KR20150005251A - 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 암세포의 노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 이렇게 암세포의 노화를 촉진함으로써, 자궁경부암, 연골육종암, 섬유육종암 및 대장암 등과 같은 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the extract of Polygoni multiflori radix}

본 발명은 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 암세포의 세포노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제할 수 있는 적하수오 추출물을 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물에 대한 것이다.

세포 노화는 정상 세포가 성장과정에서 일정횟수 분열한 후 더 이상 분열하지 않고, 성장이 멈추는 상태이다. 세포노화는 정상 체세포가 분열하면서 염색체의 텔로미어가 짧아지기 때문에 이를 복제노화 (replicative senescence)라고 한다. 이와 같이 세포 분열과정에서 나타나는 텔로미어 단축과 같은 내부적인 요인 외에도 심한 염증반응, 산화스트레스, DNA 손상, 자외선 또는 방사선 조사, 항암제 노출 등과 같은 다양한 물리, 화학적 자극에 의해서도 세포노화가 일어난다. 세포가 노화되면 세포 모양, 생화학·분자생물학, 핵 등에서 다양한 변화가 관찰된다. 세포가 늙으면 세포 모양이 납작해지면서, 크기가 커지고, 세포질에 과립이 증가하게 된다. 생화학·분자생물학적 변화는 노화연관 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 증가, p53, p16과 같은 암억제 유전자의 발현 증가, IL-1, IL-6, 세포외기질 단백질 분해효소, 싸이토카인 등과 같은 다양한 염증인자의 분비 증가 등이 특징적이다. 핵의 변화는 노화연관 헤테로크로마틴 구조(senescence-associated heterochromatin foci, SAHF)와 DNA 손상 마커인 pH2AX과 같은 DNA 손상 foci 등이 특징적으로 관찰된다.

세포 노화는 조직이나 개체 노화, 조직 재생, 암 발생과 암 억제, 노화 관련 질환 등 다양한 생리 및 병리현상에 기여하는 것으로 알려져 있다. 연령이 증가할수록 백혈구의 텔로미어가 짧아지며, 백혈구의 텔로미어 길이는 당뇨병, 고혈압, 심근경색, 만성심장부전, 간경화, 혈관치매, 동맥경화, 알쯔하이머 질환, 60세 이상에서는 사망률 증가, 기대 수명 등과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 텔로머라제 결손 생쥐의 경우 6세대 지나면 심장질환, 인슐린 저항성, 줄기세포 기능이상, 스트레스 저항성의 감소, 암 발생의 증가 등으로 수명이 감소하였다. 이와 반대로 텔로머라제 결손 생쥐에 텔로머라제를 다시 활성화시켜 주면 노화에 따른 조직의 퇴행성 변화가 개선되는 것으로 알려져 있다. 천연물에서 텔로머라제 활성을 촉진하는 물질이 발굴되었으며, 생쥐에서 암 발생은 증가시키지 않으면서 건강수명을 늘리며, 사람에 대한 임상시험에서 면역세포의 기능을 호전시키는 것으로 보고되었다. 동물 생쥐모델에서 노화세포에서 발현되는 것으로 잘 알려진 p16 유전자를 발현하는 세포를 선택적으로 제거하면 노화관련 질환이 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 세포노화는 조직이나 개체노화 그리고 노화 관련 질환의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 인식되고 있다.

