JP2018533579A - 高分子量かつ密な被覆を有する粘液浸透粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2015年10月30日に出願された米国仮出願第62/248,432号(その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
この発明は、National Institutes of Healthによる契約R01HD062844、5R21/R33AI079740、5R21/R33AI094519およびU19AI133127の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
生分解性ナノ粒子を介する治療剤の限局性送達はしばしば、低下した全身性副作用および標的部位での制御された薬物送達を含め、全身薬物投与を超える利点を提供する。しかし、粘膜表面での制御された薬物送達は、一般に、防御的な粘液層の存在によって制限される。
粘液浸透粒子(MPP)は、1もしくはこれより多くのコアポリマー、1もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および/もしくは診断剤;ならびに1もしくはこれより多くの表面改変剤(surface modifying agent)を含む。上記表面改変剤は、表面改変されていない同等のナノ粒子と比較して、粘液を通る改変されたナノ粒子の拡散を増強するために十分な密度で粒子の表面を被覆する。ナノ粒子は、上記ナノ粒子をエキソビボおよびインビボで粘液を通って迅速に拡散させるために、10,000ダルトン〜40,000ダルトンもしくはこれより大きい分子量を有するポリ(エチレングリコール)(PEG)で十分密に被覆され得る。
Γ/SA=表面充填密度
ここでΓは、粒子表面上のPEGコンホメーションが非拘束であると仮定して、PEG分子によって提供され得る全表面積被覆度(total surface area coverage)であり、SAは、ナノ粒子の全表面積である。PEGが上記表面改変剤である場合、MPPは、1.5もしくはこれより大きい表面充填密度で被覆される。いくつかの実施形態において、上記表面改変剤は、MPPの表面電荷を生理学的流体中で中性または本質的に中性にするために有効な量で存在する。例えば、いくつかの実施形態において、上記ナノ粒子は、約−10mV〜10mV(両端を含む)の間、好ましくは約−5mV〜5mV(両端を含む)の間、最も好ましくは約−2mV〜2mV(両端を含む)の間のゼータ電位を有する。
I.定義
用語「ナノ粒子(nanoparticle)」とは、一般に、約1nmから約1ミクロンまで(しかし1ミクロンを含まない)、より好ましくは約5nm〜約500nm、最も好ましくは約5nm〜約100nmの直径を有する任意の形状の粒子をいう。球形を有するナノ粒子は、一般に、「ナノスフェア(nanosphere)」といわれる。
粘膜表面への薬物の制御された送達は、防御的な粘液層の存在が原因で難問である。粘液浸透粒子(MPP)は、表面密度が十分に高い場合には、5kDを超える分子量を有する親水性ポリマーで粒子を被覆することが可能であるという発見に基づいて、改善された薬物分布、粘膜表面での保持および効力を示す。
生体適合性ポリマーの任意の数が、ナノ粒子を調製するために使用され得る。一実施形態において、生体適合性ポリマーは、生分解性である。別の実施形態において、上記粒子は、非分解性である。他の実施形態において、粒子は、分解性および非分解性の粒子の混合物である。
カルボン酸のカルボキシル末端は、ポリマー(例えば、ラクチド含有およびグリコリド含有ポリマー)を含み、例えば、エステル化によって、必要に応じてキャップされてもよく、ヒドロキシル末端は、例えば、エーテル化もしくはエステル化によって、必要に応じてキャップされてもよい。
ナノ粒子は、好ましくは、1もしくはこれより多くの表面変質剤または表面変質物質で被覆されるか、またはその表面で形成される。用語「表面変質剤(surface altering agent)」とは、表面に関して粒子の1もしくはこれより多くの特性を改変する(親水性(例えば、粒子の親水性を高くするかもしくは低くする)、表面電荷(例えば、表面を中性もしくはほぼ中性に、またはより負にもしくはより正にする)が挙げられるが、これらに限定されない)、ならびに/または体液および/もしくは組織(例えば、粘液)中のもしくはこれらを通る輸送を増強する薬剤または物質に言及する。最も好ましい物質は、ポリアルキレンオキシド(例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG))である。
pp. 18-31)、水性および有機媒体中での溶解度、毒性がない、非常に低い免
疫原性および抗原性(Dreborgら, Crit Rev Ther Drug C
