KR20140136924A - 고형 배지 상에 저장된 생물학적 샘플 중의 지방산들을 안정화시키고 분석하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 킬레이트제들(예를 들어, 에틸렌디아민-테트라아세트산, 아스코르브산, 시트르산, 또는 이들의 염들), 항산화제들(예를 들어, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논)을 포함하고 고형 배지에 적용되는 지방산들을 안정화시킬 수 있는 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지(예를 들어, 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹들)를 사용하여 체액(예를 들어, 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장 및 혈청)과 같은 샘플에 존재하는 지방산들을 안정화시키는 방법, 및 이러한 배지를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 배지 상에 저장된 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

고형 배지 상에 저장된 생물학적 샘플 중의 지방산들을 안정화시키고 분석하는 방법{STABILISING AND ANALYSING FATTY ACIDS IN A BIOLOGICAL SAMPLE STORED ON SOLID MEDIA}
본 발명은 체액과 같은 샘플에 존재하는 지방산들을 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 고형 배지에 적용된 지방산들을 안정화시킬 수 있는 고형 배지, 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
오메가-3 지방산들, 특히 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)의 과량 섭취(high intake)는 성인들에서 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환들, 당뇨병들 및 관절염의 감소, 및 미숙아들에서 개선된 정신신경 발달(mental development)과 관련이 있다. 결과적으로, 전세계의 보건 당국은 현재 예를 들어 주당 2 내지 3마리의 어류를 포함하는 식사를 소비함으로써 오메가-3 지방산들의 섭취를 증가시키는 것을 권고하고 있다.
심장 보호를 위한 규정식의 오메가-3 지방산 권고는 어류 섭취를 주당 2회의 지방 어분(fatty fish meal)으로 증가시키거나 남성 및 여성에 대해 각각 600 또는 400 ㎎/일의 장쇄 오메가-3 지방산들을 소비하는 것을 포함한다. 이러한 권고들이 오메가-3 지방산의 세포 수준들을 임상 시험에서 심장보호 범위 내의 수준으로 증가시킬 것이라는 것이 알려져 있지만, 이러한 권고들이 일반 집단의 지방산 상태에 어떻게 영향을 미치는 지에 대해 거의 알려져 있지 않다. 혈액 중의 지방산 상태가 인간 집단에서 심장 위험을 평가하고 규정식의 오메가-3 지방산 공급으로부터 이점을 나타내는 이러한 개인들을 확인하기 위한 유용한 마커이기 때문에, 지방산 상태의 평가는 중요하다.
인간 장기에서 지방산 상태의 마커로서 사용되는 인간 혈액 샘플들의 지방산 프로파일링(profiling)은 규정식의 지방산 섭취와 지방산 상태 간의 관계를 이해하기 위한 중요한 툴(tool)이 되는데, 왜냐하면 혈액 수준들이 생물학적 작용들을 반영할 것으로 사료되며 혈액이 인간 연구에서 채취(collection)하기 위해 접근 가능하기 때문이다. 그러나, 혈액 중의 지방산들을 검정하기 위한 통상적인 방법들은 정맥혈 채취 및 고가의 시간 소비적 다단계 공정들을 수반하는데, 이는 스크리닝 툴(screening tool)로서의 이의 유용성을 제한한다. 이에 따라, 오메가-3 지방산의 세포 수준들을 측정하는 빠르고 저렴하고 신뢰성 있는 수단이 필요하다.
최근까지, 인간 혈액에 존재하는 오메가-3 지방산들의 수준(오메가 3 지수(Omega 3 Index)로서 공지됨)에 대한 이러한 빠르고 신뢰성 있는 시험이 이용가능하지 않았다. 수년 전에, 몇몇 회사들은, 손가락을 찌른 후에, 혈반(blood spot)을 항산화제(들)를 지니거나 지니지 않은 작은 필터 페이퍼 조각 상에 배치시키는 혈반 시험(blood spot test)을 광고하였다. 건조 후에, 필터 페이퍼는 분석을 위해 중앙 실험실(central laboratory)로 보내어진다. 혈반 중의 지방산들이 수 주 동안 안정적이며 오메가 3 지수의 신뢰성 있는 수치(reliable measure)가 얻어질 수 있다고 주장하였다. 본 발명자들은 이러한 시험들을 되풀이하는 시도를 하였고, 시간에 따라 지방산들의 상당한 분해가 일어난다는 것을 확인하였다.
이러한 한 제품으로는 혈반들에서 n-3 및 n-6 장쇄 다불포화 지방산들의 직접 평가를 위한 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에 의해 개발된 플루카 혈액 채취 키트(Fluka blood collection kit)가 있다. 실온에서 저장된 플루카 키트 페이퍼들 상에 채취된 혈반 샘플들에 대해 수행되는 단지 장시간 안정성 연구에서는 1달 후에 장쇄 다불포화 지방산 수준이 현저히 감소(전체 지방산들의 백분율로서)된다는 것을 나타내었다[Min et al . Prostaglandins , Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 2011 84, 13-18]. 이에 따라, 장쇄 다불포화 지방산들의 산화는 이러한 혈반 방법을 사용하는데 있어 비실용적이게 만드는데, 왜냐하면 결과들을 비교하는 경우에 수집 후 고정된 시간에 모든 샘플들을 분석하는 것을 필요하게 만들 것이기 때문이다.
이에 따라, 혈액의 저장 동안 지방산 분해를 최소화하거나 제거하는 혈액 중의 지방산 함량을 측정하기 위한 간단하고 빠르고 신뢰성 있는 방법이 요구되고 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 건조된 혈반 내의 지방산들이 주변 조건들에서 여러 달의 기간 동안에 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 여러 달의 기간 동안에 고형 배지 상에 저장된 혈액의 지방산 조성의 매우 정확한 측정이 지방산들을 안정화시킴으로써 그리고 고형 배지에서 오염 물질들을 조절함으로써 달성될 수 있다는 것을 추가로 발견하였다.
제1 양태에서, 본 발명은 지방산들 또는 지방산들을 포함하는 샘플을, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지에 적용하는 것을 포함하며, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 지방산들을 안정화시키는 방법을 제공한다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다.
생물학적 샘플은 체액, 예를 들어 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장, 윤활액(synovial fluid), 및 혈청 등일 수 있다.
체액은 포유류 체액일 수 있다.
샘플은 지방산들을 포함하는 유체, 예를 들어 체액일 수 있다.
지방산들은 불포화 지방산들일 수 있거나, 불포화 지방산들을 포함할 수 있다.
지방산들은 장쇄 다불포화 지방산들(LCPUFA)일 수 있거나, 장쇄 다불포화 지방산들(LCPUFA)을 포함할 수 있다.
지방산들은 오메가-3 지방산들, 예를 들어 EPA 및 DHA 등일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 지방산들을 포함하는 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법으로서,
(a) 샘플을 고체 매트릭스에 흡수시키도록, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하되, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지에 샘플을 적용하는 단계; 및
(b) 고체 매트릭스에 흡수된 샘플의 지방산 조성을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 체액, 예를 들어 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장, 윤활액, 및 혈청 등이다.
이러한 방법은 샘플 중의 전체 지질들의 비율로서, 또는 샘플 중의 전체 지방산들의 비율로서, 샘플 중의 하나 이상의 지방산 부류의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
샘플은 약 100 ㎕ 미만, 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 20 ㎕ 미만인 양으로 고형 배지에 적용될 수 있다.
단계 (b)는 단계 (a) 이후 수 주 또는 여러 달 수행될 수 있다.
하기 기술들은 제1 양태 및 제2 양태에 적용한다:
고체 매트릭스는 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들, 또는 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함할 수 있다.
오염 물질들은 포화 지방산들일 수 있다.
고체 매트릭스는 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 또는 유리-기반 매트릭스일 수 있다.
페이퍼-기반 매트릭스는 실리카-겔 로딩된 페이퍼일 수 있다.
유리-기반 매트릭스는 유리 마이크로섬유 필터일 수 있다.
적어도 하나의 킬레이트제는 에틸렌디아민-테트라아세트산(EDTA), 아스코르브산, 또는 이의 염들, 또는 시트르산, 또는 이의 염들일 수 있다.
적어도 하나의 항산화제는 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA) 또는 t-부틸하이드로퀴논일 수 있다.
상기 주지된 킬레이트제들 및 항산화제들의 임의의 조합들이 고려된다.
일 구현예에서, 킬레이트제는 아스코르브산 및/또는 EDTA이며, 항산화제는 BHT이다.
고형 배지는 스트립 형태일 수 있다.
스트립은 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 가질 수 있다.
항산화제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 양, 또는 약 0.01 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 항산화제(들)는 약 0.1 ㎎의 양으로 존재한다.
킬레이트제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.05 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 킬레이트제(들)는 약 0.25 ㎎의 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 킬레이트제(들)는 약 0.5 ㎎의 양으로 존재한다.
제1 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 지방산들 또는 지방산들을 포함하는 샘플을, 실리카 겔-로딩된 페이퍼, EDTA 및/또는 아스코르브산 및 BHT를 포함하는 고형 배지에 적용하는 것을 포함하는 지방산들을 안정화시키는 방법을 제공한다.
제1 양태의 다른 구현예에서, 본 발명은 지방산들 또는 지방산들을 포함하는 샘플을, 유리 마이크로섬유 필터, EDTA 및/또는 아스코르브산 및 BHT를 포함하는 고형 배지에 적용하는 것을 포함하는 지방산들을 안정화시키는 방법을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하되, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지를 제공한다.
고형 배지는 지방산들을 안정화시키고/거나 샘플의 지방산 조성을 측정하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
지방산들은 불포화 지방산들일 수 있거나, 불포화 지방산들을 포함할 수 있다.
지방산들은 LCPUFA들일 수 있거나, LCPUFA들을 포함할 수 있다.
지방산들은 오메가-3 지방산들, 예를 들어 EPA, 및 DHA 등일 수 있다.
고체 매트릭스는 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들, 또는 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함할 수 있다.
