CN104244962A - 用于治疗代谢紊乱的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种草药组合物，包括治疗有效量的作为活性成分的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，药学上可接受的载体。本发明还涉及一种用于制备提取物的方法。本发明还涉及一种使用所述组合物用于治疗代谢紊乱的方法。本发明还涉及一种组合物，包含治疗有效量的植物椭圆榄仁树提取物，用于与一种或多种另外的治疗活性剂组合，用于治疗代谢紊乱。

Description

用于治疗代谢紊乱的组合物
技术领域
本发明涉及一种草药组合物，包含单独的作为活性成分的植物椭圆榄仁树(Terminaliaelliptica)的提取物，或者具有药学上可接受的载体的植物椭圆榄仁树的提取物。本发明的组合物对代谢紊乱治疗有用。本发明还涉及制备草药组合物的方法。
背景技术
代谢紊乱是，当身体不能适当地代谢碳水化合物、脂类、蛋白质、或者核酸类时，发生的失调或者缺陷。大多数代谢紊乱是由导致缺少或功能失调的、用于细胞执行代谢过程所需的酶的基因突变引起的。代谢紊乱示例包括肥胖、过度的体脂、高血脂症、高脂蛋白血症、高血糖症、高胆固醇血症、超高胰岛素血症、胰岛素抗药性、葡萄糖耐受不良和糖尿病(尤其是2型糖尿病)。考虑到与现存的药相关的缺点，需要提供/开发用于治疗代谢紊乱的新药。
为了选择或者开发用于治疗代谢紊乱的候选新药，能够使用两个新型酶靶，二酰基甘油酰基转移酶-1(DGAT-1)和硬脂酰辅酶A脱氢酶-1(SCD-1)。这些酶在合成甘油三酯(身体中储存能量的主要形式)中起关键作用。
DGAT-1是内质的膜结合的酶，在过程的最终步骤中，催化甘油三酯的生物合成，将二酰甘油(DAG)和脂肪酰辅酶A(CoA)转化为甘油三酯。由于生产用于细胞需要的甘油三酯的必要性，酶活性存在于所有的细胞类型中。DGAT-1在肠和具有低水平脂肪的肝脏和肌肉中被高度表达。在每个这些组织中(肠、脂肪、肝脏和肌肉)的DGAT-1的抑制将抑制三酰甘油合成，并可以颠倒人代谢疾病中过度的脂类积累的病理生理学(Expert Opin.Ther.Patents,17(11),1331-1339,2007)。
硬脂酰辅酶A脱氢酶-1(SCD-1)已经被作为在脂类代谢控制中的一种主要酶来描述，并可以代表潜在的新型治疗药物靶。SCD-1为催化从饱和脂肪酸类至单不饱和脂肪酸类的生物合成的限速酶。优选的SCD-1的底物，硬脂酸盐(C18:0)和软质酸盐(C16:0)分别转化为油酸盐(C18:1)和棕榈酰盐(palmitoyleate)(C16:1)。这些单不饱和脂肪酸认为是包括甘油三酯类、胆固醇酯、磷脂类和蜡酯的各种各样的脂类的主要组分。实验动物的研究建议抑制或者减少这些酶的活性导致抵抗发展肥胖、糖尿病和伴随的并发症(European Journal ofPharmacology,618,28–36,2009；European Journal of Pharmacology,650,663–672,2011)。
在现代医学中，草药材料和植物继续在发现和开发药中起重要作用。因为认为与合成的小分子药物相比从植物获得的粗产物或者加工产品具有少副作用或者没有副作用，对基于植物的药的需求日益增长。
“榄仁树属(Terminalia)”是开花植物族使君子科的大树属，包含大约百种，分布在世界的热带区域中。最通常所知的榄仁树属的植物为毗黎勒(Terminalia bellirica)、大叶榄仁树(Terminalia catappa)、圆锥榄仁树(Terminalia paniculata)、黄花榄仁树(Terminalia citrina)、栓壳榄仁树(Terminalia phellocarpa)、蔻氏榄仁树(Terminalia copelandii)、Terminalia brassi、科特迪瓦榄仁树(Terminalia ivorensis)、艳丽榄仁树(Terminalia superba)、阿江榄仁树(Terminalia arjuna)、椭圆榄仁树和诃黎勒(Terminalia chebula)。该属的树尤其被已知为次级代谢产物(例如环状三萜类及其衍生物、黄酮类化合物、单宁类、和其他芳族化合物)的来源。从植物毗黎勒特别是从没有籽的果实中获得的提取物，显示出具有α-葡糖苷酶抑制效应(日本申请公开号JP 2006-188486)。在JP 2006-188486中还报道植物Terminalia chebula的果实显示弱的α-葡糖苷酶抑制效应。
椭圆榄仁树为榄仁树属的一种，产自于南亚和东南亚(印度、尼泊尔、孟加拉、缅甸、泰国、老挝、柬埔寨和越南)。椭圆榄仁树的类似物包括毛榄仁木(Terminalia tomentosa)、细圆齿榄仁木(Terminalia crenulata)、翅榄仁木(Terminalia alata)、Terminalia coriaceana和Pentaptera crenulata。
椭圆榄仁树是具有直径为一米的树干、生长到30米高的大的落叶树。椭圆榄仁树的树皮粗糙且有深裂缝。外表面颜色为浅褐色至深褐色的，且内表面，颜色为深褐色至黑色，光滑且有纵向的条纹。树皮是苦的且是止血的，并在治疗溃疡、骨折、出血、支气管炎方面有用。树皮不仅具有利尿性质而且还有强心性质。在弛缓腹泻中和在当地应用于弱无痛性溃疡中内部采取树皮的汤剂(Glossary of Indian Medicinal Plants.CSIR,New Dehli,ISBN:8172361262,1956)。Sushruta推荐在蛇咬伤治疗中用该植物灰(Indian Medicinal Plants,Dehradun,India.第II卷,第1028页,1984)。
椭圆榄仁树的树叶用作生产tassar丝的柞蚕(蚕)的食物。椭圆榄仁树，花为淡黄色，为雌雄同体并呈现长而尖或末端圆锥花序。花期为三月至六月。
本文以上表明考虑到诸如2型糖尿病和肥胖的代谢紊乱的越来越流行，存在用于有效治疗代谢紊乱的新型组合物和方法的不断需要。事实上，通过涉及寻找解决这些问题的方案的本发明的发明者努力发现了草药组合物，该组合物包含具有双重DGAT-1和SCD-1抑制活性的植物椭圆榄仁树的提取物，因此有利于治疗代谢紊乱。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种组合物，包括治疗有效量的作为活性成分的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体，用于在治疗代谢紊乱中使用。
根据本发明的另一个方面，提供一种组合物，包含治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，该提取物与另一种治疗活性剂组合使用，用于治疗代谢紊乱。
在又一个方面，本发明涉及一种用于治疗受试者中的代谢紊乱的方法，包括给药至受试者一种组合物，该组合物包括治疗有效量的作为活性成分的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
在又一个方面，本发明涉及一种用于治疗受试者中的代谢紊乱的方法，所述方法包括给药至受试者一种组合物，所述组合物包括治疗有效量的作为活性成分的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体，其中所述方法包括将组合物与另一种治疗活性剂组合给药。
根据本发明的另一个方面，提供一种用于制备组合物的方法，该组合物包含治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，以及至少一种药学上可接受的载体。
具体实施方式
