KR20150003862A

KR20150003862A - 대사 장애를 치료하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20150003862A
Application number: KR20147032772A
Authority: KR
Inventors: 아르빈드 사클라니; 닐레쉬 말푸레; 파리크쉬트 가이콰드; 사티쉬 남데오 사원트; 투카람 키산라오 마네; 소메쉬 샤르마
Original assignee: 피라말 엔터프라이지즈 리미티드
Priority date: 2012-04-23
Filing date: 2013-04-22
Publication date: 2015-01-09
Also published as: AU2013254329A1; IN2014MN02269A; RU2014145931A; US20150290265A1; MX2014012742A; CA2870907A1; CN104244962A; JP2015514797A; EP2841080A4; EP2841080A1; IL235317A0; TW201343174A; NZ701133A; BR112014026326A2; WO2013160811A1; SA113340494B1

Abstract

본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카(Terminalia elliptica)의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로 포함하고, 선택적으로, 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물(herbal composition)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 사용하여 대사 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대사 장애를 치료하기 위해 하나 이상의 추가 치료 활성제와 함께 사용하기 위한, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

대사 장애를 치료하기 위한 조성물{COMPOSITION FOR TREATING METABOLIC DISORDERS}

본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카(Terminalia elliptica)의 추출물을 활성 성분으로 단독으로 포함하거나 또는 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 포함하는 약초 조성물(herbal composition)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 대사 장애(metabolic disorder)의 치료에 유용하다. 또한, 본 발명은, 약초 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

대사 장애는, 신체가 탄수화물, 지질, 단백질, 또는 핵산을 적절히 대사하지 못할 때 발생하는 장애 또는 결함이다. 대부분의 대사 장애는, 세포가 대사 작용을 수행하기 위해 필요한 효소의 실종(missing) 또는 기능장애를 일으키는 유전적 돌연변이에 의해 일어난다. 대사 장애의 예는, 비만(obesity), 과도한 신체 지방, 고지혈증(hyperlipidemia), 과지방단백혈증(hyperlipoproteinemia), 과혈당(hyperglycaemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 인슐린 저항성(insulin resistance), 포도당 과민증(glucose intolerance), 및 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 특히 2형 당뇨병(type 2 diabetes)을 포함한다. 기존의 약물과 관련된 단점을 고려하면, 대사 장애를 치료하기 위한 새로운 약물을 제공/개발할 필요성이 있다.

대사 장애를 치료하기 위한 새로운 약물 후보를 선택 및 개발하기 위해, 두 개의 새로운 효소 타깃인, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제-1(Diacylglycerol Acyltransferase-1)(DGAT-1)과 스테아로일-코엔자임 불포화효소-1(Stearoyl-CoA Desaturase-1)(SCD-1)이 사용될 수 있다. 이러한 효소는, 에너지가 신체에 저장되는 주요 형태인 트리글리세리드(triglyceride)의 합성에서 주요한 역할을 한다.

DGAT-1은, 디아실글리세롤(DAG)과 지방 아실-코엔자임 A(CoA)를 트리글리세리드로 변환시키는, 공정의 최종 단계에서 트리글리세리드의 생합성(biosynthesis)을 촉매화하는 내부 원형질 막(endoplasmic membrane)에 결합된 효소이다. 세포의 필요로 트리글리세리드를 생성하는 필요성 때문에 모든 세포 유형에서 효소 활성(enzymatic activity)이 존재한다. DGAT-1은 장과 지방(adipose)에서 크게 발현되고 간과 근육에서는 더 낮은 수준으로 발현된다. 이러한 조직(장, 지방, 간, 및 근육) 각각에서 DGAT-1의 억제는 트리아실글리세롤 합성을 억제할 것이고 인간의 대사 질병에서 과도한 지질 축적의 병리 생리학(pathophysiology)을 역전시킬 수 있다 {Expert Opin. Ther. Patents, 17(11), 1331-1339, 2007}.

스테아로일-코엔자임 불포화효소-1(SCD-1)은, 지질 대사의 제어에서 주요한 효소로 기술되었고 잠재적인 새로운 치료 타깃을 나타낼 수 있다. SCD-1은 포화 지방산으로부터 단일불포화 지방산의 생합성을 촉매화하는 속도 제한 효소(rate-limiting enzyme)이다. SCD-1의 바람직한 기질인, 스테아레이트(C18:0)와 팔미테이트(C16:0)는, 올레산염(oleate)(C18:1)과 팔미토일리에이트(palmitoyleate)(C16:1)로 각각 변환된다. 이러한 단일불포화 지방산은, 트리글리세리드, 콜레스테릴 에스테르, 인지질, 및 왁스 에스테르(wax ester)를 포함하는 여러 지질의 주요 성분으로 간주된다. 실험 동물의 연구는, 이러한 효소의 활성을 억제 또는 감소시키는 것이 비만, 당뇨병, 및 관련 합병증의 발달에 대한 저항을 일으킴을 암시한다 {유럽 약학 저널(European Journal of Pharmacology), 618, 28-36, 2009, 유럽 약학 저널, 650, 663-672, 2011}.

현대 의학의 시대에, 약초 재료와 식물은 약물 발견 및 개발에 계속해서 중요 역할을 한다. 식물에서 얻어진 미정제 또는 가공 생성물은, 작은 합성 분자인 약물과 비교해서 역효과를 더 적게 갖거나 또는 전혀 갖지 않는 것으로 생각되기 때문에, 식물을 기초로 한 약물(plant-based medicines)에 대한 요구는 계속 증가하고 있다.

"터미날리아(Terminalia)"는, 세계의 열대 지역에 분포된 약 백여 종을 포함하는 꽃 식물 과(flowering plant family) 콤브레타과(Combretaceae)의 거대 나무의 속(genus)이다. 터미날리아 속(Terminalia genus)의 가장 일반적으로 알려진 식물은, 터미날리아 벨리리카(Terminalia bellirica), 터미날리아 카타파(Terminalia catappa), 터미날리아 파니쿨라타(Terminalia paniculata), 터미날리아 시트리나(Terminalia citrina), 터미날리아 펠로카르파(Terminalia phellocarpa), 터미날리아 코펠란디(Terminalia copelandii), 터미날리아 브라시(Terminalia brassi), 터미날리아 이보렌시스(Terminalia ivorensis), 터미날리아 수페르바(Terminalia superba), 터미날리아 아르주나(Terminalia arjuna), 터미날리아 엘립티카(Terminalia elliptica), 및 터미날리아 체불라(Terminalia chebula)이다. 이러한 속(genus)의 나무는 특히 이차 대사물질의 공급원, 예를 들어, 사이클릭 트리테르펜(cyclic triterpene)과 그 유도체, 플라보노이드(flavonoid), 탄닌산(tannins), 및 기타 방향족 물질로 알려져 있다. 식물인 터미날리아 벨리리카로부터 얻어진 추출물, 특히, 씨가 없는 과실로부터 얻어진 추출물은, α-글루코시다아제(glucosidase) 억제 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (일본 출원 공개 번호 JP 2006-188486). JP 2006-188486에는, 식물인 터미날리아 체불라의 과실이 약한 α-글루코시다아제 억제 효과를 나타내었음이 또한 보고되어 있다.

터미날리아 엘립티카는 터미날리아의 종으로서, 인도, 네팔, 방글라데시, 미얀마, 태국, 라오스, 캄보디아, 및 베트남의 남아시아 및 동남아시아가 원산지이다. 터미날리아 엘립티카의 동의어는, 터미날리아 토멘토사(Terminalia tomentosa), 터미날리아 크레눌라타(Terminalia crenulata), 터미날리아 알라타(Terminalia alata), 터미날리아 코리아세아나(Terminalia coriaceana), 및 펜탑테라 크레눌라타(Pentaptera crenulata)를 포함한다.

터미날리아 엘립티카는, 일 미터 직경의 줄기를 갖고, 30미터 높이까지 자라는 거대한 낙엽수(deciduous tree)이다. 터미날리아 엘립티카의 나무껍질(bark)은 거칠고 깊게 갈라져 있다. 외부 표면은 색이 옅은 갈색 내지 짙은 갈색이고, 내부 표면은 색이 짙은 갈색 내지 검정이며, 매끄럽고 세로 방향으로 줄무늬가 있다. 나무껍질은 쓰고 지혈성이 있으며, 궤양(ulcer), 골절(fracture), 출혈(haemorrhage), 및 기관지염(bronchitis)을 치료하는데 유용하다. 나무껍질은 이뇨 및 강심(cardiotonic) 특성 모두를 갖는다. 나무껍질을 달인 즙(decoction)은 이완성 설사(atonic diarrhoea)에서 체내 섭취되고, 약한 무통성 궤양(indolent ulcer)에 도포로 국부적으로 사용된다 {인도 약용 식물 용어사전(Glossary of Indian Medicinal Plants), CSIR, 뉴델리, ISBN: 8172361262, 1956}. 수스루타(Sushruta)는 뱀에 물린 상처의 치료에 식물의 재(ash)를 추천한다 (인도 약용 식물, 데라둔, 인도. Vol.II, 페이지 1028, 1984).

터미날리아 엘립티카의 잎은 타사르 실크(tassar silk)를 생성하는 안테레아 파피아(Antheraea paphia)(누에)에 의해 음식으로 사용된다. 터미날리아 엘립티카의 꽃은 옅은 황색의 자웅동체(hermaphrodite)이고 스파이크(spike) 또는 말단 원추 꽃차례(terminal panicle)에 존재한다. 꽃이 피는 시기는 3월부터 6월까지이다.

상기 본 명세서에서는, 2형 당뇨병 및 비만과 같은 대사 장애의 유행이 증가하는 것을 고려해서, 대사 장애를 효과적으로 치료하기 위한 신규 조성물과 방법에 대한 계속된 필요성이 존재하는 것으로 지적되었다. 사실상, 이러한 문제에 대한 해결책을 찾기 위한 본 발명의 발명자의 노력은, 이중 DGAT-1 및 SCD-1 억제 활성을 가져서, 대사 장애의 치료에 유용한, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물을 포함하는 약초 조성물을 생기게 하였다.

본 발명의 일 양상에 따라, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는, 대사 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 양상에 따라, 추가 치료 활성제와 함께 사용하기 위한, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는, 대사 장애를 치료하기 위한 조성물이 제공된다.

다른 추가 양상에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자의 대사 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

다른 추가 양상에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자의 대사 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 추가 치료 활성제와 함께 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 양상에 따라, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량과 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법이 제공된다.

본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는, 대사 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하는 효과를 갖는다.

