M 구아니딘 히드로클로라이드
- 10 mM 내지 500 mM NaOH
- 10 mM 내지 500 mM NaOH 및 1 M NaCl,
- 50 mM NaOH 및 1 M Na2SO4,
- 150mM 인산 용액,
- 6M 우레아,
- 20% 에탄올,
- 20% 에탄올 및 0.5M 아세트산,
- 20% 에탄올 및 2M 아세트산,
- 1% Tween 또는 Triton® 계면활성제 X-100 등.
NaOH 와 같은 성분의 농도, CIP 완충액의 컬럼 상의 접촉 시간 뿐 아니라 CIP 의 수행 빈도는 당업자에 의해 조절되고 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 장치는 바람직하게는 CIP 완충액을 함유하는 하나 이상의 저장소를 갖는다. CIP 완충액은 적합한 경우 모든 분리 유닛의 CIP 에 대해 사용될 수 있다. 이후 완충액 저장소는 CIP 완충액의 흐름이 각각의 컬럼으로 독립적으로 향하게 할 수 있는 방식으로 모든 분리 유닛과 액체 연결 중에 있다. 제자리 세척 세정은 각각의 분리 사이클 후에 수행되 수 있다. 전형적으로 CIP 는 샘플 및 따라서 분리 유닛을 오염시킬 수도 있는 오염물질의 양 및 유형에 따라 매 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9. 또는 10 번째 분리 사이클 후에 수행된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 장치는 흡착제로부터의 결합된 불순물 부분적인 또는 총 제거 (세정) 를 위한 부가적인 저장소를 포함한다. 불순물 정제, 특히 HCP 및 DNA 의 제거는, 생물약학 화합물 내의 숙주 세포 DNA 수준이 FDA 에 의해 조절되기 때문에, 생물약학 화합물 내에서 주요한 역할을 수행한다. 다양한 용액에 대한 로딩된 흡착제의 부가적인 노출을 통해 흡착제 상의 결합된 HCP 의 수 및 DNA 수준을 감소시키는 것이 가능하다. 상기 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 표준 세정 프로토콜에는 전형적으로 하기와 같은 성분을 포함하는 수성 완충액의 1 내지 20 컬럼 부피로의 1 내지 10 회 세정이 포함된다:
- 0,02 M 내지 2 M NaCl,
- 0,02 M 내지 2 M NaCl 및 Na2SO4
- 0,02 M 내지 2 M Na2SO4,
- 0,02 M 내지 2 M CaCl2
- 0,02 M 내지 2 M MgCl2,
- 0,02 M 내지 2 M MgSO4,
- 10-20% 유기 용매,
- 10-20% 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜,
- 0.5M 아미노산, 예컨대 아르기닌 및 글리신,
- 0,1-1% Tween 또는 Triton® 계면활성제 X-100 등.
NaCl 과 같은 성분의 농도, 세정 완충액의 컬럼 상의 접촉 시간, 완충액 pH 값 뿐 아니라 세정의 수행 빈도는 당업자에 의해 조절되고 결정될 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에서, 세정 단계는 상이한 완충액으로 수행된다.
또다른 바람직한 구현예에서, 각각의 흡착제는 복합 세정 단계에 의해 세정된다.
하나의 구현예에서, 시스템은 친화성 크로마토그래피 매트릭스가 있는 3 개 이상의 분리 유닛을 포함한다. 적합한 친화성 매트릭스는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L 또는 단백질 r 작용기를 갖는 매트릭스 (예를 들어, Prosep® Highcap (Merck Millipore), Prosep® Ultra Plus (Merck Millipore), Poros® Prot A(Life Technologies), A650F (Tosoh), MabSelect® Sure (GE) 이다.
본 발명에 따른 장치에서 사용하고자 하는 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 40 내지 200 ㎛ 의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하며, 바람직한 직경 및 공극 크기는 본 발명에 따른 방법을 설명할 때 상기 제시되었다.