arrier Syst, 1990, 315-65)、ならびに良好な排出動態(Yamaokaら,J Pharm Sci, 1994, 83:601-6)を有する直
線状のポリエーテルジオールである。例えば、ポリ−(エチレングリコール)は、治療用タンパク質およびペプチドを誘導体化し、薬物安定性および溶解度を増大させ、毒性を低下させ、半減期を増大させ(Calicetiら,Adv Drug Del Rev
, 2003, 55, 1261-77)、クリアランスおよび免疫原性を低減するために使用されてきた。これらの利益は、誘導体化において分枝状PEGを使用して特に観察されてきた(Monfardiniら,Bioconj Chem, 1998, 9,
418-50)。
たはポリエチレンオキシドのブロック(PLURONIC(登録商標))、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキシドのブロックコポリマーで末端形成され得る。
表面変質剤の密度は、ナノ粒子が粘液に浸透する能力を決定するにあたって鍵となるパラメーターであり、粘膜上皮への活性薬剤のインビボでの成功裡の送達に影響を与える。
えば、広く使用されるポリ(乳酸−co−グリコール酸)−ポリ(エチレングリコール)(PLGA−PEG)およびポリ(乳酸)−ポリ(エチレングリコール)(PLA−PEG))から調製される生体分解性ナノ粒子上のPEG密度を決定するために適していない。
(Γ/SA)=充填密度
空間の量の増大にあるとされ得る;例えば、1つの非拘束5kDa PEG鎖によって占有される面積は、非拘束40kDa PEG分子の約180nm2と比較すると、約23nm2である。
粘液浸透ナノ粒子(MPP)は、粘膜表面への送達のために、1もしくはこれより多くの活性薬剤とともに製剤化され得る。代表的には、MPPは、1もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、栄養補助剤および/または診断剤を含む。
この目的のために有用な薬剤としては、蛍光タグ、放射性核種および造影剤が挙げられる。
粒子サイズ、ゼータ電位(ζ電位)、PEG表面密度(PEGによって網羅される面積/全表面積、またはΓ/SA)は、ナノ粒子が粘液の中で動きかつ粘液を通って浸透する能力に影響を与え得る全ての要因である。粘液中の集団平均MSD(<MSD>)と水中での類似のサイズにした粒子の理論的MSD(MSDw)との比較は、粘液中でのナノ粒子の動きがどの程度遅いかを示すために使用され得る(MSDw/<MSD>)。
それらの粘液を通じての拡散を促進するために、ナノ粒子は、代表的には、中性に近い表面電荷を有する。ある特定の実施形態において、ナノ粒子は、約10mV〜約−10mV(両端を含む)の間、好ましくは約5mV〜約−5mVの間、より好ましくは約3mV〜約−3mVの間、最も好ましくは約2mV〜約−2mVの間のζ電位を有する。
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子(MPP)は、身体上もしくは身体中
への投与のために薬学的に受容可能な組成物へと製剤化される。
粒子は、薬学的に受容可能な製剤において投与され得る(例えば、滅菌食塩水、リン酸緩衝化食塩水または取り込みを増強する低張性溶液)。いくつかの実施形態において、その薬学的キャリアは、ある特定の所望の張度を有するように調節される。例えば、ある特定の実施形態において、その薬学的キャリアは、低張性になるように調節される。当業者は、処置されるべき所望の組織が一旦同定されれば、本明細書で記載される好ましい張度範囲に基づいて、薬学的キャリアの張度を慣用的に調節し得る。
Glycerin. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical
Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 301−303; Price JC. Glycerin. In: Rowe RC,
Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 301−303; Armstrong NA. Mannitol. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen
SC, eds. Handbook of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American
Pharmaceutical Association; 2005: 449−453; Owen SC. Sodium Chloride. In: Rowe RC, Sheskey PJ and Owen SC, eds. Handbook