应被理解为，当说明本发明的示例时，仅以说明的方式给予详细的描述和具体的示例，因为在本发明的精神和范围内的各种各样的变化和修改对本领域技术人员而言变得明显。基于本文中的描述，本领域的技术人员可以最大程度地利用本发明。下述具体的示例被解释为仅仅是作为说明的，并且不会以任何方式限制公开的其余部分。
除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。
术语“代谢紊乱”是指当身体不能够适当地代谢碳水化合物、脂类、蛋白质、或者核酸类时出现的失调或者缺陷。因此，本发明的上下文中所有与代谢异常相关的失调包括在术语“代谢紊乱”中。术语代谢紊乱包括，但不限于：胰岛素抗药性，高血糖症，糖尿病，肥胖，葡萄糖耐受不良，高胆固醇血症，血脂异常，超高胰岛素血症，动脉粥样硬化疾病，多囊卵巢综合症，冠脉疾病，代谢综合征，高血压，或者与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类相关的失调或者诸如胰腺β细胞再生的葡萄糖水平相关的失调。
本文中所使用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或者“治疗(treatment)”包括预防法(预防药)和姑息治疗。
本文中所使用的术语“药学上可接受的”是指在组合物中使用的载体、稀释剂、辅料、和/或者盐必须是与配方的其他成分相容的，并且对其受体是无害的。
术语“草药组合物”或者“组合物”被互换地使用，并且可以指组合物包含治疗有效量的单独的植物椭圆榄仁树的提取物或者与至少一种药学上可接受的载体或者辅料结合的提取物。术语“单独”可以另外表明组合物仅含有植物椭圆榄仁树的提取物，而其中没有添加任何药学上可接受的载体。应当注意的是，无论作为原料药(例如携带关于预期适应证的标签)来销售，无论在柜台销售，或者无论作为植物药剂来销售，术语“组合物”应被解释为广义并且包括任何适用于达到疗效的目的的组合物。
本文中所使用的术语“椭圆榄仁树”包括所有它的类似物，诸如毛榄仁木、细圆齿榄仁木、翅榄仁木、Terminalia coriaceana和Pentaptera crenulata。
本文中所使用的术语“药学上可接受的载体”是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体、稀释、封装的材料或者任何类型的配方助剂。一些能够充当药学上可接受的载体的材料的例子为糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及它的衍生物，诸如羟甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；麦芽；明胶；以及其他无毒的相容的润滑剂(诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)、以及着色剂、释放剂、包衣衣料、甜味剂、调味剂和芳香剂；根据配方设计师的判断，防腐剂和抗氧化剂也能够使用于组合物中。
本文中所使用的术语“治疗有效量”是指提取物(“椭圆榄仁树”提取物)或者含有提取物的组合物的量，其在被规定或者治疗的条件下足够显著诱导积极的改变，但足够低以避免副作用(如果有的话(在合理的效益/风险比)，合理的医学判断范围内)。提取物或者组合物的治疗有效量随着如糖尿病或者肥胖、最终使用者的年龄和身体条件、被治疗/预防的疾病的严重程度、治疗的持续时间、同步治疗的性质、利用的特殊的药学上可接受的载体、和类似因素的被治疗的特殊条件会变化。除非另有规定，本文中所使用的百分比都按重量计。
应当注意的是，除非另有规定，在说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a)”，“一种(an)”以及“所述”包括复数的参考对象。
本文中所使用的术语“椭圆榄仁树提取物”或者“椭圆榄仁树的提取物”是指在植物椭圆榄仁树的任何部分中存在的化合物的共混物。使用本领域中公知的提取工艺，诸如通过执行使用诸如低级醇类(如甲醇或者乙醇)、烷基酯类(如乙酸乙酯)、烷基醚类(如乙醚)、烷基酮类(如丙酮)、氯仿、石油醚、己烷的有机溶剂和/或者水性溶剂(如水)的提取工艺，能够从植物的任何部分(如植物的树皮、小枝、树干、木材、树叶和果实)提取这些化合物。植物材料还能够通过使用适合比例的溶剂的混合物(例如，己烷-乙酸乙酯(1:1)，氯仿-甲醇(1:1)或者甲醇-水(3:1))来提取。
本文中所使用的术语“受试者”是指动物，具体为哺乳动物，并且更具体为人。本文中所使用的术语“哺乳动物”是指温血的哺乳类动物的脊椎动物，包括人类，以皮肤上覆盖了毛发为特征，在雌性中，产生乳的乳腺用于养育幼仔。术语哺乳动物包括诸如猫、狗、兔子、熊、狐狸、狼、猴子、鹿、小鼠、猪和人的动物。
在示例中，在用于制备“椭圆榄仁树提取物”的过程中包含作为溶剂的、醇(例如甲醇)的使用。
例如，通过植物椭圆榄仁树的任何部分(如树皮)的提取可以获得提取物。
实施例中，使用甲醇作为溶剂，从植物椭圆榄仁树的粉状的树皮获得提取物。
实施例中，使用适合的比例的溶剂的混合物，从植物椭圆榄仁树的粉状的树皮获得提取物。
实施例中，能够使用不同比例的甲醇-水混合物(例如能够使用甲醇-水(9:1)混合物，甲醇-水(3:1)混合物或者甲醇-水(1:1)混合物用于提取)来提取植物椭圆榄仁树的粉状的树皮。
通过下述传统的途径，可以容易放大用于制备植物椭圆榄仁树的提取物的过程，用于大规模的制备。
使用诸如高效液相色谱法(HPLC)或者高效薄层色谱法(HPTLC)的传统的技术能够标准化椭圆榄仁树提取物。术语“标准化的提取物”是指，通过识别提取物中存在的特别的生物活性成分或者生物活性标志物来标准化的提取物。
本文中所使用的术语“活性成分”是指，含有化合物的共混物的椭圆榄仁树的提取物或者含有一种或多种生物活性化合物(生物活性标志物)的植物椭圆榄仁树的提取物。
使用诸如高效薄层色谱法(HPTLC)或者高效液相色谱法(HPLC)的各种各样的技术能够识别生物活性标志物或者生物活性成分。通过生物活性导向柱层析纯化和制备型高效液相色谱法(HPLC)，从植物椭圆榄仁树的提取物能够分离生物活性标志物。通过光谱数据的分析来表征生物活性标志物。
本文中使用术语“生物活性标志物”以便定义与药物活性的可接受度相关的活性化合物的特征(或者植物化学分布)。通过生物活性引导，从植物椭圆榄仁树获得的提取物能够分离活性化合物“生物活性标志物”。
通过光谱数据，诸如质谱(MS)、红外(IR)和核磁共振(NMR)光谱数据的分析来表征分离的化合物(生物活性标志物)。
实施例中，从植物椭圆榄仁树分离的生物活性标志物表征为鞣花酸、4-O-α-L-吡喃鼠李糖甙(4-O-alpha-L-rhamnopyranoside)(在之后的本文中称为“化合物1”)。
使用众所周知的各种各样的生物体外和体内试验来进行提取物的生物活性测定。例如，可以使用试验(如二酰甘油酰基转移酶-1(DGAT-1)试验、硬脂酰辅酶A脱氢酶-1(SCD-1)试验或者甘油三酯合成试验的试验来进行提取物的初步体外活性测定。通过使用如高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖模型的试验来测定体内活性。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包含治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
另一个实施例中，本发明涉及草药组合物，包含植物椭圆榄仁树的标准化的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
本文中所使用的术语“标准化的提取物”是指被加工过的植物，如“椭圆榄仁树”的提取物，以便它含有特定量的化合物作为生物活性标志物。本发明的上下文中，术语标准化的提取物是指，含有特定量的作为生物活性标志物的化合物1的植物椭圆榄仁树的提取物。在标准化的提取物中存在的特定量的化合物1可以在0.01％至10％或者0.05％至5％或者0.15％至2％内变化。