본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 변화와 변형은 이 기술 분야의 당업자에게 분명하게 될 것이기 때문에, 상세한 설명과 특정 예는 본 발명의 실시예를 나타내지만 예시를 위해서만 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 이 기술 분야의 당업자는, 본 명세서의 설명을 기초로, 본 발명을 그 최대 한도까지 활용할 수 있다. 다음의 특정 실시예는 단지 예시적으로 해석되어야 하고, 무엇이든 임의의 방식으로 기재 내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.

별도로 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는, 본 발명이 속하는 이 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

"대사 장애(metabolic disorder)"라는 용어는, 신체가 탄수화물, 지질, 단백질, 또는 핵산을 적절히 대사하지 못할 때 발생하는 장애 또는 결함을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 대사의 이상에 관한 모든 장애는 "대사 장애"라는 용어에 포함된다. 대사 장애라는 용어는, 인슐린 저항성, 과혈당증, 진성 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증(dyslipidemia), 고인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerotic disease), 다낭성난소증후군(polycystic ovary syndrome), 관상 동맥 질병(coronary artery disease), 대사 증후군(metabolic syndrome), 고혈압, 또는 비정상적인 플라스마 리포단백질(abnormal plasma lipoprotein), 트리글리세리드와 연관된 관련 장애, 또는 췌장의 베타 세포 재생(pancreatic beta cell regeneration)과 같은 포도당 레벨(glucose level)과 관련된 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"라는 용어는, 예방(예방을 위한) 및 일시적인 치료를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 조성물에 사용된 캐리어, 희석제, 부형제, 및/또는 염이 제제(formulation)의 다른 성분과 화합성이 있어야만 하고, 그 수용체에 유독하지 않아야 함을 의미한다.

"약초 조성물(herbal composition)" 또는 "조성물"이라는 용어는 호환 가능하게 사용되고, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 단독으로 또는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어 또는 부형제와 함께 포함하는 조성물을 나타낼 수 있다. "단독으로"라는 용어는, 조성물이 임의의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어가 첨가되지 않고 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물만을 함유하고 있음을 추가로 나타낼 수 있다. "조성물"이라는 용어는, 넓은 의미로 해석되어야 하고, 의약품(pharmaceutical products), 예를 들어, 의도한 표시에 관하여 라벨을 지니고 있는 의약품으로 판매되는지, 일반 의약품(over the counter)으로 판매되는지, 또는 식물 의약품(phytopharmaceutical)으로 판매되는지 치료 효과를 이루고자 하는 목적으로 의도된 임의의 조성물을 포함한다는 것을 유의해야 한다.

본 명세서에서 사용된 "터미날리아 엘립티카"라는 용어는, 터미날리아 토멘토사, 터미날리아 크레눌라타, 터미날리아 알라타, 터미날리아 코리아세아나, 및 펜탑테라 크레눌라타와 같은 그 모든 동의어를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용 가능한 캐리어"라는 용어는, 비 독성, 불활성 고형, 반고형, 희석, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제제 보조제를 의미한다. 약제학적으로 허용 가능한 캐리어로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는, 락토오스, 글루코오스, 및 수크로오스와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스와 그 유도체; 몰트(malt), 젤라틴; 뿐만 아니라, 라우릴 황산 나트륨 및 스테아르산 마그네슘과 같은 다른 비독성의 화합성(compatible) 윤활제, 뿐만 아니라, 착색제, 이형제(releasing agent), 코팅제(coating agent), 감미제, 착향제, 및 방향제이고; 방부제와 산화방지제가 또한 제제 형성자(formulator)의 판단에 따라 조성물에 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "치료 유효량"이라는 용어는, 추출물("터미날리아 엘립티카" 추출물) 또는 추출물을 함유하는 조성물의 양을 의미하는데, 이 양은, 올바른 의료 판단의 범위 내에서, 조절되거나 치료될 상태(condition)의 긍정적인 변화를 충분히 유발하는데 충분하지만, 만일 존재한다면 (적절한 이득/위험의 비), 부작용을 피하기 위해 충분히 낮다. 추출물 또는 조성물의 치료 유효량은, 치료 중인 특별한 상태, 예를 들어, 진성 당뇨병 또는 비만, 최종 사용자의 나이와 물리적인 상태, 치료/예방 중인 상태의 심각성, 치료의 기간, 동반하는 치료의 성질, 사용된 특별한 약제학적으로 허용 가능한 캐리어, 및 이와 유사한 인자에 따라 달라질 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 모든 백분율은 별도 명시되지 않으면 중량을 기준으로 한다.

상세한 설명 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태는, 내용이 별도로 분명하게 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다는 것을 유의해야 한다.

본 명세서에 사용된 "터미날리아 엘립티카 추출물" 또는 "터미날리아 엘립티카의 추출물"이라는 용어는, 식물인 터미날리아 엘립티카의 임의의 부분에 존재하는 화합물의 블렌드(blend)를 의미한다. 이러한 화합물은, 이 기술 분야에서 잘 알려진 추출 절차를 사용하여, 예를 들어, 저가 알코올(lower alcohol)(예를 들어, 메탄올 또는 에탄올), 아세트산 에틸과 같은 알킬 에스테르, 디에틸 에테르와 같은 알킬 에테르, 아세톤과 같은 알킬 케톤, 클로로포름, 석유 에테르, 헥산 및/또는 물과 같은 수성 용매와 같은 유기 용매를 사용하는 추출 절차를 실행하여, 식물의 나무껍질, 잔가지, 줄기, 나무, 잎, 및 과실과 같은 식물의 임의의 부분으로부터 추출될 수 있다. 식물 재료는 또한 적절한 비의 용매 혼합물, 예를 들어, 헥산-아세트산 에틸(1:1), 클로로포름-메탄올(1:1), 또는 메탄올-물(3:1)을 사용하여 추출될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "피험자(subject)"라는 용어는 동물을 가리키고, 구체적으로 포유류를 가리키며, 보다 구체적으로는 인간을 가리킨다. 본 명세서에 사용된 "포유류"라는 용어는, 인간을 포함해서, 피부가 털(hair)로 덮여있고, 암컷(female)의 경우, 새끼에게 영양분을 공급하기 위해 젖을 생성하는 젖샘(mammary gland)을 특징으로 하는, 포유강(class Mammalian)의 온혈 척추 동물을 가리킨다. 포유류라는 용어는, 고양이, 개, 토끼, 곰, 여우, 늑대, 원숭이, 사슴, 쥐, 돼지, 및 인간과 같은 동물을 포함한다.

일 실시예에서, "터미날리아 엘립티카 추출물"을 제조하기 위한 방법은, 알코올, 예를 들어, 메탄올을 용매로 사용하는 것을 필요로 한다.

예를 들어, 추출물은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 임의의 부분, 예를 들어, 나무껍질의 추출에 의해 얻어질 수 있다.

일 실시예에서, 추출물은, 메탄올을 용매로 사용하여, 식물인 터미날리아 엘립티카의 분쇄된 나무껍질로부터 얻어진다.

일 실시예에서, 추출물은, 적절한 비의 용매 혼합물을 사용하여, 식물인 터미날리아 엘립티카의 분쇄된 나무껍질로부터 얻어진다.

일 실시예에서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 분쇄된 나무껍질은 서로 다른 비의 메탄올-물 혼합물을 사용하여 추출될 수 있고, 예를 들어, 메탄올-물(9:1) 혼합물, 메탄올-물(3:1) 혼합물 또는 메탄올-물(1:1) 혼합물이 추출을 위해 사용될 수 있다.

식물인 터미날리아 엘립티카를 제조하는 공정은 다음의 종래 접근법에 의해 대규모 제조를 위해 용이하게 규모가 확대될 수 있다.

터미날리아 엘립티카 추출물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)와 같은 종래 기술을 사용하여 표준화될 수 있다. "표준화 추출물"이라는 용어는, 추출물에 존재하는 특징적인 생체 활성 성분(들) 또는 생체 활성 마커(bioactive marker)(들)를 식별하여 표준화된 추출물을 가리킨다.

본 명세서에 사용된 "활성 성분"이라는 용어는, 화합물의 블렌드를 함유하는 터미날리아 엘립티카 추출물 또는 하나 이상의 생체 활성 화합물(생체 활성 마커)을 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 가리킨다.

생체 활성 마커 또는 생체 활성 성분은, 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 여러 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 생체 활성 마커는 생체 활성 안내 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제 및 분취용(preparative) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 식물인 터미날리아 엘립티카 추출물로부터 분리될 수 있다. 생체 활성 마커는 스펙트럼 데이터(spectral data)의 분석을 특징으로 할 수 있다.

"생체 활성 마커"라는 용어는 약제 활성(pharmaceutical activity)의 허용 가능한 정도와 상호 관련된 활성 화합물의 특징{또는 식물화학 프로파일(phytochemical profile)}을 정의하기 위해 본 명세서에 사용된다. 활성 화합물인 "생체 활성 마커"는, 안내된 생체 활성에 의해 식물인 터미날리아 엘립티카로부터 얻어진 추출물로부터 분리될 수 있다.

분리된 화합물(생체 활성 마커)은, 질량 스펙트럼(MS), 적외선(IR), 및 핵 자기 공명(NMR) 분광 데이터와 같은 스펙트럼 데이터의 분석을 특징으로 할 수 있다.

일 실시예에서, 식물인 터미날리아 엘립티카로부터 분리된 생체 활성 마커는, 엘라그산(ellagic acid), 4-O-알파-L-람노피라노시드(rhamnopyranoside)(본 명세서에서는 이후 "화합물 1"로 지칭됨)로 특징이 기술되었다.

추출물의 생물학적 활성 결정은 여러 가지 잘 알려진 생물학적 생체외 및 생체내 분석(assay)을 사용하여 실행될 수 있다. 예를 들어, 추출물의 예비 생체외 활성 결정은, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제-1(DGAT-1) 분석과 스테아로일-코엔자임 불포화효소-1(SCD-1) 분석 또는 트리글리세리드 합성 분석과 같은 분석을 사용하여 실행될 수 있다. 생체내 활성은 고지방식(high fat diet)(HFD) 유도 비만 모델과 같은 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량과 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 표준화 추출물(standardized extract)과 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물에 관한 것이다.

"표준화 추출물"이라는 용어는, 식물, 예를 들어, 특정한 양의 화합물을 생체 활성 마커로 함유하도록 처리된 "터미날리아 엘립티카"의 추출물을 가리키는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 본 발명의 문맥에서, 표준화 추출물이라는 용어는, 특정한 양의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 가리킨다. 표준화 추출물에 존재하는 특정한 양의 화합물 1은 0.01%부터 10%까지 또는 0.05%부터 5%까지 또는 0.15%부터 2%까지 달라질 수 있다.

