KR20140138639A - 점막 침투 강화를 나타내는 나노 입자 제형 - Google Patents

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Abstract

저장성 제형들을 점막의 비활성의 점막 침투성 나노입자(MPP)로써 수용성 약물의 수송을 위하여 평가되었다. 저장성 제품은 약물과 MPP들이 상피 표면에 도달하는 비율을 현저히 증가시키고, 질 주름 깊숙히 안쪽으로 포함된다. 최소의 저장성 제형, 바람직하게는 20-220 mOsm/kg 범위의 저장성 제형은 MPP를 질의 전표면에 의 신속하고 균일한 전달을 상피 독성의 최소한의 위험을 무릅쓰고 제공한다. 또한 자료는 결장에서 삼투압농도가 더 높아서 위 삼투압농도를 가진 수송체는 신속하고 삼투압적으로 초래되는 체액 흡수때문에 결장에서의 분포를 개선한다. 개선된 결장 분배, 결장내 저장성 수송체로써 개선된 결장 분포의 범위는 ~20 mOsm/kg 내지 450 mOsm/kg이다.

Description

점막 침투 강화를 나타내는 나노 입자 제형{NANOPARTICLES FORMULATIONS WITH ENHANCED MUCOSAL PENETRATION}
본 발명은 나노 입자 제형 분야, 특히 점막으로 덮힌 표면상피에 점액 침투성 나노입자를 신속하게 전달하는 저장성 나노 입자 제형 및 이의 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
미국정부의 권리
미국정부는 본 발명에 대한 권리를 가진다. 이 연구는 미국 국립보건연구소 R01HD062844, R33AI079740, R01CA140746) (J.H. and R.C.), 미국국립과학재단(L.M.E. and the National Institutes of Health/Microbicide Innovation Program 5R21AI079740)에 의해 지원받았다.
우선권
미국특허출원번호 61/588,350 (2012.1.19 출원)
PCT/US2012/024344 (2012. 2. 8 출원)
PCT/US2012/069882 (2012.12. 14 출원)
생분해성 나노 입자를 통한 치료제의 국부 전달은 종종 전신성 약물 투여보다 전신성 부작용 감소와 표적 부위에서의 약물 수준 제어를 포함하는 장점을 제공한다. 그러나 점막 표면에서의 약물 전달 제어는 보호성 점액층의 존재로 제한을 받았다.
점액은 호흡 기관, 위장관, 비인두 및 여성 생식관과 같은, 피부로 덮이지 않은 모든 노출된 상피 표면, 그리고 눈의 표면을 코팅하는 점탄성 겔이다. 점액은 입체 및/또는 부착성 상호 작용을 통해 종래의 입자성 약물 전달 체계를 효율적으로 끌어 모은다. 점액 교체 결과, 점막 표면으로 국부적으로 전달된 대부분의 치료제는 불량한 보유 및 분포를 겪으며, 이는 치료제의 효능을 제한한다.
눈, 코, 폐, 위장관, 및 여성의 생식기에서 점액이 덮여진 세포로 전달되는 나노 입자의 운반 약물 및 유전자는 이들 표면을 최대로 보호하거나 치료하기 위해 균일하게 분포되어야 한다. 그러나, 고 점탄성(즉, 본래 점성이고 고체의) 및 점착성 점액층은 입자를 느리게 하거나 완전히 움직이게 하고, 이로써 그 것들을 점막 표면위에 전개되는 것을 방지한다. 또한 어떤 점막 표면, 예를 들면 입, 위장, 창자, 결장 및 질과 같은 것들은 종래의 점막 점착성 입자와 다수의 작은 분자 약물 및 치료제에 접근 불가능한, 주름이 많은 점막 표면을 나타낸다. 이들 깊은 홈안으로 침투와 함께 최대한 분포가 없으면, 상피 표면의 많은 부분들이 감염 및/또는 치료되지 않은 상태로 남아 있게 된다. 또한, 주름진 부분, 아마 더 느리게 소거되는 점액층일 것으로 추정되는 부분안으로의 침투는 상피 표면에서 증가된 잔류시간을 허용한다.
약물 또는 유전자 전달을 위하여, 치료용 입자들은 1) 관심부위의 점막 표면위에 균일한 분포를 얻을 수 있어야 하고, 또한 2) 신속한 점액 서거를 효율적으로 방지하는 점액 장벽을 통과하여야 하며 하부 기초세포들에 치료 탑재물을 효과적으로 전달하는 것을 보장할 수 있어야 한다. (das Neves J & Bahia MF Int JPharm 318, 1-14 (2006); Lai et al. Adv Drug Deliver Rev 61, 158-171 (2009); Ensign et al. 5c/' Transl Med 4, 138ral79 (2012); Eyles et al. JPharm Pharmacol 47, 561-565 (1995)).
점액 장벽 안으로 깊이 침투하는 생분해성 나노 입자는 점막 표면에서 향상된 약물 분포, 보유 및 효능을 제공할 수 있다.
저 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 고밀도 코팅은 나노 입자가 높은 점탄성을 나타내는 인간 점액 분비를 통해 신속하게 침투할 수 있게 한다. 친수성이며 생물학적으로 불활성인 PEG 코팅은 나노 입자와 점액 성분들 사이의 부착성 상호 작용을 효과적으로 최소화한다. 생분해성 점액 침투 입자(MPP)는 사전 제작된 점막 부착성 나노 입자 상으로 F127과 같은 특정 플루로닉을 물리적으로 흡착시켜 제조되었다. 또한, MPP는 폴리(세바신산)과 PEG의 2블록 공중합체를 이용하여 나노 침전법으로 제조되었다.
질 표면은 성교 및 출산시 팽창을 수용하도록 고도로 주름져 있고; 이러한 주름("rugae")은, 통상 주름진 표면에 약물 전달을 방해하고, 복강 내 압력에 의해 축소된다. 효과적인 예방 및 치료를 위해, 유지된 약물 농도가 민감한 전 표면에 전달되어야하고, 전체 표면에 걸쳐 유지되어야 한다. 질의 전체 상피 세포위에 알맞은 분포를 얻지 못하면, 문서화된 질 살균제의 실패한 형태이다.
질에 효과적인 약물 전달에 또 다른 중요한 장벽은 질 상피 세포를 덮고 있는 내부 자궁 경부에 의해 분비되는 점액의 점탄성 층이다. 점액은 외부 입자와 입자성 물질을 입체성이고 동시에 점착성 기전에 의해 효과적으로 포집하고, 급속히 제거한다.
점막 부착 투여 형태의 사용이 질내 체류 시간을 증가시키기 위해 제안되었지만, 점액 클리어런스 점막 부착 시스템의 체류 시간을 제한 (시간 분의 주문에) 급속하게 발생한다.
점막 상피 세포는 액체 흡수와 분비를 유발하는 삼투 그라디언트를 사용한다. 질 제품은 전통적으로 효모 감염 치료 등 KY® 온난화 젤과 같은 대부분의 성적 윤활제, 및 HIV 등 성병 감염을 방지하기위한 설계 젤을 포함하여 고장성 제제로 되었다. 고장성 제형은 질에 유체의 신속한, 삼투 구동 분비를 야기하고, 이는 제제의 hypertonicity에 비례하는 속도로 질에서 유체 누설의 즉각적인 증가시킨다. 또한, 후보의 질 및 동물 모델에서 인간 모두 직장 살균제의 최근 조사는 고장성 제제는 독성 매트 감염에 대한 감수성을 증가시킬 수있다 일으킬 것으로 밝혀졌다. HIV 예방에 대한 최초의 성공적인 미생물 시험은 질 젤에서 제공되는 항 레트로 바이러스 약물, 테노포비아(tenofovir)는, 부분적인 보호를 한 것으로 나타났다. 불행히도, 겔 제제는 독성을 감소 글리세롤의 농도를 감소시키는 테 노포의 가장 최근의 임상 시험에서 연구자 선도 높은 고장성이었다. 그러나, 농도가 감소되지 시키고, 제형은 여전히 상당히 고장성이다. 고장성 제형 질액, 상피 세포에 대한 약물의 전달을 대향 유체 흐름의 급격한 삼투압적 구동 분비를 야기하여 독성 효과에 부가하기 때문에, 질 약물 전달 고장성 제형을 정당화하는 증거가 없는 것으로 나타난다. 정당성이 부족은 연구자 및 질 제품의 제조 업체에 의해 무시된, 유일한 분명 예외는 성적 윤활제는 수정을 지원하기 위한 것이다. 이들 제품은 정자의 생존 능력을 유지하는 데 도움 (삼투압 플라즈마의에 해당) 등장으로 제제화된다.
따라서, 본 발명의 목적은 상피 세포에 대한 최소의 독성으로 점막으로 덮여진 상피 표면에 광범위한 약물의 신속하고 균일한 입자의 전달을 위한 제형을 제공하는 것이다.
삼투는 고도로 절첩 점막 조직 깊은 홈에 점액 관통 입자의 빠른 침투를 야기하는데 사용될 수 있다. 점막 조직의 깊은 홈에 흡수성 및 침투성 달리 제대로 분산 엔티티의 점막 표면 위에 분포를 향상시킨다. 점막 조직의 깊은 홈에 빠른 흡수 및 침투성은 점액 관통 입자의 증가 체류 시간에 이어진다. 신속한 흡수가 치료의 효과를 증가시키고, 애플리케이션 및 점막 보호 사이의 시간을 최소화하는 이외에 사용자 수용을 용이하게 한다.
저장성 제형은 수용성 약물 전달 및 뮤코 불활성와 약물 전달을 평가하였다 (즉, 비 - 부착 성) 점액 관통 나노 입자 (MPP). 저장성 제제는 현저하게되는 약물의 속도를 증가 MPP는 상피 표면에 도달했다. 등장성 제제에 도달하지 못했음을 질 주름 (rugae)에 깊이를 포함하여 또한, 저 삼투압 제제가 크게 향상 약물 및 전체 상피 표면에 MPP 전달. 저장성 제제는 무료 약물 상피 세포에 그려 질뿐만 아니라 질 유지를 감소, 상피를 통해 그려질 뿐만 아니라 원인이 될 수 있다. 대조적으로, 제형은 저장성이 MPP 질 표면에 신속하고 균일하게 축적 있지만 이상적으로 지속적인 점막 약물 전달에 대해 위치를 유지하므로 상피를 통과하지 않는다. 바람직하게는 20-220 mOsm / kg에 이르기까지 최소한 저 삼투압 제제는 상피 독성의 위험을 최소화와 함께, 전체 질 표면에 MPP의 신속하고 균일한 전달을 제공했다. MPP를 통해 질 약물 전달 저장성 제제는 크게 생식 기관의 질병 및 장애의 예방 및 치료를 개선해야 한다.
데이터는 여전히 삼투압, 급속한에 결장 유통 개선으로 이어질 혈장의 위의 삼투압이 장착된 수송체가 (일반적으로 ~ 300 mOsm / kg의 등장으로 간주)하도록, 대장에서 더 높은 삼투 질 농도가 있음을 보여준다 콜론의 저장성 수송 향상 대장 분포의 범위는 ~ 20 mOsm / kg-450 mOsm / kg이다. 바람직한 실시 예에서, 결장 또는 직장에 적용하기위한 제제는 약 20 mOsm / kg 및 450 mOsm / kg 사이의 삼투압을 가지며 나트륨 이온 (나트륨 *) 220 mOsm 초과 삼투압의 원인이 적어도 30 % / kg. (- 230 mOsm / kg, 또는 69 mOsm / kg 제형의 삼투압이 450 mOsm 경우 즉, / kg은 나트륨 + 이온은 적어도 30 %를 포함해야 450-220).궤양 조직에 MPP의 흡수를 포함하여 유도 된 궤양 성 대장염과 직장 조직에 (CP에 비해) hypotonically 관리 MPP의 개선 분포는도 증명되었다. 저장성 정부는 또한 대장 (FITC로 표지 테 노포 비어) 개선 무료 약물의 분포에 연결된다.
도 1a 및 도 1b는 유화법에 의해 제조된 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 궤적을 나타낸 것이다. 도 1c와 도 1d는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위를 시간의 함수(시간 척도/s)로 나타내는 그래프이다. 도 1e와 도 1f는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. 도 1g와 도 1h는 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 2a와 도 2b는 인간 자궁 경부 점액에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG MW의 영향을 나타낸다. 도 2a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD/μm2>를 시간 척도/s의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 2b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. PLGA-PEG(6wt% PEG)를 이용하는 유화법으로 입자를 제조하였다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 3a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD/μm2>를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 3b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. 도 3c는 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있을 것으로 예상되는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다.
도 4의 A 내지 도 4의 C는 나노 입자의 점액 침투에 미치는 표면 PEG 피복범위([Γ/Γ*])의 영향을 나타내는 개요도이다. 도 4의 A 내지 도 4의 C는 증가하는 피복범위에서 표면 PEG 코팅이 있는 PLGA-PEG 나노 입자의 침투를 나타낸다. 표면 PEG 피복범위가 증가함에 따라, PEG 변동 형태는 버섯형(이웃하는 PEG 사슬이 겹치지 않음, [Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서 브러시형(이웃하는 PEG 사슬이 겹침, 1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B), 조밀한 브러시형([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C)으로 바뀐다. 낮은 PEG 피복범위([Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서, 뮤신 섬유는 나노 입자 코어에 강력하게 부착된다. 중간 PEG 피복범위(1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B)에서, 뮤신 섬유는 아직도 나노 입자 코어에 부분적으로 흡수될 수 있다. 높은 ([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C) PEG 피복범위에서, 나노 입자 코어는 완전히 생물학적으로 비활성인 PEG 코로나로 차폐되어, 나노 입자로 뮤신이 전혀 흡수되지 않는다. 도 4의 C는 낮은 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 점액에 고정되고, 중간 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 저지당하거나 심지어 점액에 고정되고, 높은 그리고 매우 높은 PEG 피복범위를 나타내는 입자는 신속하게 점액을 침투할 수 있음을 보여준다.
도 5a 및 5b는 저장성 (하이포) 또는 등 장 (이소) 용액 중 하나에 투여 독소루비신 (DOX)에 의한 질 범위를 보여준다. 마우스 (A)는 조직 수집 (외래) 전에 10 분간 보행하기 전에 조직 수집 (보행 불능) 또는 (B)에 1 시간 부정사 남아 있었다. (C) 등장 (ISO) 및 (D) 저장성 (하이포) 용액에서 Dox를 투여 한 마우스의 보행의 평균 질 표면 코팅의 이미지를 대표. 데이터는 평균 ± SEM이다 (n = 5)이었다. * P <0.05, 등장, 윌 콕슨 순위 합 검정 비교.
도 6은 등장성 (이소) 중 하나를 투여 독소루비신의 질 유지 또는 저장성 (저자) 솔루션을 보여준다. 마우스는 조직 수집하기 전에 10 분 동안 유지 앙와위. 등장성 솔루션 및 전체 자궁 경부 기관의 조직 저장성 솔루션에 대한 독소루비신 형광 강도와 시야 이미지의 오버레이. 용액 형광 조정 형광 시그널의 정량 분석??에 기초하여 상대 독소루비신 신호는 N = 4 쥐에 대해 계산된 평균을 대표 ± SEM 및 상대적인 신호로 정량하였다. * P <0.05 등장 비교 Wilxocon 순위 합 시험
도 7은 저장성 (저자) 중 하나에서 아시클로버 모노 포스페이트 (ACVp) 또는 등장성 (이소) 용액으로 처리 후 질 HSV-2 감염을 보여준다. ACVp (10 ㎎ / ㎖)을 1 분 또는 바이러스 접종하기 전에 60 분 동안 투여 하였다. n≥ 45 마우스는 각 그룹에서 테스트하였으며, 대조군 감염률은 -90 %이었다. * P <0.0 등장에 비해, 피셔의 정확한 시험
도 8a 및 저장성 (저자) 중 하나를 투여 MPP의도 8b 질 유지 또는 등장성 (이소) 솔루션이다. 도 8은 마우스 전에 조직 컬렉션 (비 외래)에 1 시간 동안 누운 남아 있었다. 도 8b는, 마우스는 티슈 콜렉션 (외래)에 앞서 10 분 동안 보행했다. 입자 보유는 SEM (N> S) ± 평균으로서 계산되었다. * P <0.05 등장에 비해, 윌 콕슨 순위 - 합 테스트
도 9는 가로 질 저온부와 전체에 삼투압을 변화시키는 솔루션을 투여 형광 100 nm의 MPP들의 질 분포, 질 조직을 평평하게 보여준다. 모든 조직은 입자 투여 10 분 이내에 수집 하였다. 모든 값은 mOsm/kg 단위가 있다. 점막 부착 CP 입자에 대한 삼투압이 20 mOsm / kg이었다. 이미지 n≥ 5 쥐의 대표이다. 계산 된 데이터는 ± SEM을 (N ≥ 3)을 의미한다. (4)에서 재판. * P <0.05 저장성 용액 (20 ~ 220), 윌 콕슨의 순위 합 테스트.
입, 위, 장, 대장 및 질과 같은 많은 점막 표면은 체액과 영양분의 흡수와 상피세포의 확장을 수용할 수 있도록 수많은 깊은 주름을 포함한다. 이러한 이유로, 상피 표면의 상당 부분은 주름에 접근하기 어렵다. 균일 점막 조직 표면에 배포 입자를 조작할 수 있는 능력은 치료제 전달, 이미징 및 진단 응용 프로그램에 대한 많은 중요한 의미를 보유하고 있다. 예를 들어, 깊은 홈에 균일한 분포를 달성하지 못하고 안으로 침투하지 못한 입자는 점막 표면을 완전히 치료 또는 보호하지 못한다(Rajapaksa et al. J Biol Chem 285, 23739-23746 (2010).
입, 위, 장, 대장 및 질과 같은 많은 점막 표면은 체액과 영양분의 흡수와 상피세포의 확장을 수용할 수 있도록 수많은 깊은 주름을 포함한다. 이러한 이유로, 상피 표면의 상당 부분은 주름에 접근하기 어렵다. 균일 점막 조직 표면에 배포 입자를 조작할 수 있는 능력은 치료제 전달, 이미징 및 진단 응용 프로그램에 대한 많은 중요한 의미를 보유하고 있다. 예를 들어, 깊은 홈에 균일한 분포를 달성하지 못하고 안으로 침투하지 못한 입자는 점막 표면을 완전히 치료 또는 보호하지 못한다(Rajapaksa et al. J Biol Chem 285, 23739-23746 (2010).
질 약물 전달 분야에서, 모든 타겟 표면에 적절한 분포를 달성하는 것은 자주 인용되는 문제이다. 질 표면은 매우 축소된 주름의 결과로, 성교와 출산시 확장을 수용하거나 접어 "rugae을."rugae 나쁨에 분포에서도 모의 성교 후, 질 감염을 방지하기 위해 살균 제품의 장애에 중요한 요인으로 인용되었다. 생쥐의 기타 미생물 연구보다 완전한 질 분포를 촉진하기 위하여, (40 裏까지) 시험 제품의 대량 사용했다. 마우스 질은 ~ S0 裏의 볼륨을 보유 할 수 있다; 테스트 에이전트의 이러한 비교적 큰 볼륨 distends 및 질 상피를 펼친다. 전형적인 질 제품 만 2-5 ml에 전달하면서 한편, 인간의 질은, SO ML의 범위로 유지할 수있다. 생체 내 마우스에서 질 분포를 조사하기 위해, 인간에보다 적절하게 사용될 볼륨을 모방하는 것이 소량 (5 裏) 매트에 사용 하였다. 깊은 접힌 표면에 약물을 전달하는 방법, 질을 팽창시키지 않고, 보다 효과적인 질 약물 전달을 달성할 수 있다.
질 상피 투과성 작은 분자, 및 다양한 약물을 흡수 할 수 있다.상피를 통한 분비 및 유체의 흡수를 허용하면서 질 상피의 표면층은 조밀한 죽은 세포와 죽어 포장 포함 (각질층)의 매트는 깊은 생존 세포 층을 보호한다.질은 약물 전달에 사용될 수 삼투 유체 유도 흡수 기본 용량을 갖는다.
질 조직 표면의 25 %가 등장액으로 투여 독소루비신으로 코팅 한 반면, 독소루비신은 외래 생쥐의 질 표면의 85 % 이상을 피복 저장성 용액으로 투여. 나 질 조직이 평평 할 때 등장 유체는 스트라이프 패턴을 떠나 주름(rugae)에 침투하지 않는다. 그것은 저장성 배달 점액을 통해 N9의 이동성을 개선하여 세제 논 옥시 놀 -9 (N9)의 피임 효과를 증가시킬 수 있음을 제안하고 있다. (Dunmire EN & ATZ DF 피임 (55), 209-217 (1997); Owen et al. J Control Mease 60, 23-34 (1999)). 점액은 체외에서 격리 된 점액에 나타나고, 그럼에도 불구하고 저장성 N9 솔루션의 침투를 강화, 초점은 점액의 세제와 정자 사이의 더 빠른 접촉을 달성하도록 되어있는 것을 특징으로 한다.
특히 자궁 경부 기관 대장에 납품. '* 때문에 유통 문제뿐만 아니라 누액 " 뿐만 아니라 도전 할 수 있는 대부분의 질과 직장 제제는 유체가 삼투 적 점막 상피 세포에서 분비되도록하는 높은 삼투압이다(Rudolph et al. Mol Ther 12, 493-501 (2005); Bertschinger et al. Journal of Controlled Release 116, 96-104 (2006); Pihl et al Acta Physiol 193, 67-78 (2008); Noach J Pharmacol Exp Ther 270, 1373-1380 (1994)). 이 유체 분비 삼투압 저장성 약물 용액을 사용하여 약물 흡수가 공지되어 있지만, 유통 및 보관에 흡수의 효과는 알려지지 않고 있다. 예를 들면, Rajapaksa et al. J Biol Chem 285, 23739-23746 (2010); Rudolph et al. Mol Ther 12, 493-501 (2005); Bertschinger et al. Journal of Controlled Release 116, 96-104 (2006); Pihl et al. Acta Physiol 193, 67-78 (2008); Noach et al. J Pharmacol Exp Ther 270, 1373-1380 (1994); Lennemas H Pharmaceut Res 12, 1573-1582 (1995)참조.
긴장성 제제 (예를 들어, 질내 대 결장) 조직의 침투성 특성에 따라 독성이 증가없이 흡수 및 분포의 균일 을 위한 중요한 온화 저장성 범위가 있다. 온화 저장성 제형들은 임상에서 환자에 의한 부작용도보고 "누설"을 줄일 것이다 유체 흡수를 야기한다. 양쪽 사용자 수용뿐만 아니라 예를 들어 치료제의 신속한 제거를 감소하기 위해서 제품의 이러한 누설 리드, 294 mOsm에서 삼투압의 감소 / 220 mOsm에 kg / kg (60)로부터 질 표면 커버리지를 증가 온화 저장성 유체로서 행동 76 %, 및 본질적으로 모든 hypotonically 전달 MPP % 인 깊이 투여 10 분 이내에면 내의 절첩 상피 표면에 도달하는 광속에서 도출되었다.
급속 점액을 통해 균일 한 분포뿐만 아니라 전송을 달성 미립자 제형은, 효율적 소분자 화학 요법과 같은 치료법, 펩티드에 이르는 (약물 요법을 포함한 애플리케이션의 넓은 스펙트럼을 위해 체내에서 점액이 덮여 상피 조직을 대상으로 사용될 수 있다 단백질, oligonucletoides, DNA 등), 영상 및 진단. 치료 목적을 위해, 입자 포획 분자는 소정의 속도로 장기간 회 이상 방출 될 수있다. 일반적으로, 치료 적 응용을위한 기술은 표준 배합이 가능하지 않을 어떠한 약물의 전달을 포함, 100 % 유효하지 않거나 인해 비효율적 분포, 독성, 또는 "누설"은 원치 않는 부작용을 이끈다. 또한, 이 방법은 특히 유전자 / 올리고 뉴클레오티드 전달을 위해, (약물 전달 입자없이 즉,) 침투 및 표준 약물 제형의 균일 한 분포를 개선한다; 대상 및 높은 암을 치료하는 화학 요법 전달을 지역화; 항 염증 약물의 표적 전달; 치료 또는 성병의 예방; 바이오 필름 및 기타 생물학적 코팅제 / 장벽에 침투; 항생제의 대상으로 배달 세균 감염을 치료한다.