实施例中，植物椭圆榄仁树的标准化的提取物含有0.01％至10.0％的化合物1，作为生物活性标志物。
另一个实施例中，植物椭圆榄仁树的标准化的提取物含有0.05％至5.0％的化合物1，作为生物活性标志物。
另一个实施例中，植物椭圆榄仁树的标准化的提取物含有0.15％至2.0％的化合物1，作为生物活性标志物。
另一个实施例中，本发明涉及一种草药组合物，包括含有0.01％至10.0％的化合物1(鞣花酸、4-O-α-L-吡喃鼠李糖甙)作为生物活性标志物的植物椭圆榄仁树的标准化的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的树皮的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的树干的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
本发明的草药组合物包括5％至100％的植物椭圆榄仁树的提取物。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包括45％至75％的植物椭圆榄仁树的提取物。
本发明的草药组合物包括从含有至少0.01％至10.0％的化合物1作为生物活性标志物的植物椭圆榄仁树获得的5％至100％的提取物。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包括含有至少0.05％至5.0％的化合物1作为生物活性标志物的植物椭圆榄仁树的45％至75％的提取物。
实施例中，本发明提供一种草药组合物，包括含有至少0.15％至2.0％的化合物1作为生物活性标志物的植物椭圆榄仁树的45％至75％的提取物。
实施例中，本发明提供包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物的组合物用于制备治疗代谢紊乱的药剂的用途。
实施例中，含在组合物中的植物椭圆榄仁树的提取物为标准化的提取物。
将椭圆榄仁树提取物与药学上可接受的载体混合并配制成治疗剂型。
能够以口服(例如丸剂、片剂、包衣片剂、胶囊、粉剂、粒剂、酏剂或者糖浆的形式)的形式给药包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物的组合物。
通过使用常规的方法将提取物与药学上可接受的载体充分地混合而制备按重量计含有5％至100％椭圆榄仁树提取物的口服组合物。
本发明的组合物能够被使用于经皮肤给药。
实施例中，提供所述组合物用于治疗代谢紊乱。
实施例中，代谢紊乱选自胰岛素抗药性，高血糖症，糖尿病，肥胖，葡萄糖耐受不良，高胆固醇血症，血脂异常，超高胰岛素血症，动脉粥样硬化疾病，多囊卵巢综合症，冠脉疾病，代谢综合征，高血压，与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类有关的失调，或者与胰腺β细胞再生相关的失调。
另一个实施例中，代谢紊乱选自胰岛素抗药性，糖尿病，高血糖症，代谢综合征，葡萄糖耐受不良，肥胖，血脂异常，与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类有关的失调，或者与胰腺β细胞再生相关的失调。
实施例中，提供所述组合物用于糖尿病的治疗。
术语“糖尿病(diabetes mellitus)”或者“糖尿病(diabetes)”是指，在当胰不能生产足够的胰岛素，或者当身体不能有效使用其生产的胰岛素时发生的慢性疾病或者状况。这导致在血液中的葡萄糖浓度的增加(高血糖症)。两种主要形式的糖尿病为1型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)和2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM))。1型糖尿病为胰的生产胰岛素的β-细胞被破坏的自身免疫状况，其通常导致胰岛素(控制葡萄糖利用的激素)的绝对缺乏。2型糖尿病经常在面对正常胰岛素水平或者甚至在提高的胰岛素水平下发生，并且能够由组织无力对胰岛素恰当地反应引起。其他类型的糖尿病包括妊娠期糖尿病(在怀孕期间产生的高血糖症的病情)和“其他”罕见的原因(遗传性综合征，如胰腺炎的后天获得的过程，如囊性纤维化的疾病，暴露于某些药、病毒、以及不详的原因)。
本发明的实施例中，术语糖尿病(diabetes)或者糖尿病(diabetes mellitus)是指2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM))。
实施例中，提供所述组合物用于肥胖治疗。
实施例中，提供所述组合物用于血脂异常的治疗。
实施例中，提供所述组合物用于与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类有关的失调相关的代谢紊乱的治疗。
实施例中，提供所述组合物用于诸如胰腺β细胞再生的血浆水平相关的代谢紊乱的治疗。
又一个实施例中，本发明涉及一种组合物，包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，用于与至少一种另外的治疗活性剂组合物组合使用，用于在治疗代谢紊乱中使用。
又一个实施例中，本发明涉及一种组合物，包括治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体，用于与至少一种另外的治疗活性剂组合使用，用于在治疗代谢紊乱中使用。
可以与本发明的组合物组合的治疗活性剂可以选自植物琼崖海棠(Calophylluminophyllum)、翅子树(Pterospermum acerifolium)、心叶青牛胆(Tinospora cardifolia)、辣椒(Capsicum annum)、山羊豆(Galega officinalis)或者大蒜(Allium sativum)的提取物。
可以与本发明的组合物组合的治疗活性剂也可以选自诸如奥利司他、吡格列酮、罗格列酮、格列本脲、格列甲嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列胺、或者二甲双胍的已知的治疗剂。
此外，本发明的组合物可以与可以选自植物琼崖海棠、翅子树、心叶青牛胆、辣椒、山羊豆或者大蒜的提取物的一种或多种另外的治疗剂和选自奥利司他、吡格列酮、罗格列酮、格列本脲、格列甲嗪、格列美脲、瑞格列奈、那格列胺、或者二甲双胍的已知的药组合。
本发明还涉及一种治疗代谢紊乱的方法，包括组合物的给药，可选择性地通过口服途径给药，所述组合物含有治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物，以及任选地，至少一种药学上可接受的载体。
可以通过将活性成分与常规的无毒的药学上可接受的载体混合来将本发明的草药组合物配制成粉剂、丸剂、片剂、包衣片剂、丹剂、粒剂、胶囊、溶液、乳状液、悬液、酏剂、糖浆、和适合于使用的任何其他形式，用于口服给药，其中所述活性成分，即植物椭圆榄仁树的提取物可以是标准化的提取物。本发明的配方包含那些包括滑石、水、葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、土豆淀粉、尿素、和纤维素及其衍生物(诸如羟甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素)；麦芽；明胶；以及其他无毒的相容的润滑剂(诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)、释放剂、包衣衣料和其他适合用于制备制剂的辅料，可以使用以固体、半固体或者液体形式和另外的助剂、稳定剂、增稠剂和着色剂。为了制备固体组合物(诸如片剂或者胶囊)，将提取物与药物载体(例如，传统的片剂成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸氢钙或者树胶)和其他药物稀释剂(例如水)混合以形成固体组合物。然后将该固体组合物细分为含有有效量的本发明的组合物的单位剂型。含有提取物的片剂或者丸剂能够被包衣或者以其他方式混合以提供给予延长作用的优点的剂型。