일 실시예에서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 표준화 추출물은 0.01% 내지 10.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유한다.

다른 실시예에서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 표준화 추출물은 0.05% 내지 5.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유한다.

다른 실시예에서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 표준화 추출물은 0.15% 내지 2.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유한다.

다른 실시예에서, 본 발명은, 0.01% 내지 10.0%의 화합물 1(엘라그산, 4-O-알파-L-람노피라노시드)을 생체 활성 마커로 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카의 표준화 추출물과, 선택적으로, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 나무껍질 추출물의 치료 유효량과, 선택적으로, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 줄기 추출물의 치료 유효량과, 선택적으로, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

본 발명의 약초 조성물은 5% 내지 100%의 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명은, 45% 내지 75%의 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

본 발명의 약초 조성물은, 적어도 0.01% 내지 10.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카로부터 얻어진 추출물을 5% 내지 100% 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명은, 적어도 0.05% 내지 5.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 45% 내지 75% 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명은, 적어도 0.15% 내지 2.0%의 화합물 1을 생체 활성 마커로 함유하는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을 45% 내지 75% 포함하는 약초 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명은, 대사 장애를 치료하기 위한 약물을 제조하기 위해, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 조성물에 함유된 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물은 표준화된 추출물이다.

터미날리아 엘립티카 추출물은 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 혼합되고 치료 제형(therapeutic dosage form)으로 제제화된다.

식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는 조성물은, 예를 들어, 알약, 정제, 코팅 정제, 캡슐, 분말, 과립, 일릭서(elixir) 또는 시럽의 형태로, 경구 투여될 수 있다.

5 내지 100 중량%의 터미날리아 엘립티카 추출물을 함유하는 경구 조성물은, 종래 방법을 사용하여, 추출물을 약제학적으로 허용 가능한 캐리어(들)와 완전하게 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경피 투여(transdermal administration)를 위해 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 대사 장애의 치료를 위해 제공된다.

일 실시예에서, 대사 장애는, 인슐린 저항성, 과혈당증, 진성 당뇨병, 비만, 포도당 과민증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 고인슐린혈증, 아테롬성 동맥경화증, 다낭성난소증후군, 관상 동맥 질병, 대사 증후군, 고혈압, 비정상적인 플라스마 리포단백질, 트리글리세리드와 연관된 장애, 또는 췌장의 베타 세포 재생과 관련된 장애로부터 선택된다.

다른 실시예에서, 대사 장애는, 인슐린 저항성, 진성 당뇨병, 과혈당증, 대사 증후군, 포도당 과민증, 비만, 이상지질혈증, 비정상적인 플라스마 리포단백질, 트리글리세리드와 연관된 장애, 또는 췌장의 베타 세포 재생과 관련된 장애로부터 선택된다.

실시예에서, 상기 조성물은 진성 당뇨병의 치료를 위해 제공된다.

"진성 당뇨병" 또는 "당뇨병"이라는 용어는, 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 못하거나, 신체가 췌장이 생성하는 인슐린을 효과적으로 사용하지 못할 때 발생하는 만성 질병 또는 상태를 나타낸다. 이는 혈액에서 포도당의 농도 증가를 가져온다 (과혈당증). 당뇨병의 두 가지 주요 형태는, 1형 당뇨병(인슐린 의존성 진성 당뇨병)과 2형 당뇨병{비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM)}이다. 1형 당뇨병은, 췌장의 인슐린-생성 β-세포가 파괴되고, 이것이 포도당 사용을 조절하는 호르몬인 인슐린의 절대적인 부족을 가져오는 자가면역 질병(autoimmune condition)이다. 2형 당뇨병은 흔히 정상, 또는 심지어 높은 수준의 인슐린에 직면하여 발생하고, 조직이 인슐린에 적절하게 반응하지 못하는 것으로부터 생길 수 있다. 다른 범주의 당뇨병은, 임신성 당뇨병(gestational diabetes)(임신 중에 발달하는 과혈당증 상태)과, "기타" 희귀 원인{유전적 증후군, 췌장염(pancreatitis)과 같은 후천적 과정, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 같은 질병, 특정 약물에 대한 노출, 바이러스, 및 알려지지 않은 원인}을 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 당뇨병 또는 진성 당뇨병이라는 용어는, 2형 당뇨병{비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM)}을 가리킨다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 비만의 치료를 위해 제공된다.

일 실시예에서, 상기 조성물은 이상지질혈증의 치료를 위해 제공된다.

일 실시예에서, 상기 조성물은, 비정상 플라스마 리포단백질, 트리글리세리드와 연관된 장애와 관련된 대사 장애의 치료를 위해 제공된다.

일 실시예에서, 상기 조성물은, 췌장의 베타 세포 재생과 같은 포도당 레벨과 관련된 대사 장애의 치료를 위해 제공된다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은, 대사 장애의 치료에 사용하기 위해, 적어도 하나의 추가 치료 활성제와 함께 사용하기 위한, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은, 대사 장애의 치료에 사용하기 위해, 적어도 하나의 추가 치료 활성제와 함께 사용하기 위한, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량과 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물과 결합될 수 있는 치료 활성제는, 칼로필룸 이노필룸(Calophyllum inophyllum), 프테로스페르뮴 아세리폴리움(Pterospermum acerifolium), 티노스포라 카르디폴리아(Tinospora cardifolia), 캡시쿰 아눔(Capsicum annum), 가레가 오피시나리스(Galega officinalis) 또는 알리움 사티붐(Allium sativum)으로부터 선택된 식물 추출물로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물과 결합될 수 있는 치료 활성제는, 오를리스타트(orlistat), 피오글리타존(pioglitazone), 로시글리타존(rosiglitazone), 글리벤클라마이드(glibenclamide), 글리피지드(glipizide), 글리메피라이드(glimepiride), 레파글리니드(repaglinide), 나테글리니드(nateglinide), 또는 메트포민(metformin)과 같은 알려진 치료제로부터 또한 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은, 칼로필룸 이노필룸, 프테로스페르뮴 아세리폴리움, 티노스포라 카르디폴리아, 캡시쿰 아눔, 가레가 오피시나리스 또는 알리움 사티붐으로부터 선택된 식물의 추출물로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 추가 치료제 및 오를리스타트, 피오글리타존, 로시글리타존, 글리벤클라마이드, 글리피지드, 글리메피라이드, 레파글리니드, 나테글리니드, 또는 메트포민으로부터 선택된 알려진 약물과 결합될 수 있다.

본 발명은 또한 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량과, 선택적으로 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 조성물을, 선택적으로 구강 경로에 의해 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약초 조성물은, 활성 성분, 즉, 표준화 추출물일 수 있는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물을, 분말, 알약, 정제, 코팅 정제, 펠릿(pellet), 과립, 캡슐, 용액, 에멀션, 현탁액(suspension), 일릭서, 시럽, 및 사용에 적합한 임의의 이와 다른 형태를 위해 사용 가능한 비독성의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어(들)와 혼합하여, 경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 제제는, 활석(talc), 물, 포도당, 락토오스, 수크로오스, 검 아카시아, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 3규산 마그네슘, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드 실리카, 감자 전분, 요소(urea), 및 셀룰로오스와 그 유도체(카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스, 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은); 몰트; 젤라틴; 뿐만 아니라, 라우릴 황산 나트륨 및 스테아르산 마그네슘과 같은 다른 비독성의 화합성 윤활제, 이형제, 코팅제, 및 제조물을 고형, 반고형 또는 액체 형태로 제조하는데 사용하기 위해 적합한 다른 부형제를 포함한 것을 포함하고, 또한, 보조제, 안정화제, 증점제(thickening agent), 및 착색제가 사용될 수 있다. 정제 또는 캡슐와 같은 고형 조성물을 제조하기 위해, 추출물은 약제학적 캐리어(예를 들어, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 인산 2칼슘 또는 검과 같은 종래의 정제화 성분) 및 이와 다른 약제학적 희석제(예를 들어, 물)와 혼합되어, 고형 조성물을 형성한다. 이 고형 조성물은 다음으로 본 발명의 유효량의 조성물을 함유하는 단위 제형(unit dosage form)으로 세분화된다. 추출물을 함유하는 정제 또는 알약은 코팅되거나 이와 다르게 화합되어 장기간 작용의 이점을 주는 제형을 제공한다.

표준화 추출물일 수 있는 식물 터미날리아 엘립티카의 추출물이 경구 또는 비경구 투여를 위해 통합될 수 있는 액체 형태는, 수용액; 적절하게 향미가 나는 시럽; 수성 또는 오일 현탁액; 및 식용 오일뿐만 아니라 엘릭시르 및 이와 유사한 약제학적 비히클(vehicle)을 갖는 향미 에멀션을 포함한다. 수성 현탁액을 위한 적절한 분산제 또는 현탁화제(suspending agent)는, 트라가칸트, 아카시아, 알긴산염, 덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴과 같은 합성 천연 검을 포함한다. 경구 투여용 액체 제조물은, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 갖거나, 사용 전에 물 또는 이와 다른 적절한 비히클로 재구성하기 위한 무수 생성물로 제공될 수 있다. 이러한 액체 제조물은, 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로오스 또는 수소 첨가된 식용 지방); 에멀션화제(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 유상 에스테르 또는 에틸 알코올); 방부제(예를 들어, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조산염 또는 소르브산); 및 인공 또는 천연 색 및/또는 감미제와 같은, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다.

선택된 투여량 수준(dosage level)은, 사용된 본 발명의 특정 추출물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 조성물의 배출 속도, 다른 추출물과 함께 사용된 치료의 기간, 치료를 받는 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강, 및 이전 의료 이력, 및 의료 분야에서 잘 알려져 있는 이와 유사한 인자를 포함하는 여러 인자에 의존할 것이다. 그러나, 일반적으로, 인간의 치료를 위해 사용된 투여량은 전형적으로 1일당 1 ~ 5000 mg의 범위에 있을 것이다. 어떠한 경우에도, 필요한 투여량은 질병의 심각성 및 의료 전문가에 의한 이와 다른 파라미터에 따라 증가하거나 감소할 수 있다. 예를 들어, 조성물이 사용될 수 있는 투여량은, 1 ~ 1500 mg/일 또는 5 ~ 1000 mg/일 또는 10 ~ 1000 mg/일 또는 5 ~ 500 mg/일 또는 임의의 이와 다른 적절한 투여량일 수 있다. 원하는 투여량은 단일 투여량으로 편리하게 제공되거나 또는 적절한 간격으로 투여된 분할 투여량으로, 예를 들어, 1일당 2, 3, 4 이상의 하위-투여량(sub-dose)으로 제공될 수 있다.