오염 물질들은 포화 지방산들일 수 있다.
고체 매트릭스는 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 또는 유리-기반 매트릭스일 수 있다.
페이퍼-기반 매트릭스는 실리카 겔-로딩된 페이퍼일 수 있다.
유리-기반 매트릭스는 유리 마이크로섬유 필터일 수 있다.
적어도 하나의 킬레이트제는 EDTA, 아스코르브산, 또는 이의 염들, 또는 시트르산, 또는 이의 염들일 수 있다.
적어도 하나의 항산화제는 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논일 수 있다.
상기 주지된 킬레이트제들 및 항산화제들의 임의의 조합들이 고려된다.
일 구현예에서, 킬레이트제는 아스코르브산 및/또는 EDTA이며, 항산화제는 BHT이다.
고형 배지는 스트립 형태일 수 있다.
스트립은 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 가질 수 있다.
항산화제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 항산화제(들)는 약 0.1 ㎎의 양으로 존재한다.
킬레이트제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 5 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.05 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재한다. 일 구현예에서, 킬레이트제(들)는 약 0.25 ㎎의 양으로 존재한다.
제3 양태의 일 구현예에서, 본 발명은 실리카 겔-로딩된 페이퍼, EDTA 및/또는 아스코르브산, 및 BHT를 포함하는 고형 배지를 제공한다.
제3 양태의 다른 구현예에서, 본 발명은 유리 마이크로섬유 필터, EDTA 및/또는 아스코르브산, 및 BHT를 포함하는 고형 배지를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명은 고체 매트릭스를 포함하는 고형 배지를 제공하는 단계, 및 고형 배지에 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 적용하는 단계를 포함하고, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지를 제조하는 방법을 제공한다.
고체 매트릭스, 킬레이트제 및 항산화제는 상기 양태들에서 정의된 바와 같을 수 있다.
고체 매트릭스는 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들, 또는 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 항산화제 및 적어도 하나의 킬레이트제는 고형 배지에 단일 용액, 또는 하나의 용액이 적어도 하나의 항산화제를 포함하고 하나의 용액이 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 별도의 용액들의 형태로 적용될 수 있다.
이러한 용액(들)은 알코올 및 물, 예를 들어 에탄올 및 물을 포함할 수 있다.
용액 중의 적어도 하나의 항산화제의 농도는 약 0.1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL, 또는 약 0.5 ㎎/mL 내지 약 5 ㎎/mL일 수 있다.
용액 중의 적어도 하나의 킬레이트제의 농도는 약 1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL, 또는 약 0.5 ㎎/mL 내지 약 5 ㎎/mL일 수 있다.
고형 배지는 스트립 형태일 수 있다.
스트립에 적용되는 용액의 양은 약 1 내지 500 ㎕, 또는 약 1 내지 100 ㎕일 수 있다.
스트립은 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 가질 수 있다.
오염 물질들은 포화 지방산들일 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 제3 양태의 고형 배지를 포함하는 키트를 제공한다.
이러한 키트는 지방산들을 안정화시키는데 사용하고/거나 샘플의 지방산 조성을 측정하는데 사용하기 위한 것일 수 있다.
이러한 키트는 피검체로부터 지방산들을 포함하는 샘플, 예를 들어 혈액과 같은 체액을 획득하기 위한 날카로운 물체(sharp object)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 하기에서, 단지 일 예로서, 첨부된 도면들을 참조로 하여 기술될 것이다.
도 1은 4주 저장 후에 상이한 단일 항산화제들 또는 철 킬레이트제들로 사전 처리된 두 가지 타입의 페이퍼 상에서 채취된 혈반들에 보유된 LCPUFA의 수준을 도시한 것이다.
도 2는 2달 저장 동안에 Fluka 시험 키트(Fluka test kit) 상에서 혈반들 중의 지방산 조성의 변화를 도시한 것이다.
도 3은 2달 저장 동안에 와트만(Whatman) 실리카 겔-로딩된 페이퍼 상에서 혈반들 중의 지방산 조성의 변화를 도시한 것이다.
도 4는 건조된 모세 혈반(DBS)과 전혈 추출된 전체 지질들 간의 EPA+DHA 함량에 대한 상관관계를 도시한 것이다. DBS 중의 EPA+DHA 함량(x 축) 대 전혈 추출된 전체 지질 중의 EPA+DHA 함량(y 축), 전혈(EPA+DHA)(%) = DBS (EPA+DHA)(%) × 1.068 - 0.139 (r = 0.9971, P<0.0001).
도 5는 건조된 모세 혈반과 혈장 전체 지질 간의 EPA+DHA 함량에 대한 상관관계를 도시한 것이다. DBS 중의 EPA+DHA 함량(x 축) 대 혈장 전체 지질 중의 EPA+DHA 함량(y 축), 혈장 전체 지질(EPA+DHA)(%) = DBS (EPA+DHA)(%) × 1.108 × 1.554 (r = 0.9869, P<0.0001).
도 6은 건조된 모세 혈반과 혈장 인지질 간의 EPA+DHA 함량에 대한 상관관계를 도시한 것이다. DBS 중의 EPA+DHA 함량(x 축) 대 혈장 인지질 중의 EPA+DHA 함량(y 축), 혈장 인지질(EPA+DHA)(%) = DBS (EPA+DHA)(%) × 1.186 + 0.685(r = 0.9814, P<0.0001).
도 7은 건조된 모세 혈반과 오메가-3 지수(RBC EPA+DHA) 간의 EPA+DHA의 수준에 대한 상관관계를 도시한 것이다. DBS 중의 EPA+ DHA 함량(x 축) 대 오메가-3 지수 중의 EPA+DHA 함량(y 축), 오메가-3 지수(%) = 모세 DBS (EPA+DHA)(%) × 1.345 + 1.32(r = 0.9492, P<0.0001).
도 8은 새로이 제조된 페이퍼 및 실온에서 4주에 걸쳐 저장된 사전-제조된 페이퍼 상에서의 혈반들의 지방산 조성을 도시한 것이다. 수치는 평균±SD(n=3)으로 나타내며, 서로에 대한 어떠한 현저한 차이도 없다(p<0.01). "오리지널(orginal)"은 50 ㎕의 생혈의 직접 메틸교환반응으로부터 얻어진 지방산 조성을 의미한다.
정의
하기는 본 발명의 설명을 이해하는데 도움이 될 수 있는 몇몇 정의들이다. 이러한 것들은 일반 정의로서 의도되고 어떠한 방식으로도 이러한 용어들 단독으로 본 발명의 범위를 한정하지 않아야 하지만, 하기 설명의 보다 충분한 이해를 위해 제안되는 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다," 또는 "포함하는"과 같은 파생어들은 기술된 단계 또는 구성요소 또는 정수, 또는 단계들 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 단계 또는 구성요소 또는 정수, 또는 구성요소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것을 시사하는 것으로 이해될 것이다. 이에 따라, 본 명세서의 문맥에서, 용어 "포함하는"은 "주로(principally) 포함하지만 필연적으로 단독으로 포함하지 않는 것"을 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "약"은 당업자가 동일한 기능 또는 결과를 달성하는 상황에서 인용된 수치와 균등한 것으로 여기는 숫자의 범위를 지칭하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 문맥에서, 단수 용어는 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 대상을 지칭한다. 일 예로서, "구성요소(an element)"는 하나의 구성요소 또는 하나 초과의 구성요소를 의미한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "체액(bodily fluid)"은 분비되거나 방출되는 유체들을 포함하는 인간 또는 동물 신체 내에서 비롯하는 임의의 액체를 포함하는 것으로 이해된다. 체액들의 비제한적인 예들은 혈액, 정액, 혈장, 혈액 혈청을 포함하는 혈청, 타액, 땀, 소변, 모유, 담즙 및 복막액을 포함한다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "킬레이트제"는 II족 및 III족 다가 금속 이온들 및 전이금속 이온들을 포함하는 다가 이온들을 착화시킬 수 있는 임의의 화합물을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "흡수하다(sorb)" 및 "흡수된(sorbed)"은 관련 개체가 고체 매트릭스 중에 또는 고체 매트릭스 상에 흡수되거나 흡착되거나 달리 도입되는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "생물학적 샘플"은 살아있는 유기체, 예를 들어 식물, 동물(인간 포함), 균류, 박테리아, 및 조류 등으로부터 획득된 샘플을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "페이퍼-기반 매트릭스(paper-based matrix)"는 페이퍼를 포함하거나 함유하는 매트릭스(matrix)을 의미하는 것으로 이해된다. 페이퍼-기반 매트릭스는 적어도 5%(w/w), 적어도 10%(w/w), 적어도 20%(w/w), 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 또는 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w), 또는 적어도 99%(w/w) 페이퍼를 포함할 수 있다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "유리-기반 매트릭스(glass-based matrix)"는 유리를 포함하거나 함유하는 매트릭스를 의미하는 것으로 이해된다. 유리-기반 매트릭스는 적어도 5%(w/w), 적어도 10%(w/w), 적어도 20%(w/w), 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 또는 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w), 또는 적어도 99%(w/w) 유리를 포함할 수 있다.
본 명세서의 문맥에서, 용어 "셀룰로오스-기반 매트릭스"는 셀룰로오스를 포함하거나 함유하는 매트릭스를 의미하는 것으로 이해된다. 셀룰로오스-기반 매트릭스는 적어도 5%(w/w), 적어도 10%(w/w), 적어도 20%(w/w), 적어도 30%(w/w), 적어도 40%(w/w), 적어도 50%(w/w), 적어도 60%(w/w), 적어도 70%(w/w), 적어도 80%(w/w), 또는 적어도 90%(w/w), 또는 적어도 95%(w/w), 또는 적어도 99%(w/w) 셀룰로오스를 포함할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 대략적으로 샘플 중에 존재하는 지방산들을 안정화시키는 방법, 및 지방산들을 안정화시키는데 사용하고 샘플의 지방산 조성을 측정하는데 사용하기 위한 고형 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 지방산들을 포함하는 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 지방산들을 안정화시키는데 사용하고 샘플의 지방산 조성을 측정하는데 사용하기 위한 고형 배지를 제조하는 방법까지 확장한다.