可以被结合用于口服或者肠胃外给药的植物椭圆榄仁树的提取物(可以是标准化的提取物)的液体形式，包括含水溶液、适当调味的糖浆、含水或者油的悬液、和用可食用的油调味的乳状液以及酏剂和类似药物赋形剂。用于含水悬液的适合的分散剂或者悬浮剂包括合成天然树胶，诸如黄蓍胶、阿拉伯树胶、藻酸盐、葡聚糖、羟甲基纤维素钠、甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或者明胶。用于口服给药的液体制剂可以选取例如，溶液、糖浆或者悬液的形式，或者它们可以在使用前作为用于与水或者其他适合的赋形剂重新组成的干的产品来呈现。可以通过传统的用药学上可接受的添加剂(诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或者氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或者阿拉伯树胶)；非-含水赋形剂(例如，杏仁油，油脂类或者乙醇)；防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或者山梨酸)；和人造或者天然颜料和/或者甜味剂)的手段来制备这些液体制剂。
选择的剂量水平取决于包括本发明使用的特殊的提取物的活性，给药途径，给药时间，所使用的特殊的组合物的排泄比率，治疗的持续时间，与其他提取物组合使用，被治疗的病人的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和先前病史，和医学领域中众所周知的类似因素的各种各样的因素。然而，一般地，用于人的治疗的剂量典型地为每天1至5000mg。在任何情况下，可以根据疾病的严重程度和执业医生的其他参数增加或者减少必要的剂量。例如，其中能够被使用的组合物的剂量可以为1至1500mg/天、5至1000mg/天、10至1000mg/天、5至500mg/天或者任何其他适合的剂量。在单剂量或如在恰当的间隔给药的分份剂量(例如，如每天两个、三个、四个或更多个子剂量(sub-dose))下，可以便利地给予期望的剂量。
通过参考下述的用于说明本发明但不限制其范围的示例来更容易地理解本发明。
示例
在示例中使用了下述的术语、缩写：
植物的提取
从IVYS Agro(普纳，印度)取得植物椭圆榄仁树的树皮。
对植物椭圆榄仁树的树皮进行微观和宏观的研究，用于鉴定，并将样本保存到PiramalHealthcare Limited(Goregaon，孟买，印度)的Botany Department。
将植物的树皮剁碎成小块并在用除湿器的帮助下干燥。然后将完全干燥的材料采用粉碎机进行粗磨。
示例1
在45℃下，使用甲醇(2L)，通过搅拌对椭圆榄仁树的干燥的粉状树皮(200g)进行提取3个小时。用甲醇(1.6L)重复两次该提取过程。合并并浓缩提取物至干燥。收率：41.18g(20.59％)。
如此在示例1中获得的提取物称为“示例1的提取物”。
发现示例1的提取物含有0.71％的生物活性标志物(化合物1；通过示例5中描述的分析型HPLC方法来估算)。
将示例1的提取物储存在聚丙烯小瓶中，放入4℃至8℃的冷藏室中。
示例2
在45℃下，使用甲醇:水(9:1)(1L)，通过搅拌对椭圆榄仁树的干燥的粉状树皮(100g)进行提取3个小时。用甲醇:水(9:1)(700mL)重复两次该提取过程。合并并浓缩提取物。使用冷冻干燥机(Edwards公司)将浓缩的材料冻干。收率：5.2g(5.2％)。
如此在示例2中获得的提取物称为“示例2的提取物”。
发现示例2的提取物含有0.89％的生物活性标志物(化合物1；通过示例5中描述的分析型HPLC方法来估算)。
将示例2的提取物储存在聚丙烯小瓶中，放入4℃至8℃的冷藏室中。
示例3
在40℃+5℃下，使用甲醇:水(3:1)(500mL)，通过搅拌对椭圆榄仁树的干燥的粉状树皮(50g)进行提取3个小时。用甲醇:水(3:1)(400mL)重复两次该提取过程。合并并浓缩提取物。使用冷冻干燥机(Edwards公司)将浓缩的材料冻干。收率：7.6g(15.12％)。将提取物储存在聚丙烯瓶中，放入4℃至8℃的冷藏室中。
发现示例3的提取物含有0.49％的生物活性标志物(化合物1；通过示例5中描述的分析型HPLC方法来估算)。
示例4
在40℃+5℃下，使用蒸馏水(500mL)，通过搅拌对椭圆榄仁树的干燥的粉状树皮(50g)进行提取3个小时。用蒸馏水(400mL)重复该提取过程。合并并浓缩提取物。使用冷冻干燥机(Edwards公司)将浓缩的材料冻干。收率：6.3g(12.6％)。将提取物储存在聚丙烯瓶中，放入4℃至8℃的冷藏室中。
发现示例4的提取物含有0.61％的生物活性标志物(化合物1；通过示例5中描述的分析型HPLC方法来估算)。
示例5
生物活性标志物(化合物1)的分离
通过分析型HPLC分析了示例1的提取物(条件如下面给出)：
柱子：Unisphere aqua C18，150mm x 4.6mm，3μ
梯度：
运行时间：30min；浓度：10mg/mL(在甲醇中)
注入体积：10μL；流速：1mL/min；检测：UV 254nm
9.5min的保留时间的峰为主要峰并且识别为生物活性标志物(化合物1)。分离该组分并如下描述进行纯化。
向示例1的提取物(100g)添加水(8L)和聚酰胺(300g)。将混合物在60℃下搅拌3h并过滤，用水(2L)洗涤。向获得的残留物添加甲醇(8L)并在RT下搅拌16h，过滤。向获得的残留物添加甲醇(8L)并在RT下搅拌8h，过滤。将甲醇提取物滤液合并并浓缩以获得富集的提取物(10g)。
将上述的生物活性标志物(化合物1；5g)富集的提取物分批(1.25g)经受纯化，每批使用C18快速色谱法(条件如下面给出)进行纯化。
柱子：Redisep C18，43g，14cm x 2cm
梯度：
试样装载：使用4g C18材料装载的1.25g干试样
流量：25mL/min；检测：UV 254nm
通过分析型HPLC监测级分。发现含有大量的生物活性标志物(化合物1)的级分，在静置过夜(～16h)下产出结晶的固体。将含有晶体的级分合并，过滤并干燥以获得生物活性标志物(化合物1；113mg)。
生物活性标志物的光谱数据：IR(KBr)：3379，1728，1621，1501，1441，1339，1188，1130，1048，974，918，753cm-1；1HNMR(500MHz，DMSO-d6)：δ11.05(s，1H)，10.88(br s，1H)，10.72(br s，1H)，7.75(s，1H)，7.49(s，1H)，5.47(s，1H)，5.11(br s，1H)，4.94(br s，1H)，4.72(br s，1H)，4.00(br s，1H)，3.86(br d，1H，J＝8.65)，3.55(m，1H)，3.31(br s，1H)和1.15(d，3H J＝6.2)；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ159.56，159.41，149.14，146.82，141.57，140.04，137.19，136.85，114.96，112.25，112.01，110.85，108.68，108.02，100.65，72.23，70.53，70.42，70.34和18.35；MS：m/z(ESI)446.7(M-)。
基于MS、IR和NMR的光谱数据，生物活性标志物被识别为鞣花酸，4-O-α-L-吡喃鼠李糖甙(化合物1)。另外，通过将获得的光谱数据与报道的文献(J.Nat.Products,61,901-906,1998)数据的比较确认了结构。
