KR20140127864A

KR20140127864A - 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법

Info

Publication number: KR20140127864A
Application number: KR1020147025065A
Authority: KR
Inventors: 나리만 굴리아모브
Original assignee: 유한회사 뉴메디컬 테크놀로지스
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2014-11-04
Also published as: AP2014008052A0; US11505837B2; WO2013192636A1; IL235962B; EP3517627A1; US20210140001A1; CN104066848A; US20170073779A1; ZA201405954B; US20150125852A1; EP2818558B1; IL235962A0; US10570466B2; EA201401097A1; US20230078548A1; US9873922B2; EP3517628A1; US9957579B2; US9879329B2; US10920289B2

Abstract

본 발명은 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것으로, 림프조직 친화성 바이러스의 감염 여부를 보다 신뢰성 있게 결정하고, EIA 및 PCR 시험 중 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 검사하는 혈액에서 위음성(false negative) 반응을 없애며, EIA 또는 PCR 방법의 임계 감도(sensitivity threshold)보다 낮은 바이러스 입자의 농도를 갖는 생체 시료에서 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 평가 및 탐지하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것이다.
즉, 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법은 생체 시료를 수집하는 단계와, 상기 생체 시료가 바이러스 RNA 또는 DNA를 함유하고 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 림프구 현탁액은 건강한 사람의 혈액에서 채취되며, 동일 부피의 생체 시료를 상기 림프구 현탁액에 첨가한다. 상기 두 조합물(combination)을 혼합하여, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양한 후, 상기 림프구에서 혈장을 씻어낸 후 파괴한다. 그 후, 림프구 세포질에 대하여 PCR 검사를 수행한다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지될 경우에는 상기 바이러스가 생존능을 유지하고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되지 않을 경우에는 상기 바이러스가 비활성화되어 있음을 나타낸다.

Description

림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법{METHOD FOR EVALUATION OF VIABILITY OF VIRUSES WITH LYMPHOTROPISM PROPERTIES}

본 발명은 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것으로, 림프조직 친화성 바이러스의 감염 여부를 보다 신뢰성 있게 결정하고, EIA 및 PCR 시험 중 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 검사하는 혈액에서 위음성(false negative) 반응을 없애며, EIA 또는 PCR 방법의 임계 감도(sensitivity threshold)보다 낮은 바이러스 입자의 농도를 갖는 생체 시료에서 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 평가 및 탐지하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것이다.

생물학적 기질(biological substrates)에 있는 바이러스를 세포 배양액에서 분리하여 탐지하는 방법은 공지의 기술이다. 세포배양법에 의해 분리된 바이러스는 혈구흡착법(haemadsorption), 혈구응집법(hemagglutination) 또는 면역형광법(immunofluorescence)의 방법에 의해 확인할 수 있다. 시의적절한 샘플 채취와 이를 신속히 실험실 내 배양액으로 이동하는 것은 배양을 통해 바이러스를 분리함에 있어서 아주 중요하며, 박테리아와 곰팡이의 증식을 억제하면서 바이러스 생존능을 유지할 수 있다.(Laboratory diagnostic of virus infections, Online: http://www.center-hc.ru/)

수많은 바이러스들, 특히 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스 (HCV) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)는 인간 세포에 영향을 미치는 안트로포노틱(anthroponotic) 바이러스들로서 오직 사람에게서만 질병을 야기한다. 이들에 대한 실험 모델은 아직 없으며, 특히 우즈베키스탄에서는 배양된 배양액이 없으며, 생체 외(in vitro)에서 이들 바이러스의 세포병원성 특성 및 바이러스 생존능을 연구할 수 있다. 세포 배양액에서 바이러스 분리법은 그 복잡성으로 인해 진단 목적으로는 사용되지 않는다.

생체 시료(biological material)에 있는 바이러스를 면역학적 방법으로 탐지하는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 있는데, 이 방법은 감염세포로부터 추출되거나 바이러스 항원 수에 대한 항체 탐지에 의해 유전공학적으로 생산된 특수 바이러스 단백질들을 사용한다.

HCV와 같은 일부 바이러스에 있어서, EIA는 항체만을 탐지하기 때문에 감염의 진행 및 활성을 평가하는 능력이 상당히 제한되어 있으며, 또한, EIA는 그 감응 임계점으로 인해 그 임계점 이하에서는 바이러스의 탐지가 불가능하다.