아울러 세포노화는 암을 억제하는 중요한 내부 방어기전으로 제시되고 있다. 암의 발생과 진행에 있어 Ras, Myc, Raf와 같은 다양한 암 유전자들의 비정상적인 활성화와 PTEN, Rb, NF1, VHL과 같은 암 억제 유전자의 불활성화가 매우 중요한 역할을 하고, 많은 암세포들이 세포노화를 유도하는 p53/p21, Rb/p16 암 억제 유전자들의 신호전달경로에 이상을 나타낸다. 특이하게 이러한 암유전자의 활성이 증가하면 세포노화가 촉진되는데 이를 암 유전자에 의한 세포노화 (oncogene-induced senescence, OIS)라고 한다. 암유전자의 활성이 증가하면, 지나친 세포증식으로 인하여 DNA 손상이 축적되는데, 이 과정에서 p53, p16과 같은 암억제 유전자 신호전달경로들이 활성화되면서, 세포노화와 세포사멸이 유도되고, 결국 세포성장이 억제된다. 특히 암 억제 유전자인 p53이 중요한 역할을 하는데, p53은 세포 증식 억제, 세포사멸과 세포노화 유도, 포도당대사 조절 등을 통하여 암의 발생을 억제하는 기능을 담당하고 있다. 생쥐모델에서 간암을 유발한 후, 암세포에서 p53의 발현을 유도하여 세포노화가 일어나면, 암의 성장이 억제되는 것으로 알려져 있다. 아울러 Ras 암유전자에 의한 세포노화가 유도되면, 면역세포들이 노화된 암세포를 제거하여 암 발생을 억제하는 것으로 보고되었다. 이상의 결과로부터 정상세포가 양성 암으로 변화하는 과정에서 세포노화가 나타나게 되는 것은 양성 암세포가 악성 종양세포로 변화하는 것을 억제하는 중요한 기전이 된다. 그리고 양성 암세포가 악성 종양세포로 진행되기 위해서는 어떤 기전을 통해서든 암유전자의 활성으로 나타나는 세포노화를 극복해야 되는 것이다. 따라서 암세포에서 세포노화를 유도할 수 있는 효능을 가진 약물들이 새로운 항암제로 개발될 수 있을 가능성이 제시되고 있다.

한편, 한국공개특허 제10-2011-0062212호는 모발생장촉진 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 12가지 한방추출물(상기 천연한방성분[적하수오 15%중량과 그외 11가지 한방 성분의 각 6%중량(인삼, 천궁, 당귀, 작약, 산뽕잎, 구기자, 복분자, 감초, 솔잎, 녹차, 은행)을 포함하여 추출한 추출물이 81%중량이 되도록 하는 것)]과 2가지 허브추출물액 그리고 초유성분 고단백분리대두분말을 천연광석 이온수에 농축한 후 발효시키고 발효시킨 발효액을 40일간 숙성시켜 나노공법을 적용한 모발성장촉진제에 관해 개시하고 있지만, 이는 적하수오를 포함한 12종의 한약재의 복합 추출물로서 그 용도 또한 다르므로 본원발명과는 그 기술적 구성이 상이하다.

따라서 본 발명자들은 사람 섬유아세포를 이용하여 세포노화를 촉진하는 생약 추출물을 발굴한 후, 적하수오 추출물이 자궁경부암세포, 연골육종세포, 섬유육종세포, 대장암세포 등 다양한 암세포에서 세포노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제하는지 세포수준에서 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 적하수오 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 한다.

상세하게는, 상기 적하수오 추출물은 암세포의 노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 한다. 보다 상세하게는 암세포의 노화 촉진은 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 증가를 측정하는 것을 특징으로 한다.

상세하게는, 상기 암세포는 자궁경부암세포(Hela), 연골육종암세포 (HTB94), 섬유육종암세포(HT1080) 및 대장암세포(HCT116 WT, HCT116 p53-/-, HCT116 p21-/-)가 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학조성물은 암 예방 또는 치료용 약학조성물로서, 자궁경부암, 연골육종암, 섬유육종암 또는 대장암 질환을 예방 또는 치료할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 "적하수오(Polygoni multiflori radix)" 는 잎은 어긋나며 좁은 난형 혹은 심장형이고, 탁엽의 끝은 막질로 줄기를 둘러싼다. 꽃은 작고 많으며 밀집되어 가지가 여러 개인 원추화서에 달리고, 속에 작은 꽃이 2∼4송이 혹은 다시 여러 송이가 피고 꽃은 녹백색 혹은 백색이며, 길이는 6~15cm 가량이고 굵은 부분은 지름이 3~12cm가 되며 표면은 적갈색 또는 자갈색이고 가지런하지 않은 세로홈이 있으며 울퉁불퉁하고 양단에 뿌리의 흔적이 한 개씩 있다. 주산지는 중국의 하남, 호북, 귀주, 사천, 강소, 광서 등지에 분포하며 그 외 절강, 안징, 광동, 산동, 강서, 호남에서도 서식한다. 예로부터 간, 신을 보익하고 혈을 자양하며 풍을 제거하는 효능이 있다고 알려져 있으며 머리가 일찍 희어지는데, 허두, 눈앞이 아찔한데, 허리와 무릎 아픈데, 연약, 근골산통, 유정, 대량의 자궁 출혈, 붕루대하, 만성 학질, 만성 설사, 만성 간염, 옹종, 나력, 장풍, 치질에도 효능을 나타낸다.