본 발명은, 본 발명을 예시하지만 그 범위를 제한하지 않도록 제공된 다음 예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.

예

다음의 용어/약어는 예에서 사용된다:

L: 리터 KCl: 염화 칼륨

㎖: 밀리리터 NaOH: 수산화 나트륨

㎕: 마이크로리터 MgCl₂: 염화 마그네슘

g: 그램 KH₂PO₄ : 인산 칼륨 2수소

mg: 밀리그램 K₂HPO₄ : 인산 2칼륨 수소

㎍: 마이크로그램 DMSO: 디메틸 설폭사이드

M: 몰 cpm: 분당 카운트

mM: 밀리몰 rpm: 분당 회전수

μM: 마이크로몰 dpm: 분당 붕괴

nM: 나노몰 pfu: 플라크 형성 단위

mm: 밀리미터 AESSM: 알칼리성 에탄올 정지액 혼합물

cm: 센티미터 BSA: 소 혈청 알부민

μ: 미크론 DAB: DGAT 분석 완충액

w/v: 부피당 중량 EDTA: 에틸렌 디아민 테트라아세트산

㎍/㎖: 밀리리터당 마이크로그램 FBS: 소 태아 혈청

ng/㎕: 마이크로리터당 나노그램 PBS: 인산 완충 식염수

mg/kg: 킬로그램당 마이크로그램 ORF: 개방형 해독 틀

h: 시간 RZPD: 독일 자원 센터

min: 분 MOI: 감염의 다중도

RT: 실온(25±5℃) EMEM: 이글(eagle)의 최소 필수 배지(medium)

β-NADH: β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드

트리스-HCl 완충제: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-HCl 완충액

NaH₂PO₄.2H₂O: 인산 2수소 나트륨 2수화물

Sf9 세포: 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유도된, 클론 분리세포(Clonal isolate)

HepG2 Cells: 인간의 간의 간세포 암종(hepatocellular carcinoma) 세포 라인(cell line)

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

식물의 추출

식물인 터미날리아 엘립티카의 나무껍질은 인도 푸네(Pune)의 IVYS 아그로(Agro)에서 조달되었다.

인증을 위한 현미경 및 육안을 통한 검사가 식물인 터미날리아 엘립티카의 나무껍질에 대해 이루어지고, 표본(specimen)이 인도 뭄바이 고레가온(Goregaon)에 위치한 피라말 헬스케어 리미티드(Piramal Healthcare Limited)의 식물학 부서에 보관되었다.

식물의 나무껍질은 작은 조각으로 절단되고 제습기의 도움으로 건조되었다. 완전하게 건조된 재료는 다음으로 분쇄기를 사용하여 거칠게 분쇄되었다.

예 1

터미날리아 엘립티카의 건조 분쇄된 나무껍질(200g)은 메탄올(2ℓ)을 사용하여 3시간 동안 45℃에서 교반하여 추출되었다. 이 추출 공정은 메탄올(1.6ℓ)로 두 번 반복되었다. 추출물은 합쳐지고 건조 농축되었다. 수득율(yield): 41.18g (20.59%).

예 1에서 이렇게 얻어진 추출물은 "예 1의 추출물"이라 한다.

예 1의 추출물은 0.71%의 생체 활성 마커를 함유한 것으로 밝혀졌다 (화합물 1; 예 5에 기술된 분석용 HPLC 방법에 의한 예측).

예 1의 추출물은 4℃ 내지 8℃의 냉장실에서 폴리프로필렌 바이얼에 저장되었다.

예 2

터미날리아 엘립티카의 건조 분쇄된 나무껍질(100g)은 메탄올:물(9:1)(1ℓ)을 사용하여 3시간 동안 45℃에서 교반하여 추출되었다. 이 추출 공정은 메탄올:물(9:1)(700㎖)로 두 번 반복되었다. 추출물은 합쳐지고 농축되었다. 농축된 재료는 냉동 건조기(에드워즈)를 사용하여 동결 건조되었다. 수득율: 5.2g (5.2%).

예 2에서 이렇게 얻어진 추출물은 "예 2의 추출물"이라 한다.

예 2의 추출물은 0.89%의 생체 활성 마커를 함유한 것으로 밝혀졌다 (화합물 1; 예 5에 기술된 분석용 HPLC 방법에 의한 예측).

예 2의 추출물은 4℃ 내지 8℃의 냉장실에서 폴리프로필렌 바이얼에 저장되었다.

예 3

터미날리아 엘립티카의 건조 분쇄된 나무껍질(50g)은 메탄올:물(3:1)(500㎖)을 사용하여 3시간 동안 40℃±5℃에서 교반하여 추출되었다. 이 추출 공정은 메탄올:물(3:1)(400㎖)로 두 번 반복되었다. 추출물은 합쳐지고 농축되었다. 농축된 재료는 냉동 건조기(에드워즈)를 사용하여 동결 건조되었다. 수득율: 7.6g (15.12%). 추출물은 4℃ 내지 8℃의 냉장실에서 폴리프로필렌 바이얼에 저장되었다.

예 3의 추출물은 0.49%의 생체 활성 마커를 함유한 것으로 밝혀졌다 (화합물 1; 예 5에 기술된 분석용 HPLC 방법에 의한 예측).

예 4

터미날리아 엘립티카의 건조 분쇄된 나무껍질(50g)은 증류수(500㎖)를 사용하여 3시간 동안 40℃±5℃에서 교반하여 추출되었다. 이 추출 공정은 증류수(400㎖)로 두 번 반복되었다. 추출물은 합쳐지고 농축되었다. 농축된 재료는 냉동 건조기(에드워즈)를 사용하여 동결 건조되었다. 수득율: 6.3g (12.6%). 추출물은 4℃ 내지 8℃의 냉장실에서 폴리프로필렌 바이얼에 저장되었다.

예 4의 추출물은 0.61%의 생체 활성 마커를 함유한 것으로 밝혀졌다 (화합물 1; 예 5에 기술된 분석용 HPLC 방법에 의한 예측).

예 5

생체 활성 마커(화합물 1)의 분리

예 1의 추출물은 분석용 HPLC에 의해 분석되었다 (아래 제시된 조건):

컬럼: 유니스피어 아쿠아(Unisphere aqua) C18, 150㎜×4.6㎜, 3μ

변화도(Gradient):

작동 시간: 30분; 농도: 10㎎/㎖ 메탄올

주입 부피: 10㎕; 유속: 1㎖/분; 검출: UV 254㎚

9.5분의 머무름 시간에서 피크는 주요 피크였고 생체 활성 마커로 확인되었다(화합물 1). 이 성분은 분리되고 아래 기술된 바와 같이 정제되었다.

예 1의 추출물(100g)에 물(8ℓ)과 폴리아미드(300g)가 첨가되었다. 이 혼합물은 3시간 동안 60℃에서 교반되고, 여과되며, 물(2ℓ)로 세척되었다. 얻어진 잔류물에, 메탄올(8ℓ)이 가해지고 16시간 동안 실온(RT)에서 교반되며, 여과되었다. 얻어진 잔류물에, 메탄올(8ℓ)이 가해지고 8시간 동안 실온(RT)에서 교반되며, 여과되었다. 메탄올 추출물 여과액이 합쳐지고 농축되어 강화된 추출물을 얻었다(10g).

생체 활성 마커(화합물 1; 5g)로 강화된 상기 추출물은 각각 C18 플래시(flash) 크로마토그래피를 사용하여 (아래 제시된 조건) 따로따로(in lots)(1.25g) 정제를 거쳤다.

컬럼: Redisep C18, 43g, 14㎝×2㎝

변화도:

샘플 적재(sample loading): 4g의 C18 재료를 사용하여 건조 충전된 1.25g

유속: 25㎖/분; 검출: UV 254㎚

분율(fraction)은 분석용 HPLC에 의해 모니터되었다. 분율은 유효한 양의 생체 활성 마커(화합물 1)를 함유했고, 밤새 그대로 두면 (~ 16시간) 결정성 고형물을 산출하는 것으로 밝혀졌다. 결정을 함유하는 분율은 합쳐지고, 여과되며, 건조되어, 생체 활성 마커를 얻었다 (화합물 1; 113㎎).

생체 활성 마커의 분광 데이터: IR(KBr): 3379, 1728, 1621, 1501, 1441, 1339, 1188, 1130, 1048, 974, 918, 753 cm^-1; ¹HNMR(500MHz, DMSO-d₆): δ11.05(s, 1H), 10.88(br s, 1H), 10.72(br s, 1H), 7.75(s, 1H),　7.49(s, 1H), 5.47(s, 1H), 5.11(br s, 1H), 4.94(br s, 1H), 4.72(br s, 1H), 4.00(br s, 1H), 3.86(br d, 1H, J=8.65), 3.55(m, 1H), 3.31(br s, 1H), 및 1.15(d, 3H, J=6.2); ¹³CNMR(75MHz, DMSO-d₆): δ159.56, 159.41, 149.14, 146.82, 141.57, 140.04, 137.19, 136.85, 114.96, 112.25, 112.01, 110.85, 108.68, 108.02, 100.65, 72.23, 70.53, 70.42, 70.34, 및 18.35; MS: m/z(ESI) 446.7(M-).

MS, IR, 및 NMR 분광 데이터를 기초로, 생체 활성 마커는 엘라그산, 4-O-알파-L-람노피라노시드(화합물 1)로 식별되었다. 또한, 이 구조는 얻어진 분광 데이터를 보고된 문헌 데이터(J. Nat. Products, 61, 901-906, 1998)와 비교하여 확인되었다.

생체 활성 마커(화합물 1 또는 엘라그산, 4-O-알파-L-람노피라노시드)는 생체외 생물학적 활성을 위해 시험되고, 시험 및 결과는 예 6과 예 7에 제시되어 있다.

약리학적 분석( Pharmacological assays )

DGAT-1과 SCD-1 효소의 활성 억제에서 식물인 터미날리아 엘립티카 추출물의 효능은, 이 기술 분야에 잘 알려져 있는 서로 다른 약리학적 분석에 의해 결정되고 아래 기술되어 있다.

생체외 분석

예 6

hDGAT -1 분석

DGAT-1 분석은, 그 기재 내용이 분석의 교시를 위해 참조로 포함되어 있는 참조 문헌인 유럽 약리 저널(650, 663~672, 2011)에 기술된 바와 같이, Sf9 세포-라인에 발현된 인간의 DGAT-1 효소를 사용하여 설계되었다.