생체 시료에서 림프조직 친화성을 갖는 바이러스를 탐지하는 공지 방법에 가장 근접한 방법은 바이러스 생존능 평가방법이며, EIA 및 PCR 검사의 위음성을 제거하는 것은 생체 시료를 채취하여 바이러스 RNA 또는 DNA를 탐지하고 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 바이러스 RNA 또는 DNA의 존재여부를 탐지하는 것이다

상기 방법은 생체 시료에서 병원균을 직접 탐지하는 방법으로서 바이러스 프로세스의 활성을 평가할 수 있다. PCR 결과 양성 반응이 나타나면 간 및 혈액에 바이러스가 존재할 가능성이 높다. 림프조직 친화성을 갖는 바이러스가 림프조직에서 상당히 높은 농도(PCR의 위음성)를 유지할 수는 있지만, 생체시료(혈장 또는 혈액 단백질, 조직 또는 기관의 부검 물질)를 PCR 검사를 통해서 림프조직 친화성을 갖는 바이러스에 의한 감염을 항상 탐지할 수는 없으며, 마찬가지로 그 반대의 경우에 있어서도, 바이러스가 유지(persistence)되지 않음에도 불구하고 PCR결과 양성반응이 나타날 수도 있다. 또한, PCR은 감도 임계점(sensitivity threshold)이 있어서 그 이하에서 바이러스의 탐지가 불가능하다.

Ilyina, E.N. et. al. Chronic virus liver diseases "Khronicheskiye virusnye zabolevaniya pecheni Methodological manual for physicians Metodicheskoye posobiye dlya vrachej Moscow, 2001, p. 7-11

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로, 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법은 생체 시료를 수집하는 단계와, 상기 생체 시료가 바이러스 RNA 또는 DNA를 함유하고 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함한다. 또한, 림프구 현탁액은 건강한 사람의 혈액에서 채취되며, 동일 부피의 생체 시료를 상기 림프구 현탁액에 첨가한다. 상기 두 조합물(combination)을 혼합하여, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양한 후, 상기 림프구에서 혈장을 씻어낸 후 파괴한다. 그 후, 림프구 세포질에 대하여 PCR 검사를 수행한다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지될 경우에는 상기 바이러스가 생존능을 유지하고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되지 않을 경우에는 상기 바이러스가 비활성화되는 것을 평가하는 데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 바이러스 입자 농도가 낮은 생체 시료에서 림프조직 친화성 바이러스를 탐지하는 방법, 이들의 생존능 평가 방법, EIA 및 PCR 검사 결과 중 위음성(false-negative) 결과를 제거하는 방법에 대한 것으로서, 의학 산업 및 바이오테크놀로지 분야에서 사용하는 데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 감염 탐지에 대한 신뢰도를 높이고, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 존재여부 확인을 위한 혈액 검사의 위음성 결과를 EIA 및 PCR을 통해 제거하며, 바이러스 농도가IFA 임계점 또는 PCR 감응도 이하인 생체 시료에 있는 림프조직 친화성을 갖는 바이러스를 탐지하는 데 목적이 있다.

본 발명은 생체 시료를 샘플링하고, 바이러스 RNA 또는 DNA를 PCR을 이용하여 탐지하고, 추가로 건강한 사람의 혈액에서 얻은 림프구 현탁액과 동일한 양의 생체 시료를 혼합하여 교반 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 배양 후, 혈장으로부터 림프구를 세척 후 상기 림프구를 파괴하고, 상기 림프구 세포질에 대하여 PCR을 수행하여, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존능을 평가함으로써 성취할 수 있다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되면 이는 바이러스의 생존능이 보존되고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되지 않으면 바이러스가 림프구 세포질에서 비활성화되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 혈장 또는 혈청, 조직 또는 기관의 부검 샘플, 의료기구 세척 시 얻은 물질들은 생체 시료로 사용하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명에서 상기 방법을 이용하여 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 생존능을 평가하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 림프조직 친화성을 갖는 바이러스에 감염된 것으로 추정되는 환자의 혈액을 채취하여 EIA 및 PCR 검사의 위음성 결과를 제거하고, 상기 혈액 6-8 ml를 2.0 ml의 생리 식염수 및 헤파린 2 내지 3방울을 포함하는 시험관에 넣고, 혈액으로부터 림프구를 분리 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 혈장으로부터 세척하고 파괴한 후, 림프구의 세포질에 대하여 PCR을 수행하여; 림프구의 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되면 상기 환자의 혈액에 바이러스가 존재하는 것을 나타내고, 림프구의 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 존재하지 않을 경우에는 상기 환자의 혈액에 바이러스가 없는 것으로 판단하는 방법인 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명에서 환자의 림프구의 내용물에 대하여 PCR 검사를 수행하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 본 발명에 따른 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법은 생체 시료를 수집하는 단계와, 상기 생체 시료가 바이러스 RNA 또는 DNA를 함유하고 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함한다. 또한, 림프구 현탁액은 건강한 사람의 혈액에서 채취되며, 동일 부피의 생체 시료를 상기 림프구 현탁액에 첨가한다. 상기 두 조합물(combination)을 혼합하여, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양한 후, 상기 림프구에서 혈장을 씻어낸 후 파괴한다. 그 후, 림프구 세포질에 대하여 PCR 검사를 수행한다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지될 경우에는 상기 바이러스가 생존능을 유지하고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되지 않을 경우에는 상기 바이러스가 비활성화되는 것을 평가하는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 바이러스 입자 농도가 낮은 생체 시료에서 림프조직 친화성 바이러스를 탐지하는 방법, 이들의 생존능 평가 방법, EIA 및 PCR 검사 결과 중 위음성(false-negative) 결과를 제거하는 방법에 대한 것으로서, 의학 산업 및 바이오테크놀로지 분야에서 사용하는 효과가 있다.