대부분의 질 젤은 젤의 고장성을 렌더링 글리세린 또는 프로필렌 글리콜과 같은 부형제와 혼합되어 있다. 불행하게도, 최근의 연구는 이러한 고장성 제제는 마우스의 질 기관에 독성을 일으킬 것을 보여 매트 HS V-2 감염에 대한 감수성 Fuchs의 고장성에 의한 가능성이 높다(Moench et al. BMC Infect Dis 10, 331 (2010)), Clark MR & Friend DR. (2012) Pharmacokinetics and Topical Vaginal Effects of Two Tenofovir Gels in Rabbits. AIDS Res Hum Retroviruses.).
또 고장의 겔 제재는, 사람 대장에 있어서의 표피 완전성을 파괴하는 것이 찾아내진, 및 고장 테노호비르겔 제재는, 발견된 미디어에 노출된 조직만(Rohan PLoS One 5, e9310 (2010))와 비교해 자궁질부 및 결장 직장외식편에 있어서의 표피 골절을 유발한다. 그것은 실험적 과민성장질환의 마우스 모델에서 덱스트란 황산나트륨(DSS)의 주요한 요인은, DSS 용액의 고침투압 유도성이라고 생각되어 왔다. 마우스의 질세정액중의 염증성 사이트 카인의 방출은, 고장겔 수송체의 7회의 일용량 후에 증가하지 않았지만, 저장성 제재의 7회의 일용량의 뒤에는 증가했다.
I. 정의
본원에 사용된 "나노 입자"는 일반적으로 약 1nm부터 약 1미크론까지, 그러나 약 1미크론은 포함하지 않으며, 더욱 바람직하게는 약 5nm 내지 약 500nm, 가장 바람직하게는 약 5nm 내지 약 100nm의 직경을 나타내는 임의의 형상의 입자를 지칭한다. 구 형상을 나타내는 나노 입자는 일반적으로 "나노 스피어"라고 지칭된다.
본원에 사용된 "평균 입자 크기"는 일반적으로 입자 집단 내 입자들의 통계적인 평균 입자 크기(직경)를 지칭한다. 기본적으로 구 모양의 입자의 직경은 물리적 또는 수력학적 직경이라 지칭될 수 있다. 비 구형 입자의 직경은 바람직하게는 수력학적 직경이라 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비 구형 입자의 직경은 입자 표면 상의 두 지점 사이의 최대 선형 거리를 지칭할 수 있다. 평균 입자 크기는 동적 광 산란과 같은, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
"단순 분산"과 "균일한 크기 분포"는 본원에서 서로 교환 가능하게 사용되며, 복수의 나노 입자 또는 마이크로 입자로서, 이러한 입자들이 동일하거나 거의 동일한 직경 또는 공기역학 직경을 나타내는 복수의 나노 입자 또는 마이크로 입자를 말한다. 본원에 사용된 단순 분산 분포는 분산의 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 86, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95% 이상이 중량 중위 직경 또는 공기역학 직경의 5% 내에 놓이는 입자 분포를 지칭한다.
본원 명세서에서 사용하는 "친수성"은 물과 용이하게 상호작용하는 강한 극성기를 가진 물질을 지칭한다.
"친유성"이란, 지질에 대한 친화성을 가진 화합물을 지칭한다.
"양친매성"이란, 친수성 및 친유성(소수성)의 특성을 조합시킨 분자를 지칭하고, "소수성"은 물에 대한 친화성이 없는 물질을 지칭한다. 물을 흡수하지 않고 물에 용해하거나 물과 혼합하지 않고 발명하지 않는 경향이 있다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"은 타당한 의학적 판단 범위 내에서, 미국 식품의약국과 같은 기관의 지침에 따라, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 타당한 수익성 대 위험성 비율에 비례하는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 이용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 "생체적합성" 및 "생물학적 적합성"은 임의의 대사물질 또는 분해 생성물과 함께, 일반적으로 수용체에 무독성이며, 수용체에 임의의 상당한 부작용을 유발하지 않는 물질을 일반적으로 지칭한다. 일반적으로 말하자면, 생체적합성 물질은 환자에 투여 시 상당한 염증 또는 면역 반응을 유발하지 않는 물질이다.
본원에 사용된 "분자량"은 달리 명시되지 않은 한, 일반적으로 벌크 고분자의 상대적인 평균 사슬 길이를 지칭한다. 실제로는, 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 또는 모세관 점도 측정을 포함하는 다양한 방법을 이용하여 분자량을 예상하거나 특성화할 수 있다. GPC 분자량은 수 평균 분자량(Mn)과는 반대로, 중량 평균 분자량(Mw)으로 보고된다. 모세관 점도 측정은 특정한 농도, 온도 및 용매 조건 세트를 이용하여 희석한 고분자 용액으로부터 결정한 고유의 점도로 분자량의 추정치를 제공한다.
본원에 사용된 "친수성"은 물에 대한 친화도를 나타내는 특성을 지칭한다. 예를 들어, 친수성 고분자(또는 친수성 고분자 세그먼트)는 주로 수성 용액에 용해성이 있고/있거나 물을 흡수하는 경향이 있는 고분자(또는 고분자 세그먼트)이다. 일반적으로, 고분자가 친수성일수록 그러한 고분자는 물에 더 잘 용해되거나, 혼합되거나, 젖게 되는 경향을 나타낸다.
본원에 사용된 "소수성"은 물에 대한 친화도가 부족하거나, 심지어 물을 밀어내는 성질을 지칭한다. 예를 들어, 고분자(고분자 세그먼트)가 소수성일수록 그러한 고분자(또는 고분자 세그먼트)는 물에 더 잘 용해되지 않거나, 혼합되지 않거나, 젖지 않게 되는 경향을 나타낸다.
본원에 사용된 "점액"은 주로 뮤신 당단백질 및 기타 물질을 함유하는 점탄성의 천연 물질을 지칭하는데, 이는 호흡계, 코, 자궁 경부, 위장관, 직장, 시각 및 청각 체계를 포함하는 다양한 기관/조직의 상피 표면을 보호한다.
본원에 사용된 "가래"는 뮤신 당단백질 외에도 DNA, 액틴 및 기타 죽은 세포로부터 방출된 세포 잔해물과 같은 다양한 거대분자들로 이루어지는 고도의 점탄성 점액 분비물을 지칭한다. "가래"는 천식, COPD 및 CF를 포함하나 이에 한정되지 않는 폐쇄성 폐 질환으로 고통받는 환자들의 병원성 기도에 일반적으로 존재한다. 본원에 사용된 "CF 점액" 및 "CF 가래"는 각각 낭포성 섬유증을 앓는 환자의 점액과 가래를 지칭한다.
본원에 사용된 "점액 분해제"는 환자에 투여 시 점액 제거 속도를 증가시키는 물질을 지칭한다. 점액 분해제는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Hanes, J. et al. Gene Delivery to the Lung, in Pharmaceutical Inhalation Aerosol Technology, Marcel Dekker, Inc., New York: 489-539 (2003) 참조. 점액 분해제의 예로는 뮤신에 존재하는 이황화 및 설프하이드릴 결합을 절단하는 N-아세틸시스테인(NAC)을 포함한다. 다른 점액 분해제로는 머그워트, 머그워트, 브로멜라인, 파파인, 클레로덴드럼, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 카르보시스테인, 에프라지논, 메스나, 암브록솔, 소브레롤, 도미오돌, 데누포솔, 레토스테인, 스테프로닌, 티오프로닌, 젤솔린, 티모신 베타4, 넬테넥신, 에르도스테인 및 rhDNA 분해효소를 포함하는 다양한 DNA 분해효소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 액체의 표면장력을 낮추는 작용제를 지칭한다.
용어 "치료제"는 질병 또는 질환을 예방 또는 치료하고자 투여될 수 있는 작용제를 지칭한다. 치료제는 핵산, 핵산 유사체, 소분자, 펩티도미메틱, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 당, 지질, 또는 계면활성제, 또는 이의 조합일 수 있다.
용어 "치료" 또는 질병, 장애 및/또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있으나, 아직 이에 걸렸다고 진단을 받지 않은 동물에서 질병, 장애 또는 병태가 발생하는 것의 예방은 질병, 장애 또는 병태의 억제, 예컨대, 그 진행의 지연, 및 질병, 장애 또는 병태의 완화, 예컨대, 질병, 장애 및/또는 병태의 퇴보 유발을 지칭한다. 질병 또는 병태의 치료는 특정 질병 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 개선시킴을 포함하며, 심지어 근본적인 병리생리학이 영향받지 않은 경우라도, 예컨대, 진통제 투여에 의해, 그러한 작용제가 통증의 원인을 치료하지 않는다 하더라도, 대상자의 통증을 치료하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "표적 모이어티"는 특정 장소로, 또는 특정 장소로부터 멀리 편재화하는 모이어티를 지칭한다. 이러한 모이어티는 예를 들어, 단백질, 핵산, 핵산 유사체, 탄수화물, 또는 소분자일 수 있다. 본체는 예를 들어, 소분자와 같은 치료적 화합물, 또는 검출 가능한 표지와 같은 진단적 본체일 수 있다. 장소는 조직, 특정한 세포 유형, 또는 세포 이하의 구획일 수 있다. 일 실시예에서, 표적 모이어티는 활성 본체의 편재화를 유도한다. 활성 본체는 소분자, 단백질, 고분자 또는 금속일 수 있다. 활성 본체는 치료적, 예방적 또는 진단적 목적에 유용할 수 있다.
용어 "치료적으로 유효한 양"은 본원에 기술된 입자 내 및/또는 입자 위로 도입될 때, 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 타당한 수익성 대 위험성 비율로 어떠한 원하는 효과를 산출하는 치료제의 양을 지칭한다. 유효량은 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 특정 표적 구성체, 대상자의 크기, 또는 질병 또는 병태의 중증도와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 과도한 실험을 필요로 하지 않고 특정 화합물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
용어 "도입된" 및 "캡슐화된"은 원하는 적용에서 활성제의 지연 방출과 같은 방출을 허용하는 조성물 내 및/또는 상으로, 그러한 활성제를 도입, 제형화, 또는 그렇지 않으면 포함시키는 것을 지칭한다. 이 용어는 치료제 또는 기타 물질이 고분자 매트릭스로 도입되는 임의의 방식을 고려하며, 예를 들어, 그러한 고분자의 단량체로의 (공유적, 이온성, 또는 기타 결합 상호 작용에 의한) 부착, 물리적 혼합, 고분자의 코팅층으로 작용제 봉합, 고분자성 매트릭스 전반에 걸친 분산, (공유적 또는 기타 결합 상호 작용에 의한) 고분자성 매트릭스 표면에 덧붙임, 고분자성 매트릭스 내부로의 캡슐화 등을 포함한다. 용어 "공동 도입" 또는 "공동 캡슐화"는 대상 조성물 내에 치료제 또는 기타 물질과 적어도 하나의 다른 치료제 또는 다른 물질을 도입하는 것을 지칭한다.
II . 점액 침투성 나노 입자( MPP )
A. 고분자 입자
1. 코어 고분자
임의의 수의 생체적합성 고분자가 나노 입자를 제조하는 데 이용될 수 있다. 일 실시예에서, 생체적합성 고분자(들)는 생분해성이다. 또 다른 실시예에서, 이러한 입자는 비 분해성이다. 다른 실시예에서, 입자는 분해성 및 비 분해성 입자의 혼합물이다.
예시적인 고분자로는 시클로덱스트린 함유 고분자, 특히 미국 특허번호 6,509,323호에 기술된 것들과 같은 양이온성 시클로덱스트린 함유 고분자,
폴리(카프로락톤)(PCL)과 같은 락톤으로부터 제조된 고분자,
폴리(락트산)(PLA), 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PGLA), 폴리(L-락트산-코-글리콜산)(PLLGA), 폴리(D,L-락티드)(PDLA), 폴리(D,L-락티드-코-카프로락톤), 폴리(D-락티드-코-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리(D,L-락티드-코-PEO-코-D,L-락티드), 폴리(D,L-락티드-코-PPO-코-D,L-락티드), 및 이의 혼합물과 같은 폴리하이드록시산 및 이의 공중합체,
폴리알킬 시아노아크랄레이트,
폴리에탄,
폴리-L-리신(PLL), 폴리(발레르산), 및 폴리-L-글루탐산과 같은 폴리아미노산,
하이드록시프로필 메타크릴레이트(HPMA),
폴리무수물,
폴리에스테르,
폴리오르토에스테르,
폴리(에스테르 아미드),
폴리아미드,
폴리(에스테르 에테르),
폴리카보네이트,
폴리에틸렌 및 폴리프로필렌과 같은 폴리알킬렌,
폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 산화물(PEO),
폴리옥시알킬렌 옥사이드("PLURONICS®")와 같은 블록 공중합체,
폴리(에틸렌 테레프탈레이트)와 같은 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 고분자(EVA),
폴리비닐 알코올(PVA),
폴리비닐 에테르,
폴리(비닐 아세테이트)와 같은 폴리비닐 에스테르,
폴리(비닐 염화물)(PVC)과 같은 폴리할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리실록산,
폴리스티렌(PS),
알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 에스테르, 니트로셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 유도체화 셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스,
폴리(메틸(메트)아크릴레이트)(PMMA), 폴리(에틸(메트)아크릴레이트), 폴리(부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(이소부틸(메트)아크릴레이트), 폴리(헥실 (메트)아크릴레이트), 폴리(이소데실(메트)아크릴레이트), 폴리(라우릴(메트)아크릴레이트), 폴리(페닐(메트)아크릴레이트), 폴리(메틸아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트, 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트)와 같은 아크릴산의 고분자(본원에서는 합하여 "폴리아크릴산"이라 함),
폴리디옥사논 및 이의 공중합체,
폴리하이드록시알카노에이트,
폴리프로필렌 푸마르산염,
폴리옥시메틸렌,
폴록사머,
폴리(부티르산),
탄산 트리메틸렌 및
폴리포스파진을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 그래프트 공중합체와 같이, 위의 공중합체 또는 위에 열거된 고분자의 혼합물도 이용될 수 있다.
고분자 성질을 변경하기 위하여 및/또는 기능기의 반응성을 수정(예컨대, 감소 또는 증가)하기 위하여 고분자 상의 기능기를 캡핑(capping)할 수 있다. 예를 들어, 락티드 함유 고분자 또는 글리콜라이드 함유 고분자와 같은 카르복시산 함유 고분자의 카르복실 말단은 선택적으로 예컨대, 에스테르화로 캡핑할 수 있고, 하이드록실 말단은 선택적으로 예컨대, 에테르화 또는 에스테르화로 캡핑할 수 있다.
PEG 또는 이의 유도체와 위에 기술된 임의의 고분자의 공중합체를 고분자 입자를 제조하는 데 이용할 수 있다. 특정 실시예에서, PEG 또는 유도체는 공중합체의 내부 위치에 위치시킬 수 있다. 대안적으로, PEG 또는 유도체는 공중합체의 말단 위치 근처 또는 말단 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 위의 하나 또는 하나 이상의 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 블록으로 끝낼 수 있다. 일부 실시예에서, 코어 고분자는 페길화 고분자와 비 페길화 고분자의 혼합물로, 이때, 기초 고분자는 동일하거나(예컨대, PLGA 및 PLGA-PEG) 다르다(예컨대, PLGA-PEG 및 PLA). 특정 실시예에서, 마이크로 입자 또는 나노 입자는 PEG의 영역들이 별도로 상분리되거나 그렇지 않으면 입자들의 표면으로 위치할 수 있도록 하는 조건 하에서 형성된다. 표면에 위치된 PEG 영역들은 단독으로 표면 개질제의 기능을 수행할 수 있거나, 표면 개질제를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 입자들은 표면 개질 물질로서 폴리에틸렌 글리콜의 블록들로 종결된 하나 또는 하나 이상의 고분자들로부터 제조된다.
종량 평균 분자량은 주어진 고분자에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로는 약 1000달톤 내지 1,000,000달톤, 1000달톤 내지 500,000달톤, 1000달톤 내지 250,000달톤, 1000달톤 내지 100,000달톤, 5,000달톤 내지 100,000달톤, 5,000달톤 내지 75,000달톤, 5,000달톤 내지 50,000달톤, 또는 5,000달톤 내지 25,000달톤이다.
바람직한 천연 고분자의 예로는 알부민, 콜라겐, 젤라틴과 같은 단백질, 및 프롤라민, 예를 들어, 제인, 및 알긴산염과 같은 다당류를 포함한다.
일부 실시예에서, 입자들은 나노 입자 유전자 전달체로서 이용될 수 있다. 이러한 실시예에서, 입자들은 음으로 하전된 하나 또는 하나 이상의 핵산과 복합체를 이루는 하나 또는 하나 이상의 다중 양이온성 고분자로 이루어질 수 있다.
양이온성 고분자는 생리적 조건(즉, 신체 내 또는 세포 내에서 접하는 pH 및 염 농도) 하에서 분자당 적어도 두 개의 양전하를 보유하고, 핵산과 결합하기에 충분한 전하 밀도와 분자 크기를 나타내는 임의의 합성 또는 천연 고분자일 수 있다. 특정 실시예에서, 양이온성 고분자는 하나 또는 하나 이상의 아민 잔기를 함유한다.
B. 코팅된 약물 입자
몇몇 실시예에서는, 치료, 진단, 예방, 및/또는 영양 보조제의 입자는, 점막 침투는, 코팅을 강화피복 되어 있다. 입자는, 마이크로 입자 또는 나노 입자일 수가 있다. 예시적인 치료, 진단, 예방, 및/또는 영양 보조제는, 이하에 의해 상세하게 기재되어 있다. 약물 입자는, 점막 침투는, 해당 기술 분야에서 공지의 기술을 이용해 코팅 재료를 높이는 것으로 피복 할 수가 있다. 코팅의 밀도 및 형태는, 아래와 같이 평가할 수 있다. 코팅성을 높이는 점막 침투는 공유결합 또는 비공유결합의 몇개 인가에 있어서, 에이전트와 관련있을 수 있다.
실시 형태에서는, 비공유결합이다. 다른 실시 형태에 있어서, 활성제는, 반응성 관능기를 함유 하거나 코팅을 강화 점막 침투가 공유결합 할 수가 있도록 통합된다.
C. 점액을 통한 확산을 촉진하는 물질
마이크로 및/또는 나노 입자는 바람직하게는 하나 또는 하나 이상의 표면 개질제 또는 표면 개질 물질로 코팅되거나 이를 함유한다. 본원에 사용된 "표면 개질제"는 표면에 대해 입자의 (예컨대, 입자를 다소 친수성이 되도록 하는) 친수성, (예컨대, 표면을 중성 또는 중성에 가깝게 또는 더욱 음성 또는 양성이 되게 하는) 표면 전하를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 성질을 개질하고/개질하거나, 체액 및/또는 조직에서의, 예를 들어, 점액에서의 수송, 또는 체액 및/또는 조직을 통한, 예를 들어, 점액을 통한 수송을 증진시키는 작용제 또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 표면 개질 물질은 염증 감소와 같은 직접적인 치료 효과를 제공한다.
표면 개질제의 예로는 음이온성 단백질(예컨대, 알부민)을 포함하는 단백질, 계면활성제, 당 또는 당 유도체(예컨대, 시클로덱스트린), 치료제 및 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 고분자로는 헤파린, 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 및 폴록사머(폴리에틸렌 산화물 블록 공중합체)를 포함한다. 가장 바람직한 물질은 PEG 또는 PLURONIC F127®, 즉 BASF에서 가용할 수 있는 폴리에틸렌 옥사이드 블록공중합체이다.
계면활성제의 예로는 L-α-포스파티딜콜린(PC), 1,2-디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 올레산, 소르비탄 트리올레산염, 소르비탄 모노올레산염, 소르비탄 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레산염, 천연 레시틴, 올레일 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르, 스테아릴 폴리옥시에틸렌 (2) 에테르, 라우릴 폴리옥시에틸렌 (4) 에테르, 옥시에틸렌과 옥시프로필렌의 블록 공중합체, 합성 레시틴, 디에틸렌 글리콜 디올레산염, 테트라하이드로퍼퓨릴 올레산염, 에틸 올레산염, 이소프로필 미리스트산염, 글리세릴 모노올레산염, 글리세릴 모노스테아르산염, 글리세릴 모노리시놀레산염, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 400, 세틸 피리디늄 염화물, 벤잘코늄 염화물, 올리브유, 글리세릴 모노라우린산염, 옥수수유, 면실유 및 해바라기씨유, 레시틴, 올레산, 및 소르비탄 트리올레산염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서, 입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 F127로 코팅되거나 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다. 대안적으로, PEG 또는 F127는 입자를 형성하는 데 이용되는 코어 고분자에 공유적으로 결합된(예컨대, 내부에 또는 하나의 말단 또는 양 말단에) 블록 형태일 수 있다. 특정 실시예에서, 입자는 PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성된다. 더욱 구체적인 실시예에서, 입자는 PEG를 함유하는 블록 공중합체로부터 형성되는데, 이때, PEG는 기초 고분자의 말단에 공유적으로 결합된다.
대표적인 PEG 분자량으로는 300Da, 600Da, 1kDa, 2kDa, 3kDa, 4kDa, 6kDa, 8kDa, 10kDa, 15kDa, 20kDa, 30kDa, 50kDa, 100kDa, 200kDa, 500kDa, 및 1MDa, 그리고 300달톤 내지 1MDa 범위 내의 모든 값을 포함한다. 바람직한 실시예에서, PEG는 약 5kD의 분자량을 나타낸다. 임의의 주어진 분자량의 PEG는 길이, 밀도 및 분지 등과 같은 다른 특징들이 다를 수 있다.
1. 표면 밀도 평가
마이크로 입자 또는 나노 입자 위의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 표면 밀도는 그것들의 성공적인 생체 내 적용을 결정하는 데 있어서 주요한 매개변수이다(여기서 사용되는 바와 같이, 입자 표면위에 PEG에 대한 일반적인 참조는 PLURONIC F127®에 대하여 추론할 수 있다. 점막 표면으로의 약물 제어 전달은 보호성의 점액층 존재 때문에 도전적인 일이며, 점액 침투성 입자는 점막 표면에서의 향상된 약물 분포, 보유 및 효능면에서 가능성을 보여준다. 생분해성 나노 입자 위의 PEG의 고밀도 코팅은 점액 성분과 나노 입자 사이의 크게 감소된 부착성 상호 작용 때문에 점액을 통한 빠른 침투를 허용할 수 있다.
바람직한 실시예에서는, 핵자기 공명(NMR)이 본원에 기술된 PEG를 함유하는 고분자성 나노 입자 상의 표면 PEG 밀도를 정성적으로 및 정량적으로 평가하는 데 이용할 수 있다(PEG 피크는 전형적으로 약 3.65ppm에서 관찰됨). 나노 입자가 NMR 용매 D20 내로 분산될 때, 코어 내에 내장된 PEG가 아니라 표면 PEG만을 NMR에 의해 직접적으로 검출할 수 있다. 따라서, NMR은 PEG의 표면 밀도를 직접적으로 측정하는 수단을 제공한다.