입자는 규칙적으로 또는 불규칙적으로 형성될 수 있다. 이들은 크로마토그래피 흡착제로서 적합한 임의의 재료, 예컨대 다당류 (예컨대, 아가로오스 및 셀룰로오스); 및 다른 기계적으로 안정된 매트릭스, 예컨대 실리카 (예를 들어, 제어된 기공 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴레이트, 세라믹 입자 또는 친수성적으로 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합체, 예컨대 1,2-에탄디올 모노비닐 에테르, 1,3-프로판디올 모노비닐 에테르, 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 1,6-헥산디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 가교제, 예컨대 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 또는 디비닐프로필렌우레아 (1,3-디비닐테트라히드로피리미딘-2-온) 및 상기 임의의 것의 유도체로 구성될 수 있다. 친수성적으로 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합체의 예는 EP 1910433 에 기재되어 있다. 바람직한 것은 1000 cm/h 초과의 속도가 적용될 수 있도록 높은 강성을 보이는 물질이다.
다른 바람직한 구현예에서, 기재된 장치는 생물반응기, 관류 생물반응기 및/또는 부분적인 불순물 제거 (예컨대 세포 부스러기 등) 를 위해 적용된 정제 방법론, 예컨대 심층 필터, 원심분리, 정화, 침강, 일정한 공급물 스트림을 확보하는 변동 기술과 연결될 수 있다. 이것은 연속 공급물 스트림의 필요성에 대한 방법 필요조건에 대해 필수적일 뿐 아니라, 표적 분자 생성 및/또는 공급물 스트림 정제와 표적 분자 포획 사이의 긴 저장 시간을 피하면서, 짧은 프로세싱 시간 및 생성물 품질 유지 (예컨대 낮은 수준의 응집 등) 를 제공할 수 있다.
또다른 바람직한 구현예에서, 생성물 출구 스트림은 기타 정제 기법, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피, 믹스 모드 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, HIC 크로마토그래피, SEC 크로마토그래피 모드, 심층 여과, 침강, 변동 기술 등에 직접 연결되거나 또는 저장소, 서지 백, 저장 백에 모집될 수 있다.
또다른 바람직한 실험에서, 생성물 출구 수트림은, 단일 흡착제로부터의 하나 이상의 용리 풀이 피팅된 저장소와 연결되는데, 이곳에서 풀링된 용액의 연속 또는 반-연속 배출이 수행될 수 있어 후속 정제 기술의 직접적인 연결을 가능하게 한다. 이것은 표적 농도, pH 및 전도성 값과 관련하여 후속 정제 기술에 대해 더욱 일정한 조건 (표준 크로마토그래피 용리 프로파일과 비교하여) 을 확보할 뿐 아니라, 적은 프로세싱된 표적 분자 양이 짧은 총 정제 공정을 가능하게 하기 위해서 추가의 기술로 직접 정제될 수 있으므로, 빠른 프로세싱을 확보할 것이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 적합한 컬럼 직경 및 길이는 최적의 작업을 확보하기 위해 선택되어야만 한다. 더욱 바람직하게는 흡착제 층 높이는 10cm 보다 짧아야만 하고, 심지어 더욱 바람직하게는 4-6 cm 높이이다. 이것은 산업적 규모에서 적용이 3 bars 를 초과하지 않는 컬럼에 대한 압력 강하에 영향을 준다. 장점은 압력 제한을 초과하지 않고 1000cm/h 이상에서의 작업이다.
상기 및 하기에 언급된 모든 출원, 특허 및 공개 및 2012 년 4 월 23 일에 출원된 상응하는 EP 출원 EP 12002828.7, 및 2012 년 6 월 29 일에 출원된 상응하는 US 가출원 61/666,453 의 전체 기재는 참조로서 본원에 인용된다.