아울러, 본 발명은 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 감염 탐지에 대한 신뢰도를 높이고, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 존재여부 확인을 위한 혈액 검사의 위음성 결과를 EIA 및 PCR을 통해 제거하며, 바이러스 농도가 IFA 임계점 또는 PCR 감응도 이하인 생체 시료에 있는 림프조직 친화성을 갖는 바이러스를 탐지하는 데 효과가 있다.

본 발명은 생체 시료를 샘플링하고, 바이러스 RNA 또는 DNA를 PCR을 이용하여 탐지하고, 추가로 건강한 사람의 혈액에서 얻은 림프구 현탁액과 동일한 양의 생체 시료를 혼합하여 교반 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 배양 후, 혈장으로부터 림프구를 세척 후 상기 림프구를 파괴하고, 상기 림프구 세포질에 대하여 PCR을 수행하여, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존능을 평가함으로써 성취할 수 있다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되면 이는 바이러스의 생존능이 보존되고 있음을 나타내며; 림프구 세포질에 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되지 않으면 바이러스가 림프구 세포질에서 비활성화되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 림프조직 친화성을 갖는 바이러스에 감염된 것으로 추정되는 환자의 혈액을 채취하여 EIA 및 PCR 검사의 위음성 결과를 제거하고, 상기 혈액 6-8 ml를 2.0 ml의 생리 식염수 및 헤파린 2 내지 3방울을 포함하는 시험관에 넣고; 혈액으로부터 림프구를 분리 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 혈장으로부터 세척하고 파괴한 후, 림프구의 세포질에 대하여 PCR을 수행하여; 림프구의 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지되면 상기 환자의 혈액에 바이러스가 존재하는 것을 나타내고, 림프구의 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 존재하지 않을 경우에는 상기 환자의 혈액에 바이러스가 없는 것으로 판단하는 방법인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

수많은 바이러스들, 특히 HBV, HCV 및 HIV 바이러스는 단핵 혈액세포에서 복제할 수 있으며, 특히 림프구 및 대식세포에서 복제가 가능함이 알려져 있다. HBV 및 HCV 바이러스에 감염되면 모든 간염 진행과 더불어 동시에 간에서 염증과정이 진행되며 다양한 수준의 T 림프구 감소증과 B 림프구 감소증을 동반하는 2차 면역결핍증, T 림프구 (헬퍼 T세포 및 억제 T세포)의 조절 부분모집단(regulatory subpopulations)의 불균형, 면역조절 지표(IRI)의 감소 및 이상 감마 글로블린 혈증(dysgammaglobulinemia) 등이 초래됨이 알려져 있다. 면역결핍증의 정도 및 단계는 간에서의 병적 과정의 진행 정도(degree of pathogenic process)와 무관하다.

만성 B형 간염 및 C형 간염 환자들은 일정 시간 경과 후 간 조직에서 병적 과정의 강도가 미약한 증세로부터 드러나는 정도까지 그 차이가 있으나, 이와 상관없이 일정하게 지속적으로 2차 면역 결핍증을 초래한다.