일부 실시예에서, 페길화 및 비 페길화 입자의 혼합물로부터 입자를 제조함으로써 PEG 표면 밀도를 조절할 수 있다. 예를 들어, PLGA 나노 입자 상의 PEG의 표면 밀도는 폴리(락틱-코-글리콜산) 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 혼합물(PLGA-PEG)로부터 입자를 제조함으로써 정확하게 조절할 수 있다. 나노 입자 위의 표면 PEG 밀도를 측정하는 데 정량적인 1H 핵 자기 공명(NMR)을 이용할 수 있다. 인간 점액에서 다중 입자 추적과 마우스 질에서의 뮤신 결합 및 조직 분포 연구 결과, PLGA-PEG 나노 입자가 점액을 침투하는 데 효과적인 PEG 밀도 역치가 존재하며, 이는 대략 10~16 PEG 사슬/100nm2이다. 이러한 밀도 역치는 입자 제조에 이용되는 코어 고분자, 입자 크기 및/또는 PEG의 분자량을 포함하는 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
코팅 밀도는 표면 개질 물질 및 입자의 조성을 포함한 다양한 인자들을 기초로 하여 달라질 수 있다. 일 실시예에서, 1H NMR에 의해 측정한, PEG와 같은, 표면 개질 물질의 밀도는 nm2당 적어도 0.1, 0.2, 0.5, 0.8, 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 60, 75, 80, 90, 또는 100개 사슬이다. 위의 범위는 nm2당 0.1 내지 100단위의 모든 값을 포함한다.
특정 실시예에서, PEG와 같은 표면 개질 물질의 밀도는 약 1 내지 약 25개 사슬/nm2, 약 1 내지 약 20개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 20개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 18개 사슬/nm2, 약 5 내지 약 15개 사슬/nm2, 또는 약 10 내지 약 15개 사슬/nm2이다. 다른 특정 실시예에서는 밀도는 0.05 내지 0.5 PEG 사슬/nm2이다.
예컨대 PEG와 같은 표면 개질 물질의 농도는 변화할 수 있다. 특정 실시예에서, 표면 개질 물질(예컨대, PEG)의 밀도는 표면 개질 물질(예컨대, PEG)이 확장된 브러시의 입체배치를 취했던 정도이다.
다른 실시예에서, 표면 개질 모이어티의 질량은 입자 질량의 적어도 1/10,000, 1/7500, 1/5000, 1/4000, 1/3400, 1/2500, 1/2000, 1/1500, 1/1000, 1/750, 1/500, 1/250, 1/200, 1/150, 1/100, 1/75, 1/50, 1/25, 1/20, 1/5, 1/2, 또는 9/10이다. 위의 범위를 1/10,000 내지 9/10의 모든 값을 포함한다.
D. 유화제
본원에 기술된 입자는 유화제, 특히 저분자량의 유화제를 함유한다. 이러한 유화제는 입자 형성 도중 입자 내로 도입되며, 따라서 완성된 입자의 구성성분이다. 유화제는 입자 내에 캡슐화될 수 있고, 고분자 매트릭스 내에 전체로서 또는 부분적으로 분산될 수 있고(예컨대, 유화제 일부가 고분자 매트릭스로부터 펼쳐지고/펼쳐지거나, 입자 표면과 (예컨대, 공유적으로 또는 비 공유적으로) 회합된다.
본원에 사용된 "저분자량"은 일반적으로 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 또는 300amu 미만의 분자량을 나타내는 유화제를 지칭한다. 일부 실시예에서, 분자량은 1300amu 미만이다. 일부 실시예에서, 분자량은 약 300amu 내지 약 1200amu이다.
유화제는 양으로 하전되거나, 음으로 하전되거나, 또는 중성일 수 있다. 음으로 하전된 유화제의 예로는 콜산 나트륨염(CHA, MW = 430) 및 디옥틸 설포석시네이트 나트륨(DSS, MW = 455)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 양으로 하전된 유화제의 예로는 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물(CTAB, MW = 364)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 중성 유화제의 예로는 비누(MW = 1191), 트윈 20(MW = 1,225), 트윈 80(MW = 1310), 및 당 에스테르 D1216(수크로오스 라우린산염, SE, MW = 524)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
저분자량을 나타내는 것 이외에도, 유화제는 입자 응집을 방지하기 위하여 입자 형성 중에 유화액적을 적절하게 안정시킬 수 있어야 한다.
응집체 형성을 방지하기 위하여 유화액적을 적절하게 안정화시키는 것 이외에도, 안정제는 중성 또는 중성에 가까운 표면 전하를 제공하는 표면 개질 물질 코로나(예컨대, PEG)에 의해 완전히 차폐되기에 충분히 작아야 한다. 하전된 입자의 수송은 생체 내에서 반대로 하전된 입자 종과 하전된 입자의 상호 작용 때문에 방해를 받을 수 있다. 예를 들어, 점액을 신속하게 침투하는 입자의 능력은 적어도 부분적으로는, 입자의 표면 전하에 의존적이다.
점액을 통해서 확산을 용이하게 하기 위해서, 본 명세서에 기재의 나노 입자는, 전형적으로는 거의 중성의 표면 전하를 가진다. 특정의 실시 형태 에 있어서, 나노 입자는, 바람직하게는 약 5 mV의 약간에서, 약 10 mV로 약-10 mV의 사이에서의ζ전위를 가져―5 mV의, 바람직하게는 약 3 mV의 약-3 mV의, 보다 바람직하게는 약 2 mV의 사이에 약-2 mV이다.
본 명세서에 기재된 입자는, 나노 입자 와 불려 따라서 전형적으로는 최대 1 런의 범위의 평균 직경을 가져, 가장 바람직하게는 약으로부터 약 1미크론까지, 바람직하게는 약 5 내지 약 500 NRA에 포함하지 않은 동안 약 100 nm까지 5 nm로. 일정에
실시 형태에서는, 입자의 평균 직경은 약 150nm? 약 100 nm에서의 형성이다. 그러나, 입자는, 미크론 범위에서 크기로 조제할 수가 있다. 입자를 조제하기 위해서 사용되는 조건 및/또는 재료는, 입자의 크기를 변화시키기 위해서 변화 될 수 있다.
특정의 실시 형태 에 있어서, 나노 입자는, 보다 바람직하게는 적어도 1개월간 분무 또는 저장, 적어도 2개월간, 4℃, 가장 바람직하게는 적어도 3개월 후, 그 입자 사이즈 및ζ - 전위를 가진다.
몇몇의 실시 형태에서는, 반송 능력에 대한 유화제의 효과는, 입자는, 점막에의 약물 전달을 위한 점액에 침투하기 위해서 투여된다. 기재된 입자는, 본 명세서에 점액을 다녀 수송을 향상시킬 수가 있는 표면을 변화시키는 물질을 포함한다. 예를 들면, PEG 함유 블록 공중합체는, 유화법에 의해 형성된 에마르션 액체방울의 표면에 치밀한, 점막 불활성 PEG 코팅을 형성하기 위해서 자체 조직화 할 수가 있다.
E. 치료제, 예방제, 기능성 식품 및/또는 진단제
1. 치료제
일부 실시예에서, 입자는 하나 또는 하나 이상의 치료제를 내부에 캡슐화하고, 분산시키고/분산시키거나 공유적으로 또는 비 공유적으로 하나 또는 하나 이상의 치료제의 표면과 회합시켰다. 치료제는 소분자, 단백질, 다당류 또는 당류, 핵산 분자 및/또는 지질일 수 있다.
i. 소분자 치료제
예시적인 부류의 소분자 치료제로는 진통제, 항염증제, 해열제, 항우울제, 항간질제, 항정신병제, 신경보호제, 항암제와 같은 항증식제, 항균제 및 항진균제와 같은 항감염제, 항히스타민제, 항편두통제, 항무스카린제, 불안완화제, 진정제, 수면제, 항정신병제, 기관지 확장제, 항천식 약물, 심장혈관 약물, 코르티코스테로이드, 도파민제, 전해질, 위장관 약물, 근육이완제, 영양제, 비타민, 부교감신경흥분제 모방약, 자극제, 식욕감퇴제 및 항수면발작제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 영향보급식품이 첨가될 수 있다. 이것들은, 식물추출물 또는 식물호르몬 등의 비타민, 칼슘 또는 비오틴 등의 보충제 또는 천연성분으로 할 수 있다.
ii. 핵산
일부 실시예에서, 이러한 작용제는 하나 또는 하나 이상의 핵산이다. 핵산은 내인성 핵산 서열을 변경, 교정 또는 교체할 수 있다. 핵산은 암 치료, 기타 폐 질병 및 폐 기능에 영향을 미치는 대사성 질병의 유전자와 유전자가 비강 전달을 통해 뇌에 도달하는 파킨슨병 및 ALS의 치료를 위한 유전자와 같은 유전자의 결함을 교정하는 데 이용된다.
유전자 치료법은 질병 발달의 원인이 되는 결함 있는 유전자를 교정하는 기법이다. 연구자는 결함이 있는 유전자를 교정하기 위한 여러 가지 접근법 중 하나를 이용할 수 있다:
- 비 기능적인 유전자를 교체하기 위하여 정상적인 유전자를 게놈 내의 비 특이적인 위치에 삽입할 수 있다.
- 상동 재조합을 통해 비정상적인 유전자를 정상적인 유전자로 바꿀 수 있다.
- 선택적인 역돌연변이를 통해 비정상적인 유전자를 수복시킬 수 있으며, 이는 비정상적인 유전자를 정상적인 기능으로 되돌린다.
- 특정 유전자의 조절(유전자를 발현시키거나 유전자 발현을 억제시키는 정도)은 변경될 수 있다.
핵산은 DNA, RNA, 화학적으로 개질된 핵산, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 핵산 반감기의 안정성 및 효소 절단에 대한 저항성을 증가시키는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 핵염기, 당에 대한 하나 또는 하나 이상의 수정 또는 치환, 또는 폴리뉴클레오티드의 연결을 포함할 수 있다. 핵산은 원하는 용도에 맞도록 만들어진 성질을 함유하기 위하여 주문 합성할 수 있다. 일반적인 수정은 잠금 핵산(LNA), 비 잠금 핵산(UNA), 모르폴리노, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 연결, 포스포노아세테이트 연결, 프로핀 유사체, 2'-0-메틸 RNA, 5-Me-dC, 2 -5' 연결 포스포디에스테르 일직선, 키메라 연결(혼합 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 연결 및 수정), 지질 및 펩티드의 콘쥬게이션, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 핵산은 아키랄 및 하전되지 않은 서브 단위간 연결을 보유하는 인산염 유사체(예컨대, Sterchak, E. P. et al., Organic Chem. , 52:4202, (1 87)), 또는 아키랄 서브 단위간 연결을 보유하는 하전되지 않은 모르폴리노 기반의 고분자(예컨대, 미국 특허번호 5,034,506호 참조)과 같은 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 뉴클레오티드간 연결 유사체로는 모폴리데이트, 아세탈 및 폴리아미드 연결 헤테로고리를 포함한다. 기타 백본 및 연결 수정으로는 포스포로티오에이트, 펩티드 핵산, 트리시클로-DNA, 유인 올리고뉴클레오티드, 리보자임, (L 핵산, 높은 결합 친화도를 나타내는 앱타머를 함유하는) 스피에겔머, 또는 CpG 올리고머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
포스포로티오에이트(또는 S-올리고)는 정상적인 DNA의 변이체로, 비 가교 산소 중 하나가 황으로 교체된 것이다. 뉴클레오티드간 결합의 황화는 5'에서 3'으로, 그리고 3'에서 5'으로의 DNA POL 1 핵산말단 가수분해효소, 핵산가수분해효소 SI 및 PI, RNA 분해효소, 혈청 핵산가수분해효소 및 뱀독 포스포디에스터라아제를 포함하는 핵산내부 가수분해효소 및 핵산말단 가수분해효소의 작용을 극적으로 감소시킨다. 또한, 지질 이중층을 가로지를 가능성은 증가한다. 이러한 중요한 개선점 덕분에, 포스포로티오에이트는 세포 조절에서의 적용 범위가 증가하는 것으로 나타났다. 포스포로티오에이트는 이황화탄소 내의 원소 황 용액의 하이드로겐 포스포네이트에서의 작용에 의해, 또는 테트라에틸티우람 이황화물(TETD) 또는 3H-1,2-벤소디티올-3-온 1, 1-디옥사이드(BDTD)로 포스파이트 트리에스테르를 황화시키는 더욱 최근의 방법에 의한, 두 가지 주요 경로로 제조된다. 후자의 방법은 대부분의 유기 용매에서의 원소 황의 불용성 문제와 이황화탄소의 독성을 방지한다. 또한, TETD 및 BDTD 방법은 더 높은 순도의 포스포로티오에이트를 산출한다.
펩티드 핵산(PNA)은 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 반복함으로써 올리고뉴클레오티드의 인산염 백본이 전체로서 교체되고, 포스포디에스테르 결합은 펩티드 결합으로 교체된 분자이다. 다양한 헤테로고리의 염기가 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 이러한 백본에 연결된다. PNA는 올리고뉴클레오티드와 비슷한 헤테로고리의 염기의 간격을 유지하지만, 아키랄이고 중성 전하의 분자이다. 펩티드 핵산은 전형적으로 펩티드 핵산 단량체로 구성된다. 헤테로고리의 염기는 임의의 표준 염기(우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 또는 아래에 기술된 임의의 개질된 헤테로고리의 염기일 수 있다. PNA는 또한 하나 또는 하나 이상의 펩티드 또는 아미노산 변경 및 수정을 보유할 수 있다. 따라서, PNA의 백본 구성요소는 펩티드 연결일 수 있거나, 대안적으로는, 비 펩티드 연결일 수 있다. 예로는 아세틸 캡, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산(본원에서는 O-링커라 함)과 같은 아미노 스페이서 등을 포함한다. PNA의 화학적 조립 방법은 잘 알려져 있다.
일부 실시예에서, 핵산은 이노신, S-(1-프로피닐) 우라실(pU), 5-(1-프로피닐) 시토신(pC), 5-메틸시토신, 8-옥소-아데닌, 슈도시토신(슈도시토신), 슈도이소시토신, 5 및 2-아미노-5-(2'-데옥시-p-D-리보퓨라노실)피리딘 (2-아미노피리딘), 및 다양한 피롤로- 및 피라졸로피리미딘 유도체, 4-아세틸시토신, 8-하이드록시-N-6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, l-메틸슈도우라실, 1 -메틸 구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸 구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3 -메틸시토신 , N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘우오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 2,6-디아미노퓨린, 그리고 O-메틸, 아미노-, 및 플루오로-개질 유사체와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 2'-개질 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 화학적으로 개질된 헤테로고리 염기를 포함한다. 2'-플루오로(2'-F) 피리미딘으로 개질된 억제성 RNA는 시험관 내에서 유리한 성질을 나타내는 것으로 보인다.
일부 실시예에서, 이러한 핵산은 2'-O-아미노에톡시, 2'-O-아미노에틸(2'-OAE), 2'-O-메톡시, 2'-O-메틸, 2'-구아니도에틸(2'-OGE), 2'-O,4'-C-메틸렌(LNA), 2'-0-(메톡시에틸)(2'-OME) 및 2'-0-(N-(메틸)아세트아미도)(2'-OMA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하나 또는 하나 이상의 당 모이어티 개질을 포함한다.
유전자 치료 방법은 전형적으로 세포의 유전자형을 변경시키는 핵산 분자의 세포 내로의 도입에 의존한다.
핵산 분자의 도입은 유전자 재조합을 통해 내인성 유전자를 교정, 교체, 또는 그렇지 않으면 변경시킬 수 있다. 방법들은 결합이 있는 유전자, 외래 유전자, 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 작은 핵산 분자의 전체 교체 카피의 도입을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 전형적으로 유전자 조작된 바이러스 벡터와 같은, 세포 내로 교체 유전자를 도입하기 위한 전달 체계를 필요로 한다.
유전자 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법들로는 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합을 포함한다.
발현 벡터는 일반적으로 삽입된 부호화 서열의 번역 및/또는 전사를 위해 필수적인 요소인 조절 서열을 함유한다. 예를 들어, 부호화 서열은 바람직하게는 원하는 유전자 산물의 발현 조절을 돕기 위하여 프로모터 및/또는 인핸서에 작동 가능하게 연결된다. 생명공학에 이용되는 프로모터는 의도하는 유전자 발현 조절의 유형에 따라 다른 유형이다. 그것들은 일반적으로 구성 프로모터, 조직 특이적인 또는 발달 단계 특이적인 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 나눌 수 있다.
바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 신경 트로픽 바이러스, 신드비스 및 기타 HIV 백본이 있는 이러한 바이러스를 포함하는 RNA 바이러스를 포함한다. 또한, 벡터로 이용하기에 적합하게 만드는 이러한 바이러스들의 속성을 공유하는 임의의 바이러스 패밀리도 유용하다. 전형적으로, 바이러스 벡터는 비구조적인 초기 유전자, 구조적인 후기 유전자, RNA 중합효소 III 전사체, 복제 및 캡시드화에 필수적인 역전된 말단 반복, 및 바이러스 게놈의 전사와 복제를 조절하는 프로모터를 함유한다. 벡터로서 유전자 조작될 때, 바이러스는 전형적으로 초기 유전자 중 하나 또는 하나 이상을 제거하고, 제거된 바이러스 DNA 대신에 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트를 바이러스 게놈 내로 삽입한다.
상동 재조합(HR)과 같은, 표적 재조합을 통한 유전자 표적화는 유전자 교정의 또 다른 전략이다. 표적 유전자좌에서의 유전자 교정은 표적 유전자에 상응하는 공여체 DNA 단편에 의해 매개될 수 있다(Hu, et al, Mol. Biotech., 29:197-210 (2005); Olsen, et al., J. Gene Med., 7:1534-1544 (2005)). 표적화 재조합의 한 방법은 서열 특이적인 방식으로 이중 DNA 내의 호모퓨린/호모피리미딘 자리에 대해 제3의 가닥으로서 결합하는 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)의 이용을 포함한다. 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산과 상호 작용할 수 있다. 삼중체 분자들이 표적 영역과 상호 작용할 때, 삼중체라는 구조가 형성되고, 이때, 왓슨-크릭 및 후그스틴형 염기쌍에 의존적인 복합체를 형성하는 세 가닥의 DNA가 존재한다. 삼중체 분자는 높은 친화도와 특이성으로 표적 영역에 결합할 수 있으므로 바람직하다. 삼중체 형성 분자들이 10-6, 10-8, 10-10, 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자와 결합하는 편이 바람직하다.
삼중체 형성 올리고뉴클레오티드(TFO) 및 펩티드 핵산(PNA)을 이용하는 표적화된 유전자 치료 방법은 미국 공개출원 번호 20070219122호에 기술되어 있고, HIV와 같은 감염성 질병을 치료하기 위한 이의 용도는 미국 공개출원 번호 2008050920호에 기술되어 있다. 또한, 삼중체 형성 분자는 미국 공개출원 번호 2011/0262406호에 기술된 것들과 같은 테일 클램프 펩티드 핵산(tcPNA)일 수 있다. 매우 안정적인 PNA:DNA:PNA 삼중체 구조는 이중 DNA와 두 개의 PNA 가닥의 가닥 침투로부터 형성될 수 있다. 이러한 복합체에서, PNA/DNA/PNA 삼중 나선 부분과 PNA/DNA 이중 부분은 모두 피리미딘이 풍부한 삼중 나선의 전치를 낳아, 뉴클레오티드 제거 수복 경로를 강하게 유발하고 공여체 올리고뉴클레오티드와의 재조합 부위를 활성화시키는 것으로 밝혀진 변경된 구조를 생성한다. 또한, 두 개의 PNA 가닥은 서로 연결되어 비스 PNA 분자를 형성할 수 있다. 삼중체 형성 분자는 교정된 서열을 제공하는 하나 또는 하나 이상의 공여체 올리고뉴클레오티드와 조합하여 이용될 때, 포유류 세포에서 부위 특이적인 상동 재조합을 유발하는 데 유용하다. 공여체 올리고뉴클레오티드는 삼중체 형성 분자에 묶을 수 있거나, 삼중체 형성 분자로부터 분리될 수 있다. 공여체 올리고뉴클레오티드는 표적 이중 DNA에 대해 적어도 하나의 뉴클레오티드 돌연변이, 삽입 또는 결실을 함유할 수 있다.
또한, 한 쌍의 유사 상보성(pseudocomplementary) 올리고뉴클레오티드와 같은, 이중의 이중체 형성 분자는 염색체 부위에서 공여체 올리고뉴클레오티드와의 재조합을 유도할 수 있다. 표적 유전자 치료에서 유사 상보성 올리고뉴클레오티드 사용은 미국 공개출원번호 2011/0262406호에 기술되어 있다.
2. 진단제
예시적인 진단 물질로는 상자성 분자, 형광 화합물, 자성 분자 및 방사성 핵종을 포함한다. 적합한 진단제로는 x선 영상화 작용제 및 조영제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 방사성 핵종은 영상화 작용제로서 이용될 수 있다.
다른 적합한 조영제의 예로는 방사성 비투과성인 기체 또는 기체 방출 화합물을 포함한다. 나노 입자는 투여된 입자의 위치를 결정하는 데 유용한 작용제를 더 포함할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 작용제로는 형광 태그, 방사성 핵종 및 조영제를 포함한다.
III . 약학 조성물
하나 또는 하나 이상의 치료제, 예방제 및/또는 진단제가 고분자성 나노 입자 내에 캡슐화되고/캡슐화되거나 나노 입자의 표면과 회합되는 실시예의 경우, 약물 부하 퍼센트는 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 50%, 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 40%, 더욱 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 20%, 가장 바람직하게는 중량 기준 약 1% 내지 약 10%이다. 위의 범위는 1% 내지 80%의 모든 값을 포함한다. 작용제가 입자의 표면과 회합되는 실시예Dml 경우, 부하 퍼센트는 더 높을 수 있는데, 약물의 양이 캡슐화 방법에 의해 제한되지 않기 때문이다. 일부 실시예에서, 전달되는 작용제는 나노 입자 내에 캡슐화되고, 입자 표면과 회합될 수 있다.
본원에 기술된 제형은 점막 표면으로 투여하기에 적당한 약학적 담체 내에 유효량의 나노 입자("MPPs")를 함유한다.
여기서, 상기 약학 캐리어는 저장성으로 조절될 수 있다. 치료 대상의 조직이 기에서 설명된 바람직한 장성의 범위에 기초하여 특정되기만 하면, 이 기술분야의 통상의 기술자라면, 약학 캐리어의 장성을 조절할 수 있다. 장도는, 「효과적인 중량 오스몰 농도」이며, 막을 횡단해 침투력을 발휘하는 능력을 가지는 용질의 농도의 합계와 동일하다. 많은 다른 재료들이, 장도를 조정하기 위해서 사용할 수가 있다. 예를들면, USP 29-NF 24는, 5종류의 부형제, 즉, 덱스트로제, 글리세린, 포타시움 클로라이드, 만니톨, 및 염화나트륨과 같은 저장성제로 분류되는 5종류의 부형제를 열거하고 있다. 예를 들면, United States Pharmacopeial Convention, Inc. United States Pharmacopeia 29-NationaI Formulary 24. Rockville MD: U.S. Pharmacopeial Convention, Inc.; 2005: 3261; Day, A. Dextrose. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Exciptents. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 231-233; Price JC. Glycerin. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association 2005: 301-303; Price JC. Glycerin. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 301-303; Armstrong NA. Mannitol. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 449-453; Owen SC. Sodium Chloride. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 671-674.
만니톨은, 유럽에서 식품첨가물로서 사용이 인정되고 GRAS에 기재된 성분의 예이지만, FDA는 비액티브 원재료 데이타베이스(IP, IM, IV 및 SC주사에 함;링겔;구강내, 경구 및 설하 자물쇠, 분말 및 캅셀;점안약;국소 솔루션)에 포함되고 비경구약으로 영국에서 인가되어 캐나다의 자연 건강 제품 성분 데이타베이스에 포함되어 있다. 5.07퍼센트 w / v의 수용액은, 혈청등 침투압이다.
바람직하게는 20-220오스몰/ kg의 범위에서 최저한의 저장인 제재는, 표피 독성의 리스크가 최소한으로, 전체에 질의 표면에 MPP의 신속하고 균일한 전달을 제공한다. 혈장의 그 이상의 중량 오스몰 가지는 수송체는(일반적으로는 300 오스몰/ kg로 등장으로 생각된다), 결장으로 저장수송체 와의 개선된 구두점의 배포를 위한 범위는 20 오스몰/ KG-450 오스몰/제재중의 용질의 대부분을 Na로 구성되어 있는 경우는 킬로의 +이온이 이것들을 적극적으로 받아들여질 일로부터, (흡수된) 표피에 의해, 이와 같이, 혈액에 관해서 제재가 효과적으로 저장으로 된다.