of Pharmaceutical Excipients. 5th ed. Washington DC: American Pharmaceutical Association; 2005: 671−674。マンニトールは、欧州において食品添加物としての使用に関して認められたGRASとして列挙された成分の例であり、FDA Inactive ingredients Database(IP、IM、IV、およびSC注射;注入;口内錠、経口錠剤および舌下錠、散剤およびカプセル剤;眼用調製物;局所液剤)の中に含まれ、英国において認可された非経口でない(non−parenteral)および非経口医薬の中に含まれ、Canadian Natura
l Health Products Ingredients Databaseの中に含まれる。5.07% w/v 水性溶液は、血清と等張性である。
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子(MPP)は、肺投与のために製剤化される。乾燥散剤および液体製剤の両方が、エアロゾル製剤を形成するために使用され得る。用語エアロゾルは、本明細書で使用される場合、粒子の微細な霧の任意の調製物に言及し、その粒子は、噴霧体を使用して生成されようがそうでなかろうが、液剤もしくは懸濁物中にあり得る。乾燥粉末製剤は、空気もしくは適切な噴霧体以外は、いかなるキャリアの利益がなくても患者に肺吸入を介して投与され得る。
device)が挙げられるが、これらに限定されない。吸入は、患者の鼻および/または口腔を通じて起こり得る。投与は、吸入する間の製剤の自己投与によって、または人工呼吸器に繋がれた患者への人工呼吸器を介する製剤の投与によって、起こり得る。
ある特定の実施形態において、粘液浸透ナノ粒子(MPP)を、眼の粘膜表面への投与のために製剤化する。局所または経腸製剤は、当該分野で公知の技術を使用して、水性組成物として調製され得る。代表的には、このような組成物は、液剤もしくは懸濁物;注射前に再構成媒体の添加に際して液剤または懸濁物を調製するために使用するために適した固体形態;エマルジョン(例えば、油中水型(w/o)エマルジョン、水中油型(o/w)エマルジョン、およびこれらのマイクロエマルジョン)、リポソーム、エマルソーム、スプレー、ゲル、クリーム剤、または軟膏剤として調製され得る
)が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例としては、エチレングリコールモノステアレート、プロピレングリコールミリステート、グリセリルモノステアレート、グリセリルステアレート、ポリグリセリル−4−オレエート、アシル化ソルビタン(sorbitan acylate)、アシル化スクロース(sucrose acylate)、PEG−150ラウレート、PEG−400モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、PEG−1000セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Poloxamer(登録商標) 401、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、およびポリオキシエチレン水素化獣脂アミドが挙げられる。両性界面活性剤の例としては、N−ドデシル−β−アラニンナトリウム、N−ラウリル−β−イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンホアセテート、ラルリルベタインおよびラウリルスルホベタインが挙げられる。
ために必要な有効量の緩衝液で緩衝化され得る。有用な緩衝液の例は、アセテート、ボレート、カーボネート、シトレートよびホスフェート緩衝液である。眼投与のための液剤、懸濁物、またはエマルジョンはまた、適度に低張性の範囲にあるように、製剤の張度を調節するために、1もしくはこれより多くの張度剤(tonicity agent)を含み得る。適切な張度剤は、当該分野で周知であり、いくつかの例としては、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、および他の電解質が挙げられる。