실시예
실시예 I
상응하는 데이터로의 >100 사이클에 대한 PUP 상의 mAb-x (1 mg/ml) 의 연속 정제
용액 내 모든 성분의 21% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 1 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (SP 2/0) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-x (HCP 양은 600000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 SP 2/0 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (PUP) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: PUP 수지를 16 x 55 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 33.3 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 16 mS/cm 및 pH6.4 였다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.7 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.7 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.7 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 100 회 이상 반복하였고, 두번째 사이클에서 고정 상태 작업이 수득되었다. UV 신호 추적이 도 9 에 제시되며, 각각의 컬럼이 각각의 단일 사이클을 거치고 있다는 모든 공정 단계 UV 추적을 보여준다. 로딩된 첫번째 컬럼의 세정으로 시작해서 동시에 일련 내 다음 컬럼 후 연결된 일련 내 다음 컬럼을 로딩함. 여전히 명명된 컬럼이 로딩되고 있으면서 이전에 로딩된 컬럼은 용리되고 (첫번째 피크) CIP 되고 재평형화된다. 18 분 째에 다음 컬럼의 로딩이 수행되고 로딩을 첫번째 컬럼에 이은 일련 내 다음 이후 컬럼 상으로 전환시키고, 그 결과 세정, 용리 (두번째 피크), CIP 및 재평형화를 비롯한 다음 컬럼에 대한 필수적인 공정을 진행한다. 동시에 다음 이후 및 첫번째 컬럼이 로딩된다. 36 분 째에 이후 다음 컬럼의 로딩이 수행되고 로딩을 다음 컬럼에 이은 첫번째 컬럼 상으로 전환시키고, 그 결과 세정, 용리 (세번째 피크), CIP 및 재평형화를 비롯한 다음 컬럼 이후에 대한 필수적인 공정을 진행한다.
용리된 분획은 7-9 mg/ml 항체 (도 10 참조) 를 함유하여 >35mg/ml 패킹층 결합력 및 <5% 표적 분자 손실 및 50g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 9.6g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), HCP 양은 120-250 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 SP 2/0 에 따라) (도 11 참조). 침출된 ProtA 의 양은 모든 실험을 통해 안정하게 남아있었고 10-60 ppm 의 값을 산출하였다.
실시예 II
하기 실시예는 배치에 대해 그리고 기재된 연속 크로마토그래피 방법에 대해 잔류 시간에 대한 결합력 값 의존성의 감재적인 차이를 탐구하기 위해 수행되었다. 도 8 에 나타내듯이, 결합력 값은 표준 배치 작업에 대한 1% 관류 (break through) 값이 감소할 때까지 <0,45분 잔류 시간 동안 <20mg/ml 결합력을 산출하는 잔존 값이 감소하면서 측정되었다. 반대로 연속 크로마토그래피 방법에 대한 결합력 값은 >0.2 분 잔류 시간의 측정 범위에서 >35 mg/ml 로 남아있었다. 현행 예를 순수 mAb-x 예에 대해 그리고 상이한 초기 적정농도 (1mg/ml 및 5 mg/ml) 에서 수행하였다.
상기 결과에 근거하여 공급원료 예를 하기 제시한다:
a) PUP 상의 mAb-y (0,5 mg/ml) 의 연속 정제
용액 내 모든 성분의 9% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 0,5 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (CHO) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-y (HCP 양은 250000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (PUP) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: PUP 수지를 16 x 55 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 33.3 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 14 mS/cm 및 pH6.8 이었다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.0 으로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >37mg/ml 패킹층 결합력 및 <5% 표적 분자 손실 및 136,12g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 7.12g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), 평균 HCP 양은 1300 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라).
실험 조건은 2 개의 개별 배치 경우와 비교하였는데, 배치 정제의 표준 조건은 상기 제시된 것과 일치하는 로딩 및 세정, 용리, CIP 및 재평형화 조건에 대해 4 분 잔류 시간을 사용하는 것을 적용하였다. 그리고 표준 배치 작업의 로딩이 0,22 분 잔류 시간에서 수행되었던 두번째 경우에 대해서도. 이 경우 수득된 생산성은 19,4 g/ml/h 였다.
b) PUP 상의 mAb-z (1 mg/ml) 의 연속 정제
용액 내 모든 성분의 14% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 1 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (CHO-DG44) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-z (HCP 양은 200000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (PUP) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: PUP 수지를 16 x 55 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 33.3 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 13 mS/cm 및 pH6.2 이었다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.0 으로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1500 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >37mg/ml 패킹층 결합력 및 <5% 표적 분자 손실 및 271,4g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 14.27g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), 평균 HCP 양은 1551 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라).