A. 폐 제형
약학적 제형 및 환자에 활성제를 폐 투여하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
호흡기관은 대기와 혈류 사이의 기체 교환과 관련된 구조이다. 호흡기관은 입인두와 후두를 포함하는 상기도, 뒤이어 기관지와 세기관지로의 분기로 이어지는 기관을 포함하는 하기도를 아우른다. 상기도와 하기도는 전도성 기도라 한다. 말단 세기관은 호흡세기관지로 나뉘며, 이는 궁극적인 호흡 영역인 폐포 또는 깊은 폐로 이어지고, 여기서 기체 교환이 일어난다.
제형은 건조 분말 제형과 액체 제형으로 나눌 수 있다. 건조 분말 및 액체 제형 모두 에어로졸 제형을 형성하는 데 이용할 수 있다. 본원에 이용된 용어 에어로졸은 입자의 미세한 미스트로 이루어지는 임의의 제제를 지칭하며, 추진체를 이용하여 생산되든 그렇지 않든 용액 또는 현탁액 내에 있을 수 있다.
1. 건조 분말 제형
건조 분말 제형은 나노 입자 담체를 함유하는 미세하게 분할된 고체 제형으로 폐 투여에 적합하다. 건조 분말 제형은 최소한으로, 폐 투여에 적합한 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 포함한다. 그러한 건조 분말 제형은 공기 또는 적절한 추진체 이외의, 임의의 담체의 혜택 없이, 폐 흡입을 통해 환자에 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 건조 분말 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 유전자 전달체를 함유한다. 이들 실시예에서, 나노 입자 유전자 전달체와 약학적 담체는 폐로 전달하기 위한 나노 또는 마이크로 입자로 형성될 수 있다.
약학적 담체는 증량제 또는 지질 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC)과 같은 천연 계면활성제가 가장 바람직하다. 합성 및 동물 유래의 폐 계면활성제로는 다음을 포함한다:
엑소서프 - 헥사데카놀 및 확산제로서 첨가된 티록사폴과 DPPC의 혼합물
퓨맥턴트(인공 폐 확장 화합물 또는 ALEC) - DPPC와 PG의 혼합물
KL-4 - DPPC, 팔미토일-올레일 포스파티딜글리세롤 및 팔미트산으로 구성됨. SP-B의 구조적 특징을 모방하는 21개의 아미노산 합성 펩티드와 결합됨.
큐로서프 - 분쇄된 돼지 폐로부터 유래한 물질로부터 추출됨.
인파서프 - 송아지 폐 세척액으로부터 추출됨.
서반타 - 추가적인 DPPC, 팔미트산 및 트리팔미틴과 함께, 분쇄된 소 폐로부터 추출됨.
엑소서프, 큐로서프, 인파서프 및 서반타는 현재 미국에서 사용이 FDA 승인된 계면활성제이다.
또한, 약학적 담체는 하나 또는 하나 이상의 안정화제 또는 분산제를 포함할 수 있다. 또한, 약학적 담체는 하나 또는 하나 이상의 pH 조절제 또는 완충액을 포함할 수 있다. 적절한 완충액은 시트르산 나트륨염 또는 아스코르브산 나트륨염과 같은, 유기산과 염기로부터 제조된 유기 염을 포함한다. 또한, 약학적 담체는 염화나트륨 또는 염화칼륨과 같은, 하나 또는 하나 이상의 염을 포함할 수 있다.
건조 분말 제형은 전형적으로 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 제조된다. 선택적으로, 추가적인 활성제가 아래에 논의된 바와 같이 혼합물에 혼입될 수 있다. 그런 다음, 혼합물은 동결 건조, 분무 건조, 응집, 분무 코팅, 코아세르베이션, 저온 주조, 밀링(예컨대, 공기 마찰 밀링(제트 밀링), 볼 밀링), 고압 균질화, 및/또는 초임계 유체 결정화와 같은, 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 폐 투여에 적합한 입자로 형성된다.
입자 형성의 적절한 방법은 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포, 및 제형에 바람직한 입자 형태학을 기초로 하여 선택할 수 있다. 일부 사례에서, 입자 형성 방법은 폐 투여를 위한 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포를 나타내는 입자 집단을 생성하도록 선택된다. 대안적으로, 입자 형성 방법은 폐 투여를 위한 원하는 입자 크기, 입자 크기 분포를 나타내는 입자 집단으로부터 예를 들어, 사별법에 의해 분리되는 입자 집단을 생성할 수 있다.
입자 형태학이 입자가 폐로 침투하는 깊이에 영향을 미친다는 점은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 건조 분말 제형은 적당한 중량 정중 공기역학 직경(MMAD), 탭 밀도, 및 하나 또는 하나 이상의 활성제를 폐의 원하는 영역(들)로 전달할 수 있는 표면 거칠기를 나타내는 입자로 가공된다. 예를 들어, 폐 깊숙이 전달하기에 바람직한 입자 형태학은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, Vanbever 등의 미국 특허번호 7,052,678호에 기술되어 있다.
약 5미크론을 초과하는 중량 중위 공기역학 직경(MMAD)의 입자는 일반적으로 폐에 도달하지 못한다. 대신에, 그것들은 목 뒤쪽에 충돌하는 경향이 있어 삼켜진다. 약 3 내지 약 5미크론의 직경을 나타내는 입자는 상부 내지 중간 폐 영역(전도성 기도)에 이르기에 충분할 정도로 작지만, 폐포에 도달하기에는 너무 클 수 있다. 더 작은 입자(즉, 약 0.5 내지 약 3미크론)가 폐포 영역에 충분히 도달할 수 있다. 약 0.5미크론보다 작은 직경의 입자 또한 침강에 의해 폐포 영역에 침적될 수 있다.
폐포 영역으로 전달하기에 효과적인 정확한 입자 크기 범위는 전달되는 입자의 탭 밀도를 포함하는 몇 가지 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 탭 밀도가 감소합에 따라, 폐의 폐포 영역에 효율적으로 도달할 수 있는 입자의 MMAD는 증가한다. 따라서, 낮은 탭 밀도를 나타내는 입자의 경우, 약 3 내지 약 5미크론, 약 5 내지 약 7미크론, 또는 약 7 내지 약 9.5미크론의 직경을 나타내는 입자는 효율적으로 폐에 전달될 수 있다. 폐 내에 최대한 침적되기에 바람직한 공기역학 직경은 계산할 수 있다. 예를 들어, Vanbever 등의 미국 특허번호 7,052,678호 참조.
마이크로 입자는 그것들의 표면이 점액 저항성이라 하더라도 점액을 통과하여 확산될 수 없다. 그러나, 점액 침투성 입자는 마이크로 입자 내에 캡슐화될 수 있어 상부 폐에 충돌하여 이후에 나노 입자를 방출한다.
일부 사례에서, 입자는 구형 또는 난형의 형상이다. 입자는 부드럽거나 거친 표면 질감을 나타낼 수 있다. 또한, 입자는 고분자 또는 폐에서 하나 또는 하나 이상의 활성제의 방출을 조절하기 위한 기타 적절한 물질로 코팅될 수 있다.
건조 분말 제형은 당해 기술 분야에 공지된 적절한 방법을 이용하여 건조 분말로 투여될 수 있다. 대안적으로, 건조 분말 제형은 아래 기술된 액체 제형 내에 현탁될 수 있으며, 액체 제형의 전달을 위해 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 폐로 투여된다.
2. 액체 제형
액체 제형은 액체 약학적 담체 내에 현탁시킨 하나 또는 하나 이상의 나노 입자 담체를 함유한다.
적합한 액체 담체로는 식염수, 및 또는 기타 염을 함유하는 생리학적으로 허용 가능한 수성 용액 및/또는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 완충액, 링거액, 및 등장성 염화나트륨, 또는 동물 또는 인간에 투여하기에 허용 가능한 임의의 기타 수성 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 액체 제형은 생리학적 유체에 대해 등장성이며, 약 pH 4.0 내지 약 pH 7.4, 더욱 바람직하게는 약 pH 6.0 내지 pH 7.0의 범위의, 대략 동일한 pH를 나타낸다. 액체 약학적 담체는 인산염 완충액과 같은, 하나 또는 하나 이상의 생리학적으로 양립 가능한 완충액을 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 폐 투여를 위한 수성 용액에 대해 적합한 식염수 함량 및 pH를 용이하게 결정할 수 있다.
액체 제형은 셀룰로오스 유도체, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검, 또는 레시틴과 같은 하나 또는 하나 이상의 현탁제를 포함할 수 있다. 또한, 액체 제형은 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조산과 같은 하나 또는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다.
일부 사례에서, 액체 제형은 에탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로퓨란, 에틸 에테르 및 프로판올과 같은 저독성 유기(즉, 비 수성) 분류 3 잔류 용매인 하나 또는 하나 이상의 용매를 함유할 수 있다. 이러한 용매들은 제형을 용이하게 에어로졸화하는 능력을 기초로 하여 선택할 수 있다. 액체 제형 내에 포함된 임의의 그러한 용매는 액체 제형 내에 존재하는 하나 또는 하나 이상의 활성제와 불리하게 반응하지 않아야 한다. 용매는 용액 또는 현탁액의 에어로졸의 형성을 가능하게 할 정도로 충분히 휘발성이 있어야 한다. 또한, 프레온, 알코올, 글리콜, 폴리글리콜, 또는 지방산과 같은 추가적인 용매 또는 에어로졸화제는 용액 또는 현탁액의 휘발성을 증가시키기 위하여 및/또는 에어로졸화 거동을 변경하기 위하여 원하는 대로 액체 제형 내에 포함시킬 수 있다.
또한, 액체 제형은 소량의 고분자, 계면활성제, 또는 기타 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 부형제를 함유할 수 있다. 이러한 맥락에서, "소량"은 폐에서 하나 또는 하나 이상의 활성제의 흡수에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 어떠한 부형제도 존재하지 않음을 의미한다.
3. 에어로졸 제형
위에 기술된 건조 분말 및 액체 제형을 폐 투여를 위한 에어로졸 제형을 형성하는 데 이용할 수 있다. 호흡기관으로 치료제를 전달하기 위한 에어로졸은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 본원에 이용된 용어 에어로졸은 기체 내에 현탁시킨 고체 또는 액체 입자의 미세한 미스트로 이루어진 임의의 제제를 지칭한다. 일부 사례에서, 기체는 추진체일 수 있다. 그러나, 이것이 요구되지는 않는다. 에어로졸은 초음파 또는 고압 처리를 포함하는 여러 가지 표준 기법을 이용하여 생산할 수 있다.
일부 사례에서, 폐에 제형을 투여하기 위하여 장치가 이용된다. 적절한 장치로는 건조 분말 흡입기, 가압 정량 흡입기, 분무기 및 전기수력학적 에어로졸 장치를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비경구 제형은 당해 기술 분야에 공지된 기법을 이용하여 수성 조성물로서 제조될 수 있다. 전형적으로, 그러한 조성물은 주사 가능한 제형, 예를 들어, 용액 또는 현탁액; 주사 전에 재구성 매체를 첨가할 때, 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 이용하기에 적합한 고체 형태; 유중수적(w/o) 유화액, 수중유적(o/w) 유화액과 같은 유화액, 및 이의 마이크로유화액, 리포좀, 또는 에멀좀으로 제조될 수 있다.
담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 하나 또는 하나 이상의 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 예컨대, 식물성 오일(예컨대, 땅콩유, 옥수수유, 참기름 등), 및 이의 조합을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하여, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및/또는 계면활성제 이용에 의해 유지할 수 있다. 여러 사례에서, 등장성 작용제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
유리 산 또는 염기 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염으로서 활성 화합물의 용액 및 분산액은 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 조절제 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 적절히 혼합된, 물 또는 다른 용매 또는 분산매에 제조될 수 있다.
적절한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비 이온성 표면 활성제일 수 있다. 적절한 음이온성 계면활성제로는 카르복시산염, 설폰산염 및 황산염 이온을 함유하는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 음이온성 계면활성제의 예로는 도데실벤젠 설폰산염 나트륨과 같은, 긴 사슬 알킬 설폰산 및 알킬 아릴 설폰산의 나트륨, 칼륨, 암모늄염; 도데실벤젠 설폰산염 나트륨과 같은, 디알킬 나트륨 설포석신산염; 나트륨 비스-(2-에틸티옥실)-설포석신산염과 같은 디알킬 나트륨 설포석신산염; 및 라우릴 황산 나트륨염과 같은 알킬 황산염을 포함한다. 양이온성 계면활성제로는 염화 벤잘코늄, 염화 벤제토늄, 브롬화 세트리모늄, 스테아릴 디메틸벤질 암모늄 염화물, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민과 같은 4차 암모늄 화합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비 이온성 계면활성제의 예로는 에틸렌 글리콜 모노스테아르산염, 프로필렌 글리콜 미리스트산염, 글리세릴 모노스테아르산염, 글리세릴 스테아르산염, 폴리글리세릴-4-올레산염, 소르비탄 아크릴산염, 수크로오스 아실레이트, PEG-150 라우린산염, PEG-400 모노라우린산염, 폴리옥시에틸렌 모노라우린산염, 폴리소르브산, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트리데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 폴록사머(Poloxamer®) 401, 스테아로일 모노이소프로파놀아미드 및 폴리옥시에틸렌 수소화 수지 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예로는 나트륨 N-도데실-D-알라닌, 나트륨 N-라우릴-D-이미노디프로피온산염, 미리스토암포아세트산염, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
이러한 제형은 보존제를 함유하여 미생물의 성장을 방지할 수 있다. 적절한 보존제로는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 및 티메로살을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이러한 제형은 활성제(들)의 분해를 방지하기 위하여 항산화제를 함유할 수 있다.
이러한 제형은 전형적으로 재구성 시 비경구 투여를 위해 pH 3~8로 완충된다. 적절한 완충액으로는 인산염 완충액, 아세트산염 완충액 및 시트르산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
수용성 고분자는 종종 비경구 투여를 위한 제형에 이용된다. 적절한 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
멸균 주사 가능한 용액은 위에 열거된 하나 또는 하나 이상의 부형제와 함께 적당한 용매 또는 분산매에 필요한 양으로 활성 화합물을 도입함으로써 제조되며, 필요에 따라, 여과 살균이 이어진다. 일반적으로, 염기성 분산매와 위에 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 용제 내에 다양한 멸균 활성 성분들을 혼입함으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사 가능한 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에는, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 더하기 이전에 살균 여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다. 분말은 입자들이 자연계에서 다공성인 방식으로 제조될 수 있으며, 이는 입자의 용해를 증가시킬 수 있다. 다공성 입자의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
안구 투여를 위한 약학적 제형은 바람직하게는 하나 또는 하나 이상의 고분자-약물 콘쥬게이트로부터 형성된 입자의 멸균 수성 용액 또는 현탁액의 형태이다. 허용 가능한 용매로는 예를 들어, 물, 링거 용액, 인산염 완충 식염수(PBS) 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 또한, 이러한 제형은 1,3-부탄디올과 같은, 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매 내의 멸균 용액, 현탁액 또는 유화액일 수 있다.
일부의 경우에는, 이러한 제형은 액체 형태로 배포되거나 포장된다. 대안적으로, 안구 투여를 위한 제형은 예를 들어, 적합한 액체 제형의 동결 건조에 의해 얻어진 고체로서 포장될 수 있다. 이러한 고체는 투여 전에 적당한 담체 또는 희석제로 재구성될 수 있다.
안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 안구 투여에 적합한 pH를 유지하는 데 필요한 유효량의 완충액으로 완충될 수 있다. 적절한 완충액은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, 유용한 완충액의 일부 예는 아세트산염, 붕산염, 탄산염, 시트르산염 및 인산염 완충액이다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 제형의 등장성 범위를 조정하기 위하여 하나 또는 하나 이상의 긴장성 작용제를 함유할 수 있다. 적절한 긴장성 작용제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 일부 예로는 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 및 기타 전해질을 포함한다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 안과용 제제의 박테리아 오염을 방지하기 위하여 하나 또는 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 폴리헥사메틸렌비구아니딘(PHMB), 염화 벤잘코늄(BAK), 멸균 옥시클로로 복합체(달리 퓨라이트(Purite®)로 알려져 있음), 페닐머큐릭 아세트산염, 클로로부탄올, 소르브산, 클로로헥시딘, 벤질 알코올, 파라벤, 티메로살 및 이의 혼합물을 포함한다.
또한, 안구 투여를 위한 용액, 현탁액, 또는 유화액은 분산제, 습윤제 및 현탁제와 같은 당해 기술 분야에 공지된 하나 또는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노 입자는 점막에 대한 국소 투여를 위해 제형화된다. 국소 투여를 위한 적절한 투여 형태로는 크림, 연고(ointment, salve), 스프레이, 겔, 로션, 유화액을 포함한다. 이러한 조성물은 하나 또는 하나 이상의 화학적인 침투 증진제, 막 투과성 작용제, 막 수송제, 연화제, 계면활성제, 안정제, 및 이의 조합을 함유한다.
일부 실시예에서, 나노 입자는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형, 로션 또는 연고와 같은 반고체 제형, 또는 고체 제형으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 나노 입자는 안약과 같은 용액 또는 현탁액을 포함하는 액체로, 또는 눈과 같은 점막에 또는 질 내 또는 직장 내와 같은, 국소 적용을 위한 연고 또는 로션과 같은 반고체 제형으로 제형화된다.
이러한 제형은 연화제, 계면활성제, 유화제,와 같은 하나 또는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. "연화제"는 피부를 부드럽게 하거나 진정시키는 외부적으로 적용되는 작용제로, 일반적으로 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th　Ed., Pharmaceutical Press, 2003과 같은 개요서에 열거되어 있다. 이들은 제한 없이 아몬드유, 피마자유, 세라토니아 추출물, 세토스테아로일 알코올, 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 콜레스테롤, 면실유, 시클로메티콘, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아르산염, 글리세린, 글리세린 모노스테아르산염, 글리세릴 모노올레산염, 이소프로필 미리스트산염, 이소프로필 팔미트산염, 라놀린, 레시틴, 경광유, 중간 사슬 트리글리세라이드, 광유 및 라놀린 알코올, 바셀린, 바셀린 및 라놀린 알코올, 대두유, 전분, 스테아릴 알코올, 해바라기유, 자일리톨 및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 연화제는 에틸헥실스테아르산염 및 에틸헥실 팔미트산염이다.
"계면활성제"는 계면 긴장을 낮추어 생성물의 유화성, 발포성, 분산성, 확산성 및 습윤성을 증가시키는 표면 활성 작용제이다. 적절한 비 이온성 계면활성제로는 유화 왁스, 글리세릴 모노올레산염, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리소르브산염, 소르비탄 에스테르, 벤질 알코올, 벤질 ㅂ베벤조산염, 시클로덱스트린, 글리세린 모노스테아르산염, 폴록사머, 포비돈 및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 비 이온성 계면활성제는 스테아릴 알코올이다.
"유화제"는 다른 액체 내에서 하나의 액체의 현탁을 촉진시키고, 오일 및 물의 안정적인 혼합물, 또는 유화액의 형성을 촉진하는 표면 활성 물질이다. 일반적인 유화제는 금속 비누, 특정 동물성 및 식물성 기름, 및 다양한 극성 화합물이다. 적절한 유화제로는 아카시아, 음이온성 유화 왁스, 칼슘 스테아르산염, 카보머, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아르산염, 글리세린 모노스테아르산염, 글리세릴 모노올레산염, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이프로멜로스, 라놀린, 함수의 라놀린 알코올, 레시틴, 중간 사슬의 트리글리세라이드, 메틸셀룰로오스, 광유 및 라놀린 알코올, 인산이수소나트륨, 모노에탄올아민, 비 이온성 유화 왁스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아르산염, 프로필렌 글리콜 알긴산염, 자기 유화 글리세릴 모노스테아르산염, 건조 시트르산 나트륨염, 라우릴 황산염 나트륨, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기유, 트라가칸트, 트리에탄올아민, 잔탄검및 이의 조합을 포함한다. 일 실시예에서, 유화제는 글리세롤 스테아르산염이다.
적합한 부류의 침투 증진제는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 지방 알코올, 지방산 에스테르, 지방산, 지방 알코올 에테르, 아미노산, 인지질, 레시틴, 콜산염, 효소, 아민 및 아미드, 착화제(리포좀, 시클로덱스트린, 변성 셀룰로오스 및 디이미드), 거대 고리, 예컨대, 거대 고리 락톤, 케톤, 및 무수물 및 고리형 우레아, 계면활성제, N-메틸 피롤리돈 및 이의 유도체, DMSO 및 관련된 화합물, 이온성 화합물, 아존 및 관련된 화합물, 및 용매, 예컨대, 알코올, 케톤, 아미드, 폴리올(예컨대, 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 부류의 예는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
"오일"은 친유성 물질의 적어도 95% wt을 함유하는 조성물이다. 친유성 물질의 예로는 자연 발생적인 오일 및 합성 오일, 지방, 지방산, 레시틴, 트리글리세라이드 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"연속상"은 고체가 현탁되거나 따른 액체의 액적이 분산된 액체를 지칭하며, 가끔 외상이라고도 한다. 이것은 또한 고체 또는 유체 입자가 분산된 콜로이드의 유체상을 지칭한다. 연속상이 물 (또는 친수성 용매)인 경우, 수용성 또는 친수성 약물은 (분산되는 것과는 반대로) 연속상에 용해될 것이다. 다상 제형(예컨대, 유화액)에서, 이산상은 연속상에 현탁되거나 분산된다.
"유화액"은 함께 균일하게 섞인 비 혼화성 성분의 혼합물을 함유하는 조성물이다. 특정 실시예에서, 비 혼화성 성분들은 친유성 성분과 수성 성분을 포함한다. 유화액은 제2의 액체라는 본체 전체에 걸쳐 소구체에 분포된 하나의 액체 제제이다. 분산된 액체는 불연속상이고, 분산매는 연속상이다. 오일이 분산된 액체이고 수성 용액이 연속상일 때 수중유적 유화액으로 알려져 있고, 물 또는 수성 용액이 분산상이고, 오일 또는 유성 물질이 연속상일 때 유중수적 유화액으로 알려져 있다. 오일상과 수상 중 어느 하나 또는 양자는 하나 또는 하나 이상의 계면활성제, 유화제, 유화액 안정제, 완충액, 및 기타 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 부형제로는 계면활성제, 특히 비온성 계면활성제; 유화제, 특히 유화 왁스; 및 액체 비 휘발성 비 수성 물질, 특히 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜을 포함한다. 유상은 다른 오일성의 약학적으로 승인된 부형제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실화 피마자유 또는 참기름과 같은 물질은 계면활성제 또는 유화제로서 오일상에 이용될 수 있다.
유화액은 제2의 액체라는 본체 전체에 걸쳐 소구체에 분포된 하나의 액체 제제이다. 분산된 액체는 불연속상이고, 분산매는 연속상이다. 오일이 분산된 액체이고 수성 용액이 연속상일 때 수중유적 유화액으로 알려져 있고, 물 또는 수성 용액이 분산상이고, 오일 또는 유성 물질이 연속상일 때 유중수적 유화액으로 알려져 있다. 오일상은 적어도 부분적으로는 HFA 추진체와 같은 추진체로 이루어질 수 있다. 오일상과 수상 중 어느 하나 또는 양자는 하나 또는 하나 이상의 계면활성제, 유화제, 유화액 안정제, 완충액, 및 기타 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 부형제로는 계면활성제, 특히 비온성 계면활성제; 유화제, 특히 유화 왁스; 및 액체 비 휘발성 비 수성 물질, 특히 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜을 포함한다. 유상은 다른 오일성의 약학적으로 승인된 부형제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 하이드록실화 피마자유 또는 참기름과 같은 물질은 계면활성제 또는 유화제로서 오일상에 이용될 수 있다.