に種々の極性化合物。適切な乳化剤としては、以下が挙げられる:アカシア、アニオン性乳化ワックス、ステアリン酸カルシウム、カルボマー、セトステアロイルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ジエタノールアミン、エチレングリコールパルミトステアレート、グリセリンモノステアレート、グリセリルモノオレエート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ラノリン、含水、ラノリンアルコール、レシチン、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース、鉱油およびラノリンアルコール、一塩基性リン酸ナトリウム、モノエタノールアミン、非イオン性乳化ワックス、オレイン酸、ポロキサマー、ポロキサマー類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、プロピレングリコールアルギネート、自己乳化グリセリルモノステアレート、クエン酸ナトリウム無水物(sodium citrate dehydrate)、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ひまわり油、トラガカント、トリエタノールアミン、キサンタンガムおよびこれらの組み合わせ。一実施形態において、乳化剤は、グリセロールステアレートである。
れる。油相は、他の油性の薬学的に承認された賦形剤を含み得る。例えば、ヒドロキシル化ヒマシ油またはゴマ油のような物質が、界面活性剤または乳化剤として油相において使用され得る。
モポリマーおよびコポリマー;ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。液体ビヒクル中の適切な溶媒としては、ジグリコールモノエチルエーテル;アルキレングリコール(alklene glycol)(例えば、プロピレングリコール);ジメチルイソソルビド;アルコール(例えば、イソプロピルアルコールおよびエタノール)が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、代表的には、薬物を溶解するその能力に関して選択される。他の添加剤(これは皮膚の感触および/または製剤の軟化性を改善する)がまた、組みこまれ得る。このような添加剤の例としては、イソプロピルミリステート、酢酸エチル、C12−C15アルキルベンゾエート、鉱油、スクアラン、シクロメチコン、カプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、粘液浸透ナノ粒子は、経腸投与のために製剤化される。適切な経口剤形としては、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁物、シロップ剤、およびロゼンジが挙げられる。錠剤は、当該分野で周知の圧縮または成形技術を使用して作製され得る。ゼラチンまたは非ゼラチンのカプセル剤が、硬質または軟質のカプセルシェルとして調製され得、これらは、液体、固体、および半固体の充填材料を、当該分野で周知の技術を使用して被包し得る。製剤は、1もしくはこれより多くの薬学的に受容可能な賦形剤(希釈剤、保存剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、膨潤剤、充填剤、安定化剤、およびこれらの組み合わせが挙げられる)を使用して調製され得る。
ence and practice of pharmacy」, 第20版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2000、および「Pharmaceutical dosage forms
and drug delivery systems」, 第6版, Anselら, (Media, PA: Williams and Wilkins, 1995)のような標準的な参考文献中で記載されるように調製され得る。これらの参考文献は、錠剤およびカプセル剤、ならびに錠剤、カプセル剤および顆粒剤の放出遅延剤形を調製するための賦形剤、材料、装置およびプロセスに関する情報を提供する。
限定されない。
ナノ粒子を作製するための技術は、当該分野で公知であり、溶媒エバポレーション、溶媒除去、噴霧乾燥、相反転(phase inversion)、低温注型、およびナノ沈殿(例えば、WO/2013/110028に記載されるとおり)が挙げられるが、これらに限定されない。
高分子量ポリ(エチレン)グリコールで密に被覆されたナノ粒子は被験体への治療剤、予防剤、栄養補助剤および/または診断剤の送達のために粘液に浸透し得ることが確証された。
胞または組織と同じ組織に由来する。いくつかの実施形態において、非処置コントロール被験体は、処置される被験体と同じ疾患もしくは状態に罹患しているか、またはその疾患もしくは状態に由来するリスクがある。例えば、いくつかの実施形態において、非処置コントロール被験体は、MPPによって与えられる望ましい治療効果、予防効果もしくは診断効果を受けていない。
材料および方法
ナノ粒子(NP)被覆法
ナノ粒子を、10mM NaCl溶液中に懸濁し、サイズおよびζ電位に関して、Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments)を使用して、それぞれ、動的光散乱(DLS)およびレーザードプラ流速計で特徴付けした。DLSを90°散乱角で行い、全ての測定値を、機器設定に従って25℃で取得した。