적하수오 추출물은 한국생명공학연구원 식물추출물 은행의 생약추출물 번호 CA03-047로서, 한국생명공학연구원 식물추출물 은행에서 구입하여 사용하였지만, 적하수오를 직접 추출하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물인 경우, 상기 약학적 조성물은 상기 적하수오 추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 암의 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.

본 발명은 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 암세포의 세포노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제할 수 있는 적하수오 추출물을 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 적하수오 추출물은 세포노화를 유도하므로 암세포의 성장을 억제할 수 있는 새로운 암 치료제 개발에 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 아드리아마이신으로 처리된 인간 섬유아세포에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, PARP1/2, caspase 3, p53과 p16 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), NAC: N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 2는 인간 섬유아세포에 있어서 세포독성 및 세포노화에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, 세포독성; B, SA-β-gal 활성 염색; C, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; D, PARP1/2, caspase 3, p53과 p16 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), NAC: N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine).
도 3은 암세포에서의 p53, p21 및 p16 단백질의 발현수준을 나타낸다. 세포들을 얻어 단백질을 추출하였다. p53, p21 및 p16 단백질의 수준은 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다.
도 4는 사람 자궁경부암세포 (HeLa)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 5는 사람 연골육종세포 (HTB94)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 6은 사람 섬유육종세포 (HT1080)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 7은 사람 대장암세포 (HCT116 WT)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 8은 p53-결핍된 사람 대장암세포 (HCT116 p53-/-)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).
도 9는 p21-결핍된 사람 대장암세포 (HCT116 p21-/-)에 있어서 세포노화 및 세포 성장에 대한 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 효과를 나타낸다. A, SA-β-gal 활성 염색; B, SA-β-gal 양성 세포의 백분율; C, 세포 성장; D, PARP1/2, caspase 3 및 p53 단백질 발현 변화를 나타낸다. 결과는 각 실험을 독립적으로 3회 이상 반복시행한 후 얻었다. *p<0.05 and **p<0.01 vs DMSO. Cont: 대조군, DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), ADR: 아드리아마이신(adriamycin).

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 사람 섬유아세포에서 아드리아마이신에 의한 세포노화를 촉진하는 생약 추출물 발굴

1. 실험 재료

사람 섬유아세포는 Lonza (Walkersvill, MD, 미국)에서 구입하였다. 사람 자궁경부암세포, 연골육종세포, 섬유육종세포는 한국세포주 은행에서 구입하였다. HCT116 wild type (WT), HCT116 p53-/-, HCT116 p21-/- 세포들은 Johns Hopkins의과대학 Vogelstein 박사로부터 분양받았다. Dubeccos-Modified Eagle's medium (DMEM), 우태아혈청, 항생제 용액 (penicillin-Streptomycin)은 WelGene (대구, 대한민국)에서 구입하였다. p53, p16, caspase3, PARP1/2에 대한 항체는 Santa Cruz Biotech, Inc. (Santa Cruz, CA, 미국)에서 구입하였으며, p21 항체는 Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, 미국)에서 구입하였다. GAPDH 항체는 한국생명공학연구원 권기선 박사로부터 분양받았다. 아드리아마이신은 일동제약주식회사 제품을 사용하였다.

2. 생약 추출물

생약 추출물은 한국생명공학연구원 식물추출물 은행으로부터 구입하였다. 생약의 에탄올 추출물 399종 (CA01-001에서 CA01-100, CA02-001에서 CA02-100, CA03-001에서 CA03-100, CA04-001에서 CA04-100)과 약탕기를 이용한 물 추출액 400종 (CW01-001에서 CW01-100, CW02-001에서 CW02-100, CW03-001에서 CW03-100, CW04-001에서 CW04-100)을 사용하였다. 각 추출물들은 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹여 세포에 처리하였다.