본 발명의 제1 양태의 방법은 샘플들 중에 존재하는 지방산들을 안정화시키기 위한 단순하고 안전하고 편리하고 신뢰성 있는 수단을 제공한다. 본 발명자들은 이러한 방법을 이용함으로써, 혈액, 모유 및 혈장 중에 존재하는 지방산들이 실온에서 최대 9주 동안 최소한으로 분해되면서 안정화될 수 있다는 것을 발견하였다.
고형 배지는 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제가 흡수된 고체 매트릭스를 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 고체 매트릭스들은 적어도 하나의 킬레이트제, 적어도 하나의 항산화제 및 유체를 흡수할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 이러한 매트릭스들의 예는 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 고체 매트릭스는 페이퍼-기반 매트릭스, 예를 들어 실리카 겔-로딩된 페이퍼로서, 이는 실리카 겔-코팅된 페이퍼 및 실리카 겔-함침된 페이퍼를 포함한다. 적합한 실리카 겔-로딩된 페이퍼는 Whatman, Inc.에서 번호 3668-915로 입수 가능한 실리카 겔-로딩된 페이퍼를 포함한다. 이러한 페이퍼들은 셀룰로오스 및 큰 기공 실리카로 이루어지고, 약 0.27 mm의 두께 및 30분 당 약 100 mm의 유속(물)을 갖는다. 페이퍼 및 페이퍼-기반 매트릭스의 다른 비제한적인 예는 필터 페이퍼 및 크로마토그래피 페이퍼를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 고체 매트릭스는 유리-기반 매트릭스, 예를 들어 유리 울(glass wool), 또는 유리 마이크로섬유 필터, 및 특히 보로실리케이트 유리를 포함하거나 이로 이루어진 유리 마이크로섬유 필터이다. 적합한 유리 마이크로섬유 필터는 Whatman Inc.에서 번호 A1820-047, B1821-047, C1822-047 및 D1823-047로 입수 가능한 필터를 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 페이퍼-기반 고체 매트릭스 중에 존재하는 오염 물질들이 특히, 고체 매트릭스에 적용된 유체의 부피가 적을 때(즉, 약 20 ㎕미만), 전체 지질의 비율로서 개개의 지방산 부류의 양의 정확한 측정을 방해할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 상황에서, 용어 "오염 물질" 또는 "오염 물질들"은 고체 매트릭스 중에 이러한 물질의 존재가 고체 매트릭스에 적용하기 전의 샘플 중의 전체 지질들의 비율로서 한 지방산 부류의 계산된 비율과 비교하여, 매트릭스에 적용된 샘플 중의 전체 지질들의 비율로서 한 지방 부류의 계산된 비율을 증가시키거나 감소시키는 화합물 또는 화합물들을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 이러한 오염 물질들은 예를 들어 포화 지방산들(예를 들어, 16:0 및 18:0), 포화 지방산들의 에스테르들, 수지 산들(예를 들어, 아비에트산, 이소피마르산, 덱스트로피마르산 및 레보피마르산) 및 수지 산들의 에스테르들을 포함하는데, 이는 생산 동안에 페이퍼 속으로 들어간다. 지방산 비율을 계산할 때 오염 물질들에 대해 보정하기 위한 대조군으로서 블랭크 고체 매트릭스(blank solid matrix)를 사용하는 것이 가능하지만, 이는 본 방법에 추가 단계를 부가하고, 이에 따라 효율을 감소시킨다. 본 발명자들은, 유체 중의 전체 지질들의 비율로서 개개 지방산 부류들의 양의 정확한 측정이 고체 매트릭스 중의 오염 물질들이 약 2 ㎍/㎠ 미만임을 보장함으로써 최적화될 수 있다는 것을 발견하였다. 이에 따라, 제1, 제2, 제3 및 제4 양태들의 구현예들에서, 고체 매트릭스는 약 2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.9 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.8 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.7 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.6 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.5 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.4 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.3 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.1 ㎍/㎠ 또는 약 1 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.9 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.8 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.7 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.6 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.5 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.4 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.35 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.3 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.25 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.15 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.1 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.15 ㎍/㎠ 이하, 또는 약 0.12 ㎍/㎠ 이하의 양의 오염 물질들을 포함한다. 대안적으로, 고체 매트릭스는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.5 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.3 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.1 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.2 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.15 ㎍/㎠의 양의 오염 물질들을 포함할 수 있다. 제1, 제2, 제3 및 제4 양태의 대안적인 구현예들에서, 지방산들, 또는 지방산들을 포함하는 샘플을 적용하기 이전에, 고체 매트릭스는 포화 지방산들 및/또는 수지 산들을, 약 2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.9 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.8 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.7 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.6 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.5 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.4 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.3 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 1.1 ㎍/㎠ 또는 약 1 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.9 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.8 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.7 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.6 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.5 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.4 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.3 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.25 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.2 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.15 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.1 ㎍/㎠ 미만, 또는 약 0.15 ㎍/㎠ 이하, 또는 약 0.12 ㎍/㎠ 이하의 양으로 포함하거나, 지방산들, 또는 지방산들을 포함하는 샘플을 적용하기 이전에, 고체 매트릭스는 포화 지방산들 및/또는 수지 산들을, 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.5 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.3 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.2 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.1 ㎍/㎠의 양, 또는 약 0.005 ㎍/㎠ 내지 약 0.15 ㎍/㎠의 양으로 포함할 수 있다.
본원의 실시예에서 기술되는 바와 같이, 고체 매트릭스 중에 존재하는 오염 물질의 양을 조절함으로써, 그리고 샘플 중에 존재하는 지방산들을 안정화시킴으로써, 샘플의 지방산 조성을 고체 매트릭스에 샘플을 적용한 후 수 주 동안 또는 심지어 여러 달 동안 매우 높은 정확도로 측정하는 것이 가능하다. 이와 같이, 예를 들어 혈액과 같은 샘플의 지방산 함량을 정확하게 측정하는 것이 요망되는 경우에, 개체는 이들의 손가락을 간단하게 찌르고, 고형 배지 상에 혈액의 스팟(spot)을 배치시키고, 이를 건조시키고, 이후에 이를 분석을 위해 중앙 실험실로 보낼 수 있다. 고형 배지의 냉동이 요구되지 않고, 고형 배지 상에서의 연장된 지방산 안정성의 측면에서 샘플의 빠른 전달(express posting)을 필요로 하지 않는다. 정맥천자(venepuncture)에 대한 필요성이 또한 방지되는데, 이는 고형 배지 중의 오염 물질들을 보정하기 위한 대조군으로서 블랭크 채취 페이퍼, 또는 일부 다른 수단을 사용하는 것이 요구되기 때문이다. 이에 따라, 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 샘플을 고체 매트릭스에 흡수시키도록, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하되, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지에 샘플을 적용하는 단계; 및 (b) 고체 매트릭스에 흡수된 샘플의 지방산 조성을 측정하는 단계를 포함하는, 지방산들을 포함하는 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
단계 (b)는 당업자에게 널리 공지된 방법들에 의해, 예를 들어 건조된 흡수된 샘플 중의 지방산들의 유도체화 및 가스 크로마토그래피(GC)에 의한 얻어진 유도체화된 화합물들의 분석에 의해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 건조된 흡수된 샘플 중의 지방산들은 직접 메틸교환반응에 의해, 예를 들어 메탄올 중 1% H2SO4의 용액 중에서 70℃로 3시간 동안 가열시킴으로써 지방산 메틸 에스테르로 전환된다. 지방산 메틸 에스테르는 이후에 유기 용매(예를 들어, 헵탄)로 추출되며, 지방산 메틸 에스테르를 함유한 헵탄은 가스 크로마토그래프로 주입된다. 지방산 메틸 에스테르의 획인 및 정량화는 휴렛-팩커드 캠스테이션 데이타 시스템(Hewlett-Packard Chemstation data system)을 이용하여 상업적 액체 표준물질들에 대한 미지의 샘플들의 머무름 시간(retention time) 및 피크 면적 수치들을 비교함으로써 달성될 수 있다(본원의 실시예 1 참조).
이에 따라, 일 구현예에서, 단계 (b)는
(i) 고체 매트릭스에 흡수된 샘플의 적어도 일부를 추출하여 유도체화된, 예를 들어 에스테르화된 지방산들을 포함하는 추출물을 제공하고,
(ii) 유도체화된 지방산들의 양을 기준으로 하여 샘플의 지방산 조성을 측정하는 것을 포함한다.
에스테르화된 지방산들은 C1-C6 알킬 에스테르, 예를 들어 메틸 에스테르일 수 있다.
본 방법은 샘플 중에 존재하는 전체 지질들의 비율(예를 들어, 백분율)로서, 또는 샘플 중에 존재하는 전체 지방산들의 비율로서, 샘플 중의 하나 이상의 지방산 부류(바람직하게, 불포화 지방산)의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 하기 불포화 지방산들 중 하나 이상의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다: 18:1 n-9, 18:2 n-6, 20:4 n-6, 20:5 n-3, 22:5 n-3 및 22:6 n-3. 단계 (b)는 단계 (a) 이후 수 주 또는 여러 달 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 (b)는 단계 (a) 이후 최대 약 12달, 최대 약 9달, 최대 약 8달, 최대 약 7달, 최대 약 6달, 최대 약 5달, 최대 약 4달, 최대 약 3달, 최대 약 2달, 또는 최대 약 1달 수행될 수 있다. 일부 구현예들에서, 단계 (b)는 단계 (a) 이후 최대 약 12주, 최대 약 11주, 최대 약 10주, 최대 약 9주, 최대 약 8주, 최대 약 7주, 최대 약 6주, 최대 약 5주, 최대 약 4주, 최대 약 3주, 최대 약 2주, 또는 약 1주 수행된다.