PSナノ粒子(PS NP)の表面への10kD PEGのグラフト(grafting)において、MESおよびボレート緩衝液の反応緩衝液を比較した。MES法を使用して10kDa PEGで被覆されたPS NP(PS−PEGMES、220±10nm;−12±0.4mV)は、CVM中で接着して固定化された;PS−PEGMES NPの集団平均二乗変位量(<MSD>)は、水中での類似のサイズにしたナノ粒子の理論的拡散速度と比較して、粘液中で>10,000倍遅かった(表1)。対照的に、ボレート法を使用して10kDa PEGで被覆された同じPS NP(PS−PEGボレート、260±7nm;−0.7±0.5mV)は、CVMに迅速に拡散した。PS−PEGボレート NPの集団平均二乗変位量<MSD>は、水中でのそれらの理論的拡散速度、MSDwと比較して、CVM中で11倍遅かった過ぎず(表1、図1)、非被覆PS NP(180±1nm;−59±2mV)またはPS−PEGMES(図1、表1)のいずれかより約1,000倍高かった。PS−PEGMES NPに関する<MSD>(図1
)および個々のMSD値の対数分布(図2A、図2B)は、本発明者らが以前報告した(Wangら, Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47,
9726−9729)ように、非被覆PSナノ粒子と同様であった。PS−PEGボレート NPに関する個々のMSD値の対数分布は、非被覆PSナノ粒子およびPS−PEGMES NPより遙かに大きかった(図2C)。CVM中での3秒間の動きを代表するナノ粒子軌跡は、移動挙動における差異をさらに強調する。なぜならPS−PEGボレート NPの運動は、拡散運動を反映した一方で、PSおよびPS−PEGMES NPの軌跡は、高度に拘束されたからである(図3A〜3C)。
材料および方法
PEG表面密度の測定
Release, 2013, 170, 279−286)。簡潔には、ナノ粒子を、重水素化クロロホルム(CDCl3, Sigma)、トリフルオロ酢酸−d(TFAd, Sigma)、および既知濃度のテトラメチルシラン(TMS, 1% w/v)中に完全に溶解した。H−NMRスペクトルを、Bruker REM400を使用して400mHzで得た。PEG密度、すなわちΓ/SAを、PEGピーク(3.6ppm)および内部標準TMSピーク(0ppm)の積分から計算した。各粒子上でPEG鎖によって占有される面積を計算するために、ランダムウォーク統計モデルを使用して、ある特定の長さのPEGによって占有される面積を見出した。これらの計算は、直径d=0.76(mb)0.5を有する球を生じる(ここでmbは、問題のPEGの分子量であり、A=π(d/2)2というPEGによって占有される面積を生じる(Boylanら, J
Control Release, 2012, 157, 72−79))。次いで、占有される面積を使用して、100nm2あたりのPEG鎖の数およびPEG鎖によって占有される面積/全粒子表面積(Γ/SA)を計算した。PEG 5kDaを、溶液中のPEG濃度を較正するために使用した。PEG表面密度計算のために、ナノ粒子の表面が滑らかでありかつそれらの直径がDLSによって測定されるものに等しいと仮定した。
PS−PEG NP上のPEG表面密度の定量化において、定量的NMR法を使用して、充填密度(Γ/SA、ここでΓは、グラフトされたPEG鎖によって網羅される非拘束表面積であり、SAは、ナノ粒子の全表面積である)に基づいてPEG鎖の物理的コンホメーションを推論した(Nanceら, Sci Transl Med, 2012,
4, 149−119; Xuら, J Control Release, 2013, 170, 279−286)。そのPS−PEGボレート NPに関するΓ/SA(1.5±0.0)は、PS−PEGMES NPに関する1.3±0.1と比較して増大した(表1)。これは、PEG鎖がPS−PEGボレート NPの表面上により密に充填されたことを示す。そのΓ/SA値は、PS−PEGMES NPに関する100nm2あたりの2.9±0.3 10kDa PEG鎖と比較して、PS−PEGボレート NPに関する100nm2あたりの3.3±0.1 10kDa PEG鎖鎖に相当する。以前に、PEG結合体化の後にナノ粒子表面上に残っている未反応カルボン酸基への蛍光色素の結合体化をともなうPEG表面密度を定量するための間接的方法が使用された(Wangら, Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47,
9726−9729)。この間接的方法において、PS NP表面上のカルボン酸基のうちのおよそ約69%が、2kDa PEGに結合体化され、PS NP表面上のカルボン酸基のうちの約65%が、10kDa PEGに結合体化された(Wangら, Angew Chem Int Ed Engl, 2008, 47, 9726−9729)。