실험 조건은 2 개의 개별 배치 경우와 비교하였는데, 배치 정제의 표준 조건은 상기 제시된 것과 일치하는 로딩 및 세정, 용리, CIP 및 재평형화 조건에 대해 4 분 잔류 시간을 사용하는 것을 적용하였다. 그리고 표준 배치 작업의 로딩이 0,22 분 잔류 시간에서 수행되었던 두번째 경우에 대해서도. 이 경우 수득된 생산성은 45,13 g/ml/h 였다.
c) PUP 상의 mAb-w (2,4 mg/ml) 의 연속 정제
용액 내 모든 성분의 35% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 2,4 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (NH0) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-z (HCP 양은 350000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 NH0 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (PUP) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: PUP 수지를 16 x 55 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 33.3 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 17 mS/cm 및 pH5.8 이었다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1032 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.0 으로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1032 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 1032 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >30mg/ml 패킹층 결합력 및 <5% 표적 분자 손실 및 407,24g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 34.97g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), 평균 HCP 양은 900 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 NH0 에 따라).
실험 조건은 2 개의 개별 배치 경우와 비교하였는데, 배치 정제의 표준 조건은 상기 제시된 것과 일치하는 로딩 및 세정, 용리, CIP 및 재평형화 조건에 대해 4 분 잔류 시간을 사용하는 것을 적용하였다. 그리고 표준 배치 작업의 로딩이 0,32 분 잔류 시간에서 수행되었던 두번째 경우에 대해서도. 이 경우 수득된 생산성은 101,95 g/ml/h 였다.
d) PUP 상의 mAb-x (3,5 mg/ml) 의 연속 정제
용액 내 모든 성분의 45% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 3,5 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (SP2/0) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-x (HCP 양은 450000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 SP2/0 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (PUP) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: PUP 수지를 16 x 55 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 33.3 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 17 mS/cm 및 pH5.8 이었다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 920 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.0 으로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 920 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 920 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1500cm/h 에서 25mM TRIS 및 0,05 M NaCl 완충액 pH 7 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH 7.2 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1500cm/h 에서 50mM 글리신 완충액 pH 2.8 로 용리한 후, 1500cm/h 에서 150mM 인산으로의 컬럼 세정 이후, 1500cm/h 에서 25mM TRIS 완충액 pH7.2 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >57,1mg/ml 패킹층 결합력 및 로딩에서 <5% 표적 분자 손실 및 90% 생성물 회수시 산출되는 용리액에서 ~5% 표적 분자 손실 및 572g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 46,19g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), 평균 HCP 양은 2100 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 SP2/0 에 따라).
실험 조건은 2 개의 개별 배치 경우와 비교하였는데, 배치 정제의 표준 조건은 상기 제시된 것과 일치하는 로딩 및 세정, 용리, CIP 및 재평형화 조건에 대해 4 분 잔류 시간을 사용하는 것을 적용하였다. 그리고 표준 배치 작업의 로딩이 0,36 분 잔류 시간에서 수행되었던 두번째 경우에 대해서도. 이 경우 수득된 생산성은 88,7 g/ml/h 였다.
실시예 III
MabSelect Sure 와 같은 다른 재료도 마찬가지로 본 적용에 사용될 수 있지만, 작업 조건은 PUP 재료에 대해 상기 제시된 것과 동일하지 않다는 것이 고려되어야만 한다. 단지 예로서 MabSelect Sure 는 통상 500cm/h 에서 MabSelect Xtra 는 300cm/h 에서 적용된다. 3 가지 상이한 재료 (PUP, MabSelect Xtra, MabSelect Sure) 및 2 가지 상이한 mAb 적정농도 (1 mg 및 5 mg/ml) 에 대해 배치 및 본원의 연속 접근법에서의 작업에 대한 달성가능한 결합력의 차이를 나타내는 하기 도면을 참조하기를 바란다.