각종 질병 분류학(nosological) 형태의 만성 바이러스 간염에 있어서 간 조직 손상 정도 및 2차 면역 결핍 정도를 분리하는 것은 HBV 및 HCV감염에 있어서 간염과 2차 면역 결핍증이 상호 관련되어 서로 악화시킨다는 주장을 뒷받침하지만 상호 조건부적(mutually conditional)이지 않다. 즉, HBV 및 HCV는 간 친화성과 더불어 표출되는 림프조직 친화성 - 2차 면역결핍증을 초래하는 직접적 원인 - 을 갖고 있다. HBV 및 HCV 감염에 있어서 간 조직 손상과 면역 결핍증 정도의 임상적 양상의 차이는 이들 바이러스의 간 친화성 및 림프조직 친화성의 차이에 기인한다.

즉, 이들 바이러스의 간 친화성 및 림프조직 친화성 정도에 있어서의 편차가 발병(pathogenesis)의 차이, 만성 HBV 및 HCV 감염의 각 단계에 있어서 임상적 양상과 항바이러스 치료 효과의 패턴을 결정한다.

HBV, HCV 및 HIV가 야기하는 2차 면역 결핍증 외에 림프조직 친화성은 이들 바이러스의 역학적 양상 (epidemiological features), 전이 메커니즘, 기회 감염(opportunistic infection)(빈번한 호흡기 질환 및 장관 감염(intestinal infection))의 공통점, 특히, 유기체의 각종 조직에서 림프 육아종(lymphogranulomatosis)을 발병시킴이 확인되었다. 각종 유기체의 기관 및 조직에서 림프 육아종인 림프 소절 클러스터즈(lymphoid follicles' clusters)의 발병은 림프 세포계(lymphoid cell system)의 바이러스 감염이 내재적 원인으로 생각된다.

HBV의 림프조직 친화성을 고려해 보면, 혈청 역가(serum titer)와 상관없이, HBV는 림프 성분의 세포질에서 고농도를 영구적으로 유지할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 현상은 바이러스 입자 농도가 EIA 또는 PCR검사의 임계 검사 감도 이하의 농도를 갖고 있는 생체 시료에서 신뢰도를 높이고, EIA 및 PCR에서의 위음성을 제거하며, 림프조직 친화성 바이러스를 탐지하는 방법에 사용된다.

본 발명의 발명자들은 바이러스 생존능 - 생체 외 배양 동안 이들 바이러스가 건강한 사람의 림프구에서 세포 내적으로(intracellularly) 통과 및 지속하는 능력 - 을 평가하는 방법에서 HBV, HCV 및 HIV의 림프조직 친화성을 이용하였다.

림프조직 친화성을 갖는 바이러스, 특히 HBV, HCV 및 HIV바이러스를, 장기 보관 후 이들의 생존능을 평가하려면 항바이러스 치료법 외에도 이들 바이러스에 대한 각종 바이러스 제거용(disinfecting) 물리 화학적 요소들의 항바이러스 효능을 조절하는 것이 필요하다.

림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존능 평가 및 탐지 방법을 하기에 기재하였다.

이하, 본 발명은 제조예, 실시예, 및 시험예에 의해 상세히 설명한다.

하기 제조예, 실시예, 및 시험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 제조예, 실시예, 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1 > 림프조직 친화성을 갖는 바이러스 현탁액의 제조예 1

바이러스 현탁액을 제조하기 위해, 생체 시료(혈장 또는 혈청, 조직 또는 기관의 부검 샘플, 의료기구의 세척물)을 수득한다. 그 다음, 상기 생체 시료에 대해 정량적 PCR을 수행하여 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부 및 바이러스 역가(virus titer)를 검증한다. 생체 시료를 포함하는 바이러스는 -25 ℃이하의 냉장고에 냉동 보관한다.

< 제조예 2 > 건강한 사람의 검체로부터 림프구 현탁액 제조예 2

a) 건강한 자원자들을 EIA를 통해 림프조직 친화성 바이러스의 감염 여부를 검사한다. 연구대상 바이러스에 대해 음성 결과를 보이는 건강한 사람들의 림프구를 연구한다.

b) 충분한 양의 림프구를 얻기 위해 척골 정맥(ulnar vein)으로부터 20 내지 30 ml의 혈액을 금식 중인 건강한 사람으로부터 채취한다. 그 다음, 각 7 내지 8 ml의 혈액을 2 ml의 생리 식염수 및 2 내지 3 방울의 헤파린(5000 ME/ml의 헤파린 농도; 3방울은 750 ME/ml 의 헤파린 함유)을 포함하고 있는 원심분리관에 옮기고, 그 결과 얻어지는 용액을 충분히 교반한다.