外マトリクスを通じて効果的に浸透するために、5kDa PEGで被覆された100nm PS ナノ粒子に関して必要とされた(Nanceら, Sci Transl Med, 2012, 4, 149−119)のに対して、Γ/SA=1.7は、不十分な被覆であった。
J Control Release, 2013, 170, 279−286)。
材料および方法
ナノ粒子(NP)被覆製剤
2007, 104, 1482−1487によって記載されるとおりに調製した。簡潔には、40nm、100nmおよび200nmのカルボキシレート改変ポリスチレン(PS)ビーズを、明記された緩衝液を使用して、5kDaから40kDaまでのメトキシ−PEG−アミンで被覆した。
ヒト頸膣粘液(CVM)サンプルを、以前に記載されるとおりに得た(Laiら, Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104, 1482−1487; Boskeyら, Sex Transm Dis, 2003, 30, 107−109)。簡潔には、正常な膣微生物叢を有する女性に由来する非希釈CVMを、ジョンズホプキンス医療機関の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに従って、月経液採取デバイス(menstrual fluid collection device)での自己採取法を使用して得た。粘液サンプルを、使用前に4℃で貯蔵し、採取から4時間以内に使用した。2μLまでの粒子溶液(0.02〜0.08% w/v)を、特注のウェルの中で容積30μL CVMに添加した。ウェルを、強力接着剤を付着させたカバースリップでシールした。倒立落射蛍光顕微鏡セットアップ(Zeiss
Axio Observer)の一部としてEMCCDカメラ(Evolve 512; Photometrics)を介して、100×/1.46 NA 油浸対物レンズで動画を得た。20sにつき66.7msの時間分解能でMetamorphソフトウェア(Molecular Devices)で動画を獲得した。ナノ粒子軌跡および平均二乗変位量(MSD)を、各粒子につき追跡された最小30フレームを用いてMATLAB(Schusterら, Biomaterials 2013, 34, 3439−3446)を使用して得、MSDを、<Δr2(τ)>=[x(t+τ)−x(t)]2+[y(t+τ)−y(t)]2(τ=時間的尺度もしくはタイムラグ)として計算した(Laiら, Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104, 1482−1487; Suhら, Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57, 63−78; Dawsonら, Biotechnol Prog, 2004, 20, 851−857)。少なくとも150個の粒子を、n=
3の独立したサンプルにおいて追跡した。本発明者らの以前の研究は、静的誤差が、20nm未満であると概算され得、平均粒子変位量より遙かに小さいことを示した(Suhら, Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57, 63−78; Sukら, J Control Release, 2014, 178, 8−17)。
ボレート法を使用して5〜40kDa PEGで被覆された200nm PS NP(PS−PEG5−40kDa、最終サイズ230〜300nm、表1)は、測定された高い<MSD>値によって示されるように、 CVMに迅速に浸透できた(図4)。さらに、全PS−PEG5−40kDa NPの3秒間軌跡は、非被覆PS NPとは全く対照的に、拡散性の挙動を反映した(図5A〜5E)。PS−PEG5−40kDa NPはまた、高PEG密度、Γ/SA≧1.5を有した(表1)。100nm2あたりのPEG分子数がPEG MWが増大するにつれて低下することは明らかであった。このことは、MWが増大するにつれて各PEG鎖によって占有される空間の増大した量にあるとされ得る;1つの非拘束5kDa PEG鎖によって占有される面積は、非拘束40kDa PEG分子に関して約180nm2と比較して、約23nm2である。さらに、PEG化後のナノ粒子の流体力学的直径は、PEG MWが増大するにつれて増大した;PEG鎖の密な充填は、MW PEG鎖が大きくなるほど、より厚い冠を作り出すように、伸長を引き起こす。
材料および方法
2007, 104, 1482−1487によって記載されるとおりに調製した。簡潔には、40nm、100nmおよび200nmのカルボキシレート改変ポリスチレン(PS)ビーズを、明記された緩衝液を使用して、5kDaから40kDaまでのメトキシ−PEG−アミンで被覆した。