유화액의 부분 집합은 자기 유화 시스템이다. 이러한 약물 전달 체계는 전형적으로, 오일 또는 다른 수 혼화성 액체와 같은 친유성 액체와 계면활성제(들)의 혼합물에 분산되거나 용해된 약물로 이루어진 캡슐제(경질 쉐 또는 연질 쉘)이다. 이러한 캡슐제가 수성 환경에 노출되고, 외부 젤라틴 쉘이 용해될 때, 수성 매질과 캡슐 내용물의 접촉은 즉각적으로 매우 작은 유화액적을 생성한다. 이들은 전형적으로 미셀 또는 나노 입자의 크기 범위이다. 전형적으로 유화액 제형 공정에서 그렇듯이, 유화액을 생성하는 데 어떠한 혼합하는 힘도 필요하지 않다.
"로션"은 낮은 점도 내지 중간 점도의 액체 제형이다. 로션은 현탁제 및 분산제를 이용하여 분산매에 불용성인 미세하게 분말화된 물질을 함유할 수 있다. 대안적으로, 로션은 분산상으로 용제와 혼화될 수 없으며 보통 유화제 또는 다른 적합한 안정제에 의해 분산되는 액체 물질을 보유할 수 있다. 일 실시예에서, 로션은 100 내지 1000센티스토크 사이의 점도를 나타내는 유화액 형태이다. 로션의 유동성은 넓은 표면적 위로 빠르고 균일하게 도포할 수 있게 한다. 로션은 전형적으로 피부 위에서 건조되어 피부 표면 위에 의학적 성분으로 된 얇은 막을 남기기 위한 것이다.
"크림"은 점성 있는 액체 또는 "수중유적" 또는 "유중수적 유형"의 반고체 유화액이다. 크림은 유호제 및/또는 기타 안정제를 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 제형은 1000센티스토크를 초과하는, 전형적으로는 20,000~50,000센티스토크 범위의 점도를 나타내는 크림의 형태이다. 크림은 일반적으로 펴기가 더 용이하고 제거하기가 더 용이하므로 종종 연고보다 선호된다.
크림과 로션의 차이는 점도로서, 이것은 다양한 오일의 양/이용 및 제형을 제조하는 데 이용된 물의 퍼센트에 달려 있다. 크림은 전형적으로 로션보다 걸쭉하고, 다양한 용도를 나타낼 수 있으며, 종종 피부에 원하는 효과에 따라, 더 다양한 오일/버터를 이용한다. 크림 제형에서, 물 베이스 퍼센트는 전체의 약 60~75%이고, 오일 베이스는 약 20~30%이며, 전체 100%에 대해 나머지 퍼센트는 유화제, 보존제 및 첨가제이다.
"연고"는 연고 베이스와 선택적으로 하나 또는 하나 이상의 활성제를 함유하는 반고체 제제이다. 적절한 연고 베이스의 예로는 탄화수소 베이스(예컨대, 바셀린, 백색 바셀린, 황색 연고, 및 광유); 흡수 베이스(친수성 바셀린, 무수 라놀린, 라놀린, 및 콜드 크림); 물로 제거 가능한 베이스(예컨대, 친수성 연고), 및 수용성 베이스(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 연고)를 포함한다. 페이스트는 전형적으로 더 많은 퍼센트의 고체를 함유한다는 점에서 연고와 상이하다. 페이스트는 전형적으로 동일한 성분으로 제조된 연고보다 더 흡수성을 나타내고 지성을 덜 나타낸다.
"겔"은 액체 용제 내에 용해되거나 현탁된 농조화제 또는 고분자성 물질의 작용에 의해 반고체로 된 액체 용제 내의 작거나 큰 분자들의 분산액을 함유하는 반고체 시스템이다. 이러한 액체는 친유성 성분, 수성 성분 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 유화액은 겔일 수 있고, 또는 그렇지 않으면 겔 성분을 포함할 수 있다. 그러나 일부 겔은 혼화될 수 없는 성분들의 균질화된 혼합물을 함유하지 않으므로 유화액이 아니다. 적절한 겔화제로는 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 하이드록시에틸 셀룰로오스와 같은 변성 셀룰로오스; 카보폴 단독중합체 및 공중합체; 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 액체 용제 내의 적합한 용매로는 디글리콜 모노에틸 에테르; 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜; 디메틸 이소소르바이드; 이소프로필 알코올 및 에탄올과 같은 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용매는 전형적으로 약물을 용해시키는 능력에 대해 선택한다. 피부 감촉 및/또는 제형의 연화도를 개선하는 기타 첨가제 또한 혼입될 수 있다.
그러한 첨가제의 예로는 이소프로필 미리스트산염, 에틸 아세트산염, C12~C15 알킬 벤조산염, 광유, 스쿠알렌, 시클로메티콘, 카프릭/카프릴릭 트리글리세라이드, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
폼은 기체 추진체 또는 기체 방출성분와 조합된 유화액으로 이루어진다.
완충액은 조성물의 pH를 조절하기 위하여 이용된다. 바람직하게는, 완충액은 조성물을 약 4 내지 약 7.5의 pH, 더욱 바람직하게는 약 4 내지 약 7의 pH, 그리고 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 7의 pH로 완충한다.
D. 경장 제형
적절한 경구 투여 형태로는 정제, 캡슐제, 용액, 현탁액, 시럽 및 로젠지를 포함한다. 정제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 압축 또는 성형 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 젤라틴 또는 비 젤라틴 캡슐제는 경질 또는 연질 캡슐 쉘로 제조될 수 있으며, 이는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 액체, 고체, 및 반고체 충전 물질을 캡슐화할 수 있다.
희석제, 보존제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 팽창제, 충전제, 안정제 및 이의 조합을 포함하는 하나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 이용하여 제형을 제조할 수 있다.
가소제, 색소, 착색제, 안정제 및 활주제를 포함하는 부형제는 경장 투여를 위한 코팅된 조성물을 형성하는 데에도 이용될 수 있다. 지연 방출 제형은 "Pharmaceutical dosage form tablets", eds. Liberman et. al. (New York, Marcel Dekker, Inc., 1989), "Remington - The science and practice of pharmacy", 20th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000, 및 "Pharmaceutical dosage forms and drag delivery systems", 6th Edition, Ansel et al, (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995)과 같은 일반적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 이러한 참조문헌은 부형제, 정제 및 캡슐제 그리고 정제, 캡슐제, 및 과립제의 지연 방출 제형을 제조하기 위한 재료, 장비 및 공정에 대한 정보를 제공한다.
나노 입자는 예를 들어, 일단 입자가 위의 산성 환경을 통과하면 방출을 지연시키고자, 코팅시킬 수 있다. 적절한 코팅 물질의 예로는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트 석시네이트와 같은 셀룰로오스 고분자; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 아크릴산 고분자 및 공중합체, 및 상표명 유드라짓(EUDRAGIT®)(Roth Pharma, Westerstadt, 독일)으로 시판되고 있는 메타크릴릭 수지, 제인, 쉘락 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"충전제"라고도 지칭되는 희석제는 전형적으로 고체 제형의 부피를 증가시키는 데 필수적이며, 그 결과 정제의 압축 또는 비즈 및 과립제의 형성에 대해 실제 크기가 제공된다. 적절한 희석제로는 디칼슘 인산 2수화물, 황산칼슘, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 카올린, 염화나트륨, 건조 전분, 가수분해된 전분, 전호화 전분, 이산화규소, 산화 티타늄, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 가루 설탕을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
결합제는 고체 제형에 점착 특성을 부여하여, 정제 또는 비드 또는 과립제가 제형 형성 후에 그대로 유지되도록 하는 데 이용된다. 적절한 결합제 물질로는 전분, 전호화 전분, 젤라틴, (수크로오스, 글루코오스, 덱스트로스, 락토오스 및 소르비톨을 포함하는) 당류, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 아카시아, 트라가칸트, 알긴산 나트륨과 같은 천연 및 합성 검류, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 및 비검(veegum), 및 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴산 공중합체, 아미노 알킬 메타크릴산 공중합체, 폴리아크릴산/폴리메타크릴산 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 합성 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
윤활제는 정제 제조를 촉진하기 위하여 이용된다. 적절한 윤활제의 예로는 마그네슘 스테아르산염, 칼슘 스테아르산염, 스테아르산, 글리세롤 베헨산염, 폴리에틸렌 글리콜, 탈크 및 광유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
붕해제는 투여 후 제형 붕해 또는 "분해"를 촉진하기 위하여 이용되며, 일반적으로 전분, 전분 글리콜산 나트륨, 카르복시메틸 전분 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 전호화 전분, 점토, 셀룰로오스, 알지닌, 검류 또는 가교 결합된 PVP(폴리플라스돈(Polyplasdone® XL, GAF Chemical Corp)와 같은 가교 결합 고분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
안정제는 예를 들어, 산화 반응을 포함하는, 약물 분해 반응을 억제하거나 지연시키기 위해 이용된다. 적절한 안정제로는 항산화제, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT); 아스코르브산, 그의 염 및 에스테르; 비타민 E, 토코페롤 및 그의 염; 메타중아황산나트륨과 같은 아황산염; 시스테인 및 그의 유도체; 시트르산; 프로필 갈산, 및 부틸화 하이드록시아니솔(BHA)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
IV. MPP 제조방법
나노 입자를 제조하는 기법은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 용매 증발법, 용매 제거법, 분무 건조법, 상 전환법, 저온 주조법, 및 나노 침전법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
입자 형성의 적절한 방법을 아래에 간략하게 기술한다.
입자 형성 중에 pH 개질제, 붕해제, 보존제, 및 항산화제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 부형제가 선택적으로 입자 내로 도입될 수 있다. 위에 기술된 바와 같이, 하나 또는 하나 이상의 추가적인 활성제 또한 입자 형성 도중에 나노 입자 내로 도입될 수 있다.
V. MPP-저장성 제형을 이용하는 방법
입자를 함유 하는 제재는, 1개 혹은 복수의 증상을 경감하기 위한 치료의 유효량으로 점막 표면에 투여되고, 상기 제형은 독성을 일으키는 일 없이, 점막을 통하여 입자의 수용을 높이기 위해서 저장성이다. 이 것은 점안제 또는 건조 분말, 겔 유익의 아플리케이터, 이것은, 그러한 용액 또는 현탁액을 함유 하는 단일 투여 무균 포장을 사용해도 괜찮다.
연고, 구(구강, 설하), 질, 직장 또는 에어로졸의 영역에, 눈영역에의 국소 투여용의 크림 또는 로션, 또는 그것은, 경구투여용으로 제재화할 수가 있다.
본 발명은 이하의 비한정적인 실시예를 참조하는 것에 의해 이해될 것이다.
실시예
실시예1 내지 6은 점막 침투 입자("MPPs")의 침투 및 특성을 입증한다. 실시예 7 내지 9는 점막 조직에 투여되는 MPPs의 저장성 제형의 효과와 독성을 입증한다.
재료 및 방법
콜산 나트륨염, 트윈 20, 트윈 80, 헥사데실트리메틸암모늄 브롬화물(CTAB), 디옥틸 설포석신산 나트륨(DSS), 폴리옥실 35 수소첨가 피마자유(Cremophore EL) 및 D-α-토코페롤 폴리에틸렌 글리콜 1000(비타민 E-TPGS)을 시그마(Sigma, 미국 미주리 주 세인트루이스)로부터 구입하였다.
폴리(비닐 알코올)(88% 가수분해시 Mw = 25kDa, 80% 가수분해시 6kDa), 및 Mw 약 400kDa의 폴리(에틸렌-말레익 무수물, 1:1 몰 비)은 폴리사이언스(PolySciences, Warrington, PA)에서 구입하였다.
당 에스테르 D1216(SE)는 Mitsubishi-Kagaku Foods Co.(일본 도쿄)로부터 기증받았다.
알렉사플루오르(Alexa Fluor) 555 카다베린은 인비트로겐(Grand Island, NY)에서 구입하였다.
0.15~0.25dL/g의 고유 점도(MW 대략 15kDa)의 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA; LA:GA 50:50)은 레이크쇼어 바이오매터리얼즈(Lakeshore Biomaterials, 미국 앨라배마 주 버밍햄)에서 구입하였다. PEG MW가 10, 5, 2 및 1kDa인 PLGA(LA:GA 50:50)-PEG 공중합체, PLA-PEG5k 및 PCL-PEGSk는 Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd,(Jinan, 중국)에 의해 맞춤 합성되어, 1H NMR 및 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 특징을 분석하였다. 굴절률 검출기를 구비한 시마즈(Shimadzu) 장치와 두 개의 워터스 스티라겔(Waters Styragel®) HR4와 HR5 컬럼을 이용하였다. 용리액으로 테트라하이드로퓨란(THF)을 이용하여 유속 0.5ml/분으로 35℃에서 분석을 수행하였다. 폴리스티렌 표준물질(시그마, 미국 미주리 주 세인트루이스)로 GPC를 보정하였다
PLGA-PEG 공중합체의 화학적 조성 및 분자량(MW)을 1H NMR로 분석하였다. 고분자를 CDC13에 용해시키고, 1H NMR 스펙트럼을 400MHz에서 브루커(Bruker) 400 REM 기기를 이용하여 기록하였다. CDC13 내의 공중합체에 대한 1H NMR 스펙트럼을 도 3에 나타내었다. LA 단위로부터 CH(5.22ppm), GA 단위로부터 CH2(4.83 ppm), 및 에틸렌 산화물 단위로부터 CH2CH2(3.65ppm)의 피크를 적분하였고, 여기서 I5 .22, I4 .83, I3.65는 각각 5.22, 4.83, 및 3.65ppm에서의 피크의 적분 강도이다. LA:GA 비율을 I5.22:(I4.83/2)로 추정하였다.
PLGA-PEG의 MW를 다음과 같이 추정하였다:
(I3 .65/4)/(I4 .83/2)=(MWPEG/44)/(MWGA/58)
(I3 .65/4)/(I5 .22/1)=(MWPEG/44)/(MWLA/72)
MWPLGA - PEG=MWPEG+(MWGA+MWLA), 여기서 MWPEG는 1, 2, 5 및 10kDa이다.
마찬가지로, PLA-PEG와 PCL-PEG의 분자량을 다음과 같이 추정하였다:
(I3 .65/4)/(I5 .22/1)=(MWPEG/44)/(MWLA/72)
MWPLA - PEG=MWPEG+MWLA;
(I3 .65/4)/((I4 .06+I2 .31)/4)=(MWPEG/44)/(MWCL/114)
MWPCL - PEG=MWPEG+MWCL;
여기서 MWPEG는 5kDa이고, I4 .06과 I2 .31은 각각 4.06 및 2.31ppm에서 PCL로부터 피크의 적분 강도이다.
다양한 PEG를 함유하는 블록 공중합체의 특징을 표 1에 나타내었다.
PEG를 함유하는 블록 공중합체의 특징
블록 고분자 PEG
[kDa]		 LA:GA[a] PEG 함량
[b][%]		 Mn[c]
[kDa]		 Mn[d]
[kDa]		 Mw[d]
[kDa]		 PDI[d]
PLGA-PEG10k 10 54:46 21.6[e] 46.3 23.6 38.3 1.62
PLGA-PEG5k 5 51:49 6.0 83.0 39.2 57.8 1.48
PLGA-PEG2k 2 52:48 6.3 31.8 19.0 27.7 1.46
PLGA-PEG1k 1 61:39 5.7 17.7 19.3 27.6 1.43
PLA-PEG5k 5 100:0 5.3 94.9 64.7 87.4 1.35
PCL-PEG5k 5 6.4 77.9 54.6 73.6 1.35
[a]　5.22ppm(락티드의 -CH-), 1.59ppm(락티드의 -CH3) 및 4.83ppm(글리콜라이드의 -CH2-)에서의 1H NMR 적분 강도를 비교하여 LG:GA의 몰 비를 측정하였다.
[b] 블록 공중합체 내의 PEG 함량을 1H NMR으로 결정하였다.
[c] 5.22ppm(락티드의 -CH-), 1.59ppm(락티드의 -CH3), 4.83ppm(글리콜라이드의 -CH2-) 및 3.65ppm(PEG의 -CH2CH2-)에서의 적분을 비교하고, PEG에 대한 공지된 Mn을 고려하여, 1H NMR로 PLGA-PEG 분자량(Mn)을 결정하였다. PCL-PEG의 경우, 4.06ppm(-O-CH2-)과 2.31ppm(-CH2-CO-)에서의 적분을 분석하였다.
[d] Mn, Mw 및 다분산도(PDI)를 GPC로 측정하였다.
[e] PLGA15kDa를 PLGA-PEG10kDa(21.6% PEG 함량)과의 혼합에 의해 PLGA-PEG10kDa 나노 입자를 제조하였으며, 나노 입자 내의 전체 PEG 함량은 6wt%였다.
나노 입자 내의 전체 PEG 함량을 400mHz에서 브루커 400 REM 기기를 이용하여 1H NMR로 결정하였다. 동결 건조된 나노 입자를 정확하게 칭량하여 내부 표준물질로 1wt% 헥사듀테로디메틸 설폭사이드(TMS)를 함유하는 CDCl3에 용해시켰다. 내부 표준물질로 TMS를 이용한 1H NMR 스펙트럼으로부터 달성된 PEG 5kDa 보정 곡선과 비교하여 PEG 함량을 결정하였다.
신선한 인간의 자궁경질 점액(CVM)에서 형광으로 표지된 나노 입자를 39~40에 게재된 바와 같이 추적하였다. 간략하게, 적절히 희석한 0.6㎕의 나노 입자를 20㎕의 점액과 혼합하여 현미경 관찰 전 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100x 유침용 대물렌즈가 구비된 도립 형광 현미경 위에 마운트된 SIT(silicon-intensified target) 카메라(VE-1000, Dage-MTI)를 이용하여 66.7ms의 시간 해상도로 동영상을 캡쳐하였다. 메타모프(MetaMorph) 소프트웨어(유니버셜 이미징(Universal Imaging))를 이용하여 실험당 n>150개 입자에 대한 궤적을 추출하였다. 메타모프 소프트웨어(유니버셜 이미징, 미국 위스콘신 주 글렌데일)를 이용하여 추적 동영상(20s)을 분석하였다. 각 입자에 대한 시간 평균화 평균 제곱 변위(MSD)와 유효 확산도를 시간 척도의 함수로 계산하였다. 각 조건에 대해 3회 실험을 수행하였다. 한쪽 꼬리, 불균등 분산 스튜던트의 t 검정법을 유의도를 평가하는 데 이용하였다(P<0.05)
VP-ITC 마이크로칼로리미터(MicroCal Inc., USA)를 이용하여 25℃에서 ITC 실험을 수행하였다. 물 내의 1mg/ml의 농도에서 상이한 PEG 표면 밀도를 나타내는 나노 입자를 함유하는 2mL 샘플 세포에 DI 물 내의 뮤신 2mg/ml 용액을 481rpm의 교반 속도로 주입하여 실험을 수행하였다. s의 간격 및 μcal/s의 기준 전력으로 총 28회의 주입을 수행하였다. 2㎕ 뮤신 용액의 최초 주입에 이어, 10㎕ 뮤신 용액을 27회 주입하였다. 결합 등온선을 그리고, 오리진(Origin) 소프트웨어를 이용하여 분석하였는데, 여기서 ITC 측정을 한 자리 결합 모델에 맞추었다. 화학량론을 적용하여 나노 입자 표면 상의 뮤신의 결합 함량을 계산하고, m2당 뮤신 mg으로 나타내었다.
실시예 1. 나노 입자의 제조
재료 및 방법
R. C. Mundargi et al, J Control. Release 125, 193 (2008), M. Li et al, Int. J. Pharm. 363, 26 (2008), C. E. Astete and C. M. Sabliov, J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 17, 247 (2006), 및 R. A. Jain, Biomater Ms, 21, 2475 (2000)에 기술된 바와 같이, o/w 단일 유화액 또는 w/o/w 이중 유화액 방법에 의해 생분해성 나노 입자를 제조하였다.
크기, 표면 특성 및 (약물 캡슐화 나노 입자에 대한) 약물 부하에 대해 나노 입자의 특성을 분석하였다. 다중 입자 추적을 이용하여 신선한, 희석되지 않은 인간 CVM에서 나노 입자의 이동을 추적하였다.
상이한 양의 PEG 로 제조된 나노 입자
유화를 이용하여 다양한 목표 PEG 함량(0, 2, 3, 5, 8, 10 및 25wt%, PLGA, PLGA-PEG2%, PLGA-PEG3%, PLGA-PEG5%, PLGA-PEG8%, PLGA-PEG10% 및 PLGA-PEG25%라 함)으로 PLGA-PEG 나노 입자를 제조하였다. PEG 분자량 5kDa를 선택하였는데, 동일한 PEG 함량에서, 1kDa 내지 10kDa 범위의 PEG가 있는 6wt% PLGA-PEG 나노 입자 모두가 빠르게 점액을 침투할 수 있기 때문이다. 나노 입자를 제조하는 동안 PLGA와 PLGA-PEG 비율을 다르게 하여 목표 PEG 함량을 조절하였다. 고분자 농도와 유화 절차를 조율함으로써 나노 입자의 입자 크기를 약 100nm로 조절하였고, 모든 나노 입자는 동적 광산란 하에서 작은 다분산도 지수(0.1 미만)와 함께 단분산 직경을 나타냈다. 나노 입자는 TEM 연구를 기초로 할 때 구 형상이었고, 최고의 목표 PEG 함량을 나타내
GA-PEG25% 나노 입자는 입자 경계에서 더 적은 대조를 보였는데, 이는 아마도 표면에 위치한 더 낮은 전자 밀도의 PEG의 높은 함량에서 기인한 것이다.
결과
표 2는 위에 기술된 바와 같이 제조된 입자의 특징을 나타낸다.
나노 입자 특성
표적 PEG
함량(wt%)		 직경[nm]
[a] 		PDI[a] ζ-전위
[mV]		 α[b] Dw / Dm [c]
25 91±5 0.094 -2.7±0.7 0.89 6.0
10 117±57 0.097 -2.4±0.6 0.80 8.7
8 116±8 0.068 -4.3±0.9 0.81 7.7
5 106±6 0.085 -7.0±0.7 0.78 17
3 101±6 0.078 -10±0.1 0.53 142
2 91±6 0.075 -20±1.4 0.31 4,000
0 144±6 0.056 -72±2.2 0.13 38,000
[a] 나노 입자의 직경 및 다분산도 지수(PDI)를 동적 레이저 산란으로 측정하였다.
[b] 수송 속도는 또한 이중 로그의 MSD 대 시간 척도 그래피의 기울기에 의해 반영될 수 있다(α=1은 방해받지 않은 브라운 수송을 나타내며, 더 작은 α는 입자 운동에 대한 증가된 방해를 반영한다.).
[c] 나노 입자에 대한 물(D w )에서와 비교했을 때의 점액(D m )에서의 전체 평균 확산 계수의 비율 및 유효 확산도 값을 1s의 시간 척도에서 계산하였다.
데이터는 평균±SD이다.
목표 PEG 함량 증가는 나노 입자 표면 전하의 상당함 감소를 가져왔고(표 2), PEG 함량이 8wt% 이상에 도달했을 때, 거의 중성의 표면 전하(대략 4mV)가 달성되었다. 감소된 표면 전하는 증가된 표면 PEG 피복범위를 반영하는데, 고밀도 PEG 코팅은 나노 입자의 표면 전하를 효과적으로 가릴 수 있기 때문이다. 그러나, 표면 전하(제타 전위) 측정은 입자 표면 위의 PEG 사슬의 수와 관련하여, PEG 표면 밀도를 평가하기 위한 정량적인 정보를 제공할 수 없다. 또한, 표면 전하 측정은 코어 물질과 측정 매체에 의해 영향 받을 수 있다.
나노 입자 위의 PEG 표면 밀도를 직접적으로 정량하는데 1H NMR을 활용하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 나노 입자 위의 표면 PEG 함량은 목표 PEG 함량이 증가함에 따라 증가한다. 표 3은 상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도를 나타낸다. 표준 DSS(1wt%)와 비교하여 표면 PEG 수준을 D20에서 1H NMR로 검출하였다. 표준 TMS(1wt%)와 비교하여 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 CDC13에서 1H NMR로 측정하였다. N/A, 해당 없음.