3. 세포 배양

사람 섬유아세포, 자궁경부암세포, 연골육종세포, 섬유육종세포, 대장암세포를 사용하였다. 각 세포는 10% 우태아혈청과 1% 항생제 (penicillin 10,000 unit/ml, stretomycin 10 mg/ml) 가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 직경 100 mm 배양접시에 세포를 2 × 10⁵개로 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 80-90% 정도 세포가 자라면, 트립신-EDTA 용액 (2.5%) 을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 사람 섬유아세포는 계대할 때 마다 세포 수를 측정하여 세포가 몇 회 분열하였는지 분열 횟수를 조사하였다. 세포의 분열 횟수 (population doubling, PD)는 PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)로 계산하였다. 실험에 사용한 세포들은 분열횟수가 사람 섬유아세포의 경우 분열횟수가 35회 미만인 것을 사용하였다.

4. 아드리아마이신 처리에 의한 세포노화 유도

세포 배양액을 제거하고 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하였다. 세포에 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리한 후, 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척하였다. 4일 후, 노화연관 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색으로 세포 노화가 유도됨을 확인하였다.

5. 노화연관 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 염색

세포노화에 대한 생약 추출물의 효과는 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 12 well plate에 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액 500ul에 사람 섬유아세포는 5x10³개, 자궁경부암세포, 연골육종세포, 섬유육종세포, 대장암세포는 1x10⁴개가 되도록 한 후, 각 well에 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액 500ul를 더 첨가하였다. 생약추출물 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)을 50, 100 ug/ml로 처리한 후, 4일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 1×PBS로 2번 씻어준 뒤, 3.7% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 세포를 고정한 후, 고정액을 제거하였다. SA-β-gal 염색 용액 (40 mM citric acid/phosphate [pH 5.85], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂ , X-gal 1 mg/ml)을 각 well 당 500ul를 넣어 주었다. 은박지로 싸서 37℃에서 16~18시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액 (PBS)로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액으로 2분간 염색하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 100개 이상의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율 (%)로 표시하였다.

6. 웨스턴블랏(Western blot) 분석

단백질 (30μg)을 10% SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 이동시킨 후, 5% 전지분유가 포함된 TTBS (0.5% Tween 20 in Tris-buffered saline)에서 1시간 동안 반응시켰다. 니트로셀룰로스 막을 PARP 1/2, caspase3, p53, p21 또는 p16에 대한 일차항체가 포함된 5% 전지분유 TTBS 용액에서 밤새도록 반응시켰다. TTBS 용액으로 3회 세척 한 후, 겨자무 과산화수소(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 3시간 반응시켰다. TTBS로 막을 5분씩 5회 세척 한 후, enhanced chemiluminescence 용액을 이용하여 단백질의 발현을 측정하였다. 각 항체와 반응한 특정 단백질의 양은 LAS-3000 영상장치 (Fujifilm Corp., Stanford, CT, 미국)을 사용하여 측정하였다. 각 실험에 동일한 양의 단백질이 사용되었음은 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease; GAPDH) 항체를 사용하여 확인하였다.

7. 세포 수 측정

12 well plate에 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액 500 ul에 섬유아세포는 5000개/well, 자궁경부암세포, 연골육종세포, 섬유육종세포, 대장암세포를 1×10⁴개 되도록 한 후, 각 well에 분주하였다. 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 10% 우태아혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액 500ul를 더 첨가해주었다. 생약추출물 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)을 50, 100 ug/ml로 처리한 후, 4일 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양액을 제거하고, 세포를 2.5×트립신-EDTA 용액으로 바닥에서 뗀 후, 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하였다.

8. 세포 단백질 추출

각 세포를 60 mm 배양접시에 2×10⁵개로 분주한 후 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 세포의 배양액을 바꿔주고 생약 추출물 분획을 농도별로 4일 동안 처리하였다. 배양액을 제거한 후, 인산완충액으로 1회 세척하였다. 세포 용해 용액 (25mM Tris-HCl [pH 7.6], 150mM Nacl, 1% Tryton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1mM Sodium vanadate, 5mM NaF, protease inhibitor or 1mM PMSF)을 50 ul를 넣었다. 세포 긁게를 이용하여 용액과 세포를 모은 후 미세원침관으로 옮겼다. 얼음에서 30분간 반응시키면서 매 10분마다 용액을 진탕하였다. 12,000xg에서 10분간 원침하여 상청액을 새 튜브로 옮겼다. 용액의 단백질 양은 우혈청알부민을 표준단백질로 사용하여 bicinchoninic acid (BCA) 법 (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, 미국)으로 정량하였다.