100nm PS NPを、ボレート法を使用して5kDa〜40kDa PEGで被覆した(PS−PEG5−40kDa、最終サイズ110〜170nm)。表1および図
6は、Γ/SA値が100nm PS−PEG5−40kDa NPに関して全て>2であり、CVMを通る迅速なNP拡散を生じたことを示す。PEG被覆ナノ粒子軌跡は、非被覆PSとは全く対照的に、拡散運動を反映した(図7A〜7E)。100nmおよび200nmのPS−PEG5−40kDa NP製剤は全て、水中でのそれらの理論的拡散速度と比較して、CVM中で<20倍遅かった(表1)。
材料および方法
48−57, Epub 2014 Nov 4)。マウスにイソフルランを使用して麻酔をかけ、DI水中0.02% w/vの100nm(腟内)または40nm(直腸内)のナノ粒子を、5μL(腟内)または20μL(直腸内)投与した(Maiselら,
J Control Release, 2015, 10, 197, 48−57, Epub 2014 Nov 4; Ensignら, Sci Transl Med, 2012, 4, 138−179; Maiselら, J Control
Release, 2015, 209, 280−287)、5〜10分後マウスを屠殺し、組織を摘出し、Tissue−Tek O.C.T. Compound中で急速凍結した。組織を、膣および結腸直腸の全長に沿って、Leica CM−3050−Sクリオスタットで6μmスライスへと切片にした。スライスを、10% ホルマリンで固定し、ProLong Gold antifade(登録商標)試薬とDAPIとを使用して染色して、核を染色し、粒子蛍光を保持した。倒立落射蛍光顕微鏡セットアップ(Zeiss Axio Observer)を使用して画像を得た。全ての実験は、ジョンズホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。
種々のMW PEG(5kDa、10kDa、20kDa、40kDa)で密に被覆されたPS−PEG NPは、被覆PS−PEG NPを含む溶液の投与から5〜10分後に得た膣および結腸直腸組織の横断低温切片において観察されるように、マウスの頸膣路および結腸直腸において均一に分布された。出願人が以前に観察した適切なサイズの投与したPS−PEG NPは、十分よくPEG化されかつ上皮による流体吸収を誘導する低張性ビヒクルにおいて投与される場合、マウス膣(約100nm)および結腸直腸(約40nm)において均一に分布する(Ensignら, Sci Transl Med,
2012, 4, 138−179; Ensignら, Biomaterials, 2013, 34, 6922−6929; Maiselら, J Control Release, 2015, 10, 197, 48−57, Epub 2014 Nov 4; Maiselら, J Control Release, 2015, 209, 280−287)。出願人の以前の観察と同様に、非被覆PS NPは、管腔粘液層において凝集したが、エキソビボ粘液サンプル中での拡散のために十分に密なPEG被覆を有する全てのPS−PEG NP製剤(PS−PEG5−40kDa)は、インビボで膣および結腸直腸上皮表面に迅速にかつ均一に輸送された。この結果は、エキソビボでの粘液中のナノ粒子の拡散が、インビボでの粘膜表面における観察された分布と十分に相関するという以前の観察と一致する。すなわち、エキソビボで粘液中に迅速/妨害されずに拡散する粒子はまた、粘膜表面にわたってはるかにより均一に分布し、次いで、これらが粘膜組織へと局所投与される場合により長く持続する。改善されたナノ粒子分布は、粘膜部位での疾患のより効果的な処置および防止(頸膣路におけるヘルペス(HSV−2)感染の防止、喘息誘導性肺炎症の防止、および子宮頚がんの処置が挙げられる(Ensignら, Sci Transl Med, 2012, 4, 138−179; Sukら, J Control Release, 2014, 178,
8−17; Yangら, Adv Healthc Mater, 2014, 3, 1044−1052; da Silvaら, J Control Release, 2014, 180, 125−133))を提供する。
Claims (16)
- 被験体において粘膜を通ってその下にある上皮へと治療剤、予防剤、もしくは診断剤を送達するための粘液浸透粒子であって、前記粘膜浸透粒子は、
前記粒子を形成する1もしくはこれより多くのコアポリマー;
1もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および/もしくは診断剤;ならびに
ポリアルキレンオキシドポリマーを含み、かつ約5kDaより大きく約100kDa(両端を含む)の、好ましくは約10kDa〜約40kDaの分子量を有する、1もしくはこれより多くの表面改変剤