나노 입자 상의 표면 PEG 함량
목표 PEG 함량(wt%) 전체 NP 내의 총 PEG 함량(wt%) NP 표면 위의 PEG 함량(wt%) PEG 표면 밀도
[Γ]
(사슬/100nm2)[a] 		[Γ/Γ*][b]
25 13.0±0.3 12.9±1.0 29.7±2.9 6.7±0.7
10 7.4±0.1 7.2±0.2 19.4±1.3 4.4±0.3
8 6.0±0.3 6.0±0.3 16.4±1.6 3.7±0.4
5 3.7±0.1 3.7±0.2 10.4±0.2 2.4±0.04
3 2.5±0.1 2.6±0.1 6.5±0.2 1.5±0.05
2 1.4±0.4 1.4±0.02 3.2±0.1 0.76±0.02
0 N/A N/A N/A N/A
[a] PEG 밀도 [Γ]는 표면 위의 모든 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG5kDa이라고 가정하여 계산한 100nm2당 PEG 분자의 수를 의미한다.
[b]　PEG 밀도/전체 표면 피복범위[Γ/Γ*]. 전체 버섯 피복범위[Γ*]는 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수를 의미한다(>>1의 값이 매우 높은 PEG 밀도의 밀집한 브러시형을 나타낼 때, < 1의 값은 낮은 PEG 밀도의 버섯 피복범위를 나타내며, > 1 은 브러시형을 나타낸다.)
데이터(평균±SD)는 적어도 세 개의 상이한 배치의 샘플들의 평균값이다.
실시예 2: 상이한 유화제로 제조된 나노 입자
재료 및 방법
알렉사 플루오르 555 카다베린(AF555)을 고분자에 화학적으로 콘쥬게이트시켰다. 유화를 이용하여 나노 입자를 제조하였다. 전형적으로, PLGA-PEG5k와 AF555가 표지된 PLGA-PEG5k의 혼합물(총 50mg)을 1mL 디클로로메탄(DCM)에 용해시켰다. 얼음수조에서 2분 동안 30% 진폭의 초음파(VibraCell, Sonics & Materials Inc., Newtown, CT) 하에서 1% 유화제를 함유하는 5mL 수성 용액에 유상을 부어 수중유적 유화액을 형성하였다.
이러한 유화액을 적어도 3시간 동안 700rpm에서의 자석 교반 하에 또 다른 유화제 용액의 40mL 수상으로 부어 용매가 증발하도록 하였다. 용액을 진공 챔버에 30분 동안 위치시켜 용매를 더 증발시켰다. 최종적인 나노 입자 현탁액을 1μm 시린지 필터로 여과하고, 20,000g에서 25분 동안 원심분리하고, 물로 철저히 세척하였다.
콜산 나트륨염(CHA), 디옥틸 설포석신산 나트륨(DSS), 헥사데실트리메틸 암모늄 브롬화물(CTAB), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리(에틸렌-말레익 무수물)(PEMA), 사포닌, 트윈20, 트윈80 및 당 에스테르 D1216(SE)를 포함하는 유화제를 1% w/v의 농도로 시험하였다. 0.01%~0.5% w/v의 CHA 용액도 나노 입자를 성공적으로 제조할 수 있었다. 플루로닉 F127, F68 용액 및 크레모포어 EL과 비타민 E TPGS와 같은 기타 저분자량 유화제도 시험하였으나, 불안정한 유화액은 큰 응집 입자를 초래했다.
표 4는 PLGA-PEG(Mn 약 83kDa) 및 PLGA(Mn 약 15kDa) 및 다양한 유화제(1% w/v)를 이용하여 제조한 나노 입자의 특징을 나타낸다.
PLGA-PEG5k(Mn 약 83kDa) 및 PLGA(Mn 약 15kDa) 및 대표적인 유화제(1% w/v)를 이용하는 유화법에 의해 제조된 생분해성 나노 입자의 특징.
고분자 유화제 유화제 MW [Da] 직경
[nm]		 ζ-전위
[mV]		 Dw / Dm [a]





PLGA-PEG5k






 DSS 444 136±5 -5.5±0.5 3.9
CHA 430 115±11 -3.7±0.4 5.1
CTAB 364 77±3 -4.6±0.7 5.6
사포닌 1.8k 108±1 -7.0±0.7 10
SE 540 97±3 -4.2±0.3 6.8
트윈20 1.2k 156±7 -3.8±0.3 3.5
트윈80 1.3k 152±6 -4.2±0.3 6.8
F127 12.5k 169±8 -2.4±0.2 4.2
F68 8.4k 162±5 -3.3±0.3 4.2
TPGS 1.5k 204±7 -4.8±0.3 5.6
크레모포어 2.1k 232±4 -3.5±0.1 3.6
PVA 25k 156±8 -2.9±0.3 40,000
PEMA 400k 185±6 -42±1.6 23,000
PLGA
 PVA 25k 175±5 -2.6±1.0 19,000
CHA 430 144±6 -72±2.2 41,000
[a] 1s의 시간 척도에서 점액(D m )에서와 비교할 때의 물(D w )에서의 전체 평균 분산 계수의 비율.
유화에 의해 제조된 나노 입자의 점액 투과성에 미치는 폴리에틸렌 글리콜 분자량(PEG MW)의 영향을 평가하기 위하여, 대표적인 저분자량의 강한 유화제로 CHA를 선택하였다. 대략 6wt% PEG 함량의 상이한 PEG MW를 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자를 0.5% CHA 용액에 제조하였다. PLGA-PEGlOk 나노 입자에 대한 전체 6wt% PEG 함량을 달성하기 위하여, PLGA-PEGlOk(21.6 wt%) 및 PLGA15k의 혼합물을 이용하였다.
결과
다양한 분자량(약 6wt% PEG 함량)의 PEG로부터 제조된 나노 입자의 성질을 표 5에 나타내었다.
유화법에 의한 다양한 MW(약 6wt% PEG 함량)의 PEG를 이용하여 제조한 생분해성 나노 입자의 특징
PEG MW
[kDa]		 직경
[nm]		 ζ-전위
[mV]		 PEG 밀도[Γ]
[a](#PEG/100nm2)		 [Γ/Γ*][b] Dw / Dm
10 124±6 -2.3±0.1 6.7 3.0 9.6
5 107±3 -4.2±0.3 13.9 3.3 4.4
2 128±1 -12±0.9 26.2 2.5 5.0
1 134±5 -18±1.2 45.0 2.3 7.7
[a] PED 밀도 [Γ]는 100nm2당 PEG 분자의 수를 나타낸다. D20 내의 나노 입자의 lH NMR로 표면 PEG 함량을 정량하였다.
[ bl　전체 표면 피복범위에 대한 PEG 밀도의 비율 [Γ/Γ*]. 전체 표면 피복범위 [Γ*]는 100nm2 표면을 완전히 코팅하는 데 필요한 구속되지 않은 PEG 분자의 이론적인 수를 의미한다. ([Γ/Γ*]<1은 낮은 표면 PEG 밀도를 나타내는 버섯형을 나타내고, >1은 높은 표면 PEG 밀도를 나타내는 브러시형을 나타낸다).
다양한 농도의 CHA 및 6wt% PEG를 함유하는 PLGA-PEG5k로부터 제조된 나노 입자의 성질을 표 6에 나타내었다.
유화법으로 제조한 상이한 농도의 유화제(CHA)를 이용한 생분해성 나노 입자의 특성 분석. 6wt% PEG를 함유하는 PLGA-PEG5k를 이용하였다.
유화제[w/v %] 직경 [nm] ζ-전위[mV] Dw / Dm
1 115±10 -3.7±0.4 5.1
0.5 107±3 -4.2±0.3 4.4
0.1 142±9 -3.5±0.6 4.1
0.01 125±6 -5.1±0.5 4.3
실시예 3: 약물 캡슐화 나노 입자의 제조
재료 및 방법
DCM에 고분자와 함께 용해시킨 소수성 약물 모델로서 커큐민을 선택하였다. 절차는 비 부하 나노 입자의 제조 절차와 비슷하였다. 제조된 커큐민-나노 입자는 커큐민의 고유한 형광색 때문에 점액에서 가시화할 수 있다.
BSA는 큰 분자 생물학을 대표하므로, 친수성 약물 모델로 이용하였다.BSA-FITC와 BSA(BSA-FITC의 10% 비율)를 37℃의 0.2mL 16% w/v 수성 용액에 용해시켰다. 이 용액을 얼음수조에서 프로브 초음파(30% 진폭, 1s 펄스로 1분) 하에서 DCM 용액 내의 100mg/ml PLGA-PEG5k 1mL에 첨가하였다. 그에 따른 W/O 1차 유화액을 즉시 초음파(20% 진폭, 2분) 하에서 제2의 수상(5mL 1% 사포닌 용액)에 첨가하였다. 이중 유화액을 또 다른 40mL의 1% 사포닌 용액으로 옮겨 3시간 동안 자석 교반하였다. 나노 입자를 1μm 시린지 필터로 여과하고, 세척하고, 원심분리에 의해 수집하였다. BSA-FITC는 점액에서 BSA가 부하된 나노 입자를 추적할 가능성을 허용하였다.
결과
커큐민 나노 입자 및 BSA 나노 입자에 대한 표적 약물 부하는 각각 9.1%와 16.7%였다.
실시예 4. 유화 능력의 추정
재료 및 방법
PLGA-PEG5k(MW 대략 83kDa)를 고분자 모델로 이용하였고, 50mg/mL의 DCM에 용해시켰다. DCM 내 PLGA-PEG5k의 0.5ml 용액을 30% 진폭의 초음파 하에서 1%(w/v) 유화제를 함유하는 5ml 수상에 첨가하여, 위에 기술된 동일한 방법을 이용하여 유화액을 제조하였다. 3시간 동안 700rpm에서 자석 교반하에서 형성된 유화액을 추가적인 20ml 1% 유화제 용액에 첨가하였다. 각 유화제의 유화 능력을 응집된 입자의 형성을 방지하는 능력으로 추정하였다. 응집된 입자를 500g에서 20분 동안 원심분리에 의해 수집하고, 상층액의 나머지 나노 입자를 30,000g에서 25분 동안 원심분리하여 수집하였다. 응집된 입자에 대한 나노 입자의 중량 비율을 계산하고, 유화제의 유화 능력을 추정하기 위하여 지수로 이용하였다.
직경 및 표면 전하
나노 입자의 직경 및 ζ-전위(표면 전하)를 제타사이저 나노 NS90을 이용하여 측정하였다. 나노 입자를 10mM NaCl 용액에 재현탁시켰다. TEM 그리드 상에 나노 입자의 희석 현탁액을 떨어뜨려서 TEM 샘플을 제조하고, 공기 중에서 건조되게 하였다. H7600 투과 전자 현미경(Hitachi, 일본)을 이용하여 입자 형태학의 특성을 분석하였다.
캡슐화 효율
동결 건조된 나노 입자를 DMSO 내에 용해시키고, 바이오텍 시너지(Biotek Synergy) MX 플레이트 판독기를 이용하여 430nm에서 흡광도를 측정함으로써 나노 입자 내의 커큐민의 캡슐화 효율을 측정하였다. 커큐민 보정 곡선(농도 범위 0~50μg/ml)을 비교함으로써, 약물 함량을 결정하였다. 동일한 고분자 농도에서의 DMSO 내의 블랭크 나노 입자의 흡광도를 제하였다. 알칼리 소화 후 BSA-FITC의 캡슐화 효율을 분석하였다. 알려져 있는 양의 동결 건조된 나노 입자를 1M 수산화나트륨에서 완전히 가수분해시켰다. 그에 따른 용액을 490nm 여기 파장과 525nm 방출 파장에서 바이오텍 시너지 MX 플레이트 판독기를 이용하여 분석하였다. 동일한 가공 조건에서 동일한 양의 고분자와 증가하는 양의 BSA-FITC를 함유하는 표준 용액을 제조하였다. BSA-FITC 보정 곡선과 비교하여 나노 입자 내의 BSA의 양을 결정하였다.
약물 부하(DL)와 캡슐화 효율(EE)을 다음과 같이 계산하였다:
DL(%) = 약물의 중량/나노 입자의 중량 ×100%
EE(%) = 실험적인 약물 부하/표적 약물 부하 ×100%
결과
다양한 유화제에 대한 결과를 표 7에 나타내었다.
PLGA-PEG5k(6wt% PEG)를 이용한 MPP(유화제로서 CHA와 사포닌) 및 CP(유화제로 PVA)에서 소수성 약물 모델(커큐민)과 친수성 약물 모델(BSA)의 캡슐화
제형 DL[%][a] EE[%][b] 직경
[nm]		 ζ전위
[mV]		 Dw/Dm
PLGA-PEG5k/CHA
(커큐민)		 4.5 49 156±12 -5.1±0.5 6
PLGA-PEG5k/PVA
(커큐민)		 4.3 47 151±11 -3.3±1.1 2400
PLGA-PEG5k/사포닌
(BSA)		 11.4 68 164±1 -4.5±0.4 36
PLGA-PEG5k/PVA
(BSA)		 11.5 69 218±22 -2.2±0.8 5100
[a] 약물 부하(DL%)는 나노 입자 내의 약물의 중량 함량을 나타낸다.
[b] 약물 캡슐화 효율(EE%)은 이론적인 약물 부하와 비교하여, 최종적인 약물 부하의 비율을 나타낸다.
표면 폴리에틸렌 글리콜( PEG ) 밀도의 정량
나노 입자 상의 표면 PEG 밀도를 400MHz에서 브루커 400 REM 기기를 이용하여 1H NMR로 결정하였다. 완화 시간을 10s로, ZG를 90°로 설정하였다. 상이한 PEG 함량을 나타내는 나노 입자를 0.5% CHA D20 용액에 직접적으로 제조하고, 1H NMR 분석을 위한 내부 표준물질로서 1wt% 3-(트리메틸실릴)-1-프로판설폰산, 나트륨염과 함께 D20 내에 현탁시켰다.
1% 3-(트리메틸실릴)-1-프로판설폰산, 나트륨염과 함께 D20 내의, 알려진 중량의 PEG5kDa(시그마, 미국 미주리 주 세인트루이스) 단독중합체를 상이한 농도까지 단계적으로 희석하여, 1H NMR에서 PEG 신호를 위한 보정 곡선을 설정하였으며, 이러한 보정 곡선을 나노 입자 위의 표면 PEG 함량을 계산하는 데 이용하였다.
D20 내의 나노 입자의 0.2ml 용액을 동결 건조시키고 중량을 측정하였다. 모든 표면 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG 5kDa이라고 가정하여, 표면 PEG 밀도를 나노 입자 위의 100nm2당 PEG 분자의 수로 계산하였다. 동일한 방법에 의해 제조된 PLGA 나노 입자로 대조군 1H NMR 실험도 수행하였으며, PLGA 나노 입자에 대해서는 검출 가능한 CHA 피크가 없었다. PEG 밀도, [Γ]는 100nm2당 나노 입자 표면 위의 PEG 분자의 수이다. 1H NMR으로 검출된 전체 PEG 함량(MPEG, 몰)을 모든 나노 입자의 총 표면적으로 나눔으로써 PEG 밀도를 아래와 같이 계산할 수 있다:
Figure pct00001
여기서 WNP는 나노 입자의 총 질량이고, dNP는 나노 입자의 밀도이고(나노 입자의 밀도는 고분자의 밀도와 동일할 것으로 추정된다, PLGA의 경우 1.21g/ml), D는 동적 광산란에 의해 측정한 입자의 직경이다.
전체 표면 버섯 피복범위[Γ*]는 입자 표면적의 100nm2을 차지하는 구속되지 않은 PEG 분자의 수이다. [Γ*]를 결정하기 위하여, 단일 PEG 사슬이 차지하는 표면적을 추정하였다. 랜덤워크 통계학을 이용하여, 단일 PEG 사슬은 직경 ξ의 구에 의해 주어진 계면에서의 면적을 차지한다:
Figure pct00002
여기서 m은 PEG 사슬의 분자량이다. 하나의 PEG 분자에 의해 차지되는 표면적은 (ξ/2)2으로부터 결정할 수 있다. 따라서, PEG 5kDa은 5.4nm의 직경을 나타내는 구속되지 않은 분자 구를 가지고 있고, 22.7nm2의 표면적을 차지한다. 따라서, 100nm2 표면적을 완전히 덮는 PEG 분자의 수 [Γ*]는 4.4이다.
[Γ/Γ*]는 나노 입자 표면 상의 PEG 밀도를 측정하는 지수로서 이용될 수 있는데, 여기서 <1의 값은 낮은 PEG 밀도를 나타내고, 이때, PEG 분자는 버섯 형태이다; 반면, >1의 값은 높은 PEG 밀도를 나타내고, 이때, PEG 분자는 브러시와 같은 형태이다. 이와 비슷하게, PEG 10kDa, 2kDa 및 1kDa에 대한 [Γ*]은 각각 2.2, 11 및 22이다. 결과를 위의 표 2에 나타내었다.
표 8은 상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도를 보여준다. 표준 DSS(1wt%)와 비교하여 표면 PEG 수준을 D20에서 1H NMR로 검출하였다. 표준 TMS(1wt%)와 비교하여 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 CDC13에서 1H NMR로 측정하였다. N/A, 해당 없음.
상이한 PEG 함량을 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자의 PEG 표면 밀도
목표 PEG 함량(wt%) 전체 NP 내의 총 PEG 함량(wt%) NP 표면 위의 PEG 함량(wt%) PEG 표면 밀도
[Γ]
(사슬/100nm2)[a] 		[Γ/Γ*][b]
25 13.0±0.3 12.9±1.0 29.7±2.9 6.7±0.7
10 7.4±0.1 7.2±0.2 19.4±1.3 4.4±0.3
8 6.0±0.3 6.0±0.3 16.4±1.6 3.7±0.4
5 3.7±0.1 3.7±0.2 10.4±0.2 2.4±0.04
3 2.5±0.1 2.6±0.1 6.5±0.2 1.5±0.05
2 1.4±0.4 1.4±0.02 3.2±0.1 0.76±0.02
0 N/A N/A N/A N/A
[a] PEG 밀도 [Γ]는 표면 위의 모든 PEG 사슬이 전체 길이의 PEG5kDa이라고 가정하여 계산한 100nm2당 PEG 분자의 수를 의미한다.
[b]　PEG 밀도/전체 표면 피복범위[Γ/Γ*]. 전체 버섯 피복범위[Γ*]는 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수를 의미한다(>>1의 값이 매우 높은 PEG 밀도의 밀집한 브러시형을 나타낼 때, < 1의 값은 낮은 PEG 밀도의 버섯 피복범위를 나타내며, > 1 은 브러시형을 나타낸다.)
데이터(평균±SD)는 적어도 세 개의 상이한 배치의 샘플들의 평균값이다.
표면 PEG 밀도([Γ], 100nm2당 PEG 사슬의 수)를 계산하여, 전체 표면 버섯 피복범위([Γ*], 100nm2당 구속받지 않는 PEG 분자의 수)와 비교하였다. PLGA-PEG3% 나노 입자는 [Γ]/[Γ*]=1.5와 동일한, 6.5PEG/1OOnm2의 밀도와 함께 2.6wt%의 표면 PEG 함량을 나타냈으며, 이는 PLGA-PEG3%에 브러시 형태의 표면 PEG 코팅을 준다. 높은 밀도의 브러시 형태의 PEG 코팅([Γ]/[Γ*]>3)은 10PEG/100nm2을 초과하는 PEG 표면 밀도에서 달성되었다(PLGA-PEG5%).
동결 건조된 PLGA-PEG 나노 입자를 NMR 용매 CDCl3에 용해시킴으로써, 1H NMR에 의해 나노 입자 내의 총 PEG 함량을 측정하였고, 나노 입자 내의 총 PEG 함량(표면 PEG 및 나노 입자 코어 내에 매립된 PEG 모두)은 표 5에 나타난 바와 같이 표면 PEG 함량에 매우 가까운 것으로 밝혀졌다. 유화법에 의해 제조된 PLGA-PEG 나노 입자 내의 거의 모든 PEG 사슬이 입자 표면 위에서 검출되었다. 유화법은 유화액적으로부터 유기 용매(디클로로메탄)의 증발 및 이어진 고분자 코어의 고체화를 수반했다. 유기 용매의 느린 증발은 친수성 PEG 사슬이 확산하여 나노 입자 표면에서 집합할 충분한 시간을 제공하며, 이는 표면에 대한 PEG의 높은 분배율을 가져왔다. 그러나, 유화법에 의해 나노 입자를 제조하는 동안 상당한 PEG의 손실이 있으며, PEG 손실 비율은 PLGA-PEG25% 나노 입자의 경우 50% 정도로 높을 수 있다.
이전의 보고와 비슷하게, PEG의 손실은 공중합체 내의, 더 높은 PEG 함량 및 더 높은 친수성을 나타내는 저분자량 부분의 PLGA-PEG에 의한 미셀 형성 때문일 수 있다. 더 높은 PEG 함량의 고분자를 함유하는 매우 작은 규모의 입자들로 이루어진 이러한 부분은 원심분리 및 세척 단계 후에는 수집할 수 없으며, 이는 겔 투과 크로마토그래피로 측정한, 원 고분자와 비교할 때의 나노 입자 형성 후의 고분자의 증가된 평균 분자량으로부터 확인할 수 있다. 대조군 실험에서 나노 침전법(용매 확산법)에 의해 제조된 PLGA-PEG10% 나노 입자(117nm)는 나노 입자에서 6.5wt%의 총 PEG 함량을 나타냈으며, PEG 사슬 중 89%만이 표면에서 검출되었다(5.8wt% 표면 PEG 함량과 동일).
실시예 5. 나노 입자의 점액 침투 추적
재료 및 방법
인간 자궁 경부의 질 점액(CVM)을 수집하였다. 간략하게는, 존스 홉킨스 대학교의 기관감사위원회가 승인한 프로토콜에 따라 자가 샘플링 생리 수집 장치를 이용하여 정상적인 질 세균총을 가지고 있는 여성으로부터 희석되지 않은 자궁 경부 질 분비물을 획득하였다. 장치를 60초 동안 질에 삽입하고, 제거하여, 50ml 원심분리 튜브에 위치시키고, 1000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 분비물을 수집하였다.
신선한 인간 자궁 경부 질 점액(CVM) 내의 형광 표지된 나노 입자의 추적을 수행하였다. 간략하게는, 적절히 희석한 나노 입자 0.6㎕를 맞춤 제작된 챔버 슬라이드 내의 20㎕ 점액에 첨가하고, 현미경 관찰 전 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. CVM 내의 나노 입자의 궤적을 다중 입자 추적법(MPT)으로 기록하였다. 100x 유침용 대물렌즈(N.A., 1.3)가 구비된 도립 형광 현미경 위에 마운트된 SIT(silicon-intensified target) 카메라(VE-1000, Dage-MTI)를 이용하여 66.7ms의 시간 해상도로 20초 동영상을 캡쳐하였다. 메타모프 소프트웨어(유니버셜 이미징, 미국 위스콘신 주 글렌데일)를 이용하여 추적 동영상(20s)을 분석하였다.
각 입자에 대한 시간 평균화 평균 제곱 변위(MSD)와 유효 확산도를 시간 척도의 함수로 계산하였다:
Figure pct00003
여기서 x와 y는 시간의 함수로서 나노 입자 좌표를 나타내고, τ는 시간 지연이다.
커큐민 부하 나노 입자와 FITC-BSA 부하 나노 입자를 캡슐화된 커큐민 또는 BSA-FITC로부터의 형광을 이용하여 동일한 방식으로 인간 CVM에서 추적하였다. 점액층으로의 입자 침투를 픽의 제2 법칙 및 추적 실험으로부터 얻어진 확산 계수를 이용하여 모형화하였다.