지방산 조성의 측정에 있어 부정확성에 기여할 수 있는 소수성 화합물들로의 오염에 대한 가능성을 추가로 최소화하기 위하여, 단계 (a)에서 얻어진 샘플은 바람직하게 단계 (b)의 수행 이전에 셀로판 백(cellophane bag)에 저장된다. 바람직하게, 샘플은 주변 온도, 어두운 곳에서 셀로판 백에 저장된다.
통상적으로, 샘플은 생물학적 샘플이지만, 당업자는 본 발명의 방법들 및 배지들이 지방산들, 및 분해에 대해 특히 민감한 불포화 지방산들을 포함하는 임의의 샘플에 적용될 수 있는 것으로 인식할 것이다. 일부 구현예들에서, 생물학적 샘플은 체액이다. 체액들의 비제한적인 예는 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장, 윤활액 및 혈청을 포함한다. 대안적인 구현예들에서, 샘플은 지방산 조성을 측정하기 위해 요망되는 불포화 지방산들을 포함하는, 오일, 예를 들어 수산유지(marine oil) 또는 식물성 오일과 같은 식용 오일(edible oil)일 수 있다. 품질 조절 목적을 위해 및/또는 저장 수명을 평가하기 위해 이러한 오일들의 지방산 조성을 측정하는 것이 요망될 수 있다. 다른 구현예에서, 오일은 생성된 전체 지질의 비율로서, 증가된 양의 선택된 지방산, 예를 들어 오메가-3 지방산들을 생산하기 위해 개발된 유전공학 처리된 작물(예를 들어, 카놀라(canola))로부터 유래된 오일일 수 있다. 이러한 경우에서, 제2 양태의 방법은 생성된 전체 지질들의 비율로서 오메가-3 지방산들의 증가를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
샘플은 고형 배지에 약 100 ㎕ 미만, 또는 약 90 ㎕ 미만, 또는 약 80 ㎕ 미만, 또는 약 70 ㎕ 미만, 또는 약 60 ㎕ 미만, 또는 약 50 ㎕ 미만, 또는 약 40 ㎕ 미만, 또는 약 30 ㎕ 미만, 또는 약 25 ㎕ 미만, 또는 약 20 ㎕ 미만, 또는 약 20 ㎕인 양으로 적용될 수 있다.
다른 구현예들에서, 샘플은 고형 배지에 약 10 ㎕ 내지 약 250 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 150 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 75 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 60 ㎕, 또는 약 30 ㎕ 내지 약 60 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 20 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 30 ㎕ 또는 약 50 ㎕의 양으로 적용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 고체 매트릭스는 고체 매트릭스에 흡수되는 적어도 하나의 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 킬레이트제들은 EDTA, 에틸렌글리콜-O,O'-비스(2-아미노에틸)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 트리에탄올아민, 살리실산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 디에틸렌트리아민-N,N,N',N',N"-펜타아세트산, N,N-비스(2-(비스-(카복시메틸)아미노)에틸)-글리신, 디에틸렌트리아민 펜타아세트산, [[(카복시메틸)이미노]비스(에틸렌니트릴로)]-테트라-아세트산, N,N-비스(카복시메틸)글리신, 트리글리콜람산, Trilone A, α,α',α"-트리메틸아민트리카복실산, 트리(카복시메틸)아민, 아미노트리아세트산, Hampshire NTA 산, 니트릴로-2,2',2"-트리아세트산, Titriplex I, 니트릴로트리아세트산 및 데페록사민을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 고체 매트릭스는 고체 매트릭스에 흡수되는 적어도 하나의 항산화제를 추가로 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 항산화제들은 레스베라트롤(resveratrol), t-부틸하이드로퀴논, BHT, BHA, 시트르산, 시트레이트, 아스코르브산, 아스코르베이트, 플라보노이드, 예를 들어 바칼레인, 및 항산화제 식물 추출물들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
항산화제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 항산화제(들)는 약 0.1 ㎎의 양으로 존재한다.
킬레이트제(들)는 고형 배지 상에 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 양, 또는 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양, 또는 약 0.05 ㎎ 내지 약 0.5 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일 구현예에서, 킬레이트제(들)는 약 0.25 ㎎의 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 킬레이트제(들)는 약 0.5 ㎎의 양으로 존재한다.
본 발명은 또한, 고체 매트릭스를 포함하는 고형 배지를 제공하는 단계 및 고형 배지에 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 적용하는 단계를 포함하며, 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지를 제조하는 방법에 관한 것이다.
고체 매트릭스, 킬레이트제 및 항산화제는 본원에서 정의된 바와 같을 수 있다. 적어도 하나의 항산화제 및 적어도 하나의 킬레이트제는 고형 배지에 단일 용액, 또는 하나의 용액이 적어도 하나의 항산화제를 포함하고 하나의 용액이 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 별도의 용액들의 형태로 적용될 수 있다. 대안적으로, 적어도 하나의 항산화제 및/또는 적어도 하나의 킬레이트제가 액체인 경우에, 각각은 고형 배지에 그 상태로(neat) 적용될 수 있다.
용액(들)은 유기 용매 및 물, 예를 들어 알코올(예를 들어, 메탄올 또는 에탄올) 및 물을 포함할 수 있다.
용액 중의 적어도 하나의 항산화제의 농도는 약 0.1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL, 또는 약 0.5 ㎎/mL 내지 약 5 ㎎/mL일 수 있다. 용액 중의 적어도 하나의 킬레이트제의 농도는 약 1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL, 또는 약 0.5 ㎎/mL 내지 약 5 ㎎/mL일 수 있다. 스트립에 적용되는 용액의 양은 약 1 내지 500 ㎕, 또는 약 1 내지 100 ㎕, 또는 약 50 ㎕일 수 있다. 통상적으로, 용액은 드롭 방식으로(dropwise) 적용된다.
고형 배지는 임의의 형상(예를 들어, 환형, 직사각형, 및 정사각형 등)을 가질 수 있지만, 통상적으로 스트립의 형태이다. 스트립은 약 1 ㎝ × 1 ㎝ 내지 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 가지지만, 다른 크기의 스트립들이 고려된다. 통상적으로, 고형 배지는 표준 엔벨로프(envelope)에서 중앙 실험실로 저렴하고 용이하게 발송하는 것을 가능하게 하기 위하여 얇다(즉, 1 내지 2 mm).
본 발명은 또한, 제3 양태의 고형 배지를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 키트는 피검체로부터 지방산들을 포함하는 샘플, 예를 들어 체액을 획득하기 위해 날카로운 물체(예를 들어, 핀, 또는 니들 등)를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 체액은 혈액이다. 바람직하게, 날카로운 물체는 이를 사용한 후에 피검체가 감염증에 걸린 위험을 최소화하기 위하여 사전-살균된다. 본 키트는 사용을 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
본 발명은 하기에서 오로지 예시로 하기 실시예에 관하여 보다 상세히 기술될 것이다. 본 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로서 의도되고 어떠한 방식으로도 본 명세서 전반에 걸쳐 이러한 설명의 대부분의 내용을 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1 - BHT 및 아스코르브산/ EDTA 의 조합을 사용한 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼 상에서의 혈반 들의 안정화
물질 및 방법
혈액 채취 페이퍼( Blood collection paper )
혈반 채취를 위해 두 가지 타입의 페이퍼를 사용하였다: Fluka 혈액 채취 키트 페이퍼(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) 및 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼(46×57cm, Whatman, Buckingham, UK). 두 개의 상업적 페놀성 항산화제들, 즉 부틸화된 하이드록시톨루엔 및 3차 부틸하이드로퀴논(TBHQ)을 Sigma-Aldrich(St Louis, MO)로부터 구입하였다. 철 킬레이트제인 L-아스코르브산 및 EDTA를 Chem-supply Company(Gillman, South Australia)로부터 구입하였다.
항산화제/ 킬레이트제 (보호제) 용액
두 가지 타입의 채취 페이퍼 모두 상에 혈반들 중의 지방산들을 안정화시키기 위하여 14개의 보호제 포뮬레이션(protectant formulation)들을 제조하였다(표 1). 혈반들에서의 지질 산화를 조절하기 위한 최적의 항산화제 농도를 측정하기 위하여, 두 종류의 항산화제(BHT 및 TBHQ) 모두를 3개의 상이한 농도(0.5㎎/㎖, 2㎎/㎖ 및 4㎎/㎖)에서 시험하였다(표 1). 철 킬레이트제로서 L-아스코르브산 및 EDTA를 5㎎/㎖의 수준으로 사용하였다. 한 방울의 각 보호제 포뮬레이션(~ 50㎕)을 채취 페이퍼 스트립들 위에 고르게 펼치고, 페이퍼 상에서 혈액의 채취 이전에 공기-건조시켰다.
표 1. 채취 페이퍼의 처리를 위해 사용되는 보호제
Figure pct00001
샘플 제조
정기적으로 어유를 소비하고 혈액 중에 EPA 및 DHA의 매우 높은 함량을 갖는 한 명의 건강한 지원자로부터 전주 정맥(antecubital vein)을 통해 혈액을 채취하였다. 5 ml 시일링된 바이알(Wheaton, Millville, USA)에서 무수 메탄올 중에서 생혈(fresh blood)(~ 50 ㎕)을 2 ml의 1%(v/v) H2SO4(18M AR 등급, BDH, Sussex, UK)와 혼합하고 70℃에서 3시간 동안 가열하여 전혈 중의 지방산들의 직접 메틸교환 반응을 달성하였다. 얻어진 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 헵탄으로 추출하고, 종래에 확립된 방법들(1)에 따른 분석을 위해 GC에 주입하였다. 보호제 포뮬레이션의 부재 또는 존재 하에 두 타입의 혈액 채취 페이퍼 스트립들(1 × 3cm) 모두 상에 한 방울의 생혈(~ 50 ㎕)을 흡수시켜 혈반들을 획득하고, 모든 혈반들을 주변 온도에서 6시간 동안 공기 건조시켰다. 혈반들을 건조시킨 직후에, 이러한 혈반들을 4개 그룹으로 나누었다. 제1 그룹을 생혈에 대한 것과 동일한 절차에 따른 직후에 에스테르교환시켰다. 공기 건조 동안에 혈반 샘플들 중에서의 LCPUFA의 임의의 산화성 손실이 존재하였는 지의 여부를 측정하기 위하여 이러한 샘플들로부터 얻어진 결과들을 생혈의 지방산 조성을 직접적으로 측정함으로써 얻어진 결과와 비교하였고, 혈반들 중의 지방산 조성에 대한 기준선 수치(baseline measure)를 제공한다. 주변 온도, 어두운 곳에서 나머지 3개의 그룹들에서의 혈반들을 셀로판 백에 저장하였고, 혈액 채취 후 2주, 4주 또는 9주 후에 이러한 샘플들 중의 지방산 조성을 측정하였다. 모든 샘플들을 3회 처리하였다.