为了体外生物活性进行生物活性标志物(化合物1或者鞣花酸、4-O-α-L-吡喃鼠李糖甙)测试，测试及结果在示例6和示例7中给出。
药理学试验
通过下面描述和在本领域众所周知的不同的药理学试验确定了植物椭圆榄仁树的提取物在抑制DGAT-1和SCD-1酶活性的功效。
体外试验
示例6
hDGAT-1试验
使用如在参考文件“European Journal of Pharmacology，650，663–672，2011”中描述(其公开通过引用并入用于试验的教导)的过表达在Sf9细胞系中的人DGAT-1酶，设计了DGAT-1试验。
人DGAT-1(hDGAT-1)克隆的克隆化与表达
从RZPD(德国)获得hDGAT-1ORF表达克隆(在pDEST载体中的RZPD0839C09146)。hDGAT-1基因(NM_012079)在具有抗氨比西林标志物的苜蓿银纹夜蛾(苜蓿尺蠖)核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV))的强多角体促进剂下被克隆成pDEST8载体。含有杆状病毒穿梭载体(杆粒)的重组质粒通过转化被引入到DH10BAC感受态细胞(Invitrogen公司，US)，并且根据杆状病毒表达系统(Invitrogen公司，US)在含有氨比西林(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和庆大霉素(10μg/mL)的溶菌培养基(Luria broth(LB))琼脂板上划线生成的细胞。挑选白色菌落并在具有上述抗生素的LB琼脂板上再划线并在37℃下培养一夜。第二天，将含有hDGAT-1基因的重组杆粒的分离的白色菌落接种到具有抗生素(氨比西林(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)和庆大霉素(10μg/mL))的10mL的溶菌培养基中并在定轨摇床(New Brunswick)中，在200rpm，37℃下培养一夜。取10mL的溶菌培养基并使用Qiagen公司迷你制备试剂盒制备重组杆粒DNA(具有hDGAT-1基因)并使用nanodrop进行量化。含有hDGAT-1基因的杆粒DNA的浓度大约为97ng/μL。
使用Sf9细胞的转染和病毒扩增
根据制造商的说明书使用Cellfectin(Invitrogen公司，US)，在6-孔组织培养板中，将1至3μg的hDGAT-1杆粒DNA转染成Sf9细胞。在27℃下，在没有胎牛血清和抗生素-抗真菌(100单位/毫升)、盘尼西林(100μg/mL)、硫酸链霉素(0.25μg/mL)和两性霉素B的不完全的Grace昆虫培养基(Gibco公)中培养转染的Sf9细胞5h。培养完成后，培养基被生长培养基(含有10％胎牛血清(Hyclone)和抗生素-抗真菌(100units/mL)、盘尼西林(100μg/mL)、硫酸链霉素(0.25μg/mL)和两性霉素B的Grace昆虫培养基；(Gibco公))取代，并在培养箱中，在27℃下，将细胞进一步培养120h。
该培养期间，在昆虫细胞内部形成病毒颗粒并被分泌。在120h结束时，通过使用Biofugestatos离心机(Heraeus 400)，在1500Xg下离心5min而收集含有病毒的上清液，并通过0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤上清液。它作为P1重组杆状病毒被储存在4℃下。通过按照制造商的科学实验方案(Invitrogen公司的试剂盒)进行的菌斑试验确定含量>105pfu(噬斑形成单位)/mL。
在0.05至0.1的MOI(感染复数)下，进一步扩增P1重组杆状病毒，以便在含有5x106Sf9细胞(在5mL完全Grace’s昆虫培养基中)的T-25烧瓶(Nunc)中生殖P2重组杆状病毒120h，接着在1500Xg下离心5min，通过0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，并作为P2/(>106pfu/mL)重组杆状病毒在4℃下储存。类似地，在0.05至0.1的MOI下，通过再感染进一步扩增P3和P4重组杆状病毒，以便各自生殖P3和P4重组杆状病毒，并在4℃下储存直到进一步使用。确定了用于P4重组杆状病毒的病毒滴度并发现其为1x108pfu/mL。最后使用P4(>108pfu/mL)重组杆状病毒以便在5至10的MOI下感染sf9细胞。
微粒体制备
使Sf9细胞(2x106细胞/mL)生长在含有具有抗生素-抗真菌(Gibco公)的250mLGrace昆虫细胞培养基(Gibco公司)的500mL旋转烧瓶中，并在5的MOI下用hDGAT-1重组杆状病毒(25mL)进行感染。将感染的细胞在28℃下保持48h，并在室温下，通过在1000Xg下将培养基离心来收集细胞粒剂。用PBS(pH 7.4)洗涤粒剂以便除去剩下的培养基。
然后在含有1X量的蛋白酶混合剂片剂(Roche公司)的15ml的微粒体制备缓冲剂中通过悬浮粒剂来破裂细胞，并且通过将裂解物穿过27G针，接着在4℃下通过温和地超声处理来内部制备蛋白酶抑制剂混合物。分离细胞碎片，并且在4℃下，使用Biofuge statos离心机(Heraeus 400)，在1000Xg下离心核后上清液(PNS)、裂解物10min。然后，将获得的PNS，使用Biofuge statos离心机(Heraeus)，在15000Xg，4℃下离心30min以分离线粒体后上清液(PMS)。最后，在4℃下，使用BeckmaTi-转子，在100,000Xg下超速离心1h以获得微粒体的粒剂。为了增加纯度，在含有内部制备的蛋白酶抑制剂混合物(抑肽酶(0.8μM)，胃酶抑制素A(10μM)和亮抑酶肽(20μM)-Sigma公司)的微粒体制备缓冲剂中洗涤粒剂两次。
最后，在1.5mL的微粒体制备缓冲剂中悬浮微粒体的粒剂，并通过Bradford方法确定蛋白质浓度。
每个微粒体以100μL的等分部分在-70℃下储存，用于体外试验。
缓冲剂和试剂的制备
备用溶液
hDGAT-1试验缓冲剂备料：通过在150mM Tris-HCl(Sigma公司)中溶解0.25M蔗糖(Sigma公司)和1mM EDTA(Sigma公司)来制备pH 7.4的试验缓冲剂。
终止液：为了制作10mL的终止液，在0.2mL去离子水中添加7.84mL的异丙醇(Qualigens公司)和1.96mL的正庚烷(Qualigens公司)。
A.E.S.S.M(碱性乙醇终止液混合物)：为了制作10mL的A.E.S.S.M溶液，将1.25mL的变性乙醇、1.0mL的去离子水、和0.25mL的1N NaOH(Qualigens公司)添加到7.5mL的终止液中。
闪烁液：为了制作2.5L的闪烁液，混合1667mL甲苯(Merck公司)，833mL聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)(Sigma公司)，12.5g 2,5-二苯噁唑(PPO；Sigma公司)和500mg(1,4-双(5-苯基-2-噁唑基)苯(POPOP；Sigma公司)。
工作备料
hDGAT-1试验缓冲剂：使用之前，制备含有0.125％的BSA(游离脂肪酸，Sigma公司)的新鲜的hDGAT-1试验缓冲剂。
底物混合物的制备：通过添加2047.5μM的1,2-二油酰-sn-甘油(19.5mM；Sigma公司)和280nCi/mL的[14C]油酰-辅酶A(0.1mCi American Radiolabeled Chemicals/mL)制备新鲜的底物混合物，并且使用hDGAT-1试验缓冲剂使最终体积达到1000μL。
hDGAT-1酶制备：在hDGAT-1试验缓冲剂中稀释酶至1mg/mL的工作浓度，在hDGAT-1试验(最终浓度25μg/mL)中使用2.5μL的工作酶备料。