c) 밀도가 1.077 g/ml인 피콜-페로그라핀 구배(ficoll-verografin gradient)에서 혈액을 함유하는 전 헤파린(whole heparin)으로부터 상기한 방법에 따라 림프구를 분리한다 (Garib, F.Yu., Gurary, N.I., Garib, V.F. "Sposob opredeleniya subpopulyatsij limfotsitov (Determination method of lymphocytes' subpopulations)" // Rasmij Akhborotnoma. Tashkent, 1995, #1, p. 90 UZ DP 2426). 2 ml의 피콜-페로그라핀 구배를 깨끗한 원심분리관에 부어 넣은 후, 헤파린화된 혈액을 표면에 놓고 1500 rpm으로 20분간 원심 분리한다. 원심분리를 진행하는 동안, 림프구를 제외한 모든 혈액 세포들은 피콜-페로그라핀 구배를 통과시킨다. 혈장은 상기 구배 이상으로 남게 된다. 피콜-페로그라핀 구배와 혈장의 경계에 순수한 림프구로 구성된 유난히 혼탁한(turbid) 고리가 형성된다. 림프구를 갖는 상기 고리는 피펫을 이용하여 조심스럽게 펌프하여 깨끗한 원심분리관으로 이동시킨다.

d) 림프구는 10 ml의 생리 식염수로 2 내지 3회 세척 후 1500 rpm으로 20분간 원심 분리한 후, 추가로 1500 rpm으로 20분간 원심 분리한다

e) 최종 원심분리 후 상층액을 제거한다. 림프구를 포함하는 침전물을 희석 후 600 ml의 생리 식염수에 재현탁한다. 림프구 현탁액은 4 ℃에서 하루 이상 보관하면 안 된다.

< 시험예 1 > 인간 림프구에서 림프조직 친화성 바이러스의 세포내적 통과 및 유지에 대한 생체 외( in vitro ) 평가

1) 림프조직 친화성 바이러스를 함유한 생체 시료를 냉장고에서 꺼내어 실온에서 해동한다.

2) 생체 시료와 동일한 양(300 ㎕)의 바이러스와 건강한 사람의 림프구를 피펫을 이용하여 깨끗한 원심분리관으로 옮긴다; 상기 내용물들을 혼합 후 37 ?의 항온기에서 6 내지 8시간 (생체 외에서 바이러스를 림프구와 함께) 배양한다. 시험관을 매 1.5 내지 2시간마다 흔들어서 혼합한다.

3) 림프구의 세척.

시험관을 항온조에서 꺼낸 후 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하고, 혼합 후 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 림프구들은 시험관의 바닥에 침전되며 상등액(혈장과 식염수의 혼합물)을 모두 제거한다. 림프구들은 생리 식염수로 2 내지 3회 세척 후 2 내지 3회 침전시킨다. 최종 원심분리 후, 상등액을 제거하고 림프구 현탁액(침전물)을 500 ㎕의 생리 식염수에 희석한 후 1.5 ml 잠금 튜브(에펜도르프 튜브; Eppendorf tube)에 옮긴다.

4) 그 다음에, 상기 튜브를 가정용 냉장고의 냉동고에 하룻밤 동안 넣어 둔다. 림프구들은 냉동조건에서 파괴된다.

5) 파괴된 림프구들의 막 제거.

그 다음 날, 상기 튜브들을 냉동고에서 꺼내어 실온에서 해동한다. 상기 파괴된 림프구를 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 그 막을 제거한다. 림프구의 막은 튜브의 바닥에 침전되면 림프구의 세포질 내용물은 상등액에 위치한다.

6) 상기 튜브로부터 상등액을 옮긴 후 감염환자의 혈장에 있던 림프구의 세포질에 있는 바이러스 RNA 또는 DNA를 정량 PCR 한다.

< 결과 분석 >

1. 림프구의 세포질에 바이러스 RNA 또는 DNA의 존재 여부에 대한 PCR 검사결과가 양성이면 바이러스 생존능이 잔존함을, 즉 생체 외에서 인간 림프구를 통과 및 유지하는 활성이 있음을 의미한다.

2. 림프구의 세포질에 바이러스 RNA 또는 DNA의 존재 여부에 대한 PCR검사 결과가 음성이면 바이러스 생존능의 상실(비활성화), 즉 생체 외에서 인간 림프구를 통과 및 유지하는 활성이 상실되었음을 의미한다.