9. 통계처리

각 실험은 한번에 3개씩 각각 3회 이상 반복 실험하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계적 유의성은 Student t-test로 분석하였으며, p값이 0.05 이하 (p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 평가하였다.

10. 결과

사람 섬유아세포에서 799가지 생약 추출물들 중에서 아드리아마이신에 의한 세포노화를 촉진하는 효능이 있는 추출물을 발굴하기 위하여, SA-β-gal 활성염색을 하였다. 각 물질들을 녹이는데 사용한 용매인 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)와 세포노화를 억제하는 것으로 알려진 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine; NAC)을 처리하여 물질들의 효능을 비교하였다. 매 실험은 3 반복으로 3회 실험하였다. 이 중에 SA-β-gal 활성을 증가시키는 생약 추출물로CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)을 확인할 수 있었다. CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 SA-β-gal 활성 증가 효능을 추가로 확인하기 위하여 섬유아세포를 아드리아마이신으로 처리한 후, 각 생약 추출물을 50과 100ug/ml로 처리하여 SA-β-gal 활성염색을 하였다. 그 결과 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오) 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켰다 (도 1A 및 도 1B). 따라서 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)이 항암제 처리에 의한 섬유아세포의 세포 노화를 더 촉진시킴을 확인하였다. CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능이 세포사멸과 관련된 PARP1/2, caspase 3 또는 암 억제 유전자인 p53과 p16과 단백질의 발현에 영향을 미치는지 웨스턴블랏(Western blot) 분석으로 조사하였다. 그 결과 PARP1/2, caspase 3, p53과 p16 단백질 발현변화가 관찰되지 않아 추출물에 의한 세포노화 촉진은 세포사멸이나 암 억제 유전자의 발현을 통하여 일어나지 않음을 추정할 수 있었다 (도 1C).

< 실시예 2 > 사람 섬유아세포에서 CA03 -047의 세포독성조사

1. 3-(4, 5-디메틸티아졸-2일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; MTT) 분석

사람 섬유아세포를 100ul 배양액에 500개씩 96 well plate의 각 well에 분주하였다. 하루가 지난 후 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)을 농도별 (10, 25, 50, 100 ul/ml)로 처리하였다. 4일 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양시켰다. 각 well에 0.1% MTT 용액을 50 ul씩 넣고 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시켰다. 배양액과 MTT 용액을 제거 한 후, DMSO 100ul를 첨가하여 결정을 녹였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2. 결과

암세포에서 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능을 조사하기 전에 사람 섬유아세포에서 CA03-047이 세포독성을 나타내는지 조사하였다. 사람 섬유아세포에서는 100 ug/ml까지 증가시켜 처리하였을 때, DMSO에 비해 유의한 수준의 세포독성은 나타나지 않았다(도 2A). 사람 섬유아세포에서 세포노화를 촉진하는지 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 그 결과 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색이 증가하여, 세포노화를 촉진함을 확인하였다(도 2B 및 도 2C). CA03-047을 20시간 동안 처리한 후 PARP1/2, caspase3, p53, p16 단백질 발현을 조사한 결과, 각 단백질의 발현 변화를 관찰할 수 없었다 (도 2D).

< 실시예 3 > 사람 자궁경부암세포( HeLa ), 연골육종암 ( HTB94 ), 섬유육종암 세포( HT1080 ), 대장암세포 ( HCT116 WT , HCT116 p53 -/-, HCT116 p21 -/-)에서 p53 , p21, p16 의 발현 조사

암세포에서 추출물의 세포노화 촉진 효능을 조사하기 전에 각 암세포에서 p53, p21, p16 암억제유전자의 발현정도를 웨스턴 블랏(Western blot)법으로 조사하였다. 그 결과 HeLa세포에서는 p53, p21, p16의 발현이 매우 관찰되지 않았으며, HTB94 세포에서는 p53과 p21의 발현이, HT1080세포에서는 p53의 발현이, HCT116 WT세포에서는 p53과 p21의 발현이, HCT116 p53-/-에서는 p21의 발현이, HCT116 p21-/-세포에서는 p53의 발현이 각각 관찰되었다(도 3).