가스 크로마토그래피 분석
FAME를 BPX70 모세관 컬럼 50m × 0.32mm, 막 두께 0.25 ㎛(SGC Pty Ltd., Victoria, Australia), PTV 주입기 및 불꽃 이온화 검출기(FID)가 장착된 GC(Hewlett-Packard 6890; Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분리하고 정량화하였다. 주입기 온도를 250℃로 설정하였으며, FID 온도를 300℃로 설정하였으며, 프로그램화된 온도 기울기(140에서 240℃)를 사용하였다. 컬럼에서 운반 가스로서 헬륨 가스를 초당 35 cm의 유속으로 사용하였으며, 유입구 분할비를 20:1로 설정하였다. 휴렛-팩커드 캠스테이션 데이타 시스템을 이용하여 미지 샘플들의 머무름 시간 및 피크 면적 수치들을 상업적 액체 표준물(Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA)의 것들과 비교하여 FAME의 확인 및 정량화를 달성하였다.
통계학적 분석
PASW Statistic 18을 이용하여 모든 통계학적 분석을 수행하였다. 수치들은 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표현된다. 한 방향 ANOVA를 사용하여 공기 건조 후 전체 혈액 지질 중의 지방산들의 백분율 간의 유의미한 차이(significant difference)를 측정하였다. 시간에 따른 동일한 혈액 샘플 내의 지방산 백분율의 변화에 대한 페이퍼 타입 및 보호제 포뮬레이션의 효과를 2-방향 ANOVA를 이용하여 시험하였다. 페이퍼 타입과 보호제 포뮬레이션 간의 유의미한 상호작용이 ANOVA에서 측정되는 경우에, 시간에 따른 지방산의 변화를 상이한 페이퍼 타입 한 방향 ANOVA 및 터키(Tukey) post-hoc 시험에 대해 별도로 측정하였으며, p<0.05는 통계학적으로 유의미한 것으로서 허용되었다.
결과
페이퍼 및 항산화제 농도의 효과
항산화제들 및 철 킬레이트제들의 부재 하에, Fluka 또는 실리카 겔 페이퍼 상에 채취된 혈반들은 항산화제 사전-처리된 페이퍼들 상에 채취된 혈반들과 비교할 때 4주 저장 기간에 걸쳐 측정된 LCPUFA 함량의 유의미한 감소를 나타내었다(도 1). BHT 사전-처리된 페이퍼 상에 채취된 혈반들은 주변 온도에서 4주 저장 후에 3가지 농도 모두에서 다른 항산화제 또는 철 킬레이트제로 사전-처리된 페이퍼 상에 채취된 혈반들 보다 더욱 높은 백분율의 LCPUFA를 보유하였다. BHT에 의해 제공된 최적의 보호는 2 ㎎/ml의 농도에서 나타난 것으로 보였다. 혈반들 중의 LCPUFA가 Fluka 페이퍼 상에서 보다 실리카 겔-코팅된 페이퍼 상에서 더욱 안정적인 것으로 나타났다는 것이 주목할 만하다.
철 킬레이트제의 효과
두 가지 타입의 페이퍼 모두 상에서의 혈액의 스팟팅(spotting), 및 6시간 동안 혈반을 건조시키는 것은 산성화된 메탄올 중에서 직접적으로 에스테르교환된 동일한 양의 혈액에 비해 LCPUFA의 손실을 초래하였다(표 2 및 3). 직접 에스테르교환은 혈액 지질의 지방산 조성을 측정하는 신뢰성 있는 방법으로서 입증된 것이다. 전체 혈액 지질 중의 에이코사펜타엔산(EPA, 20:5n-3) 및 도코사헥사엔산(DHA, 22:6n-3)의 백분율의 유의미한 감소가 또한 BHT 단독으로 처리된 페이퍼 상에 채취된 혈반 샘플들에 대해 검출되었다. 그러나, BHT 및 철 킬레이트제들 중 어느 하나(L-아스코르브산 또는 EDTA)의 혼합물로 사전-처리된 채취 페이퍼들 중 어느 하나 상에 흡수된 혈반들 중에서 측정된 지방산 조성은 생혈으로부터 얻어진 결과들과 유의미한하게 차이가 나지 않았다(표 2 및 표 3 참조). 또한, 사용되는 보호제 포뮬레이션들과는 무관하게, Whatman 실리카 겔 페이퍼 상에 채취된 혈반들은 Fluka 혈액 채취 키트 페이퍼 상에 채취된 혈반들과 비교하여 생혈에서와 더욱 유사한 지방산 조성을 일관되게 나타내었다.
표 2. 생혈의 직접 메틸화교환의 결과와 비교하여 6시간 동안 공기 건조 후에 측정된 Fluka 시험 키트 페이퍼 상에서의 혈반들의 지방산 조성(%)
Figure pct00002
표 3. 생혈의 직접 메틸화교환의 결과와 비교하여 6시간 동안 공기 건조 후에 측정된 Whatman 실리카 겔 페이퍼 상의 혈반들의 지방산 조성(%)
Figure pct00003
혈반 지방산 조건에 대한 장기 저장의 효과
Fluka 시험 키트 페이퍼 상에 채집되고 9주의 기간에 걸쳐 저장된 혈반들은 6시간의 공기 건조 직후에 측정된 혈반들과 비교하여 유의미하게 상이한 지방산 조성들을 나타내었다(도 2, p<0.01). 사용되는 보호제 포뮬레이션과는 무관하게, Fluka 시험 키트 상에 채취된 혈반 중의 측정된 오메가-6 지방산들(리놀렌산, LA, 18:2n-6; 아라키돈산, AA, 20:4n-6) 및 오메가-3 EPA 및 DHA의 수준들은 저장 후 2주 정도로 이른 시기에 기준선에서 측정된 수치 보다 유의미하게 보다 낮았으며, 이러한 수준들은 9주 저장 기간에 걸쳐 계속 감소하였다. 반대로, 혈반들 중에서 측정된 전체 포화 지방산들의 백분율은 저장 기간에 걸쳐 꾸준히 증가하였다(도 2).
혈반들이 어떠한 보호제도 지니지 않는 Whatman 실리카 겔 페이퍼 상에 채취되었을 때, 2주의 저장 후에 혈반 전체 지질 중의 EPA 및 DHA의 백분율이 유의미하게 감소하였으나(도 3, p<0.01), 이러한 손실은 동일한 기간에 걸쳐 Fluka 페이퍼 상에서 관찰된 것보다 낮았다. Whatman 실리카 겔 페이퍼를 BHT로 처리함으로써, EPA 및 DHA의 수준의 유의미한 감소는 저장 후 4주까지 보이지 않았다. BHT, 및 철 킬레이트제들 중 어느 하나(L-아스코르브산 또는 EDTA)의 둘 모두를 Whatman 실리카 겔 페이퍼에 첨가한 후에, 혈반 샘플들 중의 모든 LCPUFA의 백분율은 실온에서 9주 저장 후에서도 기준선 수치와 유의미하게 차이가 나지 않았다(도 3).
논의
개체의 LCPUFA 상태의 평가를 위한 혈반 기술이 보편적으로 채택될 경우에, 연구원들은 본 방법이 정확하고 시간에 따라 안정적이라는 것을 확인해야 할 필요가 있다. 필터 페이퍼 상의 혈액의 스팟팅이 혈액 중의 LCPUFA를 공기에 자연적으로 노출할 경우에, 연구원들은 이러한 방식으로 채취된 혈반 샘플들 중의 LCPUFA의 안정화에 대해 우려하였다(2). 상업적으로, 혈반 기술은 샘플의 오메가 3 지수(EPA+DHA)의 평가를 얻기 위하여 준비된 페이퍼 상의 샘플들 상태로 발송할 것을 요청하라고 소비자들에게 광고되고 있다. 이러한 시험은, 스팟팅 때부터 떨어져 있는 실험실에서 샘플이 분석될 때까지 혈액 중의 지방산들, 가장 특히 EPA 및 DHA가 안정한 것으로 가정한다. 분명하게, Fluka 시험 키트가 사용되는 경우에, 이러한 오메가-3 지방산들의 시간 의존적 산화는 페이퍼가 BHT로 코팅되었는 지의 여부와는 무관하게 일어날 것이다. 채취 페이퍼들의 BHT 처리의 경우에도, 샘플 중의 n-3 LCPUFA 함량의 단지 약 60%가 주변 온도에서 1달 저장 후에 유지되었다는 것이 보고되었다(2).
혈반들의 지방산 조성의 가장 큰 안정성은 항산화제 BHT를 철 킬레이트제(L-아스코르브산 또는 EDTA) 및 채취 페이퍼로서 실리카 겔 페이퍼와 결합시킴으로써 달성되었는데, 이는 주변 온도에서 심지어 2달의 저장 후에도 혈반 중의 본래 EPA 및 DHA 수준의 유지를 가능하게 하였기 때문이다.