を含み、ここで前記表面改変剤は、1H NMRによって測定される場合に、約0.1〜約100分子/100nm2の十分な密度において存在して、
表面改変されていない粒子と比較して、改変された前記粒子の粘膜拡散を増強する、
粘膜浸透粒子。 - 前記表面改変剤が、ポリ(エチレングリコール)、ポリエチレングリコール−ポリエチレンオキシドブロックコポリマー、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリルアミド)およびこれらのコポリマーからなる群より選択される中性ポリマーである、請求項1に記載の粘液浸透粒子。
- 1種の表面改変剤が、約5kDa〜約40kDa(両端を含む)、より好ましくは約20kDaの分子量を有するポリ(エチレングリコール)である、請求項2に記載の粘液浸透粒子。
- 前記ポリ(エチレングリコール)の表面密度が、1H NMRによって測定される場合、約0.5〜約50分子/100 nm2、より好ましくは約0.9〜約45分子/100nm2である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 前記ポリ(エチレングリコール)の表面充填密度が、以下の式:
Γ/SA=表面充填密度
の関数として測定される場合、1.5であるか、または1.5より大きく、
ここで、Γは、非拘束ポリ(エチレングリコール)によって網羅され得る全表面積であり、SAは、ナノ粒子の全表面積である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。 - 1もしくはこれより多くの表面変質物質が、前記粒子の表面電荷を、生理学的流体中で中性または本質的に中性にするために有効な量で存在する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 前記粒子が、約−10mV〜10mV(両端を含む)の間、好ましくは約−5mV〜5mV(両端を含む)の間、最も好ましくは約−2mV〜2mV(両端を含む)の間のゼータ電位を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- ポリ(カプロラクトン)、ポリヒドロキシ酸、ポリアミノ酸、ポリ無水物、およびポリオルトエステルからなる群より選択されるコアポリマーを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 前記コアポリマーが、ポリ(乳酸)、ポリ(L−乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸−co−グリコール酸)、ポリ(L−乳酸−co−グリコール酸)、ポリ(D,L−ラクチド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−カプロラクトン)、ポリ(D,L−ラクチド−co−カプロラクトン−co−グリコリド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−PEO−co−D,L−ラクチド)、およびポリ(D,L−ラクチド−co−PPO−co−D,L−ラクチド)からなる群より選択されるポリヒドロキシ酸である、請求項8に記載の粘液浸透粒子。
- 前記コアポリマーが、表面改変物質に共有結合される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 前記粒子が、約50nm〜500nm(両端を含む)の間、好ましくは約60nm〜300nm(両端を含む)の間の流体力学的直径を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 経腸投与、非経口投与、もしくは局所投与からなる群より選択される経路を介して身体中にもしくは身体上に投与するための薬学的に受容可能な賦形剤とともに製剤化される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の粘液浸透粒子。
- 1もしくはこれより多くの治療剤、予防剤、および/もしくは診断剤を必要性のある被験体に投与する方法であって、前記方法は、前記被験体に、有効量の請求項1〜12のいずれか1項に記載の粒子を投与する工程を包含する、方法。
- 前記粒子が、経腸経路、非経口経路もしくは局所経路からなる群より選択される経路を介して投与される、請求項13に記載の方法。
- 前記粒子が、腟上皮、結腸直腸路、眼上皮、気道、口腔およびこれらの組み合わせからなる群より選択される位置において粘膜上皮に投与される、請求項14に記載の方法。
- 前記粒子が、頸膣粘液、結腸直腸粘液、または上部気道もしくは下部気道における粘液へと投与される、請求項15に記載の方法。
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