결과
유화법에 의해 제조된 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 인간 CVM 수송 비교를 도 1a 내지 도 1h에 나타내었다. 도 1a와 도 1b는 CHA와 PVA를 함유하는 PLA-PEG 및 PCL-PEG 나노 입자의 대표적인 궤적을 나타낸다. 도 1c와 도 1d는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위(<MSD>)를 시간 척도의 함수로 나타내는 그래프이다. 도 1e와 도 1f는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그 분포를 나타내는 그래프이다. 도 1g와 도 1h는 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 이러한 데이터는 PVA를 이용하여 제조된 나노 입자의 고정화와, PLGA-PEG5k 나노 입자에 대해 측정된 값과 비슷한 유효 확산도와 함께, 저분자량의 유화제인 CHA를 이용하여 제조된 나노 입자의 빠른 점액 침투를 보여준다.
CVM에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG 분자량의 영향을 도 2a와 도 2b에 나타내었다. 도 2a와 도 2b는 인간 자궁 경부 점액에서 MPP의 수송 속도에 미치는 PEG MW의 영향을 나타낸다. 도 2a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위(<MSD>)를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 2b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그의 분포를 나타내는 그래프이다. PLGA-PEG(6wt% PEG)를 이용하는 유화법으로 입자를 제조하였다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 이들 입자들은 모두 신속하게 점액을 침투했다(표 5도 참조).
나노 입자 표면 전하는 PEG MW에 반비례하였고, -18mV(1kDa) 내지 -2.3mV(10kDa)으로 다양했다. PEG MW가 증가함에 따라 1H NMR로 측정한 표면 PEG 밀도 [Γ](100nm2당 PEG의 수)는 감소했다. 그러나, 브러시 같은 PEG 코팅[Γ*]을 형성하는 데 필요한 이론적인 PEG 밀도에 대한 표면 PEG 밀도의 비율 [Γ/Γ*]은 PEG MW와는 관계없이 2를 초과하여(표 5), PLGA-PEG(1~10kDa)/CHA 나노 입자의 표면 위에 PEG의 조밀한 브러시 같은 코팅이 존재함을 나타냈다.
도 3a 내지 도 3c는 커큐민과 BSA가 부하된 MPP 및 종래의 입자(CP)의 수송 속도를 나타낸다. 도 3a는 전체 평균을 낸 기하 평균 제곱 변위<MSD>를 시간 척도의 함수로 나타낸 그래프이다. 도 3b는 1s의 시간 척도에서 개별적인 입자의 유효 확산도(Deff)의 로그 분포를 나타내는 그래프이다. 도 3c는 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있을 것으로 예상되는 입자의 시간의 경과에 따른 예상 분획을 나타내는 그래프이다. 데이터는 각 실험에서 추적된 ≥ 120개 나노 입자를 이용한 세 개의 독립적인 실험을 대표한다. 오차 바는 s.e.m으로 나타냈다. 커큐민 및 BSA가 부하된 나노 입자는 τ=1s에서의 물에서보다 각각 겨우 6배 및 36배 더 느린 속도로 점액에 빠르게 확산되었다(도 3a). 이와 대조적으로, PVA로 제조된 나노 입자는 CVM에 고정화되었고(도 3b), 수송 속도는 물에서보다 2,000배 더 느렸다.
PEG 코팅이 없는 PLGA 나노 입자는 점액 내에 완전히 고정화되었고, 확산도는 물에서 동일한 크기의 나노 입자의 확산도보다 38,000배 더 느렸다. 나노 입자 위의 PEG 표면의 존재는 매우 점탄성의 점액을 통한 확산을 상당히 향상시켰고, 6.5PEG/lOOnm2의 표면 PEG 밀도를 나타내는 PLGA-PEG3%는 142까지 증가된 Dw/Dm 값을 나타냈다. 10.4PEG/lOOnm2까지 표면 PEG 밀도를 더 증가시키면, PLGA-PEG5% 나노 입자는 물에서의 확산보다는 겨우 17배 더 느렸다. 표면 PEG 밀도가 16.4PEG/lOOnm2(PLGA-PEG8%)를 초과할 때, 90%를 초과하는 나노 입자들이 확산성을 나타냈다. 표면 PEG 밀도의 추가적인 증가는 점액 내에서 입자 확산도를 상당히 향상시키지 않을 가능성이 높은데, 16.4 PEG/lOOnm2의 표면 밀도는 이미 점액 구성성분의 결합을 효과적으로 차폐할 수 있기 때문이다. PLGA-PEG8%, 10% 및 25%의 대략 50~70% 나노 입자는 60분 이내에 생리적인 30μm 두께의 점액층을 침투할 수 있었고, PLGA-PEG5%,　PLGA-PEG3%(조밀한 코팅), PLGA-PEG2%(낮은 코팅) 및 PLGA(무 코팅)보다 훨씬 더 빠른 속도를 나타낸다.
실시예 6: 점액에서의 나노 입자의 안정성
재료 및 방법
입자와 점액 구성요소 사이의 부착성 상호 작용을 최소화함으로써 달성되는 점액에서의 나노 입자의 안정성은 생체 내에서 점액 침투 약물 전달체로서의 적용에 있어서 중요한 기준이 된다. 뮤신 존재 시 상이한 PEG 표면 밀도를 나타내는 나노 입자들의 안정성을 결정하기 위하여, 뮤신 결합의 지표로 뮤신 존재 하의 나노 입자 크기의 변화를 연구하였다. 뮤신은 점액의 주요한 구성요소이고, 소의 턱밑샘의 뮤신은 인간 CVM과 구조 및 생리적인 성질에서 유사성을 공유하므로, 소의 턱밑샘으로부터 추출된 뮤신을 뮤신 모델로 선택하였다.
나노 입자를 뮤신 용액(10mg/ml)으로 인큐베이션시키고, 시간 경과에 따른 입자 크기의 변화를 모니터링하였다.
결과
>16.4PEG/1OOnm2　의 PEG 표면 밀도를 나타내는 PLGA-PEG 나노 입자는 전체 3시간의 인큐베이션 기간 동안 수력학적 직경을 보유하는 뮤신 용액에서 안정적이었고, 이러한 PEG 표면 밀도에서, PEG 코팅은 고밀도의 브러시 형태였다([Γ]/[Γ*]>3). 이와 대조적으로, 6.5PEG/1OOnm2의 표면 밀도를 나타내는 PLGA-PEG5% 나노 입자는 심지어 5분 동안 뮤신 용액과 인큐베이션시킨 후 입자 직경이 대략 5% 증가하는 것으로 나타났고, 이러한 PLGA-PEG5% 나노 입자 상의 PEG 표면 밀도는 벌써 브러시의 PEG 코팅을 초래하였다([Γ]/[Γ*]>1). 따라서, 브러시 PEG 코팅만으로는 뮤신 결합을 완벽하게 차단하기에 충분하지 않다. 브러시 형태로부터 버섯 형태로의 감소된 PEG 표면 밀도와 함께, 입자 크기의 점진적인 증가가 있었다. PEG 코팅 없이 PLGA 나노 입자는 뮤신에서 5분 이내의 인큐베이션 시 109±2nm 내지 207±9nm의 극적인 크기 증가를 나타냈다.
도 4의 A는 나노 입자의 점액 침투에 미치는 표면 PEG 피복범위([Γ/Γ*])의 영향을 나타내는 개요도이다. 위의 패널은 증가하는 피복범위에서 표면 PEG 코팅이 있는 PLGA-PEG 나노 입자의 침투를 나타낸다. 표면 PEG 피복범위가 증가함에 따라, PEG 형태는 버섯형(이웃하는 PEG 사슬이 겹치지 않음, [Γ/Γ*]＜1, 도 4의 A)에서 브러시형(이웃하는 PEG 사슬이 겹침, 1＜[Γ/Γ*]＜3, 도 4의 B), 조밀한 브러시형([Γ/Γ*]＞3, 도 4의 C)으로 바뀐다. 중간 패널은 PEG 피복범위가 어떻게 점액 노출 후의 점막 부착성 상호 작용을 결정하는지를 보여준다. 낮은 PEG 피복범위([Γ/Γ*]＜1)에서, 뮤신 섬유는 나노 입자 코어에 강력하게 부착된다. 중간 PEG 피복범위(1＜[Γ/Γ*]＜3)에서, 뮤신 섬유는 아직도 나노 입자 코어에 부분적으로 흡수될 수 있다. 높은 ([Γ/Γ*]＞3) PEG 피복범위에서, 나노 입자 코어는 완전히 생물학적으로 비활성인 PEG 코로나로 차폐되어, 나노 입자로 뮤신이 전혀 흡수되지 않는다. 하부 패널은 낮은 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자가 점액에 고정화되고, 중간 PEG 피복범위를 나타내는 나노 입자는 저지당하거나 심지어 점액에 고정화되고, 높은 그리고 매우 높은 PEG 피복범위를 나타내는 입자는 신속하게 점액을 침투할 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 질 및 결장의 점막 조직에 있어서의 나노 입자의 분포 및 지지에서 입자 용액의 침투압의 영향.
접착 점막 표면에 존재하는 점액층에 의해 트랩 되는 것을 피하는 점액 꿰뚫어서 속에 넣는 것 나노 입자(MPP)는, 점막 표면에서의 이 효과를 연구했다. 매우 낮은 분자량(5 kDa의) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 조밀한 코팅은, 공유결합 점막침투성 PS-PEG 나노 입자를 생성하기 위해서, 형광 1 OOnm 카르보키실 변성 폴리스티렌(PS) 입자의 표면에 부착했다. 코팅되어 있지 않은 나노 입자( 「종래의 입자」, 또는 「CP」)는, 뮤신에 부착한다. CP는, 급속냉동 전 마우스 결장 및 질조직 중강에, 대신에, 집합체를 잘 점액층에 침투하고 있지 않다. 그러나, MPP는, 마우스의 직장 와 질의 조직의 양쪽 모두에 있어서의 입자의 연속적인 「층」을 생성해, 모든 방법하에 있는 표피에 점액 바리어를 관통했다. 입자는, 순수한 물과 같이, 저자극성 침투압 용매중에 투여되는 경우에는, 점막 표면의 큰 흡수 능력은 급속히 점액층을 지나, MPP는 아니고, CPS를 「흡입」하였다. 그러한 초고순도(UP)등의 저침투압의 용액, 수중의 입자의 투여는, 이와 같이 해 대류에 의해 MPP의 묘화, 침투압 평형에 이르기 위해서 점액층 아래에 있는 조직에 의해 유체의 흡수를 일으킨다.
질 및 직장 전달을 위해서 사용되는 고침투압성 제재를 투여하는 부작용이 보고되었다(Fuchset al. J Infect Dis 195, 703-710 (2007); Lacey et al. Int J STD AIDS 21, 714-717 (2007)). 이는 심각한 독성 및 표피 침식을 야기할 수 있다.그러나, 경도의 저침투압의 유체는 같은 독성 프로파일을 가지는 것이 나타나지 않았다.
재료 와 방법
(A) IX PBS 또는(B) 초순수한 물 중 어느 하나에 투여되는 플래시-동결 전체 결장 조직의 단면상에, 형광을 100 nm점액 침투 PEG화 된 폴리스티렌 입자의 분포를 조사했다.
조직은 즉시 투여 후에 골라내, 세포핵을 나타내기 위해서 DAPI로 염색했다.
(A) IX PBS 또는(B) 초순수한 물 중 어느 하나의 항에로 투여 급속냉동 전체질조직의 단면상의 형광 100 nm의 점액 침투 PEG화 된 폴리스티렌 입자의 분포도 조사했다. 조직은 투여 후 즉시 골라내, 세포핵을 나타내기 위해서 DAPI로 염색했다.
어느 쪽 UP수중에서의 형광 나노 입자의 최초의 투여 후의 마우스 전체의 질관 및 결장 직장 조직의 형광(저침투압) 또는 PBS(등 침투압)를 평가했다.
나노 입자의 지지, 5μl를 평가한다. 적색 형광의 CP인가의 MPP의 질내에 투여했다. 전체 경질관은, 0,2,4, 및 6시간의 시점에서 얻을 수 있어 표준적인 조직배양사라에 들어갈 수 있었다. 각 조건 및 시점에 대해서는, n는> 7마리의 마우스를 이용했다. 조직의 형광 화상은, Xenogen사 IVIS 스펙트럼 촬상 장치(Caliper Life Sciences)를 이용해 얻었다. 단위 면적 근처의 형광 카운트의 정량은 제노젠리빙이메이지 2.5 소프트웨어를 이용해 계산했다.
결과
저침투압 용액중에서 투여되었을 경우, MPP는 곧바로 질 및 직장 결장 표피를 배접하기 시작한다.
UP수중의 투여를 측정한 후에, MPP(PSPEG) 와 CP(PS)의 비율은, 시간 위에서 마우스의 질관내에 지지. 6시간 후에, MPP의 57%와 CP의 7%가, CV관내에 남아 있습니다.
MPP는, 적어도 6시간, 훨씬 높은 양으로 마우스의 질내에 지지 되었다.
FITC를 함유 하는 생분해성의 MPP는, 질내 UP수중에서 투여했다. 비교 와 해, 표준적인 등 침투압 프라세보겔중의 FITC, hydroxyethlycellulose(HEC)는, 투여했다. 24시간 후, 질조직을 잘라, 2매의 슬라이드 글라스의 사이에 평탄화. FITC가 드문드문하게 분포하고 있던 것에 대해, 저장전달 MPP는, 완전하게 피복 하는 표피를 하도록 보였다. MPP는 극적으로 그렇지 않으면 불충분하게 분포해, 엔티티의 표피 분포를 개선했다.
실시예 8：침투압의 함수로서 질조직에 있어서의 MFPs 의 분포
실시예 7의 연구는 점액에 부착하지 않는 MPP는, 주름이 보다 완만하게 제거되어 점액층에 깊게 침투로 연결되는 전체의 질표면을 코팅하고, 급속하게 사람 및 마우스의 경질점액(CVM)을 개입시켜 확산하는 것이 가능한 것을 실증 해, 소위가 발행해, 종래의 점막 부착성 나노 입자(CP), 보다 길고 질내에 존재한다. Ensign, et al Sci Transl Med 4, 138ral79 (2012)공표.
MPP에 의한 개선된 질분포 및 지지 하는 하나의 열쇠는, 저장액중의 나노 입자를 투여했다. 저장액으로 전달되는 경우, MPP는 급속히 아득하게 급속히 확산에만 기초를 두어, 예상 이상으로 거기에 도착해, 전체에 질의 표면에 축적. 유체인 경우에는 압력 야기 유동 유체(즉, 용제 드러그 하는 것에 의해) 와 함께 점액을 개입시켜 점액 겔, MPP 플로우를 다녀 흐르도록, 연구는, 약물 및 MPP는, 저장성 처방물중의 질내에 전달되었을 경우도 같은 효과가 발생할지 어떨지를 결정하기 위해서 행하였다. 이 연구는, 저장 전달이 개선된 분포, 지지, 및 보호를 제공할 가능성이 있을지 어떨지를 판단하기 위해서 유리 약물 및 MPP에 의한 저장경질분만을 조사했다.
재료와 방법
동물 모델
암컷의 6-8주령의 CF-1 마우스를 Harlan (Indianapolis, IN)으로부터 구입했다. 마우스는, 자연 순환 발정 상태로 마우스의 선택을 가능하게 하기 위해서, 역의 광사이클 시설(12시간명/ 12시간암)에 수용했다. 발정 주기의 발정기의 사이, 마우스의 질은 인간의 질에 가장 유사하고 있다. 발정기의 마우스의 점액중의 나노 입자의 장벽은, 밀접하게 인간의 CVM중의 나노 입자에의 바리어 특성을 모방한다. 이와 같이, 발정기의 마우스는, 질입구의 출현에 의해 시각적으로 결정되도록, 모든 분포 및 지지의 연구에 사용했다. 질HSV-2의 보호와 감수성의 연구에 사용한 마우스는, 100μl 2.5mg Depo-Provera (Pharmacia & Upjohn Company, New York, NY)를 피하 프랭크 주사했다. 이 처리는 인산염, 완충 성장리식염수(PBS), 실험전에 7일간. 이 처리는, 일반적으로, 질HSV-2 감염에 대한 감수성을 증가시키기 위해서 사용된다. 모든 실험 프로토콜은 존즈호프킨스 동물 실험 위원회에 의해 승인되었다.
나노 입자의 조제 및 특성 평가
형광, 카르보키실기(COOH) 변성 폴리스티렌(PS) 직경이 나노 입자는 100 nm로 Molecular Probes사(Eugene, OR)로부터 구입했다. 이전에 난스등 과학 TRANSL 멧드 4, 149ral 19(2012)에 의해 기재되도록, MPP를 제조하려면 , PS입자를 공유결합 5 kDa의 아민 수식 PEG(크리에이티브 PEGworks, 윈스턴 샐럼, 노스캐롤라이나주)로 수식되었다.
입자 사이즈 및ζ-전위는, 제이타사이자나노 ZS90(Malvern Instruments사, 사우스 고물, MA)를 이용해, 각각, 동적광산란 및 레이자돕라 유속계에 의해 측정했다. 사이즈의 측정은, 90о의 산란각으로 25оC로 갔다. 샘플은, 계기 설명서에 따라 행 10 mM의 NaCl 용액(pH7) 중, 측정중에 희석했다. 거의 중성의ζ-전위는, PEG 콘쥬게이션을 확인하기 위해서 사용한, 입자는, 먼저 Lai등에 의해 기재된 사람 CVM에 있어서의 점액 침투 능력에 대해 시험했다. 6444-6448 U SA 104, 1482년부터 1487년(2007년) 및 Wang등. Angew CHEM의 Int 에도 ENGL 47, 9726에서 9729(2008). 이러한 입자는, 이전에 급속히 발정기의 마우스질점액에 침투하는 것이 나타났다. 용액의 오스몰 농도는, Wescor VAPRO 증기압 침투압계를 이용해 측정했다.
질내에 약물 및 나노 입자 분포
독소루비신(NetQem, 노스캐롤라이나주 다람)은, PBS(혈액에 관해서 등 침투압), 또는 초순수한 물(저침투압) 중 어느 하나의 항에로/ ml의 농도를 1 mg로 용해시켰다. IX PBS, 증류수 800 ml, 염화 나트륨 8 g의 1리터를 위한; KC1를 0.2g; 의 Na 1.44그램 2 HPO 4, KH 0.24 g의 2 PO 4; 광고는 HCl로 7.4에 정확히 pH는, 1리터의 전량을 증류수를 추가합니다.
독소루비신은 경질 2개(살)이 다른 상태로 마우스에 양쪽 모두 isoosmotically 와 hypoosmotically 투여했다. 「보행 불능」그룹이(젼즈호프킨스 ACUC 가이드 라인에 따라 제조한) 작업 용액 아베르틴의 복강내 주사로 마취되어
조직 수집전에 1시간앙와 정도인 채에서 만났다. 「외래」그룹이 마우스는 곧바로 눈을 뜬 마에구미직수집에의 10분간의 보행 가능했어 게, 즉효성, 흡입 가능 ISO 풀 런으로 마취했다. 질의 조직은, 그 후, 오픈 슬라이스 해, 수집했다
세로 방향에, 평탄화 되어 슈퍼 접착제로 닫고 밀봉해 2매의 슬라이드 글라스의 사이에 클램프. 이 순서에서는, 완전하게 내강으로부터 infolded표면을 노출시키는, 조직을 평탄화합니다. 조직은 2배의 배율로 락 쏘아 맞히고 형광 현미경(Nikon E6100) 상에서 화상화했다.
독소루비신은, 형광(예/전각 590분의 470)이다. 미처리의 대조 조직은, 독소루비신으로부터의 형광 시그널은 웰 조직 자기 형광을 넘고 있던 것을 확인하기 위해서 화상화했다. 마셔2-3화상이 전체 조직 표면을 관찰하기 위해서 필요했어로, 저배율은, 조직의 대부분을 포획 했다. 화상은, 형광 시그널의 주위에 관심의 경계 영역을 묘화 하기 위해서 「반응을 일으키는 최소의 물리량화」해, 그 다음에 피복 면적은, ImageJ 소프트웨어를 이용해 정량 했다. 평균 피복율은, 각각의 마우스에 대해 결정해, 이러한 값은, n = 5마리의 마우스의 군에 걸쳐서 평균했다.
에 의한 즉시 유체 흡수 다이내믹스 MPP의 분포를 수중에 넣으려면 , 등 침투압(PBS) 또는 저침투압(초순수한 물) 중 어느 하나의 항에의 20μl MPP액을 질내 투여했다. 용액의 것보다 높은 양은, 루멘이 유체로 채워질 매트를 확실히 지원해, 농도 구배가 마우스를 ISO 풀 런으로 마취해, 시각적으로 분명하도록, 입자는, (w / v의 0.01%)그리고 희석해, 입자의 투여의 직후에 도살했다. 질조직을 신속히 절제해, tissue - 텍 OCT 화합물로 플래시 동결했다. 횡단 절편을 라이카 CM-3050-S의 쿠라이오스탓트를 이용해 조직의 길이에 따라 다양한 점으로써 얻을 수 있던 절편의 두께는, 단전지층의 두께를 달성하기 위해서, 6미크론으로 설정했다. 그 다음에, 절편을, 세포핵을 가시화해, 입자의 형광을 지지 하기 위해서 DAPI로 늘리는 Gold 퇴색 방지 시약으로 염색했다. 섹션의 형광 화상은, 물구나무 서기락 쏘아 맞히고 형광 현미경(트이스아크시오오브자바)으로 얻을 수 있었다. 용액의 오스몰 농도를 변화시킨 MPP 분포에 대해서는, (w / v의 0.08%)의 입자 용액은, PBS 및 초순수한 물의 비를 변화시키는 것으로부터 조제했다. 마우스였다
ISO 풀 런으로 마취해, 그리고 입자 용액의 5μl를 경질적으로 투여했다. 10 분후, 조직을, 순간 동결 절편 수집, 및 유체 흡수 동태를 관찰하기 위해서 개설된 순서에 따라 염색했다. MPP질조직의 커버리지(coverage)를 정량 하기 위해서, 마우스를 ISO 풀 런으로 마취해, 그리고 나노 입자 용액의 5μl를 경질적으로 투여했다. 10분 이내에, 조직은, 절제된 긴 방향에 열어, 및 약물 분포 실험을 위해서 기재되도록, 그 다음에 평탄화했다. 대조 조직은, 형광 시그널은 웰 조직 자기 형광을 넘고 있던 것을 확인하기 위해서 화상화했다. 조직을 물구나무 서기락 쏘아 맞히고 형광 현미경(트이스아크시오오브자바)을 사용해, 1소의 배율로 화상화해, 조직 마다 8 화상이 취득되었다. 이전에 약물 분포 실험을 위해서 개설한 것처럼, 커버리지(coverage)를 정량 했다.
질내에 드러그? 앤드? 나노 입자의 지지
독소루비신 또는 초순수한 물(저침투압)(혈액에 대해서 등 침투압) 인산 완충 생리 식염수( 「PBS」)에 1 mg / ml의 농도로 용해했다. 마우스를 마취했다
전독소루비신 용액 5μl의 것의 질내 투여에 아베르틴의 복강내 주사. 마우스는 그 후, 리텐션의 측정에 영향을 주지 않는 「아웃 방울져 떨어져 "그 솔루션을 확실히 하기 위해서 10분간의 앙와 정도인 채로, 전체경질관은, 표준적인 조직배양접시에 절제해, 배치했다. 조직의 형광 화상은, Xenogen사 IVIS 스펙트럼 촬상 장치(캐리파라이후사이엔스)를 이용해 얻었다. 독소루비신소류션 형광의 잠재적인 차이를 고려하기 위해서, 등 침투압 및 저침투압의 양쪽 모두 독소루비신 용액의 바이알은, 화상에 포함되어 있었다. 2개의 용액의 강도의 비율은, 각 그룹을 위한 조직의 형광을 표준화 하기 위해서 사용했다. 단위면적 근처의 형광 카운트의 정량은 제노젠리빙이메이지 2.5 소프트웨어를 이용해 계산했다. 등 침투압 및 저침투압의 그룹의 평균치는, 등 침투압의 그룹에 표준화 했다.