인간의 DGAT -1( hDGAT -1) 클론의 클로닝과 발현

hDGAT-1 ORF 발현 클론(expression clone)(pDEST 벡터에서 RZPD0839C09146)은 독일의 RZPD에서 얻어졌다. hDGAT-1 유전자(NM_012079)는, 암피실린 저항 마커(ampicillin resistance marker)를 갖는 오토그라파 칼리포니카 핵다면체 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)의 강력한 다면체 촉진제(polyhedron promoter) 하에 pDEST8 벡터로 클로닝되었다. 재조합형 플라스미드(recombinant plasmid)는, 배큘로바이러스 셔틀 벡터(baculovirus shuttle vector)(bacmid)를 함유한 형질전환(transformation)에 의해 DH10BAC 적격 세포(인비트로겐, 미국)에 도입되고, 생성된 세포는, Bac-to-Bac 배큘로바이러스 발현 시스템(인비트로겐, 미국)에 따라, 암피실린(100㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin)(50㎍/㎖), 및 젠타마이신(gentamycin)(10㎍/㎖)을 함유한 루리아 브로스(Luria broth)(LB) 한천 평판(agar plate) 상에 선조접종(streak)되었다. 백색의 군락(colony)이 선택되고, 상기 항체를 갖는 LB 한천 평판 상에 선조접종이 반복되며, 37℃에서 밤새 배양되었다. 이튿날, hDGAT-1 유전자를 함유하는 재조합형 bacmid를 갖는 분리된 백색 군락은, 항체 {암피실린(100㎍/㎖), 카나마이신(50㎍/㎖), 및 젠타마이신(10㎍/㎖)}를 갖는 10㎖의 루리아 브로스에 접종되고, 궤도형 진동기(orbital shaker)(뉴 브런스윅)로 37℃에서 200rpm으로 밤새 배양되었다. 10㎖의 루리아 브로스가 선택되고, 재조합형 bacmid DNA(hDGAT-1 유전자를 갖는)는 퀴아젠 미니 제조 키트(Qiagen mini prep kit)를 사용하여 제조되고 미량 방울(nanodrop)을 사용하여 정량되었다. hDGAT-1 유전자를 함유하는 bacmid DNA의 농도는 약 97 ng/㎕였다.

Sf9 세포를 사용하는 형질주입( Transfection )과 바이러스 증폭( virus amplification )

6-웰(well) 조직 배양 평판에서 제조업자의 명세에 따라 셀펙틴(Cellfectin)(인비트로겐, 미국)을 사용하여, 1~3㎍의 hDGAT-1 bacmid DNA가 Sf9 세포에 형질주입되었다. 형질주입된 Sf9 세포는, 소 태아 혈청과 항생제-항진균제(100단위/㎖), 페니실린(100㎍/㎖), 황산 스트렙토마이신(0.25㎍/㎖), 및 암포테리신 B를 함유하지 않는 불완전한 그레이스의 곤충 배지(Grace's insect media)(Gibco^®)에서 5시간 동안 27℃에서 배양되었다. 배양 완료 후, 배지는 성장 배지{그레이스의 곤충 배지; (Gibco^®) 10%의 소 태아 혈청(하이클론)과 항생제-항진균제(100단위/㎖), 페니실린(100㎍/㎖), 황산 스트렙토마이신(0.25㎍/㎖), 및 암포테리신 B를 함유}로 대체되었고, 세포는 배양기에서 120시간 동안 27℃에서 추가 배양되었다.

이러한 배양 동안, 바이러스 입자가 곤충 세포 내에 형성되고 분비되었다. 바이러스를 함유한 상청액은, 120시간이 끝나고 바이오퓨즈 스테이토스 원심분리기(Biofuge statos centrifuge)(Heraeus 400)를 사용하여 5분 동안 1500Xg에서 원심분리에 의해 채취되고, 0.22㎛ 필터(밀리포어)를 통해 여과되었다. 이것은 P1 재조합형 배큘로바이러스로 4℃에서 저장되었다. 제조업자의 프로토콜(인비트로겐 키트)에 따라 수행된 플라크 분석에 의해, 농도 > 10⁵ pfu(플라크 형성 단위)/㎖가 결정되었다.

P1 재조합형 배큘로바이러스는 0.05~0.1의 MOI{감염 다중도(multiplicity of infection)}에서 추가 증폭되어, 120시간 동안 5㎖의 완전한 그레이스 곤충 배지에 5×10⁶ Sf9 세포를 함유하는 T-25 플라스크(Nunc)에서 P2 재조합형 배큘로바이러스를 생성한 다음, 5분 동안 1500Xg에서 원심분리하고, 0.22㎛ 필터(밀리포어)를 통해 여과하며, P2/(>106 pfu/㎖) 재조합형 배큘로바이러스로 4℃에서 저장했다. 이와 유사하게, P3와 P4 재조합형 배큘로바이러스는 0.05~0.1의 MOI에서 재감염에 의해 추가 증폭되어, P3와 P4 재조합형 배큘로바이러스를 각각 생성하고, 추가 사용까지 4℃에서 저장되었다. P4 재조합형 배큘로바이러스에 대한 바이러스성 역가(viral titer)가 결정되고, 이것은 1×10⁸ pfu/㎖인 것으로 밝혀졌다. P4(>10⁸pfu/㎖) 재조합형 배큘로바이러스는 5~10의 MOI에서 sf9 세포를 감염시키는데 최종 사용되었다.

마이크로솜 ( Microsome ) 제조

Sf9 세포(2×10⁶ 세포/㎖)는 항생제-항진균제(Gibco^®)를 갖는 250㎖의 그레이스 곤충 세포 배지(Gibco)를 함유하는 500㎖ 스피너 플라스크에서 성장되고, 5의 MOI에서 hDGAT-1 재조합형 배큘로바이러스(25㎖)로 감염되었다. 감염된 세포는 48시간 동안 28℃에서 유지되고, 세포 펠릿은 실온에서 1000Xg에서 배지를 원심분리하여 채취되었다. 펠릿은 PBS(pH 7.4)로 세척되어 잔류 배지를 제거했다.

다음으로, 세포는, 27G 니들을 통해 용해물(lysate)을 통과시킨 다음, 4℃에서의 약한 초음파 처리에 의해, 1X 양의 프로테아제 칵테일 정제(로슈)와 인 하우스(in house) 제조된 프로테아제 억제제 혼합물을 함유한 15㎖의 마이크로솜 제조 완충액에 펠릿을 현탁하여 분열되었다. 세포 부스러기가 분리되고, 후핵 상청액(post nuclear supernatant)(PNS)인 용해물(lysate)은 바이오퓨즈 스테이토스 원심분리기(Heraeus 400)를 사용하여 4℃에서 10분 동안 1000Xg에서 원심분리되었다. 얻어진 PNS는, 다음으로, 바이오퓨즈 스테이토스 원심분리기(Heraeus)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 15000Xg에서 원심분리되어, 후사립체 상청액(post mitochondrial supernatant)(PMS)을 분리하였다. 마지막으로, BeckmaTi-로우터(rotor)를 사용하여 4℃에서 1시간 동안 100,000Xg에서 초 원심분리가 수행되어 마이크로솜 펠릿을 얻었다. 순도를 증가시키기 위해, 펠릿은 프로테아제 억제제 혼합물의 인 하우스 제조물을 함유하는 마이크로솜 제조 완충액에서 두 번 세척되었다 {아프로티닌(aprotinin)(0.8μM), 펩스타틴(pepstatin)A(10μM), 및 류펩틴(leupeptin)(20μM)-시그마}.

최종적으로, 마이크로솜 펠릿은 1.5㎖의 마이크로솜 제조 완충액에 현탁되고 단백질 농도는 브래드포드법(Bradford method)에 의해 결정되었다.

마이크로솜은 생체외 분석을 위해 -70℃에서 각각 100㎕의 분액(aliquot)으로 저장되었다.

완충액과 시약의 제조

모액( stock solution )

hDGAT -1 분석용 완충 모액: pH 7.4의 분석 완충액(Assay buffer)은 0.25M 수크로오스(시그마)와 1mM EDTA(시그마)를 150mM의 트리스 HCl(시그마)에 용해시켜 제조되었다.

정지액( stop solution ): 10㎖의 정지액을 제조하기 위해, 7.84㎖의 이소프로판올{콸리젠스(Qualigens)}과 1.96㎖의 n-헵탄(Qualigens)이 0.2㎖의 탈이온수에 가해졌다.

A.E.S.S.M(알칼리성 에탄올 정지액 혼합물): 10㎖의 A.E.S.S.M 용액을 제조하기 위해, 1.25㎖의 변성 에탄올(denatured ethanol), 1.0㎖의 탈이온수, 및 0.25㎖의 1N NaOH(Qualigens)가 7.5㎖의 정지액에 가해졌다.

섬광 유체( scintillation fluid): 2.5ℓ의 섬광 유체를 제조하기 위해, 1667㎖의 톨루엔(머크), 833㎖의 트리톤 X-100(시그마), 12.5g의 2,5-디페닐옥사졸(PPO; 시그마), 및 500mg의 1,4-비스(5-페닐-2-옥사졸릴)벤젠(POPOP; 시그마)이 혼합되었다.

작용 스톡( working stock )

hDGAT -1 분석 완충액: 0.125%의 BSA(유리 지방산, 시그마)를 함유하는 새로운 hDGAT-1 분석 완충액이 사용 전에 제조되었다.

기질 혼합물 제조( substrate mix preparation: 기질 혼합물(substrate mix)은, 2047.5μM의 1,2-디올레오일(dioleoyl)-sn-글리세롤(19.5mM; 시그마)과 280 nCi/㎖의 [¹⁴C]올레오일-코엔자임{0.1 mCi 미국 방사성 표시 화학물질(American Radiolabelled Chemicals)/㎖}을 첨가하여 새로 제조되고, 최종 부피는 hDGAT-1 분석 완충액을 사용하여 1000㎕로 구성되었다.

hDGAT -1 효소 제조: 효소는 hDGAT-1 분석 완충액에서 1 mg/㎖의 작용 농도로 희석되었고, 2.5㎕의 작용 효소 스톡이 hDGAT-1 분석에 사용되었다 (최종 농도 25 ㎍/㎖).

시험용 샘플의 제조

시험용 샘플은 다음과 같이 제조되었다. 20 mg/㎖의 모액은 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 각각의 추출물(예 1의 추출물과 예 2의 추출물)에 대해 제조되었다. 작용 스톡은 hDGAT-1 분석 완충액에서 제조되었다. 10㎕의 작용 스톡이 100㎕의 분석 혼합물에 가해져서 50 ㎍/㎖에서 추출물의 최종 농도를 얻었다.