< 실시예 4 > 암세포에서 CA03 -047의 세포노화 촉진 효능 조사

1. 사람 자궁경부암세포 (HeLa)에서 추출물의 세포노화 촉진 효능

사람 자궁경부암세포를 대상으로 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능을 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 생약 추출물을 녹이는데 용매인 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide; DMSO)를 음성 대조군으로 암세포의 세포노화를 촉진하며 성장을 저해하는 것으로 알려진 아드리아마이신을 양성 대조군으로 처리하여 CA03-047의 효과를 비교하였다. 그 결과 CA03-047 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켜, 세포노화를 촉진시킴을 확인하였다(도 4A 및 도 4B). 세포노화가 촉진되면 세포 성장이 감소할 것이므로 CA03-047에 의한 세포성장을 세포 수를 헤아려 조사하였다. 그 결과 세포성장 역시 추출물의 농도의존적으로 감소하였다(도 4C). CA03-047의 세포노화 촉진 및 세포성장 저해 효능은 항암제로 잘 알려진 아드리아마이신보다 높았다. CA03-047 처리 후, PARP1/2, caspase3, p53 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏법으로 조사하였으나 차이가 없었다(도 4D).

2. 사람 연골육종세포 (HTB94)에서 추출물의 세포노화 촉진 효능

사람 연골육종세포를 대상으로 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능을 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. CA03-047 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켜, 세포노화를 촉진시킴을 확인하였다(도 5A 및 도 5B). 세포성장 역시 CA03-047의 농도의존적으로 감소하였다(도 5C). CA03-047 처리 후, PARP1/2, caspase3, p53 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏법으로 조사한 결과, 각 단백질의 발현 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 5D).

3. 사람 섬유육종세포 (HT1080)에서 추출물의 세포노화 촉진 효능

사람 섬유육종세포를 대상으로 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능을 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. 4가지 추출물은 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켜, 세포노화를 촉진시킴을 확인하였다(도 6A 및 도 6B). 마찬가지로 세포성장 역시 CA03-047 농도의존적으로 감소하였다(도 6C). CA03-047 처리 후, PARP1/2, caspase3, p53 단백질 발현 정도는 큰 변화가 없었다(도 6D).

4. 사람 대장암세포 (HCT116 WT, HCT116 p53-/-, HCT116 p21-/-)에서 추출물의 세포노화 촉진 효능

사람 대장암세포는 야생형 HCT116세포와 암 억제 유전자 p53과 p21이 각각 결손된 HCT116 변이주를 대상으로 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)의 세포노화 촉진 효능을 조사하였다.

HCT116 WT세포에서는 CA03-047은 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켜, 세포노화를 촉진시킴을 확인하였다(도 7A 및 도 7B). 세포 성장 역시 CA03-047 농도 의존적으로 감소하였다(도 7C). PARP1/2, caspase3, p53 단백질 발현 정도를 조사한 결과, 각 단백질의 발현변화는 관찰할 수 없었다(도 7D).

HCT116 p53-/-세포에서는 CA03-047은 농도 의존적으로 SA-β-gal 활성 염색을 증가시켜, 세포노화를 촉진시킴을 확인하였다 (도 8A 및 도 8B). 세포 성장 역시 CA03-047 농도 의존적으로 감소하였다(도 8C). CA03-047 처리에 따른 PARP1/2, caspase3, p16 단백질 발현 정도는 큰 변화가 없었다(도 8D).

HCT116 p21-/-세포에서는 CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)이 SA-β-gal 활성 염색을 증가시키지 않았다. 세포 성장은 CA03-047 농도 의존적으로 감소하였다 (도 9C). CA03-047 (Polygoni multiflori radix, 적하수오)에 의해 PARP1/2과 caspase3의 발현이 감소하였다(도 9D).

Claims (6)

1. 적하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 적하수오 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 적하수오 추출물은 암세포의 노화를 촉진하여 암세포의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 암세포의 노화 촉진은 노화 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-gal) 활성 증가를 측정하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 암세포는 자궁경부암세포(Hela), 연골육종암세포 (HTB94), 섬유육종암세포(HT1080) 및 대장암세포(HCT116 WT, HCT116 p53-/-, HCT116 p21-/-)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 연골육종암, 섬유육종암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
   

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