测试试样的制备
如下制备测试试样。在100％二甲基亚砜(DMSO)中，制备20mg/mL的备用溶液用于每种提取物(示例1的提取物和示例2的提取物)。在hDGAT-1试验缓冲剂中制备工作备料。在100μL的试验混合物中添加10μL的工作备料以获得50μg/mL的最终浓度的提取物。
通过备用溶液的连续的稀释，制备用于剂量响应的三种不同浓度(即25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL)，用于示例1的提取物和示例2的提取物。
在50μg/mL浓度下测试生物活性标志物(化合物1)。
试验
100μL的总试验容积中添加60μL的底物混合物(如上述描述)。通过添加2.5μg的含有微粒体蛋白质的hDGAT-1开始反应，并在37℃下培养10min。通过添加300μL的碱性乙醇终止液混合物(AESSM)停止反应。反应包括，在1,2-二油酰-sn-甘油的第三个羟基(OH)中引入放射性[14C]油酰-辅酶A以便形成后续提取到上部庚烷相的放射性的甘油三酯([14C]甘油三酯)。通过添加600μL的正庚烷，将这样形成的放射性的甘油三酯产品分离到有机相中。在4mL的闪烁液中添加250μL的上部庚烷，并使用液体闪烁计数器(Packard公司；1600CA)以蜕变/分钟(dpm)计数来测量。计算关于赋形剂的抑制百分率。结果在表1中示出。
在25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度下通过hDGAT-1试验缓冲剂中连续稀释示例1的提取物和示例2的提取物的备用溶液确定剂量响应。结果表示在表2中。
表1：hDGAT-1抑制试验
*IN 5530：按照PCT申请公开号WO2004/047755A2，内部制备用作标准的2-((1s,4s)-4-(4-(4-氨基-7,7-二甲基-7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-6-基)苯基)环己基)醋酸。
结论：证明在hDGAT-1抑制试验中，植物椭圆榄仁树的提取物(示例1的提取物和示例2的提取物)和生物活性标志物(化合物1)是活性的。
表2：在hDGAT-1抑制试验中的剂量响应
*IN5530：标准化合物，2-((1s,4s)-4-(4-(4-氨基-7,7-二甲基-7H-嘧啶并[4,5-b][1,4]噁嗪-6-基)苯基)环己基)醋酸。
结论：示例1的提取物和示例2的提取物；没有显示剂量依赖体外DGAT-1抑制作用。
示例7
SCD-1试验
根据在参考文献“European Journal of Pharmacology,618,28–36,2009”(其公开通过引用并入用于试验的教导)中描述的方法，进行了试验。
SCD-1酶的制备
如PCT公开申请WO2008/074835A1(其公开通过引用并入用于试验的教导)中描述的由大鼠肝微粒体制备SCD-1酶。
禁食雄性Sprague–Dawley大鼠(150–175g)两天，然后喂食低脂肪饮食三天以便诱导SCD-1活性。然后处死大鼠，去除它们的肝脏并放置在冰上。用剪刀精细地剪碎肝脏，然后在4℃下使用Polytron均质器在均化缓冲剂(150mM KCl，250mM蔗糖，50mM tris–HCl，pH 7.5，5mM EDTA，和1.5mM还原型谷胱甘肽)中均质处理。在4℃，1500Xg下将匀浆离心。收集上清液并在4℃，在10,000Xg下离心两次，每次20分钟。收集生成的上清液并在4℃，100,000Xg下离心60min。排出上清液，在均化缓冲剂中再悬浮微粒体的粒剂，进行等分，并在-80℃下储存。通过Bradford试验鉴定再悬浮过的粒剂的蛋白质含量。
缓冲剂和试剂的制备
SCD-1试验缓冲剂的制备：缓冲剂由100mM K2HPO4(Qualigens公司)和100mMNaH2PO4.2H2O(Qualigens公司)组成，pH 7.4。
磷酸钾缓冲剂的制备：缓冲剂由200mM K2HPO4(Qualigens公司)和200mM KH2PO4(Qualigens公司)组成，pH 7.0。
SCD-1提取缓冲剂的制备：缓冲剂由250mM蔗糖(Sigma公司)、15mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma公司)、5mM MgCl2(Sigma公司)、0.1mM EDTA(Sigma公司)、0.15M KCl(Sigma公司)、和62mM磷酸钾缓冲剂组成，pH 7.0。
β-NADH的制备：在SCD-1试验缓冲剂中制备β-NADH(Sigma公司)的20mM备用溶液并在-70℃下储存。通过用刚才使用的试验缓冲剂将备料稀释至8Mm来制备β–NADH的工作备料。
硬酯酰辅酶-A的制备：在SCD-1试验缓冲剂中制备硬酯酰辅酶-A(Sigma公司)的1.65mM备用溶液并在-70℃下储存。
放射性混合剂的制备：将100μL的1μCi/mL硬酯酰(9,103H)辅酶A(AmericanRadiolabeled Chemicals)和144μL的1.65mM硬酯酰辅酶-A添加到5516μL的SCD-1试验缓冲剂中。
在多层筛板中活性炭床的制备
在试验缓冲剂中制备33％活性炭(Sigma公司)溶液。多层筛板的每个孔中添加250μL的溶液。由通过真空歧管将真空施加至板上来形成炭床。将板储存直到使用板为止。
测试试样的制备
如下制备测试试样。在100％二甲基亚砜(DMSO)中，制备20mg/mL的备用溶液用于每个提取物(示例1的提取物和示例2的提取物)。在SCD-1试验缓冲剂中制备工作备料。在100μL的试验混合物中添加10μL的工作备料以获得50μg/mL的最终浓度的提取物。
通过备用溶液的连续的稀释，制备用于剂量响应的三种不同浓度(即25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL)，用于示例2的提取物。
生物活性标志物(化合物1)是在50μg/mL浓度下测试的。
试验
用测试试样治疗微粒体(62.5μg)15min。然后，添加25μL的β-NADH工作备料和20μL的含有9,10-3H硬酯酰辅酶A的放射性混合剂并在25℃下培养混合物30min。通过添加高氯酸终止反应。然后将板离心，并将来自每个孔的上清液使用真空歧管穿过炭床进到储藏板。将含有3H2O的滤液转移到含有4mL的闪烁液的闪烁瓶中并使用液体闪烁计数器测定cpm计数。参考赋形剂的控制来计算抑制百分率。
通过连续稀释示例2的提取物的备用溶液在25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度下，确定剂量响应。
用每个实验试验阳性对照。结果表示在表3和表4中。
表3：SCD-1抑制试验
编号 试样 浓度 SCD-1的抑制百分率
01 示例1的提取物 50μg/mL 46.00
02 示例2的提取物 50μg/mL 60.65
03 化合物1 50μg/mL 74.20
04 MF-152* 100nM 70.71
*MF-152：标准化合物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,19,5214–5217,2009)。
结论：发现在SCD-1抑制试验中，植物椭圆榄仁树的提取物(示例1的提取物和示例2的提取物)和生物活性标志物(化合物1)是活性的。
表4：剂量响应SCD-1抑制试验
编号 试样 浓度 抑制百分率
01 示例2的提取物 25μg/ml 44.74
02 示例2的提取物 50μg/ml 72.24
03 示例2的提取物 100μg/ml 82.17
04 MF-152* 100nM 44.91
*MF-152：标准化合物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,19,5214–5217,2009)。