결론적으로, 이러한 연구의 결과들은, BHT, 킬레이트제 및 실리카 겔 페이퍼의 조합으로 구성된 보호 시스템이 주변 온도에서 저장되었을 때 혈반들 중의 LCPUFA가 적어도 2달 동안 유의미한 산화성 손실되는 것을 막을 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 방법은 장기간 저장 후에 모세 혈액 샘플들에서 지방산 상태를 정확하게 평가할 수 있는 가능성을 가지고, 이에 따라 상이한 시간의 기간 동안 저장된 샘플들 간의 비교를 가능하게 한다.
실시예 2 - BHT 및 EDTA 의 조합을 사용한 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼 상에서의 혈장 혈반들의 안정화
하루에 1 캡슐의 어유를 규칙적으로 소비한 피검체로부터 혈액을 채취하였다. 혈액 샘플을 4℃에서 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리하여 혈장 및 적혈구를 분리하였다. 한 방울의 혈장(~50 ㎕)을 직접적으로 에스테르교환반응시키고, 얻어진 FAME를 GC로 분석하여 혈장 전체 지질 중의 지방산 조성에 대한 기준선을 제공하였다. 나머지 혈장을 두 부분으로 나누고, 제1 부분을 -20℃에서 저장하고, 1, 2 및 4주에 직접 에스테르교환반응을 이용하여 지방산 조성에 대해 시험하였다. 제2 부분을 2㎎/㎖ BHT 및 5㎎/㎖ EDTA로 함침된 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼(46×57cm, Whatman, Buckingham, UK)(페이퍼 당 ~50 ㎕) 상에 스팟팅시키고, 5 내지 6시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 혈장 혈반들을 이후에 어두운 곳, 실온(19 내지 23℃)에서 셀로판 백에 저장하고, 이러한 샘플들 중의 지방산 조성을 혈액 채취 후 1, 2 및 4주에 측정하였다. 모든 샘플들을 3회 처리하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.
표 4. 4주 저장에 대한 혈장(-20℃에서 저장됨) 및 혈장 혈반(실온에서 저장됨)의 지방산 조성
Figure pct00004
실시예 3 - BHT 및 EDTA 의 조합을 사용한 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼 상에서의 모유 스팟(breast milk spot)들의 안정화
5달 동안 젖을 분비하고 어유 보충물을 섭취하지 않은 피검체로부터 모유를 획득하였다. 한 방울의 모유(~50 ㎕)를 직접적으로 에스테르교환반응시키고, 얻어진 FAME를 GC로 분석하여 모유 전체 지질 중의 지방산 조성에 대한 기준선을 제공하였다. 나머지 모유를 2㎎/㎖ BHT 및 5㎎/㎖ EDTA로 함침된 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼(46×57cm, Whatman, Buckingham, UK)(페이퍼 당 ~50 ㎕) 상에 스팟팅하고, 5 내지 6시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 모유 스팟들을 건조시킨 직후에, 이러한 스팟들을 4 그룹으로 나누었다. 제1 그룹을 신선한 모유에 대한 것과 동일한 에스테르화 교환 절차에 따라 바로 에스테르교환시켰다. 이러한 샘플들로부터의 얻어진 결과들을 신선한 모유의 지방산 조성을 직접적으로 측정함으로써 얻어진 결과와 비교하여 공기 건조 동안에 모유 스팟 샘플들 중의 LCPUFA의 임의의 산화성 손실이 존재하는 지의 여부를 결정하고, 모유 스팟들 중의 지방산 조성에 대한 기준선 수치를 제공한다. 나머지 세 그룹의 모유 스팟들을 어두운 곳, 실온(19 내지 23℃)에서 셀로판 백에 저장하였고, 이러한 샘플들 중의 지방산 조성을 모유 채취 후 1, 2 및 4주에 측정하였다. 모든 샘플들을 3회 처리하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
표 5. 실온(19 내지 23℃)에서 4주 저장을 걸친 모유 스팟의 지방산 조성
Figure pct00005
실시예 4 - 페이퍼 및 다른 소스들로부터의 오염 물질
물질 및 방법
혈반 채취 페이퍼
혈반 페이퍼로서 5가지 타입의 페이퍼를 사용하였으며, 이러한 것들은 두 개의 상업적으로 개발된 혈반 채취 페이퍼, 즉 Fluka 혈액 채취 키트(Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland) 및 Whatman 903 시편 수집 카드(Whatman, Buckingham, UK); 및 세 개의 크로마토그래피 페이퍼, 즉 Whatman 3MM 크로마토그래피 페이퍼(46 × 57cm, Whatman, Buckingham, UK), Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼(46 × 57cm, Whatman, Buckingham, UK) 및 Watman 유리 마이크로섬유 필터(GF/B 47 mm, Whatman, Buckingham, UK)이다.
샘플 제조
대략 5 ml의 혈액을 전주 정맥을 통해 30세의 건강한 지원자로부터 채취하고, 채취 직후에 처리하였다. 생 전혈(50 ㎕)을 5 ml 시일링된 바이알(Wheaton, Millville, USA)에서 무수 메탄올 중의 1% (v/v) H2SO4(18M AR grade, BDH, Sussex ,UK) 2 ml와 혼합하고, 70℃에서 3시간 동안 가열하여 직접적으로 메틸교환시켰다. 얻어진 지방산 메틸 에스테르(FAME)를 헵탄으로 추출하고, 종래 확립된 방법(1)에 따라 분석하기 위해 GC에 주입하였다. 혈액 채취 시에, 두 개의 혈액 샘플의 추가 분취액(각각 25 ㎕ 및 50 ㎕)을 페이퍼 스트립들(1 × 1 ㎝) 상에 배치시키고, 생혈에 대해 동일한 절차에 따라 처리하였다. 혈액 없는 동일한 면적(1 × 1 ㎝)의 블랭크 채취 페이퍼 스트립들을 대조군으로서 동일한 절차로 처리하였다. 모든 샘플들을 3회 처리하였다.
샘플 수집, 처리 및 저장 동안 페이퍼 이외의 소스들로부터 가능한 오염 물질들을 평가하기 위하여, 블랭크 Watman 유리 마이크로섬유 필터 스트립들(1 × 1 ㎝)을 본 발명자들의 실험에서 사용되는 라텍스 글러브, 니트릴 글러브, 폴리에틸렌(PE) 지퍼락 백, 알루미늄 호일 지퍼락 백 또는 셀로판 백을 포함하는 10 ㎝2 표면적의 다양한 물질들 상에서 닦았다. 이후에 닦여진 페이퍼 샘플들을 상술된 방법을 이용하여 메틸교환하고, GC로 분석하였다. 블랭크 유리 마이크로섬유 필터의 오염 물질 함량을 닦여진 유리 마이크로섬유 필터로부터 차감하여 이러한 글러브들 및 백들로부터 유래된 오염 물질들을 평가하였다. 모든 샘플들을 3회 처리하였다.
가스 크로마토그래피 분석
BPX70 모세관 컬럼 50 m × 0.32 mm, 막 두께 0.25 ㎛(SGC Pty Ltd., Victoria, Australia), PTV 주입기 및 불꽃 이온화 검출기(FID)가 장착된 GC(Hewlett-Packard 6890; Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 FAME를 분리하고 정량화하였다. 주입기 온도를 250℃로 설정하였으며, FID 온도를 300℃로 설정하였으며, 프로그램화된 온도 기울기(140에서 240℃)를 사용하였다. 컬럼에서 운반 가스로서 헬륨 가스를 초당 35 cm의 유속으로 사용하였으며, 유입구 분할비를 20:1로 설정하였다. 휴렛-팩커드 캠스테이션 데이타 시스템을 이용하여 미지 샘플들의 머무름 시간 및 피크 면적 수치들을 상업적 액체 표준물(Nu-Chek Prep Inc., Elysian, MN, USA)의 것들과 비교하여 FAME의 확인 및 정량화를 달성하였다
통계학적 분석
PASW Statistic 18을 이용하여 모든 통계학적 분석을 수행하였다. 수치들은 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표현된다. 한 방향 ANOVA를 사용하여 전체 혈액 지질 중의 지방산들의 백분율들 간의 유의미한 차이를 결정하였으며, 통계학적 유의성을 결정하기 위하여 p < 0.05를 사용하였다.
결과 및 분석
혈반 샘플들과 생혈 간의 상이한 결과들
생혈 측정과 비교할 때, 실리카 겔 페이퍼 및 유리 마이크로섬유 필터 둘 모두 상에 스팟팅된 25 ㎕ 혈액의 분석은 지방산 조성에 대한 동일한 결과들을 나타내었다. 대조적으로, Fluka 시험 키트 또는 Whatman 903 수집 카드 상의 25 ㎕ 혈반들은 생혈 측정과 비교할 때 전체 혈액 지질 중의 유의미하게 보다 낮은 백분율의 오메가-3 지방산들 및 아라키톤산(AA, 20:4 n-6)을 갖는다. 혈반 샘플들 중의 오메가-3 및 AA의 비율의 이러한 분명한 감소는 이러한 샘플들에서 측정된 포화 지방산들, 즉 팔미트산(16:0) 및 스테아르산(18:0)의 백분율의 유의미한 증가에 의해 상쇄되었다. 혈반의 부피가 50 ㎕로 증가되었을 때, Fluka 시험 키트 상에 채취된 혈반들로부터 측정된 지방산 조성은 생혈과 유의미하게 상이하지 않지만, Whatman 903 수집 카드 상의 50 ㎕ 혈반들의 분석은 생혈 중의 것과 유의미하게 상이한 지방산 프로파일을 또한 형성하였다(표 7).