용액 내 모든 성분의 10% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 0,68 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 세포 배양 (SP2/0) 용액 내의 단일클론 항체 mAb-x (HCP 양은 450000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 SP2/0 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 ProtA 수지 (MabSelect Sure) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: MabSelect Sure 수지를 10 x 60 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 25 mM PBS 완충액 pH 7.2 로 20 ml/분에서 평형시켰다. 총 3 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 세포 배양 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 16 mS/cm 및 pH6.8 이었다. 모든 3 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다. 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 917,2 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 6,8 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 완충액 pH 6.8 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 20mM 아세트산 완충액 pH 3,2 로 용리한 후, 50mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH6.8 로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 917,2 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 6,8 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 완충액 pH 6.8 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 20mM 아세트산 완충액 pH 3,2 로 용리한 후, 50mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH6.8 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 917,2 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 및 1,5 M NaCl 완충액 pH 6,8 로 적어도 5 회 CV 에 대해 세정한 다음, 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 완충액 pH 6.8 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 20mM 아세트산 완충액 pH 3,2 로 용리한 후, 50mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH6.8 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >38mg/ml 패킹층 결합력 및 로딩에서 <5% 표적 분자 손실 및 93% 생성물 회수시 산출되는 용리액에서 ~2% 표적 분자 손실 및 102g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 12,1 g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), 평균 HCP 양은 120-150 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 SP2/0 에 따라).
실시예 IV
이전에 논의된 바와 같이, 상기 기재된 연속 크로마토그래피 개념은 상이한 크로마토그래피 모드 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피) 로 사용될 수 있다. 결합력의 규모 대 잔류 시간으로 표현되는 상기 기재된 접근법의 잠재력에 대해서는 도 13 을 참조한다. Eshmuno S 작업으로 패킹된 단일 컬럼의 경우 mAb x 에 대한 결합력은 물질 전달 저항력으로 인해 잔류 시간이 감소하면서 감소한다. 연속 크로마토그래피 접근법의 경우, 결합력은 짧은 잔류 시간 값에서 높은 생산성의 잠재력을 보이는 특정 잔류 시간 값까지 감소하지 않는다. 부가적으로 결합력 값은 조사된 잔류 시간 윈도우에서 더 높다. 이 경우에 대한 예는 하기 제시된다:
용액 내 모든 성분의 98% 의 분획을 구성하는 (분석 SEC 에 따라) 5,5 mg/ml 단일클론 항체를 가졌던 post-ProtA 용리 풀 용액 내의 단일클론 항체 mAb-y (HCP 양은 2000 ng/mg 항체 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라) 였음) 를, 하기 조건 하에서 이온 교환 수지 (Eshmuno S) 상에서 정제하였다. 크로마토그래피 컬럼: Eshmuno S 수지를 16 x 63 mm 컬럼 내에 패킹하였다; 컬럼을 이후 50 mM 아세테이트 완충액 pH 4.5 로 33 ml/분에서 평형시켰다. 총 4 개의 컬럼을 패킹하였다. 샘플을 제조하기 위해: 단일클론 항체 post-ProtA 용액을 0,45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 용액 전도성은 약 2 mS/cm 및 pH4.8 이었다. 따라서, 3 또는 4 개의 컬럼을 연속 크로마토그래피 시스템에 부착시켜, 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 하거나 또는 첫번째 컬럼과 두번째 컬럼 사이의 연결 뿐 아니라, 두번째 컬럼과 세번째 컬럼 사이의 연결 및 세번째 컬럼과 네번째 컬럼 사이의 연결 및 네번째 컬럼과 첫번째 컬럼 사이의 연결을 가능하게 한다.