结论：在体外SCD-1抑制试验中，示例2的提取物显示剂量相关的抑制作用。
示例8
基于细胞的甘油三酯(TG)合成试验
通过按照在参考文件“European Journal of Pharmacology,618,28–36,2009”(其公开通过引用并入用于试验的教导)中报到的方法，评价示例1的提取物和示例2的提取物在HepG2细胞中抑制甘油三酯合成的能力。
缓冲剂、试剂和培养基的制备
鹰的最低基础培养基(EMEM)：将一小香袋粉末的EMEM(Sigma公司)添加到1L锥形瓶中。用10mL的蒸馏水漂洗空的小香袋。在900mL的蒸馏水中使用磁力搅拌器溶解粉末。还补充1.5g的碳酸氢钠(Sigma公司)，10mL的丙酮酸钠(Sigma公司)和1mL的盘尼西林-链霉素(Gibco公司)。适当的混合之后将pH调节到7.2并将体积补到1L。将培养基过滤消毒并在4℃下储存。
灭活的胎牛血清(FBS)：在预定为56℃的水浴中放置胎牛血清(Hyclone)30min。然后在50mL的聚丙烯管中等分(45mL)FBS并在-80℃下储存。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)：在900mL的蒸馏水中溶解一小香袋的PBS(Sigma公司)内容物。将pH调节至7.2并将体积补到1L。然后将它过滤消毒且在-20℃下储存。
胰蛋白酶-EDTA溶液：解冻胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma公司)并在50mL的聚丙烯管中无菌地等分(45mL)并在-20℃下储存。
测试试样的制备
如下制备测试试样。在100％二甲基亚砜(DMSO)中，制备20mg/mL的备用溶液用于示例1的提取物和示例2的提取物。将10μL的工作备料添加到100μL的试验混合物中，以获得50μg/mL的最终浓度的提取物。
通过备用溶液的连续的稀释，制备用于剂量响应的三种不同浓度(即25μg/mL，50μg/mL和100μg/mL)，用于示例1的提取物和示例2的提取物。
HepG2细胞的培养
在37℃的水中解冻一个冷冻小瓶的HepG2细胞(ATCC编号HB-8065)。将所有小瓶的内容物转移到含有9mL的EMEM和1mL灭活的胎牛血清的T-75组织培养烧瓶中。在37℃下，在具有5％CO2湿度控制的培养箱中培养烧瓶。观察用于细胞生长的烧瓶。当细胞铺满约70％时排出失效的培养基并用5mL的PBS洗涤细胞单层。将1.5至2mL的胰蛋白酶EDTA溶液添加到烧瓶中，以致覆盖整个细胞层。来自烧瓶的所有细胞全部被分离时，添加用10％胎牛血清补充的6mL的EMEM并混合至得到均匀的细胞悬液。在1000rpm下离心细胞悬液5min以获得细胞的粒剂。在用10％胎牛血清补充的6mL的EMEM中逐渐地分散细胞粒剂。如上面的描述制备六个T-75烧瓶并将1mL的细胞悬液添加到每个烧瓶中。在37℃下，在具有5％CO2湿度控制的培养箱中培养烧瓶24h。每48小时候更换培养基。72h时烧瓶被铺满为约70％并准备好于平板接种。
试验
在含有10％胎牛血清的EMEM培养基中制备HepG2细胞悬液。使用血球计数器确定细胞计数并将计数调节至4x105细胞/毫升/孔，用于24-孔板。还制作平行板用于实验结束时要做的生存力测试。在37℃下，在具有5％CO2的湿度控制的培养箱中培养板，直到铺满细胞。当细胞铺满70至80％时，排出培养基并用含有10μM的标准化合物(MF-152)或者50μg/mL的示例1的提取物或者示例2的提取物的新鲜培养基来代替。在0.1％的最终浓度下在赋形剂孔中添加DMSO。将板培养一夜约18h。第二天排出培养基并用含有用0.1％BSA(不含脂肪酸)补充的标准化合物/提取物/DMSO的培养基来代替。
还将2μCi的14C标记的醋酸添加到每个孔中并在37℃下进一步培养板6h，其后排出培养基并提取脂类。
为了评定植物提取物的细胞毒性效应，培养2h后，使用MTS(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺酰基)-2H-四唑鎓)试剂，在平行版上进行细胞的生存力测试。
脂类提取
按照下述的方案进行提取：
实验结束时，用冰冷的PBS洗涤细胞两次。在1mL冷的PBS中细胞被解体并用移液管移到含有4mL甲醇:氯仿(2:1)的15mL玻璃管中并使用涡旋混合器搅拌。在4000rpm下将管旋转5min，并将上清液转移到新的管中。排出主要由蛋白质组成的粒剂。将1mL的50mM柠檬酸，2mL的水和1mL的氯仿添加到上述的上清液中并使用涡旋混合器搅拌。获得混浊的两相混合物。在未冷却的离心机中在3500rpm下将管旋转15min。获得下层氯仿相和上层水/甲醇相。在两个主要由沉淀的蛋白质组成的物质之间还有相间(inter-phase)。排出上层水/甲醇相，留下未触及的相间。将含有脂类的下层氯仿相转移到新的管中，并在加热块上进行蒸发。在200μL的氯仿:甲醇(2:1)中再溶解脂类。使用己烷:乙醚:醋酸(85:15:0.5)的溶剂体系，在TLC硅胶板上分离甘油三酯。无放射标记的甘油三酯标准物在旁边跑过以及所有斑点被甘油三酯标准物共同沾上斑点。将TLC板暴露于碘蒸汽，并刮去甘油三酯斑点，并转移到含有4mL的闪烁液的闪烁瓶中。在液体闪烁计数器中以cpm来测定放射活性并参考赋形剂计算抑制作用。结果表示在表5中。
通过连续稀释示例1的提取物和示例2的提取物的备用溶液在25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的浓度下，确定剂量响应。结果表示在表6中。
表5：甘油三酯合成的抑制作用
编号 试样 浓度 TG的抑制百分率
01 示例1的提取物 50μg/mL 80.3
02 MF-152* 10μM 47.46
03 示例2的提取物 50μg/mL 69.69
04 MF-152* 10μM 36.5
*MF-152：标准化合物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,19,5214–5217,2009)。
结论：发现基于细胞的甘油三酯合成试验中，植物椭圆榄仁树的提取物(示例1的提取物和示例2的提取物)是活性的。
表6：甘油三酯合成的抑制的剂量响应
编号 试样 浓度 TG抑制百分率 毒性百分率
01 示例1的提取物 25μg/mL 43.70 4
02 示例1的提取物 50μg/mL 66.70 30
03 示例1的提取物 100μg/mL 91.07 48
04 MF-152* 10μM 22.45 7
05 示例2的提取物 25μg/mL 32.56 0
06 示例2的提取物 50μg/mL 63.28 2
07 示例2的提取物 100μg/mL 83.67 22
08 MF-152* 10μM 38.25 7
*MF-152：标准化合物(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,19,5214–5217,2009)。
结论：示例1的提取物和示例2的提取物显示出甘油三酯合成的剂量相关的抑制作用。
体内研究
依照Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments on Animals(CPCSEA)的指导方针和Institutional Animal Ethics Committee(IAEC)的批准进行体内实验。
示例9
示例1的提取物对高脂肪饮食(HFD)诱导的体重增加的影响
已报到在啮齿动物中高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖模型会是对评估抗肥胖剂的功效有用的模型(Obesity,17(12),2127–2133,2009)。报道了喂含有58％kcal脂肪的高脂肪饮食导致小鼠肥胖(Metabolism,47,1354-1359,1998)。另外，喂高脂肪饮食的小鼠比起那些喂正常饮食的小鼠显示出显著较高的体重和显著较重的内脏脂肪组织(例如，附睾的脂肪组织、腹膜后的脂肪组织和肠系膜的脂肪组织)(Life Sciences,77,194–204,2005)。