투여량 반응(dose response)에 대해 세 개의 다른 농도(즉, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)가, 모액의 연속적인 희석에 의해, 예 1의 추출물과 예 2의 추출물에 대해 제조되었다.

생체 활성 마커(화합물 1)는 50 ㎍/㎖ 농도에서 시험되었다.

분석

60㎕의 기질 혼합물(상술한 바와 같은)이 100㎕의 전체 분석 부피에 첨가되었다. 반응은 마이크로솜 단백질을 함유하는 2.5㎍의 hDGAT-1을 첨가하여 시작되고 37℃에서 10분 동안 배양되었다. 반응은 300㎕의 알칼리성 에탄올 정지액 혼합물(AESSM)을 첨가하여 중단되었다. 반응은, 방사성 [¹⁴C] 올레오일-코엔자임이 1,2-디올레오일-sn-글리세롤의 세 번째 히드록시기(OH)에 결합되어 방사성 트리글리세리드([¹⁴C] 트리글리세리드)(이는 다음에 상부 헵탄 상으로 추출됨)를 형성하는 것을 수반한다. 이렇게 형성된 방사성 트리글리세리드 생성물은 600㎕의 n-헵탄을 가하여 유기상으로 분리되었다. 250㎕의 상부 헵탄이 4㎖의 섬광 유체에 가해지고, 액체 섬광 카운터(패커드; 1600CA)를 분당 붕괴(dpm) 카운트로 사용하여 측정되었다. 퍼센트 억제는 비히클(vehicle)에 대해서 계산되었다. 결과는 표 1에 제공된다.

투여량 반응은, hDGAT-1 분석 완충액에서 예 1의 추출물과 예 2의 추출물의 모액을 연속적으로 희석하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖의 농도에서 결정되었다. 결과는 표 2에 제공된다.

번호	샘플	농도	hDGAT-1의 %억제
01	예 1의 추출물	50 ㎍/㎖	72.76
02	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	75.94
03	화합물 1	50 ㎍/㎖	85.00
04	IN 5530^*	20 nM	41.76
05	IN 5530^*	0.1 μM	71.86

표 1: hDGAT-1 억제 분석

^*IN 5530: 스탠더드(standard)로 사용된, 2-((1s,4s)-4-(4-(4-아미노-7,7-디메틸-7H-피리미도[4,5-b][1,4]옥사진-6-일)페닐)시클로헥실)아세트산은, PCT 출원 공개 번호 WO2004/047755 A2에 따라 인 하우스로 제조된다.

결론: 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물(예 1의 추출물과 예 2의 추출물)과 생체 활성 마커(화합물 1)는 hDGAT-1 억제 분석에서 활성인 것으로 밝혀졌다.

번호	샘플	농도	hDGAT-1의 %억제
01	예 1의 추출물	25 ㎍/㎖	79.91
02	예 1의 추출물	50 ㎍/㎖	80.62
03	예 1의 추출물	100 ㎍/㎖	83.02
04	예 2의 추출물	25 ㎍/㎖	83.07
05	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	80.55
06	예 2의 추출물	100 ㎍/㎖	83.66
07	IN 5530^*	20 nM	57.87
08	IN 5530^*	0.1 μM	79.94

표 2: hDGAT-1 억제 분석에서 투여량-반응

^*IN5530: 스탠더드 화합물, 2-((1s,4s)-4-(4-(4-아미노-7,7-디메틸-7H-피리미도[4,5-b][1,4]옥사진-6-일)페닐)시클로헥실)아세트산

결론: 예 1의 화합물과 예 2의 화합물은 투여량에 의존성의 생체외 DGAT-1 억제를 나타내지 않는다.

예 7

SCD -1 분석

분석은, 그 기재 내용이 분석의 교시를 위해 참조로 포함되어 있는 참조 문헌인 유럽 약리 저널(618, 28~36, 2009)에 기술된 방법에 따라 실행되었다.

SCD -1 효소의 제조

SCD-1 효소는, 그 기재 내용이 분석의 교시를 위해 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 PCT 공개 번호 WO2008/074835A1에 기술된 바와 같이 쥐의 간 마이크로솜으로부터 제조되었다.

수컷 스프래그 다우리 쥐(Sprague-Dawley rat)(150~175g)는 2일 동안 먹이를 주지 않은 다음, 저지방식으로 3일 동안 먹이가 공급되어 SCD-1 활성을 유발했다. 다음으로, 쥐는 희생되고 그 간을 제거하여 얼음 위에 놓았다. 간은 가위를 사용하여 잘게 다져진 다음, 4℃의 균질화 완충액(homogenization buffer)(150 mM KCl, 250 mM 수크로오스, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 및 1.5 mM 환원된 글루타티온)에서 폴리트론 균질화기(Polytron homogenizer)를 사용하여 균질화되었다. 균질액(homogenate)은 4℃에서 20분 동안 1500Xg에서 원심분리되었다. 상청액이 채취되고 4℃에서 각각 20분 동안 10,000Xg에서 두 번 원심분리되었다. 생성된 상청액이 채취되고 4℃에서 60분 동안 100,000Xg에서 원심분리되었다. 상청액은 버려지고, 마이크로솜 펠릿은 균질화 완충액에서 재현탁되고, 분액화되며(aliquoted), -80℃에 저장되었다. 재현탁된 펠릿의 단백질 함량은 브래드포드 분석에 의해 확인되었다.

완충액과 시약의 제조

SCD -1 분석 완충액의 제조: 완충액은 100 mM K₂HPO₄(Qualigens)와 100 mM NaH₂PO₄.2H₂O(Qualigens)로 이루어졌다 (pH 7.4).

인산 칼륨 완충액의 제조: 완충액은 200 mM K₂HPO₄(Qualigens)와 200 mM KH₂PO₄(Qualigens)로 이루어졌다 (pH 7.0).

SCD -1 추출물 완충액: 완충액은 250 mM 수크로오스(Sigma), 15 mM N-아세틸 시스테인(Sigma), 5 mM MgCl₂(Sigma), 0.1 mM EDTA(Sigma), 0.15 M KCl(Sigma), 및 인산 칼륨 완충액 62 mM으로 이루어졌다 (pH 7.0).

β- NADH 의 제조: β-NADH(Sigma)의 20 mM 모액은 SCD-1 분석 완충액에서 제조되고 -70℃에 저장되었다. β-NADH의 작용 스톡은 사용 직전 분석 완충액으로 스톡을 8 Mm로 희석하여 제조되었다.

스테아로일 코엔자임의 제조: 스테아로일 코엔자임(시그마)의 1.65 mM 모액은 SCD-1 분석 완충액에서 제조되고 -70℃에 저장되었다.

방사성 칵테일( radioactive cocktail )의 제조: 100㎕의 1μCi/㎖ 스테아로일(9,10³H)코엔자임(미국 방사성 표시 화학물질)과 144㎕의 1.65 mM 스테아로일 코엔자임이 5516㎕의 SCD-1 분석 완충액에 첨가되었다.

다중스크린 평판( multiscreen plates )에서 활성탄 층( activated charcoal bed )의 제조

33%의 활성탄(시그마) 용액이 분석 완충액에서 제조되었다. 250㎕의 용액이 다중스크린 평판의 각 웰(well)에 가해졌다. 활성탄 층은 진공 매니폴드(vacuum manifold)를 통해 평판에 진공을 가하여 형성되었다. 평판은 사용시까지 저장되었다.

시험용 샘플의 제조

시험용 샘플은 다음과 같이 제조되었다. 20 ㎎/㎖의 모액은 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 각각의 추출물(예 1의 추출물과 예 2의 추출물)에 대해 제조되었다. 작용 스톡은 SCD-1 분석 완충액에서 제조되었다. 10㎕의 작용 스톡이 100㎕의 분석 혼합물에 가해져서 50 ㎍/㎖에서 추출물의 최종 농도를 얻었다.

투여량 반응에 대해 세 개의 다른 농도(즉, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)가, 모액의 연속적인 희석에 의해, 예 2의 추출물에 대해 제조되었다.

생체 활성 마커(화합물 1)는 50 ㎍/㎖ 농도에서 시험되었다.

분석

마이크로솜(62.5㎍)은 15분 동안 시험용 샘플로 처리되었다. 그 후, 25㎕의 β-NADH 작용 스톡 및 9,10-³H 스테아로일 코엔자임을 함유하는 20㎕의 방사성 칵테일이 가해지고 혼합물은 25℃에서 30분 동안 배양되었다. 반응은 과염소산(perchloric acid)의 첨가로 중단되었다. 다음으로, 평판은 원심분리되고, 각 웰의 상청액은 활성탄 층을 통해 저장소 평판(reservoir plate)으로 진공 매니폴드를 사용하여 통과되었다. ³H₂O를 함유하는 여과액은 4㎖의 섬광 유체를 함유하는 섬광 바이얼(scintillation vial)로 이동되고, cpm 카운트는 액체 섬광 카운터를 사용하여 측정되었다. %억제는 비히클 대조군(vehicle control)에 대해서 계산되었다.

투여량 반응은, 예 2의 추출물의 모액을 연속적으로 희석하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖의 농도에서 결정되었다.

양성 대조군(positive control)은 각 실험으로 분석되었다. 결과는 표 3과 표 4에 제공된다.

번호	샘플	농도	SCD-1의 %억제
01	예 1의 추출물	50 ㎍/㎖	46.00
02	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	60.65
03	화합물 1	50 ㎍/㎖	74.20
04	MF-152^*	100 nM	70.71

표 3: SCD-1 억제 분석

^*MF-152: 스탠더드 화합물 (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19, 5214~5217, 2009).

결론: 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물(예 1의 추출물과 예 2의 추출물)과 생체 활성 마커(화합물 1)는 SCD-1 억제 분석에서 활성인 것으로 밝혀졌다.

번호	샘플	농도	%억제
01	예 2의 추출물	25 ㎍/㎖	44.74
02	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	72.24
03	예 2의 추출물	100 ㎍/㎖	82.17
04	MF-152^*	100 nM	44.91

표 4: 투여량-반응 SCD-1 억제 분석

결론: 예 2의 추출물은 생체외 SCD-1 억제 분석에서 투여량 관련 억제를 보여주었다.

예 8

세포 기판의 트리글리세리드 ( Cell based triglyceride )( TG ) 합성 분석

예 1의 추출물과 예 2의 추출물은, 그 기재 내용이 분석의 교시를 위해 참조로 포함되어 있는 참조 문헌인 유럽 약리 저널(618, 28~36, 2009)에 보고된 방법에 의해, HepG2 세포에서 트리글리세리드 합성을 억제하는 이들의 능력이 평가되었다.