표 6. 생혈과 비교하여 25 ㎕ 건조된 혈반들 중에 측정된 지방산 조성(%)
Figure pct00006
표 7. 생혈과 비교하여 50 ㎕ 혈반들 중에서 측정된 지방산 조성(%)
Figure pct00007
여기에 제시된 결과들은 혈반 샘플들로부터의 지방산 상태 시험 결과들이 생 전혈로부터 얻어진 것들에서 벗어날 수 있다는 것을 명확하게 입증한다. Fluka 혈액 채취 키트 및 Whatman 903 시편 채취 카드는 혈액 채취를 위해 널리 사용되는 상업적 제품들이며, Whatman 3MM 크로마토그래피 페이퍼는 또한 임상 시험에서 혈액 채취 페이퍼로서 흔히 사용된다. 그러나, 이러한 세 가지 타입의 페이퍼 중 임의의 것 상의 적은 부피의 혈액(25㎕)은 이러한 것들이 한 방울의 전혈로부터 LCPUFA의 직접 평가를 위해 사용되었을 때 모호한 지방산 상태 결과를 나타내었다. 본 데이타로부터, 이러한 채취 페이퍼들로부터의 오염 물질들이 전체 지질의 비율로서 개별적인 지방산 부류의 양의 정확한 측정을 방해한다는 것이 명확하다. 오염 물질에 대해 보정하기 위한 대조군으로서 블랭크 채취 페이퍼의 사용은 개개 지방산들 조성 시험에 대해 실현 가능하다. 그러나, 상이한 타입의 혈액 채취 페이퍼로부터의 오염 물질들의 가변적인 양, 및 동일한 타입의 페이퍼 중에 존재하는 오염 물질들의 양이 시트를 가로지르거나 배치들 간에 다양할 가능성은 특히 큰 임상 시험에서 임의의 정도의 확실성을 갖는 블랭크 페이퍼의 오염 물질들을 기반으로 한 보정 인자(correction factor)를 적용하는 것을 비실용적이게 만든다.
상이한 페이퍼들로부터의 오염 물질들
본 발명자들은, 모든 타입의 채취 페이퍼에서 두 가지 주요 오염 물질들이 16:0 및 18:0 포화 지방산에 해당하다는 것을 발견하였다(표 8). 이는 생혈 중의 지방산들과 비교할 때 혈반 샘플들 중에 검출된 16:0 및 18:0 포화 지방산들의 백분율의 증가를 설명한다. 또한, 오염 물질들의 전체 양은 상이한 타입의 채취 페이퍼들 간에 다양하였으며, 예를 들어 Whatman 실리카 겔 페이퍼는 단지 0.1 ㎍/㎠의 오염 물질을 가진 반면, Whatman 903 페이퍼의 일부 배치들은 이러한 양의 거의 25배를 갖는다. 페이퍼를 용매로 세척하는 것 및 심지어 페이퍼를 메틸교환 절차로 처리하는 것은 오염 물질을 제거하는데 실패하였으며, 이는 지방산들이 페이퍼의 구성요소인 것으로 사료되게 한다.
혈반 시험에 대한 이전 연구들은 GC 피크가 오로지 채취 페이퍼를 처리한 후에 관찰되지 않았음을 주장하였으나, 본 발명자들은 시험된 모든 타입의 채취 페이퍼에서 오염 물질 피크를 발견하였다. 이는 채취 페이퍼 중의 소량의 오염 물질들이 지방산 조성 시험 결과를 유의미하게 달라지지 않을 수 있다는 경우일 수 있다. 예를 들어, Whatman 실리카 겔 페이퍼 및 Watman 유리 마이크로섬유 필터는 생혈의 것과 동일한 지방산 조성의 결과를 나타내었다. 그러나, Fluka 시험 키트 및 Whatman 903 샘플 채취 페이퍼와 같은, 많은 양의 오염 물질들을 함유한 이러한 페이퍼에 대하여, 지방산 결과는 채취된 혈액의 부피가 작을 때, 생혈과 명백하게 상이하였다. 이러한 오염 물질들은 수지 산들 또는 지방산들일 수 있는데, 왜냐하면 둘 모두가 이러한 페이퍼들이 궁극적으로 자유 산 또는 다양한 에스테르로서 합성되는 목재에 존재하기 때문이다. 16:0 및 18:0 포화 지방산을 포함하는 페이퍼 밀(paper mill)로부터 얻어진 처리된 물 샘플들로부터의 수지들 및 지방산들이 보고되었다. 이에 따라, 이러한 산들 또는 이들의 에스테르들이 최종 페이퍼 제품 중에 불순물로서 잔류할 수 있고 이러한 페이퍼들 상에서 채취된 혈반들의 지방산 조성을 평가할 때 오염 물질들의 도입을 야기시킨다는 것을 나타낸다.
표 8. 메틸화 동안에 상이한 타입의 채취 페이퍼들로부터의 오염 물질들의 양
Figure pct00008
다른 소스들로부터의 가능한 오염 물질들
페이퍼들을 라텍스 글러브, 니트릴 글러브, PE 지퍼락 백, 알루미늄 호일 지퍼락 백 및 셀로판 백을 포함하는 물질들에 접촉시킴으로써 본 발명자의 실험실에서 오염 물질들의 소스들을 시험하였다(표 9). 라텍스 글러브는 유의미한 양의 오염 물질들을 함유하지만, 니트릴 글러브로부터 실제적으로 어떠한 오염도 검출되지 않았다. PE 백 및 알루미늄 백 각각은 올레산(18:1 n-9) 및 에루크산(22:1 n-9)에 해당하는 다량의 오염 물질들을 함유하였지만, 셀로판 백은 임의의 유의미한 오염의 출현을 초래하지 않았다.
표 9. 상이한 소스들로부터의 가능한 오염 물질들의 양
Figure pct00009
라텍스 글러브, PE 백 및 알루미늄 백은 여러 실험실에서 널리 사용되는 것이다. 이전 연구들에서는 실험들에서 오염의 소스로서 락텍스 글러브에 초점을 맞춘 적이 없으며, 기존의 조사에서는 단지 락텍스 글러브가 알레르기를 야기시킬 수 있는 내독소들을 방출시킬 수 있다는 것이 보고되어 있다. 그러나, 본 실험에서는 심지어 이러한 널리 사용된 실험실 물품들이 소수성 오염 물질들을 방출시킬 가능성을 가지고 특히 혈액 샘플 부피가 낮을 때, 혈액 지방산 조성 시험들의 결과들의 변화에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 이에 따라, 글러브 및 백으로부터 잠재적인 오염 물질 문제를 최소화하기 위하여, 수집 동안 니트릴 글러브 및 셀로판 백의 사용, 혈반 샘플들의 처리 및 저장이 제안된다.
요약하면, 모든 타입의 채취 페이퍼들은 오염 물질들을 방출하며, 이러한 오염 물질들은 특히, 혈반의 부피가 낮을 때, 건조된 혈반 샘플들의 분석 결과를 변화시킬 가능성을 갖는다. 페이퍼를 세척하거나 메틸교환반응시키는 것 또는 심지어 블랭크 수치를 차감시키는 것 중 어느 하나가 페이퍼로부터 오염 물질들을 제거하기 위해 효과적인 전략이 아니기 때문에, 최소 오염 물질들을 함유한 채취 페이퍼의 선택은 빠른 지방산 조성 시험을 위해 중요하다. 본 발명자들은 Whatman 실리카 겔 페이퍼 및 Watman 유리 마이크로섬유 필터에 대한 임의의 유의미한 오염 물질들을 검출할 수 없었으며, 이들은 심지어 페이퍼 상의 혈액의 양이 낮을(25㎕) 때에도 생혈 중의 지방산 조성과 동일한 지방산 조성 결과를 나타내었다. 또한, 본원에 제시된 실험 결과들은 또한, 니트릴 글러브 및 셀로판 백의 사용이 샘플 수집, 처리 및 저장 동안에 잠재적인 오염으로부터 혈반 샘플들을 방지할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 모세 혈반의 비교 및 지방산 상태의 통상적인 측정
모세 혈액 및 정맥혈 둘 모두를 50명의 피검체로부터 채취하였다. 모든 피검체들 중에서, 35명은 어유 보충물을 거의 소비하지 않았거나, 소비한 경우에, 단지 소량(하루에 < 3 ml)을 소비하였으며, 이들 중 15명은 다량의 어유 보충물(~15 ml, MAXEPA)을 소비하였다.
한 방울의 모세 혈액(30 내지 50 ㎕)을 2㎎/㎖ BHT 및 5㎎/㎖ EDTA로 함침된 Whatman 실리카 겔 페이퍼 상에 흡수시키고, 실온(19 내지 23℃)에서 5 내지 6시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 혈반 샘플들을 건조시킨 직후에, 이러한 샘플들을 에스테르교환시키고, 얻어진 FAME를 GC로 분석하였다. 정맥 천자로 채취된 혈액에 대하여, 전체 지질에 대해 500 ㎕의 전혈을 클로로포름/이소프로판올(2:1, v/v)로 추출하였다. 나머지 혈액을 4℃에서 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리하여 혈장 및 적혈구(RBC)를 분리하였다. 혈장 및 RBC 중의 전체 지질들을 각각 클로로포름/메탄올(2:1, v/v) 또는 클로로포름/이소프로판올(2:1, v/v)을 사용하여 추출하고, 인지질 분획을 박막 크로마토그래피로 전체 지질로부터 분리하였다. 이러한 결과는 표 10에 나타내었다.
표 10. 모세 DBS와 통상적인 검정으로부터의 지방산 조성
Figure pct00010
개개의 지방산 상태가 다양한 방식으로 보고되어 있기 때문에, 건조된 혈반 중의 지방산 스펙트럼을 혈액 중의 지방산들을 보고하는 표준 방식과 비교하는 것이 중요하다. 이러한 것들은 전혈 추출물, 혈장 인지질, 및 적혈구 지방산을 포함하였다. 또한, 이러한 혈액 분획들 중 각각에서의 지방산 집단들, 예를 들어 EPA+DHA(오메가 3 지수)는 건조된 혈반들 중에서 발견된 유사한 집단들과 비교되었다.
여기에서의 결과들은 건조된 모세 혈반 지방산 조성과 표준 혈액 분획들 중에서 확인된 상응하는 지방산 수치들 간에 높은 상관 관계가 있으며(표 11) 이러한 것들이 단순한 방정식으로 표현될 수 있다는 것을 입증한 것이다(도 4 내지 7 참조).