3 개 컬럼 접근법에 대한 전체 실험은 3 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 50mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
따라서, 4 개 컬럼 접근법에 대한 전체 실험은 4 단계로 나뉜다. 첫번째 단계가 시작되면서 첫번째 컬럼은 두번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 네번째 컬럼을 810cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정하고 세번째 컬럼과 연결한 다음, 세번째 컬럼을 두번째 컬럼과 연결하고, 네번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50 mM 아세테이트 pH 4,5 로 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
두번째 단계가 시작되면서 두번째 컬럼은 세번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 첫번째 컬럼을 810cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정하고 네번째 컬럼과 연결한 다음, 네번째 컬럼을 세번째 컬럼과 연결하고, 첫번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50 mM 아세테이트 pH 4,5 로 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
세번째 단계가 시작되면서 세번째 컬럼은 네번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 두번째 컬럼을 810cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정하고 첫번째 컬럼과 연결한 다음, 첫번째 컬럼을 네번째 컬럼과 연결하고, 두번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50 mM 아세테이트 pH 4,5 로 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
네번째 단계가 시작되면서 네번째 컬럼은 첫번째 컬럼과 연결된다. 상기 컬럼 그룹을 810 cm/h 에서 준비된 샘플과 함께 로딩하면서, 세번째 컬럼을 810cm/h 에서 50mM 아세테이트 pH 4,5 로 적어도 3 회 CV 에 대해 세정하고 두번째 컬럼과 연결한 다음, 두번째 컬럼을 첫번째 컬럼과 연결하고, 세번째 컬럼을 1000cm/h 에서 50 mM 아세테이트 pH 4,5 로 세정한 다음, 50mM TRIS 완충액, 250 mM NaCl, pH 7,5 로 용리한 후, 500mM 수산화나트륨으로의 컬럼 세정 이후, 50mM 아세테이트 완충액 pH4.5 로의 재평형화를 수행한다.
명명된 단계를 2 회 이상 반복하였다.
용리된 분획은 >55mg/ml 패킹층 결합력 및 로딩에서 <5% 표적 분자 손실 및 3 개 컬럼 개념에 대해서는 91% 생성물 회수시 및 4 개 컬럼 개념에 대해서는 96% 회수시 산출되는 3 개 컬럼 개념에 대한 용리액에서 ~4% 표적 분자 손실을 산출하였다. 3 개 컬럼 개념에 대해서는 666g/ml/h 의 평균 생산성 및 4 개 컬럼 개념에 대해서는 720 g/ml/h 의 평균 생산성 (배치 작업과 비교하여, 생산성은 76,8 g/ml/h 였음) 을 산출하였고, 이것이 모든 성분의 99.9% 를 구성하였으며 (분석 SEC 에 따라), HCP 양은 400-430 ppm 이었다 (면역효소측정 어세이 CHO 에 따라).
Claims (14)
- 공급물이 전혀 중단되지 않으며, 800 cm/h 초과의 속도를 갖고, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스가 40 내지 200 ㎛ 의 직경 및 50 nm 내지 200 nm 의 범위의 공극 직경을 갖는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 하기 단계를 포함하는, 샘플 내의 하나 이상의 불순물로부터 표적 분자를 정제하는 방법:
a) 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하는, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛을 제공하는 단계
b) 샘플을 첫번째 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 분리 유닛에 결합하도록 하는 첫번째 pH 및 전도성에 있음), 상기 분리 유닛이 다음 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 첫번째 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하는, 용리하는 그리고 재평형화하는 동시에, 다음 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 단계
c) 공급물을 다음 분리 유닛으로 전환시키는 단계
d) 샘플을 다음 분리 유닛 상에 공급하여 샘플이 상기 다음 분리 유닛 상에 로딩되는 동안 (이 때 샘플은 표적 분자를 상기 다음 분리 유닛에 결합하도록 하는 첫번째 pH 및 전도성에 있음), 상기 다음 분리 유닛이 다음 이후 분리 유닛과 유체 소통 중인 로딩 시간의 적어도 일부여서, 상기 다음 분리 유닛에 결합하지 않은 표적 분자가 로딩되고 있는 분리 유닛과 상이한 그리고 로딩되고 있는 분리 유닛과 유체 소통 중인 유닛과 상이한 하나의 분리 유닛을 적어도 세정하는, 용리하는 그리고 재평형화하는 동시에, 다음 이후 분리 유닛에 결합할 수 있도록 하는 단계
e) 상기 단계 c) 및 d) 를 1 회 이상 반복하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 공급물이 800 cm/h 초과의 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개, 4 개 또는 5 개의 분리 유닛이 단계 a) 에서 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스가 55 내지 100 ㎛ 의 직경을 갖는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 유닛의 크로마토그래피 매트릭스가 60 nm 내지 100 nm 의 범위의 공극 직경을 갖는 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b), c) 및 d) 에서, 로딩되고 있는 분리 유닛이 로딩 시간의 일부일 뿐 아니라 다음 분리 유닛과의 유체 소통에서 전체 로딩 시간을 넘는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b), c) 및 d) 에서, 로딩되고 있는 분리 유닛과 다음 분리 유닛 사이의 유체 소통이 로딩 시간의 후반에서 시작되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩된 분리 유닛을 세정할 때, 상기 로딩된 분리 유닛으로부터 용리되는 세정 액체를 또다른 분리 유닛의 입구로 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 정화된 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 유닛으로부터 용리된 표적 분자를 하나 이상의 관류 (flow through) 정제 단계에 추가로 적용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기를 포함하는 장치:
- 연결 라인으로 연결되어 액체가 하나의 분리 유닛에서 후속 유닛으로 그리고 최종에서 첫번째 분리 유닛으로 흐를수 있게 하며, 2 개의 분리 유닛 사이의 각각의 연결 라인이 하나 이상의 온/오프 밸브를 포함하는, 동일한 크로마토그래피 매트릭스를 갖는 3 개 이상의 분리 유닛
- 각각의 분리 유닛의 입구에 가까운 분리 유닛 사이에 연결 라인 내의 분지를 통해 각각의 분리 유닛의 출구와 유체 연결상태에 있는 용매 전달 시스템
- 2 개 이상의 분지를 갖는 라인을 포함하는 분리 유닛의 출구에 가까운 분리 유닛 사이에 각각의 연결 라인으로부터 분지된 유체 출구 라인으로서, 각각의 분지는 온/오프 밸브를 갖는 유체 출구 라인. - 본 발명에 따른 방법을 포함하는 단백질의 정제 방법.
- 제 12 항에 있어서, 방법이 하기 단계 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
- 정화
- 바이러스 불활성화
- 관류 정제
- 멸균 여과. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 방법의 2 개 이상의 단계가 그의 지속기간 중 적어도 일부에서 중복되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| EP3037513A1 (de) * | 2015-05-13 | 2016-06-29 | Bayer Technology Services GmbH | Verfahren zur kontinuierlichen elution eines produktes von chromatographiesäulen |
| US11835501B2 (en) | 2015-07-13 | 2023-12-05 | Sartorius Stedim Chromatography Systems Ltd. | Optimizing operating binding capacity for a multiple column chromatography process |
| GB201515339D0 (en) * | 2015-08-28 | 2015-10-14 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | A seperation matrix and a method of seperating antibodies |
| US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
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| EP3455241B1 (en) | 2016-05-11 | 2022-02-23 | Cytiva BioProcess R&D AB | Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix |
| US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
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| US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
| US11519851B2 (en) * | 2016-09-17 | 2022-12-06 | C Technologies Inc. | Monitoring of compounds |
| GB201622343D0 (en) * | 2016-12-29 | 2017-02-15 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | Method in bioprocess purification system |
| CN110267721B (zh) * | 2017-01-30 | 2022-03-01 | 瑞泽恩制药公司 | 用于降低色谱中生物负载的组合物和方法 |
| GB201703116D0 (en) * | 2017-02-27 | 2017-04-12 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | A seperation matrix and a method of seperating antibodies |
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| EP3381529A1 (fr) * | 2017-03-29 | 2018-10-03 | EMD Millipore Corporation | Installation de traitement de liquide biologique |
| GB201710130D0 (en) | 2017-06-26 | 2017-08-09 | Ge Healthcare Bioprocess R & D Ab | A Method of seperation |
| CN107793469B (zh) * | 2017-10-16 | 2021-07-30 | 上海药明生物技术有限公司 | 一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺 |
| GB201806752D0 (en) * | 2018-04-25 | 2018-06-06 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method in bioprocess system |
| EA202190163A1 (ru) * | 2018-07-02 | 2021-03-30 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Системы и способы получения полипептида из смеси |
| JP7527273B2 (ja) * | 2018-08-17 | 2024-08-02 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 多量体タンパク質の量および純度を決定するための方法およびクロマトグラフィーシステム |
| SG11202101860UA (en) | 2018-08-31 | 2021-03-30 | Genzyme Corp | Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes |
| US10981950B2 (en) * | 2019-01-31 | 2021-04-20 | Joanna Pezzini | Therapeutic protein flow kit for a continuous purification system |
| FR3099066B1 (fr) | 2019-07-26 | 2021-08-13 | Novasep Process | Procédé de purification d’une substance cible avec inactivation virale |
| US11906510B2 (en) * | 2020-03-20 | 2024-02-20 | Stanford Junior University | Metabolic profiling by reverse-phase/ion-exchange mass spectrometry |
| EP4126899A1 (en) | 2020-03-25 | 2023-02-08 | Merck Patent GmbH | Reuse of intein-bound resins for protein purification |
| EP4408573A1 (en) | 2021-09-28 | 2024-08-07 | Merck Patent GmbH | Integrated solution for process intensification using inline constantly pressurized tank: "icpt" |
| JP2024535429A (ja) | 2021-09-28 | 2024-09-30 | メルク パテント ゲーエムベーハー | 連続クロマトグラフィ動作中のクロマトグラフィ樹脂をモニタリングするための方法 |
| CN115006884B (zh) * | 2022-06-28 | 2023-08-15 | 江南大学 | 一种在线解耦式模拟移动床分离系统及其分离木糖和阿拉伯糖的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11183459A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-09 | Japan Organo Co Ltd | クロマト分離方法及びクロマト分離装置 |
| JP2010530068A (ja) * | 2007-06-15 | 2010-09-02 | ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー | クロマトグラフィー法 |
| EP2339339A1 (en) * | 2008-09-25 | 2011-06-29 | JSR Corporation | Filler for affinity chromatography |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4603114B2 (ja) * | 1999-09-07 | 2010-12-22 | オルガノ株式会社 | 液体に含まれる複数成分を分離する方法及び装置 |
| US7691645B2 (en) * | 2001-01-09 | 2010-04-06 | Agilent Technologies, Inc. | Immunosubtraction method |
| US20080312425A1 (en) * | 2004-08-30 | 2008-12-18 | Lonza Biologics Plc. | Ion Exchange Chromatography and Purification of Antibodies |
| JP5475284B2 (ja) | 2005-08-03 | 2014-04-16 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 親水性架橋ポリマー |
| EP1775001A1 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Xendo Holding B.V. | Device for chromatographic separations |
| WO2007144476A1 (fr) | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Groupe Novasep | Procede de separation sequence multicolonnes |
| US8362217B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| WO2008079302A2 (en) | 2006-12-21 | 2008-07-03 | Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US8569464B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-10-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| AU2008209404B2 (en) | 2007-01-22 | 2012-08-16 | Genentech, Inc. | Polyelectrolyte precipitation and purification of antibodies |
| US7618539B2 (en) | 2008-03-31 | 2009-11-17 | Ampac Fine Chemicals Llc | Simulated moving bed chromatography for strongly retained compounds |
| SG171764A1 (en) | 2008-12-16 | 2011-07-28 | Millipore Corp | Purification of proteins |
| KR102006097B1 (ko) * | 2010-03-31 | 2019-07-31 | 제이에스알 가부시끼가이샤 | 친화성 크로마토그래피용 충전제 |
| CN101948399A (zh) * | 2010-10-11 | 2011-01-19 | 江南大学 | 一种使用模拟移动床色谱连续分离纯化发酵液中缬氨酸的方法 |
-
2012
- 2012-04-23 EP EP12002828.7A patent/EP2656892A1/en not_active Withdrawn
-
2013
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11183459A (ja) * | 1997-12-25 | 1999-07-09 | Japan Organo Co Ltd | クロマト分離方法及びクロマト分離装置 |
| JP2010530068A (ja) * | 2007-06-15 | 2010-09-02 | ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー | クロマトグラフィー法 |
| EP2339339A1 (en) * | 2008-09-25 | 2011-06-29 | JSR Corporation | Filler for affinity chromatography |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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