완충액 , 시약, 및 배지의 제조

이글의 최소 필수 배지( EMEM ): 분말 EMEM(시그마)의 하나의 봉지(sachet)가 1ℓ의 삼각 플라스크(conical flask)에 넣어졌다. 빈 봉지는 10㎖의 증류수로 세정되었다. 분말은 자기 교반기를 사용하여 900㎖ 증류수에 용해되었다. 1.5g의 중탄산 나트륨(시그마), 10㎖의 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)(시그마), 및 1㎖의 페니실린-스트렙토마이신(깁코)이 또한 추가되었다. 적절한 혼합 후에 pH는 7.2로 조절되고 부피는 1ℓ로 되었다. 배지는 필터 멸균되고 4℃에서 저장되었다.

불활성화 소 태아 혈청( FBS ): 소 태아 혈청(하이클론)은 56℃에 미리 설정된 수조(water-bath)에 30분 동안 넣어졌다. FBS는 다음으로 50㎖ 폴리프로필렌 튜브에 분액화되고 (45㎖), -80℃에 저장되었다.

인산 완충 식염수( PBS ): PBS(시그마)의 하나의 봉지의 내용물은 900㎖의 증류수에 용해되었다. pH는 7.2로 조절되고 부피는 1ℓ로 되었다. 이것은 다음으로 필터 멸균되고 -20℃에 저장되었다.

트립신- EDTA 용액: 트립신-EDTA 용액(시그마)은 해동되고 50㎖ 폴리프로필렌 튜브에 무균(aseptically) 분액화되고 (45㎖), -20℃에 저장되었다.

시험용 샘플의 제조

시험용 샘플은 다음과 같이 제조되었다. 20 ㎎/㎖의 모액은 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 예 1의 추출물과 예 2의 추출물에 대해 제조되었다. 10㎕의 작용 스톡이 100㎕의 분석 혼합물에 가해져서 50 ㎍/㎖에서 추출물의 최종 농도를 얻었다.

투여량 반응에 대해 세 개의 다른 농도(즉, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖)가, 모액의 연속적인 희석에 의해, 예 1의 추출물과 예 2의 추출물에 대해 제조되었다.

HepG2 세포의 배양

HepG2 세포(ATCC No. HB-8065)의 하나의 동결 바이얼(frozen vial)은 37℃의 물에서 해동되었다. 바이얼의 모든 내용물은 9㎖의 EMEM과 1㎖의 불활성화 소 태아 혈청을 함유하는 T-75 조직 배양 플라스크로 운반되었다. 이 플라스크는, 습도 조절 배양기에서 5% CO₂를 갖고, 37℃에서 배양되었다. 플라스크는 세포 성장을 위해 관찰되었다. 세포가 70% 이하 증식하면(confluent), 소비된 배지는 버려지고 세포 단일층은 5㎖의 PBS로 세척되었다. 1.5 ~ 2㎖의 트립신 EDTA 용액은 전체 세포 층이 덮이도록 플라스크에 가해졌다. 플라스크에서 모든 세포가 떨어지면, 10% 소 태아 혈청이 추가된 6㎖의 EMEM이 첨가되고, 균일한 세포 현탁액을 얻기 위해 혼합된다. 세포 현탁액은 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리되어 세포 펠릿을 얻었다. 이 세포 펠릿은 10% 소 태아 혈청이 추가된 6㎖의 EMEM에 부드럽게 분산되었다. 여섯 개의 T-75 플라스크가 상술한 바와 같이 준비되고 1㎖의 세포 현탁액이 각각의 플라스크에 가해졌다. 이 플라스크는, 습도 조절 배양기에서 5% CO₂를 갖고, 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 배지는 48시간마다 교체되었다. 72시간까지 플라스크는 70% 이하 증식되었고, 플레이팅(plating) 준비가 되었다.

분석

HepG2 세포의 현탁액은 10%의 소 태아 혈청을 함유하는 EMEM 배지에서 제조되었다. 세포 카운트는 헤모세포측정기(haemocytometer)를 사용하여 결정되고 카운트는 24-웰 평판에 대해 4×10⁵세포/㎖/웰로 조절되었다. 평행 평판(parallel plate)은 실험의 끝에 실행될 생존력 시험(viability testing)을 위해 또한 제조되었다. 이 평판은, 세포가 증식될 때까지 습도 조절 배양기에서 5% CO₂를 갖고, 37℃에서 배양되었다. 세포가 70 ~ 80% 증식하면, 배지는 버려지고, 10μM에서 스탠더드 화합물(MF-152)을 함유하거나, 또는 50 ㎍/㎖에서 예 1의 추출물 또는 예 2의 추출물을 함유하는 새로운 배지로 교체되었다. DMSO는 0.1%의 최종 농도에서 비히클 웰(vehicle well)에 첨가되었다. 평판은 밤새 18시간 이하 동안 배양되었다. 다음 날, 배지는 버려지고, 0.1% BSA(유리된 지방산)이 추가된 스탠더드 화합물/추출물/DMSO를 함유하는 배지로 교체되었다.

¹⁴C 라벨 아세트산의 2μCi가 또한 웰마다 첨가되고, 평판은 37℃에서 6시간 동안 추가 배양되며, 이후 배지는 버려지고 지질이 추출되었다.

식물 추출물의 세포 독성 효과(cytotoxic effect)에 접근하기 위해, 세포 생존력 시험(cellular viability test)이, 2시간 배양 후, MTS (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포닐)-2H-테트라졸륨) 시약을 사용하여 평행 평판에서 수행되었다.

지질 추출

추출은 다음 프로토콜에 따라 실행되었다:

실험 끝에, 세포는 아이스 콜드(ice-cold) PBS로 두 번 세척되었다. 세포는 1㎖의 차가운 PBS 안으로 폐기되고, 4㎖의 메탄올:클로로포름(2:1)을 함유하는 15㎖의 유리 튜브 안으로 피펫으로 들어가며, 와류 혼합기(vortex mixer)를 사용하여 교반되었다. 이 튜브는 4000 rpm에서 5분 동안 회전되고, 상청액은 새 튜브로 옮겨졌다. 대부분 단백질로 이루어진 펠릿은 버려졌다. 1㎖의 50mM 시트르산, 2㎖의 물, 및 1㎖의 클로로포름이 상기 상청액에 가해지고 완류 혼합기를 사용하여 교반되었다. 혼탁한(turbid) 두 개의 상 혼합물이 얻어졌다. 튜브는 비냉각 원심분리기에서 15분 동안 3500 rpm에서 회전되었다. 하부 클로로포름 상과 상부 물/메탄올 상이 얻어졌다. 대부분 침전 단백질로 이루어진 두 개 사이의 상간(inter-phase)이 또한 있었다. 상부의 물/메탄올 상은 버려지고, 상기 상간은 접촉되지 않은 상태로 두었다. 지질을 함유하는 하부의 클로로포름 상은 새로운 튜브로 옮겨지고, 가열 블록 상에서 증발되었다. 지질은 200㎕의 클로로포름:메탄올(2:1)에 재용해되었다. 트리글리세리드는 헥산: 디에틸에테르:아세트산(85:15:0.5)의 용매 시스템을 사용하여 TLC 실리카 평판 상에서 분리되었다. 방사성 미표시 트리글리세리드 스탠더드(non-radiolabelled triglyceride standard)는 나란히 실행되었고, 뿐만 아니라, 모든 스폿(spot)은 트리글리세리드 스탠더드와 공동 스폿되었다 (co-spot). TLC 평판은 요오드 증기에 노출되었고, 트리글리세리드 스폿은 폐기되고 4㎖의 섬광 유체를 함유하는 섬광 바이얼로 옮겨졌다. 방사능은 액체 섬광 카운터에서 cpm 단위로 측정되고, 억제는 비히클에 관하여 계산되었다. 결과는 표 5에 제공된다.

투여량 반응은, 예 1의 추출물과 예 2의 추출물의 모액을 연속적으로 희석하여 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 및 100 ㎍/㎖의 농도에서 결정되었다. 결과는 표 6에 제공된다.

번호	샘플	농도	TG의 %억제
01	예 1의 추출물	50 ㎍/㎖	80.3
02	MF-152^*	10 μM	47.46
03	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	69.69
04	MF-152^*	10 μM	36.5

표 5: 트리글리세리드 합성의 억제

결론: 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물(예 1의 추출물과 예 2의 추출물)은 세포 기반의 트리글리세리드 합성 분석에서 활성인 것으로 밝혀졌다.

번호	샘플	농도	TG의 %억제	%독성
01	예 1의 추출물	25 ㎍/㎖	43.70	4
02	예 1의 추출물	50 ㎍/㎖	66.70	30
03	예 1의 추출물	100 ㎍/㎖	91.07	48
04	MF-152^*	10 μM	22.45	7
05	예 2의 추출물	25 ㎍/㎖	32.56	0
06	예 2의 추출물	50 ㎍/㎖	63.28	2
07	예 2의 추출물	100 ㎍/㎖	83.67	22
08	MF-152^*	10 μM	38.25	7

표 6: 트리글리세리드 합성의 억제의 투여량 반응

결론: 예 1의 추출물과 예 2의 추출물은 트리글리세리드 합성의 투여량 관련 억제를 보여주었다.

생체내 연구

생체내 실험(in vivo experiment)은, 동물 실험의 제어 및 감독을 위한 위원회(CPCSEA)의 지침과 제도상의 동물 윤리 위원회(Institutional Animal Ethics Committee)(IAEC)의 승인에 따라 실행되었다.

예 9

고지방식( HFD )에 의해 유도된 체중 증가에 대한 예 1 추출물의 효과

설치류에서 고지방식(HFD)에 의해 유도된 비만 모델은 비만 치료제(anti-obesity agent)의 효능을 평가하기 위한 유용한 모델일 것으로 보고되었다 {오비서티(Obesity), 17(12), 2127~2133, 2009). 58%의 kcal 지방을 함유하는 고지방식을 먹이는 것은 쥐에게서 비만을 일으키는 것으로 보고되었다 {메타볼리즘(Metabolism), 47, 1354~1359, 1998). 또한, 고지방식을 먹은 쥐는, 일반식을 먹은 쥐보다 훨씬 더 높은 체중과 훨씬 더 무거운 내장 지방 조직(visceral adipose tissue){예를 들어, 정소상체(epididymal), 복막후(retroperitoneal), 및 장간막 지방(mesenteric adipose) 조직}을 나타내었다 (라이프 사이언스, 77, 194~204, 2005).