표 11. 건조된 모세 혈반과 통상적인 검정 간의 지방산 조성에 대한 보정
Figure pct00011
실시예 6 - 지방산 안정성에 대한 저장 온도의 효과
건조된 혈반 중의 지방산들의 안정성에 대한 저장 온도의 영향을 시험하였다. 혈액을 2㎎/㎖ BHT 및 5㎎/㎖ EDTA로 함침된 Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼들 상에서 스팟팅하고, 5시간 동안 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 혈반 샘플들을 건조제의 존재 하에 지퍼락 알루미늄 호일 백에서 -20℃, 4℃ 및 실온(19 내지 23℃)에서 저장하였다. 건조된 혈반 샘플들의 지방산 조성을 상술된 바와 같이 5시간, 2주 및 4주 후에 분석하였다. 이러한 결과들은 하기 표 12에 나타내었다.
일반적으로, 4주 저장에 걸쳐 -20℃, 4℃ 및 실온(19 내지 23℃)에서 저장된 건조된 혈반 샘플들 중에서 지방산 조성의 유의미한 차이가 존재하지 않았다.
표 12. 상이한 온도에서 4주에 걸쳐 저장된 실리카 겔 로딩된 페이퍼 상의 건조된 혈반들의 지방산 조성
Figure pct00012
실시예 7 - 고형 배지 상에서의 저장 수명의 효과
고형 배지의 안정성에 대한 저장 기간의 영향을 시험하였다. Whatman 실리카 겔 크로마토그래피 페이퍼들을 2㎎/㎖ BHT 및 5㎎/㎖ EDTA로 함침시키고, 사용하기 1달 및 2달 전에 저장하였다. 혈액을 저장된 페이퍼들, 뿐만 아니라 새로이 제조된 보호제 용액(2㎎/㎖ BHT + 5㎎/㎖ EDTA)으로 처리된 페이퍼들 둘 모두 상에서 스팟팅하였다. 혈반들을 공기 중에서 5시간 동안 건조시키고, 실온(19 내지 23℃에서 건조제가 존재하는 지퍼-락 알루미늄 호일 백에서 저장하였다. 건조된 혈반 샘플들의 지방산 조성을 5시간, 2주 및 4주 후에 상술된 바와 같이 분석하였다. 이러한 결과들은 하기 표 13 및 도 8에 나타내었다.
표 13. 실온에서 4주에 걸쳐 저장된 새로이 제조되거나 이전에 제조된 실리카 겔 로딩된 페이퍼 상에서 혈반들의 지방산 조성
Figure pct00013
일반적으로, 이러한 결과들은, 사용하기 2달 전에 사전 제조된 고형 배지가 새로이 제조된 고형 배지와 동일한 LCPUFA를 안정화시키는 효율을 갖는다는 것을 입증하였다. 본 실시예에서 2달 동안 저장 수명이 조사되었지만, 이러한 결과들은 사전 제조된 고형 배지가 보다 긴 저장 수명을 가질 수 있다는 가능성을 명확하게 나타낸다.
참조문헌:
1. W.C. Tu, et al. 2010. Omega-3 long chain fatty acid synthesis is regulated more by substrate levels than gene expression. Prostaglandins , Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 83, 61-68.
2. Min, Y.J., et al. 2011. Effect of storage temperature and length on fatty acid composition of fingertip blood collected on filter paper. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 84, 13-18.

Claims (74)

  1. 지방산들, 또는 지방산들을 포함하는 샘플을, 고체 매트릭스(solid matrix), 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지(solid medium)에 적용하는 것을 포함하며, 이때 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 지방산들을 안정화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 오염 물질들이 포화 지방산들인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리(fibreglass) 및 다공성 세라믹들로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 및 유리-기반 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 실리카 겔-로딩된 페이퍼(silica gel-loaded paper)인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 유리 마이크로섬유 필터인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 체액이 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  12. 제11항에 있어서, 체액이 혈액인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 킬레이트제가 에틸렌디아민-테트라아세트산, 아스코르브산 또는 이의 염들, 또는 시트르산 또는 이의 염들인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논인 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제가 아스코르브산 및/또는 에틸렌디아민-테트라아세트산이며, 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산들이 불포화 지방산들인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 배지가 스트립(strip) 형태인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 스트립이 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 갖는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제(들)가 고형 배지 상에 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제(들)가 고형 배지 상에 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 지방산들 또는 지방산들을 포함하는 유체를, 유리 마이크로섬유 필터 또는 실리카 겔-로딩된 페이퍼, 에틸렌디아민-테트라아세트산 및/또는 아스코르브산 및 부틸화된 하이드록시톨루엔을 포함하는 고형 배지에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  22. 지방산들을 포함하는 샘플의 지방산 조성을 측정하는 방법으로서,
    (a) 샘플이 고체 매트릭스에 흡수되도록, 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지에 샘플을 적용하되, 이때 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 단계; 및
    (b) 고체 매트릭스에 흡수된 샘플의 지방산 조성을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 오염 물질들이 포화 지방산들인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹들로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 및 유리-기반 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  28. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 실리카 겔-로딩된 페이퍼인 방법.
  29. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 유리 마이크로섬유 필터인 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 생물학적 샘플이 체액인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 체액이 혈액, 타액, 모유, 소변, 정액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  33. 제32항에 있어서, 체액이 혈액인 방법.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 킬레이트제가 에틸렌디아민-테트라아세트산, 아스코르브산 또는 이의 염들, 또는 시트르산 또는 이의 염들인 방법.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논인 방법.
  36. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제가 아스코르브산 및/또는 에틸렌디아민-테트라아세트산이며, 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔인 방법.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가
    (i) 고체 매트릭스에 흡수된 샘플의 적어도 일부를 추출하여 유도체화된 지방산들을 포함하는 추출물을 제공하고,
    (ii) 유도체화된 지방산들의 양을 기준으로 하여 샘플의 지방산 조성을 측정하는 것
    을 포함하는 방법.
  38. 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제, 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하며, 이때 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 고형 배지.
  39. 제38항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지.
  40. 제39항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 고형 배지.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 오염 물질들이 포화 지방산들인 고형 배지.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹들로 이루어진 군으로부터 선택된 고형 배지.
  43. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 및 유리-기반 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택된 고형 배지.
  44. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 실리카 겔-로딩된 페이퍼인 고형 배지.
  45. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 유리 마이크로섬유 필터인 고형 배지.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 킬레이트제가 에틸렌디아민-테트라아세트산, 아스코르브산 또는 이의 염들, 또는 시트르산 또는 이의 염들인 고형 배지.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논인 고형 배지.
  48. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제가 아스코르브산 및/또는 에틸렌디아민-테트라아세트산이며, 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔인 고형 배지.
  49. 제38항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 배지가 스트립 형태인 고형 배지.
  50. 제49항에 있어서, 스트립이 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 갖는 고형 배지.
  51. 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제(들)가 고형 배지 상에 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 고형 배지.
  52. 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제(들)가 고형 배지 상에 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 양으로 존재하는 고형 배지.
  53. 제38항에 있어서, 상기 배지가 유리 마이크로섬유 필터 또는 실리카 겔-로딩된 페이퍼, 에틸렌디아민-테트라아세트산 및/또는 아스코르브산 및 부틸화된 하이드록시톨루엔을 포함하는 고형 배지.
  54. 고체 매트릭스, 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 포함하는 고형 배지를 제조하는 방법으로서,
    고체 매트릭스를 포함하는 고형 배지를 제공하는 단계, 및
    고형 배지에 적어도 하나의 킬레이트제 및 적어도 하나의 항산화제를 적용하는 단계
    를 포함하며, 이때 고체 매트릭스가 약 2 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 1 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 고체 매트릭스가 약 0.5 ㎍/㎠ 미만의 오염 물질들을 포함하는 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 오염 물질들이 포화 지방산들인 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 유리-기반 매트릭스, 페이퍼-기반 매트릭스, 셀룰로오스-기반 매트릭스, 친수성 폴리머들, 폴리테트라플루오로에틸렌, 섬유 유리 및 다공성 세라믹들로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  59. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 페이퍼, 페이퍼-기반 매트릭스 및 유리-기반 매트릭스로 이루어진 군으로부터 선택된 방법.
  60. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 실리카 겔-로딩된 페이퍼인 방법.
  61. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 매트릭스가 유리 마이크로섬유 필터인 방법.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 킬레이트제가 에틸렌디아민-테트라아세트산, 아스코르브산 또는 이의 염들, 또는 시트르산 또는 이의 염들인 방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 t-부틸하이드로퀴논인 방법.
  64. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제가 아스코르브산 및/또는 에틸렌디아민-테트라아세트산이며, 항산화제가 부틸화된 하이드록시톨루엔인 방법.
  65. 제54항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항산화제 및 적어도 하나의 킬레이트제가 고형 배지에 단일 용액, 또는 하나의 용액이 적어도 하나의 항산화제를 포함하고 하나의 용액이 적어도 하나의 킬레이트제를 포함하는 별도의 용액들의 형태로 적용되는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 용액(들)이 알코올 및 물을 포함하는 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 용액 중의 적어도 하나의 항산화제의 농도가 약 0.1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL인 방법.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중의 적어도 하나의 킬레이트제의 농도가 약 1 ㎎/mL 내지 약 10 ㎎/mL인 방법.
  69. 제54항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 배지가 스트립 형태인 방법.
  70. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 스트립에 적용되는 용액의 양이 약 1 내지 500 ㎕인 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 스트립이 약 1 ㎝ × 3 ㎝의 치수를 갖는 방법.
  72. 제38항 내지 제53항 중 어느 한 항의 고형 배지를 포함하는 키트.
  73. 제73항에 있어서, 피검체로부터 지방산들을 포함하는 샘플을 획득하기 위한 날카로운 물체(sharp object)를 추가로 포함하는 키트.
  74. 제73항에 있어서, 샘플이 혈액인 키트.
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