报到有用于评价各种各样的天然产品的抗肥胖效果的HFD诱导的体重增加模型(BMCComplementary and Alternative Medicine,5:9,1-10,2005；BMC Complementary and AlternativeMedicine,6:9,1-9,2006)。
实施在小鼠中HFD诱导的体重增加研究以便评价示例1的提取物的功效。
用HFD(60％Kcal，D12492，Research Diets，USA)驯化雄性C57BL/6j小鼠两周(内部；Central Animal Facility，Piramal Healthcare Limited，Goregaon，孟买，马哈拉施特拉邦，印度)。选择呈现重量增加的小鼠用于研究并随机分为以10只小鼠每组组成的治疗组。
测试试样的制备
在聚乙二醇400(30％)(PEG 400，Fisher Scientific，印度)和0.5％羧甲基纤维素(70％)(CMC，Sigma公司，USA)中制备示例1的提取物的悬液。
试验
以500mg/kg体重的剂量口服给药示例1的提取物，每天一次。奥利司他(Biocon公司，印度)作为标准药且以15mg/kg体重的剂量口服给药(每天两次)。将低脂肪饮食(LFD，10％kcal，D12450B，Research Diet，USA)喂给作为正常对照的10只小鼠的单独组。以10mL/kg体重的剂量将赋形剂给药至HFD和LFD对照组。
治疗延续到60天期间。每天监控体重和进食量。计算体重变化百分率(从第一天开始体重增加的百分率)和累积的进食量数据。在第61天，异氟烷麻醉下在肝素化(50IU/mL)微量离心管中收集血样(约200μL/小鼠)。在4℃下，通过10000rpm的离心分离血浆用于各种各样的血浆生物化学参数的估计。在BS-400自动分析仪(迈瑞公司，中国)中进行生物化学分析。此后，处死小鼠随后切开取出器官/组织(即，肝脏、心脏、肾、附睾脂肪和腹膜后脂肪)并称重。通过单向ANOVA，随后Dunnet事后测试分析所有数据，用于统计学显著性，并认为P<0.05的值是显著的。使用用于Windows(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)的GraphPad Prism版本4.00来进行所有的分析。结果呈现在表7、表8和表9中。
表7：小鼠中HFD诱导的体重增加的效果
*p<0.05，**p<0.01对HFD+赋形剂；平均数±标准误差。
与HFD+赋形剂组相比，示例1的提取物显示出显著的体重增加的抑制作用。
表8：对累积进食量的影响
组 累积的进食量(g/小鼠)(60天)
LFD+赋形剂 120.3±3.3
HFD+赋形剂 110.5±2.8
HFD+示例1的提取物 104.5±4.7
HFD+奥利司他 119.7±4.7
平均数±标准误差。
在累积进食量上，与HFD+赋形剂组相比，在示例1的提取物中没有观察到显著地减少。
表9：对脂肪组织重量的影响
#总脂肪＝附睾的脂肪+腹膜后的脂肪，*p<0.05，
**p<0.01对HFD+赋形剂；平均数±标准误差。
与HFD+赋形剂组相比，示例1的提取物显示脂肪组织重量的更好的减少。
用于如葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、肌酸酐和尿素的参数的血浆生物化学分析显示，在示例1的提取物和赋形剂组之间没有显著差异。器官重量(心脏，肝脏和肾)没有显示任何显著不同。
结论：对具有示例1的提取物的HFD的小鼠的治疗引起体重增加的显著减少。达到了该体重增加的减少，而没有显著减少进食量，并在脂肪组织重量(脂肪量)减少上同样明显。在高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖模型中，示例1的提取物显示抗肥胖活性。
示例10
含有椭圆榄仁树提取物的片剂的制备
过程
步骤1：称重500mg的示例1提取物并使它筛过#40筛目。
步骤2：称重212mg的微晶纤维素、40mg的交联羧甲纤维素钠、8mg的羟丙基纤维素并筛过#40筛目。
步骤3：在非剪切混合器中，将步骤1中的成分与步骤2中的成分混合10min。
步骤4：使用恰当的压紧器压紧共混物。
步骤5：使用适合大小的筛粉碎获得的片状粉以获得期望大小的颗粒。重复该过程，直到获得期望量的粒剂。
步骤6：称重额外粒状的辅料(即预胶化淀粉、二氧化硅胶体、滑石)并将成分筛过#40筛目。
步骤7：在非剪切混合器中，将步骤6的成分与步骤5的粒剂混合15min。
步骤8：称重8mg的硬脂酸镁并将其筛过#60筛目。
步骤9：将筛过的硬脂酸镁与步骤7的共混物混合2min。
步骤10：用期望的工具压缩共混物。
包衣溶液的制备
步骤1：在需要的量的水中分散包衣材料。
步骤2：均质化30min。
步骤3：通过尼龙布过滤溶液。
步骤4：将片剂包衣以得到所期望的重量增加。
步骤5：在包衣锅中干燥片剂约20至30min。

Claims (13)

1.一种组合物，包括治疗有效量的作为活性成分的植物椭圆榄仁树的提取物以及至少一种药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物含有5％至100％的所述植物椭圆榄仁树的所述提取物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述提取物从所述植物椭圆榄仁树的树皮获得。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述植物椭圆榄仁树的提取物含有生物活性标志物以及至少一种药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述生物活性标志物为鞣花酸、4-O-α-L-吡喃鼠李糖甙(化合物1)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述植物椭圆榄仁树的所述提取物含有0.01％至10.0％的所述化合物1作为所述生物活性标志物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中将所述组合物口服给药至需要治疗代谢紊乱的受试者。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中以片剂、胶囊或者粒剂的形式配制用于口服给药的所述组合物。
9.一种在治疗代谢紊乱中应用的根据权利要求1所述的组合物。
10.一种组合物，用于根据权利要求9所述的应用，其中所述代谢紊乱选自胰岛素抗药性，高血糖症，糖尿病，肥胖，葡萄糖耐受不良，高胆固醇血症，血脂异常，超高胰岛素血症，动脉粥样硬化疾病，多囊卵巢综合症，冠脉疾病，代谢综合征，高血压，或者与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类相关的失调，或者与胰腺β细胞再生相关的失调。
11.一种组合物，用于根据权利要求10所述的应用，其中所述代谢紊乱选自胰岛素抗药性，糖尿病，高血糖症，代谢综合征，葡萄糖耐受不良，肥胖，血脂异常，与异常的原生质脂蛋白、甘油三酯类有关的失调或者胰腺β细胞再生相关的失调。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中提供所述组合物，用于与至少一种另外的治疗活性剂组合使用，用于治疗代谢紊乱。
13.包含治疗有效量的植物椭圆榄仁树的提取物的组合物用于制备治疗代谢紊乱的药剂的用途。
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