HFD 유도 체중 증가 모델은 여러 천연 생성물의 비만 치료 효과를 평가하기 위해 보고된다 {BMC 보완 대체 의학(Complementary and Alternative Medicine), 5:9, 1~10, 2005; BMC 보완 대체 의학, 6:9, 1~9, 2006}.

쥐에 대한 HFD 유도 체중 증가 연구는 예 1의 추출물의 효능을 평가하기 위해 수행되었다.

수컷 C57BL/6j 쥐{인-하우스; 중앙 동물 시설, 피라말 헬스케어 리미티드(Piramal Healthcare Limited), 고레가온, 뭄바이, 마하라시트라, 인도}는 2주 동안 HFD(60% Kcal, D12492, 연구용 식단, 미국)에 익숙해졌다. 체중 증가를 나타내는 쥐가 연구를 위해 선택되고, 각각 10마리의 쥐로 이루어진 치료 그룹으로 무작위 추출되었다.

시험용 샘플의 제조

예 1의 현탁액은, 폴리에틸렌글리콜 400(30%){PEG 400, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 인도}과 0.5% 카르복시 메틸셀룰로오스(70%)(CMC, 시그마, 미국)으로 제조되었다.

분석

예 1의 추출물은 하루에 한 번 500mg/kg 체중의 투여량으로 경구 투여되었다. 오를리스타트(Orlistat){바이오콘(Biocon), 인도}는 스탠더드 약물로 사용되고, 하루에 두 번 15mg/kg 체중의 투여량으로 경구 투여되었다. 10마리 쥐의 개별 그룹은 정상 대조군으로서 저지방식(LFD, 10% kcal, D12450B, 연구용 식단, 미국)이 먹이로 공급되었다. 비히클은 10㎖/kg 체중의 투여량으로 HFD와 LFD에 투여되었다.

치료는 60일의 기간 동안 계속되었다. 체중과 먹이 섭취량(feed intake)이 매일 관찰되었다. 체중의 %변화(1일째부터 체중의 %증가) 및 누적된 먹이 섭취량 데이터가 계산되었다. 61일째, 혈액 샘플(~200 ㎕/쥐)은, 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia) 하에, 헤파린화(heparinised)(50 IU/㎖) 마이크로-원심분리기 튜브에서 채취되었다. 플라스마는 여러 플라스마 생화학 파라미터의 예측을 위해 4℃에서 10000 rpm에서의 원심분리에 의해 분리되었다. 생화학 분석은 BS-400 자동 분석기(autoanalyzer){민드레이(Mindray), China} 상에서 수행되었다. 그 뒤에, 쥐는 희생되고, 다음의 기관/조직, 즉, 간, 심장, 신장, 정소상체 지방(epididymal fat), 및 복막후 지방(retroperitoneal fat)이 절개되고 중량이 측정되었다. 모든 데이터는, 통계적 유의도(statistical significance)를 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어, 던넷의 사후 시험(Dunnet's post-hoc test)에 의해 분석되고, P < 0.05의 값이 유의한 것으로 간주되었다. 모든 분석은 윈도우즈용 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 4.00(그래프패드 소프트웨어, 샌 디에고, 캘리포니아, 미국)을 사용하여 실행되었다. 결과는 표 7, 표 8, 및 표 9에 제공된다.

그룹	체중 (g, 0일째)	체중 (g, 60일째)	체중의 %변화
LFD + 비히클	24.8±0.7	27.1±0.6	9.66±1.56^**
HFD + 비히클	26.5±0.6	32.9±1.0	24.28±1.15
HFD + 예 1의 추출물	26.7±0.4	30.1±0.6	14.38±2.36^*
HFD + 오를리스타트	26.4±0.4	30.9±0.9	16.74±2.70^*

표 7: 쥐의 HFD 유도 체중 증가에 대한 효과

^*p < 0.05, ^**p < 0.01 Vs. HFD + 비히클; 평균 ± S.E.M.

예 1의 추출물은 HFD + 비히클 그룹과 비교해서 체중 증가의 유효 억제를 보여주었다.

그룹	누적 먹이 섭취량 (g/쥐) (60일째)
LFD + 비히클	120.3±3.3
HFD + 비히클	110.5±2.8
HFD + 예 1의 추출물	104.5±4.7
HFD + 오를리스타트	119.7±4.7

표 8: 누적된 먹이 섭취량에 대한 효과

평균 ± S.E.M.

HFD + 비히클 그룹과 비교시, 예 1의 추출물에서 누적 먹이 섭취량의 유효 감소(significant reduction)는 관찰되지 않았다.

그룹	정소상체 지방 (g)	복막후 지방 (g)	총 지방^# (g)
LFD + 비히클	0.43±0.03^**	0.17±0.01^**	0.60±0.05^**
HFD + 비히클	1.39±0.13	0.65±0.08	2.03±0.20
HFD + 예 1의 추출물	0.97±0.12^*	0.44±0.05^*	1.41±0.16^*
HFD + 오를리스타트	1.07±0.10^*	0.42±0.05^*	1.49±0.15^*

표 9: 지방 조직 중량에 대한 효과

^#총 지방 = 정소상체 지방 + 복막후 지방, ^*p < 0.05,

^**p < 0.01 Vs. HFD + 비히클; 평균 ± S.E.M.

예 1의 추출물은 HFD + 비히클 그룹과 비교해서 지방 조직 중량의 더 나은 감소를 보여주었다.

글루코오스, 트리글리세리드, 콜레스테롤, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase), 아스파르트산 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase), 알부민, 크레아티닌(creatinine), 및 요소와 같은 파라미터를 위한 플라스마 생화학 분석은, 예 1의 추출물과 비히클 그룹 사이에 유효 차이(significant difference)를 나타내지 않았다.

결론: 예 1의 추출물을 이용한 고지방식(HFD) 쥐의 치료는 체중 증가의 유효 감소를 일으켰다. 체중 증가의 이러한 감소는 먹이 섭취량의 유효 감소 없이 이루어지고, 감소한 지방 조직 중량(지방 질량)에서 또한 분명하였다. 예 1의 추출물은 고지방식(HFD) 유도 비만 모델에서 비만 방지 활성(antiobesity activity)을 나타내었다.

예 10

터미날리아 엘립티카의 추출물을 함유하는 정제의 제조

절차

단계 1: 500mg의 예 1의 추출물의 중량을 측정하고, #40 메시를 통해 거른다.

단계 2: 212mg의 미결정 셀룰로오스, 40mg의 크로스카멜로오스 나트륨(Croscarmellose sodium), 및 8mg의 하이드록시프로필 셀룰로오스의 중량을 측정하고, #40 메시를 통해 거른다.

단계 3: 단계 1의 성분을 단계 2의 성분과 비전단 블렌더(non-shear blender)에서 10분 동안 혼합한다.

단계 4: 적절한 압축기(compactor)를 사용하여 블렌드를 압축한다.

단계 5: 적절한 크기의 스크린을 사용하여 얻어진 플레이크를 분쇄하여 원하는 입자 크기를 얻는다. 원하는 양의 과립이 얻어질 때까지 이 공정을 반복한다.

단계 6: 초과립 부형제(extragranular excipient), 즉, 예비 젤라틴화 전분(pregelatinised starch), 콜로이드 이산화규소, 및 활석의 중량을 측정하고, 상기 성분을 #40 메시를 통해 거른다.

단계 7: 단계 6의 성분을 단계 5의 과립과 15분 동안 비전단 블렌더에서 혼합한다.

단계 8: 8mg의 스테아르산 마그네슘의 중량을 측정하고, #60 메시를 통해 거른다.

단계 9: 걸러진(sifted) 스테아르산 마그네슘을 단계 7 블렌드와 2분 동안 혼합한다.

단계 10: 원하는 공구(tooling)로 블렌드를 압착한다.

코팅 용액( coating solution )의 제조

단계 1: 코팅 재료를 필요한 양의 물에 분산시킨다.

단계 2: 30분 동안 균질화한다.

단계 3: 나일론 직물을 통해 용액을 여과한다.

단계 4: 정제를 코팅하여 원하는 중량 증가를 얻는다.

단계 5: 코팅 팬(coating pan)에서 약 20~30분 동안 정제를 건조한다.

Claims

조성물로서,
식물인 터미날리아 엘립티카(Terminalia elliptica)의 추출물의 치료 유효량을 활성 성분으로써, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 포함하는, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 상기 추출물을 5% 내지 100% 함유하는, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은, 식물인 터미날리아 엘립티카의 나무껍질로부터 얻어지는, 조성물.
제 1항에 있어서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 상기 추출물은, 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 생체 활성 마커(bioactive marker)를 함유하는, 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 생체 활성 마커는, 엘라그산(ellagic acid), 4-O-알파-L-람노피라노시드(rhamnopyranoside)(화합물 1)인, 조성물.
제 1항에 있어서, 식물인 터미날리아 엘립티카의 상기 추출물은, 생체 활성 마커로서, 상기 화합물 1을 0.01% 내지 10.0% 함유하는, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은, 대사 장애의 치료를 필요로 하는 피험자에게 경구 투여되는, 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은, 경구 투여를 위해 정제, 캡슐, 또는 과립의 형태로 제제화되는, 조성물.
제 1항에 있어서, 대사 장애의 치료에 사용되는, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 대사 장애는, 인슐린 저항성(insulin resistance), 과혈당증(hyperglycemia), 진성 당뇨병(diabetes mellitus), 비만, 포도당 과민증(glucose intolerance), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 이상지질혈증(dyslipidemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerotic disease), 다낭성 난소 증후군(polycystic ovary syndrome), 관상 동맥 질병(coronary artery disease), 대사 증후군(metabolic syndrome), 고혈압, 또는 비정상적인 플라스마 리포단백질(abnormal plasma lipoprotein), 트리글리세리드와 연관된 관련 장애, 또는 췌장의 베타 세포 재생(pancreatic beta cell regeneration)과 관련된 장애로부터 선택되는, 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 대사 장애는, 인슐린 저항성, 진성 당뇨병, 과혈당증, 대사 증후군, 포도당 과민증, 비만, 이상지질혈증, 비정상적인 플라스마 리포단백질, 트리글리세리드와 연관된 장애, 또는 췌장의 베타 세포 재생과 관련된 장애로부터 선택되는, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은, 대사 장애를 치료하기 위해, 적어도 하나의 추가 치료 활성제와 함께 사용하도록 제공되는, 조성물.
대사 장애의 치료를 위한 약물(medicament)을 제조하기 위해, 식물인 터미날리아 엘립티카의 추출물의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 사용하는 방법.