적색 형광 MPP는, (w / v)의 0.2%PBS(등 침투압), 또는 초순수한 물(저침투압) 중 어느 하나의 항에에 현 흐렸다. 약물 분포 실험을 위해서, 전술과 같이 마우스에, ( 「외래」) 아베르틴의 복강내 주사( 「보행 불능」)로 마취 또는 ISO 풀 런의 흡입에 의한 언젠가에서 만났다. 등 침투압 또는 저침투압의 어느 쪽 MPP액의 5μl를 질내에 투여했다. 보행 불능 마우스에 대해 1시간, 또는 외래의 마우스에 대한 10 분후, 전체경질관을 골라내, 표준적인 조직배양사라에 들어갈 수 있었다. 형광 화상을 촬영해, 약물의 지지에 대해 기재한 것처럼 정량 했다. 전체경질관이 이미 제거되어 조직배양사라에 들어갈 수 있던 후 MPP 지지를 위한 기준점 와 해, MPP 용액 S ul의 주의 깊고 질내에 피펫팅 했다. 이 어프로치는, MPP에 사용하고 있습니다(독소루비신), 나노 입자가 조직을 관통하지 않기 때문에; 따라, 형광 시그널에 있어서의 차동조직 침투로부터의 잠재적인 영향은 없습니다. 지지는, 평균 기준 조직 신호의 백분율로 계산했다.
HSV -2 감염증의 마우스 모델
마우스는, 사용 직전에 PBS(등 침투압) 중 어느 하나의 항에에 용해한 10 mg / ml의 아시크로빌1 인산 또는 초순수한 물(저침투압)의 20μl 를 받았다. 이 약제는, 질내 HSV-2 감염증의 마우스 모델에 대해 부분적인 보호를 주는 것이 나타났다. 마우스를, 바이러스 접종전에 1분 또는 60 분의 어느쪽이든을 투여했다. 그 다음에, 마우스를, HSV-2주 G를 포함한 접종물 10μl의(ATCC＃VR-724를, 2.8×10으로 공격한 7 1 ml근처 TCIDso). 보호 연구를 위해서, HSV-2는 10 IDso를 제공하는 바텔의 배양지에서 10배에 희석해, 투여량 매트는, 전형적으로는, 대조 마우스의 85? 90%에 감염한다. 침투압 유도성 감수성 시험을 위해서, 바이러스는 IDso, 마우스의 반에 감염 용량 바텔 배양지(등 침투압) 또는 탈이온수(저침투압) 중 어느 하나의 항에로 바텔의 배양지 및 한층 더 희석한 10배 와 10배에 희석했다. 마우스는 인간의 포피 섬유싹세포(진단 하이브리드(hybrid), MRHF 로트＃440318 W) 상에서 PBS질세정을 배양하는 것으로써, 접종 후 3일 후에 감염에 대해 평가했다. 그것은 공격 후 12시간 이상을 모으고 있는 경우는, 이 모델에서는, 입력(챌린지) 바이러스는, 이미 세정액중의 검출되지 않는다.
통계
윌 코쿠 손 순위화검정은, 데이터 세트를 비교하기 위해서 사용했다. 이 시험은, Gauss의 상황으로 논파라메트릭크 보다 적절하다
분포를 가정할 수 없다. HSV-2 감염 연구를 위해서, 통계적 유의성은, 피셔의 정확 검정, 양측 분포를 사용해 결정했다.
결과
질 약물 분포에 장성의 영향
마우스가 보행 불능(1시간앙와 정도)이었을 경우에는, 질조직 면적의 불과 15%가 저침투압 용액(도 5A)으로 투여했을 경우에 88퍼센트가 덮여 있던 것에 대해, 등 침투압 용액중에서 투여된 독소루비신으로 덮여 있었다. 마우스는 조직 채취에 앞서 10분간 보행했을 경우에는 저침투압 솔루션은 면적(도 5B) 86%에 그것을 전달의에 대해, 등 침투압 솔루션은, 질의 표면적의 25%에 독소루비신을 전달했다. 등 침투압 솔루션은 유일, 따라 이것 와는 대조적으로 흑표시되어 노광되어 있지 않은 조직 와의 「스트라이프」의 패턴을 생성하는, 루멘은 아니고, 붕괴한 질벽내에 포함되는 표면을 질의 표면에 약제를 전달, 저침투압 용액을, 독소루비신을 배포한다.
질 약물 지지에 대한 장성의 영향
등 침투압 및 저침투압 독소루비신소류션
액누락의 영향을 피하기 위해서, 마취한 마우스에 질내에 투여했다. 앙와 정도에서의 10 분후, 전체의 생식기관을 골라내, 형광 이메징 와 정량적으로 분석했다. 불과 10분으로, 독소루비신의 상대적인 형광 시그널의 뒤
저침투압 용액중에서 투여하면, 등 침투압 용액(도 6)으로 투여 독소루비신의 반이었다.
질HSV-2 저장투여된 약물의 강화된 만큼 분포는, 짧은 시간에 시험한 감염증 와 어떻게, 보다 긴 시간에 감소해 지지가 경질투여된 약물의 유효성에 영향을 주는 것 방지에 관한 장성의 효과. 아시크로빌 일 인산(ACVp), 그것은 아마 개선된 만큼 분포의 어떠한 이익을 분명히 하기 때문에 30분 질HSV-2 감염증의 마우스 모델에 대해 바이러스 접종의 전에 사용한 투여했을 경우에 부분적인 보호를 제공해 적당히 보호약. 독소루비신 와 같이, ACVp는 수용성이며, 세포내에서 작용. 우선, 등 장성 또는 저장성 중 어느 하나의 항에의 용액중에 현 흐리게 한(통상은 마우스의 50%에 감염한다) 저장액이 바이러스의 ID50 용량을 투여하는 것에 의해, 감염에 대한 감수성을 증가시키지 않았던 것을 확인했다. 바이러스는 마우스에 감염시킨(9월 15일) 60%, 등 장성 또는 저장어느 쪽 용액중에서 투여했을 경우. 이 대조 실험은, 바이러스 또는 조직의 감수성에 대한 저장성의 영향으로부터의 약제의 존재에 의하는 것은 아니고, 감염율의 변화한 것을 나타냈다. 방어 연구를 위해 IOID50, 전형적으로는 마우스의 90%에 감염하는 용량은, 사용되었다.
1%ACVp가 바이러스의 전에 1분을 투여했을 경우 ACVp가 등 장투여했을 경우, 마우스의 49%가(45분의 22) 감염시켜, 31%(45분의 14) 마우스의 ACVp가(도 7) 저장투여했을 경우에 감염시켰다. 이 결과는, 저장액이 질보호가 증가하고 있을 가능성을 시사했지만, 이 차이(p = 0.1) 통계적으로 의미가 있지 않았다. 1%ACVp가 바이러스에 1시간전에 투여했을 경우 ACVp가 등 장투여했을 경우, 마우스의 45%가(60분의 27) 감염시켜, 73%(45분의 33) 마우스의 ACVp가(도 7) 저장투여했을 경우에 감염시켰다. 이 차이는, 저장성 전달은, 즉시의 보호를 개선하고 있을지도 모르지만, 표피를 통과하는 침투류는, 보호의 저하로 연결되는 질로부터 ACVp를 제거 하도록 보인 것을 시사해, 통계적으로 의미가 있었다.
질 나노 입자 분포에 대하여 침투적으로 구동되는 대류의 영향
유리 약물의 저장성 전달은, 질관에서의 개선된 분포로 연결되었지만, 유체의 침투압 야기 흡수는, 질표피는, 용제, 드러그 하는 것에 의해 제거하는 것이 투과 되고 있는 약을 일으킬 가능성이 있습니다. 이것 와는 대조적으로, 질표피는에 대해서 본질적으로 불투과성이다
나노 입자, 및, 그것들은 점액 관통이면, 침투류는 표피 표면에 전달합니다. 저장액으로 전달된 후, 10분 이내에 질점액, 코트 전체를 질의 표면을 관통할 수가 있는 MPP,. 저장액으로 전달해도, 점막 부착성 나노 입자(CP) 내 강의 점액층안의 골재 와는, 침투적으로 유발되는 대류에 의해 질표피에 질점막을 개입시켜 수송되고 있지 않습니다. 정권이 결정된 직후에 MPP의 침투압 구동 분포의 장성에의 의존. 질을 동결하는 것으로써,
즉시 MPP 투여 후의 조직은, 한편이 초기의 입자 분포 다이내믹스의 「snapshot」를 취득할 수가 있었다.
MPP는, 등장용액으로 투여했을 경우에는, 나노 입자는, 내강전체에 분포했지만, 저장액에 전달되었을 경우, 입자 농도의 구배는, MPP는 질표피의 표면에 집중하는 것으로, 분명함 것을 알았다. MPP의 표면 분포로부터, 저장유발되는 유체의 흐름이 급속히 표피를 횡단해 흡수하지 않고, 질의 표면에 그려져 있는 MPP를 가져왔던 것은 분명하다.
질나노 입자 지지에 대한 장성의 영향
이것은, 저장액에 투여된 유리굴와는 대조적으로, MPP의 질지지는 저장전달에 개선할 것이다, 와 말하는 가설을 세울 수 있었다. 그것은, 유체 누락이 나노 입자의 지지에 역할을 완수하는 것이 예상되었으므로, 보행 불능 및 보행 양쪽 모두의 조건을 비교했다. 보행 불능 마우스(앙와 정도로 1시간)의 경우, MPP 69%의 등장용액으로 투여해, 저장액으로 투여 MPP의 83%(도 8 A)에 지지 되었다. 이것은, 누락을 저감 하는, 유체의 흡수 및 제거 중력의 영향을 위해서 허가된 1시간의 기간 와 생각된다. 저장액으로 투여했을 경우, MPP의 것보다 높은 비율이 유지되었지만, 그 차이는 통계적으로 의미가 있지 않았다.
마우스가 보행 가능했을 때 그러나, 등장용액으로 투여 MPP의 지지의 의미가 있는 감소가 있었다. 보행의 10 분후, 등장용액으로 투여 MPP의 불과 22%는, 저장액(도 8 B)으로 투여 MPP의 75%와 비교해 지지 되었다. 이것은, 질의 표면에의 MPP의 신속한 전달이 급속히 보행중에 배출되어 질내의 유체가 많고 이래 지지의 증가로 연결되었다고 생각된다..
질나노 입자 분포에 침투압의 영향
이것은 자주(잘) 장성을 강하게 세포에 영향을 줄 수가 있는 것이 알려져 있어 최근의 증거는, 특별히 반복해 폭로해, 양쪽 모두의 질 와 직장 표피에 강하고 고장겔의 독성을 강조하고 있습니다. 저장용액은 또, 독성을 일으키는 일이 있습니다. 잠재적인 독성 작용을 피하기 위해서는, 저장성의 소극적인 레벨은 아직 입자를 개선할 가능성이 있을지 어떨지를 조사했다
질내에 분포. 정권의 10분 이내에, 10배의 범위(20에서 220 오스몰/ kg)를 커버하는 저장용액중에서의 MPP)는 질의 표면에, MPP를 달성했습니다. 몇개의 표피 표면에 그려져 있으면 질중강전체에 분산 MPP 입자를 남긴 등장용액(294 미리오스몰/ kg)의것 과는 대조적으로, 소극적으로 저장액(220 미리오스몰/ kg)은, 표피 표면에의 신속한 수송을 일으켰다. 또, 증가하는 저장성 와 증가질 보도하는 경향이 있었던：질의 표면의 불과 60%가 MPP로 코팅 한 것에 대해, 가장 저장액(20 미리오스몰/ kg)의 것에서는, MPP는, 10 분후에 질표피의 88%를 피복 한 294 오스몰/ kg의 용액(도 9)으로 투여. 시험한 모든 tonicities에서는, MPP는, 점막 부착(CP) 입자보다 표피 표면의 것보다 큰 비율에 이르러, 최소한의 저장액(220 미리오스몰/ kg)을 60와 비교해, 질의 표면의 76%에 큰폭으로 증가한 입자를 납입 등장용액(294 미리오스몰/ kg)의 중량%를 커버.
결론 와 해, 질에의 대류 증가 약물 전달을 위한 저장용액의 사용을 조사하는 연구는, 독소루비신의 저장전달질분포를 개선했지만, 약물이 질지지력을 저감 하는 것, 표피를 개입시켜 흡수된 것을 나타냈다. 대조적으로, mucoinert 점액 침투 nanopaiticles(MPP)의 저장전달이 분포 및 지지의 양쪽 모두를 개선하는 것이 찾아내졌다. 또, 매트가 있어도 최저한의 저장전달이 의미가 있게 MPP의 질의 분포를 개선 찾아내졌다. 결과는, 저장성 처방물은, 종래의 고장제재보다 질에의 약물 전달을 위한 보다 효과적인 것을 나타내, MPP는, 저장전달함전체질표면에 비독성의 지속 약물 전달을 위한 중요한 약속을 제공한다.
저장액중의 약물의 분포가 개선되었지만, 유체 흡수는, 잠재적으로 질표피를 통과하는 유체 수송에 의한 약물의 신속한 제거로 연결될 가능성이 있습니다. 아시크로빌1 인산(ACVp), 경질HS V-2 바이러스의 직전에 투여한 저장액중 ACVp에 의한 개선된 보호의 경향을 사용하는 것을 실증 했다. 개선된 보호는, 저장액에 투여된 약제에 의한 질보도의 증가에 의할 가능성이 높다. 이것 와는 대조적으로, HSV-2는, 1시간 후에 약제를 투여했을 경우, 저장액으로 투여 ACVp에 의한 보호가 큰폭으로 등장용액에 ACVp 와 비교해 감소했다. 침투압 유도된 유체의 흐름을 가지는 표피를 통과 약물 흡수는, 약물 클리어 랑스로 연결되었고, 1시간 후에 보호를 감소시켰다. MPP는, 나노 입자가 질표피의 표면에 축적하므로, 저장전달에 의해, 약제의 개선된 만큼 분포를 달성하기 위한 방법을 제공해, 사전의 HSV-2 바이러스에 질 30분 투여했을 경우에 ACVp를 포함한 MPP는, 유리 약물의 10배 높은 농도보다 뛰어난 보호를 실증 했다. 최소한의 저장액으로 투여했을 경우, MPP는 곧바로 질표피에 그려져 있습니다.
유체의 흡수 및 분비도 질의 지지에 영향을 줄 수가 있다. 이것은, 이전에 실증 된 그 질겔의 누락율이 고침투압의 증가 와 와도에 직선적으로 증가해, 사람(더 실 인등.
피임 68, 139에서 155(2003)). 미스의 경우에, 지지는, 제품의 누락으로 연결되는 침투압적으로 유도되는 체액 분비 감소했다. 이것은 저장제품은 액체 흡수 와 저하해, 누락의 원인 와 되는 것을 나타내, 거기에 따라 질의 지지를 향상하는 일이 있습니다. 그것은 사질표피를 통해 흡수할 수가 있어 이것은, MPP 와는 달라, 약제이기 때문에 반드시 진이 아니었습니다 매트를, 발견되었다. MPP, 깊은 질벽으로 보다 천천히 클리어 점액층에 침투하는 것으로, 보다 길고 지지 됩니다
점막 부착성, CP. 이 연구로 나타나도록, 질의 누락을 저감 하는 것으로써, 등장용액중의 투여 와 비교해 저장액으로 투여했을 경우, MPP 보다 좋은 보행 마우스의 질관내에 지지 된다. 결과는, MPP를 포함한 저장성 겔 제재는, 아마 인간의 질내에 약물의 분포 및 지지의 양쪽 모두를 높일 일을 나타내고 있다.
실시예 9： Colon 의 입자 흡수에 미치는 침투압의 영향의 비교
재료와 방법
장성을 변화시켜 용액중의 마우스 결장에 있어서의 MPP의 분포를 비교예 7,9로 설명한 것처럼 연구를 실시했다.
20 오스몰, 260 미리오스몰 와 결장에서의 연구 와 비교해 입자의 수중에 넣어, 350 오스몰, 450 오스몰, 860 mOsm로, 2200 mOsm로 솔루션을 제공하고 있다. 유일한 이유 하나는 표피에 이류수송을 얻을 수 있다
그것들을 Na 와 고침투압성이었을 경우에 고침투압성의 용액이다.
직장 후의 CP 와 MPP의 다양한 사이즈의 분포
T BS-유발성 대장염을 가지는 마우스에 동시 투여도 측정했다. CP(빨강) 와 다양한 크기의 MPP(초록)(100나노미터, 200나노미터, 500나노미터)의 혼합물을 함유 하는 용액의 저장직장 투여 후의 평탄화 결장 조직의 형광 화상을 분석했다.
200 nm의 CP 및 MPP의 횡단 결장 동결 절편(DAPI로 청색에 염색 세포핵)도 조제했다.
결과
구두점의 효과적인 침투압은 혈장 침투압(-300오스몰/ kg) 위에, 400에서 530 오스몰/ kg의 사이인 것처럼 생각된다. 이 높은 범위는 Billich 와 레비탄, J임상 투자, (1969)에 의해 서포트되고 있습니다. 이하에 400 오스몰/ kg이며, 침투압을 가지는 수송체는, 결장 조직면에서의 MPP의 개선된 만큼 분포를 제공한다..
실시예 10： 저침투압 MPP 의 독성의 결정
제형
최근의 연구에서는, 특정의 질의 제품에 대응해, 질표피는, 성감염증에의 감수성을 높일 수가 있는 면역 메디에이타를 분비할 수가 있는 것을 나타내고 있다. 또, 그러한 조기 분만과 같은 다른 조건은, 관련지을 수 있고 있는 것이 확립되어 있다
생식관의 염증. 따라서, 질의 제품은, 특히 반복 투여 후, 그러한 면역 응답을 유도하지 않는 것이 중요하다. 고침투압성 제재는, 이전에 투여된 약물의 보호나 치료상의 유익성을 지울 수가 있어 질 와 직장의 표피에의 같은 독성이 실증 되고 있다. 따라서, 이 연구는, 점막 표피에 투여했을 경우 고침투압성 제재는 독성을 일으키지 않는 것을 보증하기 위해서 실시했다.
재료와 방법
순수하게 저장성(~20 미리오스몰/ kg)의 유체 와 세븐 매일의 트리트먼트
표준등 침투압(심성암 F127나의 MPP를 옮긴다)
히드록시 에틸 셀룰로오스는, 무치료고장겔 와 비교했다
(임상시험으로 사용되는 비히크루를 함유 하는 20%글리세롤). 저장성 겔 제재(HEC는, 20%글리세롤을 함유 하는 종래의 고장의 겔 제재 와 비교한 MPP를 포함한(20%증가한 물함유량을 가지는 HEC 겔은 물의 흡수를 상쇄한다), 표준 글리세롤
질 단면에 기초하여, 질겔 제재를 위해서 사용되는 농도).
각 시험 약제의 20μl를 7일간 1일1회 DP마우스 모델에 질내에 투여했다. HEC 겔 및 N9는, TFV 수송체 겔은 친절하게 C. Dezzutti(피츠버그 대학)에 의해 제공되었다. 8 일째에, 각 마우스를 PBS50μL의 것으로 2회 lavaged. 각 세정액샘플은, PBS의 추가의 200μL의 희석해, 점액마개를 제거하기 위해서 원심분리했다.
상청(200μL의 것)을 제거해, 스프릿트 SOμl 에, 4의 각각 붙어, (IL-Ιβ, IL-라, TNF-α, 및 IL-6)의 Quantikine ELISA 킷(R＆D Systems)을 했다. ELISA를, 제조업자의 지시에 따라 실시했다.
결과
(프르로닉크 F127 또는 MPP를 옮긴다) 순수하게 저장성(~20 미리오스몰/ kg)로 유체 및 표준등 침투압을 가지는 7개의 일일 처치
히드록시 에틸 셀룰로오스는, 원인 와 되는 무치료고장겔(임상시험으로 사용 20%글리세롤을 포함한 수송체)에 비해, 질의 사이트 카인의 증가(IL-1 알파/베타)는, 이러한 질의 사이트 카인의 의미가 있는 증가를 일으키지 않았다. MPP를 포함한 저장성 겔 제재는, 질crosssectional 화상 에 기초하여, 종래의 고장성 겔 제재 와 비교했다. 이것은,-20 6 h는 고장 와 비교해 저장성(81%, 6시간 후에 지지) 겔(20%의 HEC 겔은 물의 흡수를 상쇄하기 위해서 함수량을 증가시키고)(개선된 후 MPP의 질의 분포 및 지지의 것인가와 같이 보이는 6시간 후에 지지%), 20%글리세롤, 표준의 글리세롤을 함유 하는 겔 제재(HEC질겔 제재를 위해서 사용되는 농도).

Claims (20)

  1. 점막 침투성 입자를 포함하는 저장성 제형이고, 상기 입자는 점막 조직에 투여를 위하여 점막 침투성을 강화한 코팅 및 치료, 예방, 진단 또는 영양보급제를 포함하고, 상기 제형은 전달되는 상피 조직의 저장성으로 되어, 점액 팀투 나노입자를 상피 표면으로 신속하게 전달함으로써 상피 조직에 물 흡수를 야기하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 점막 침투성 입자는 고분자 나노 입자를 포함하고, 상기 고분자 나노 입자는 코어 폴리머, 표면에 점막 침투성 강화 코팅를 포함하고, 상기 나노 입자는 점막 조직으로의 투여를 위하여 치료, 예방, 진단 또는 영양보급제를 함유하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 점막 침투성 강화 코팅은 상기 코어 폴리머에 공유결합으로 결합되고, 상기 코어 폴리머는 하나 또는 하나 이상의 표면개질제 블록을 함유하거나, 상기 코어 폴리머는 코어 폴리의 한쪽 말단에서 공유결합되는 점막 침투성 강화 코팅 물질의 단일 블록을 포함하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노 입자는 점막 침투성 강화 코팅으로 코팅된 점막 조직에 투여를 위한 치료, 예방, 진단 또는 영영보급제의 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 점막 침투성 강화 코팅물질은 폴리에틸렌글리콜 도는 폴리에틸렌옥사이드의 블록공중합체인 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 1kD 내지 100kD이고, 상기 폴리에틸렌글리콜의 밀도는 HNMR로 측정하였을 때, 0.05 내지 0.5사슬/nm2인 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  7. 제1항 내지 제6항에 있어서,
    상기 점막 침투성 강화 코팅은 중성 또는 기본적으로 중성의 입자 표면전하를 만들기 위한 유효량이 존재하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  8. 제1항 내지 제7항에 있어서,
    상기 저장성 제형은 질에 적용을 위하여 20 내지 200mOsm/kg사이의 삼투압농도를 가지는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 점막 침투성 나노입자는 질내의 전달을 위한 유효량의 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  10. 제1항 내지 제7항에 있어서,
    상기 저장성 제형은 직장 또는 결장에 적용을 위하여, 20 mOsm/kg 내지 450 mOsm/kg 사이의 삼투압농도를 가지고, 소디움 이온(Na+)은 220 mOsm/kg을 초과하는 삼투압 농도의 적어도 30%를 포함하는 것(예, 제형의 삼투압 농도가 450 mOsm/kg이면, Na+ 이온은 450-220=230의 적어도 30%, 또는 69 mOsm/kg를 포함하여야 하는 것)을 특징으로 하는 저장성 제형.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 점막 침투성 나노입자는 결장 및/또는 직장에 투여를 위한 유효량의 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 저장성 제형은 솔루션, 현탁액, 겔, 연고, 크림, 로션, 정제 또는 캡슐 및 파우더로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 저장성 제형.
  13. 하나 또는 하나 이상의 치료 및/또는 진단제를 인간 또는 동일에 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항의 제형의 유효양을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 장(腸)에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 눈 또는 눈의 인접조직에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 국부적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 눈 또는 눈의 콤파트먼트(compartment)에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 폐의 기도 또는 비강(鼻腔)내에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 직장 또는 결장에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 제형은 구강, 혀밑 또는 경구에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020147023088A 2012-01-19 2013-01-21 점액 침투 강화를 나타내는 나노 입자 제형 KR101811917B1 (ko)

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