상기 방법들을 하기 실시예를 통하여 입증하고자 한다:

< 실시예 1 > 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 분석의 실시예 1

C형 간염 항바이러스 치료를 받은 환자의 혈액을 척골 정맥으로부터 채취한다. 혈장을 전혈(whole blood)로부터 분리한 후 정량 PCR을 수행하여 HCV 바이러스의 존재 여부 및 바이러스 역가의 정량을 확인한다. PCR 결과는 음성이고 검사한 혈장은 냉동고에 -25 ℃이하의 온도로 보관한다.

동시에, 오전에 건강한 인간 자원자의 척골 정맥에서 20 내지 30 ml의 혈액을 채취한다. 혈장의 일부에 대해 PCR을 수행하여 림프조직 친화성 바이러스의 감염 여부를 확인한다. 상기 건강한 사람의 림프구 중 감염 결과 음성반응을 보이는 림프구는 추후 연구에 사용한다. 그 다음에, 7 내지 8 ml의 상기 혈액을 2 ml 의 생리 식염수 및 3 방울의 헤파린이 포함된 원심분리관에 옮긴다 ("헤파린" 농도는 5000 ME/ml이고, 750 ME/ml 농도의 헤파린을 3방울 포함함). 튜브에 있는 용액을 완전히 혼합한다. d=1.077 g/ml의 밀도를 갖는 피콜-페로그라핀 구배에서 헤파린화한 전혈(whole heparinized blood)로부터 림프구를 가리브 (Garib, F.Yu. et al method)의 방법에 따라 분리한다. 2 ml의 피콜-페로그라핀 구배를 깨끗한 원심분리관에 부은 후, 헤파린화한 혈액을 구배의 표면에 떨어뜨린 후, 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 림프구를 제외한 모든 혈액세포들은 피콜-페로그라핀 구배를 통과하여 그 아래에 침전한다. 혈장은 상기 구배 위에 존재한다. 피콜-페로그라핀 구배와 혈장의 경계에는 깨끗한 림프구 현탁액과 더불어 유난히 혼탁한 고리가 생성된다. 림프구를 갖는 고리를 피펫을 사용하여 조심스럽게 흡인하여 깨끗한 원심분리관으로 옮긴다. 상기 림프구들은 생리 식염수에 세척 후 2-3회 침전시킨다. 최종 원심분리 후, 상등액을 제거한다. 림프구를 포함하는 침전물을 600 ㎕의 식염수에 희석 후 재현탁한다. 림프구 현탁액은 4 ℃에서 하루 이상 보관할 수 없다.

검사용 혈장을 냉동고에서 꺼내어 실온에서 해동한다. 동일한 부피(300 ㎕)의 혈장 및 림프구 현탁액을 피펫을 사용하여 깨끗한 원심분리관에 옮겨서, 혼합 후 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 상기 튜브를 매 1.5 내지 2시간마다 흔들어서 혼합한다.

배양 후, 상기 튜브를 항온조에서 꺼내어, 6 내지 8 ml 의 식염수를 첨가하고, 혼합 후 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 림프구는 상기 튜브의 바닥에 침전된다. 상등액(혈장과 생리 식염수의 혼합물)을 제거한 후, 생리 식염수에 2 내지 3회 세척 후, 림프구를 상기와 동일하게 침전시킨다. 최종 원심분리 후, 상등액을 제거하고 림프구 현탁액(침전물)을 300 ㎕의 생리 식염수에 희석한 후 1.5 ml 잠금 튜브(에펜도르프 튜브)에 옮긴다.

그 후, 림프구 막을 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 넣어 파괴시킨다. 다음 날 튜브들을 실온에서 해동한 후, 상기 파괴된 림프구 막을 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 제거한다. 상기 막은 튜브의 바닥에 침전되고 림프구 세포질의 내용물은 상등액에 남게 된다. 상기 상등액을 튜브에서 회수하여 림프구의 세포질에 HCV 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위해 정량 PCR을 수행한다. HCV에 대한 PCR 양성 반응은 HCM 바이러스 생존능이 유지됨을 나타내며 따라서 추가적 항바이러스 치료가 필요하다.

< 실시예 2 > 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 분석의 실시예 2

B형 간염 항바이러스 치료를 받은 환자의 간에 구멍을 내어 간조직을 샘플링한다. 간 부검 샘플을 1.5 ml 생리 식염수에서 균질화한 후, 원심분리관에 옮기고, 1500 rpm으로 원심분리하여, 그 결과 얻어지는 상등액을 튜브에 옮긴다. 상기 상등액의 일부는 정량 PCR검사를 통해 HCV 바이러스의 존재 여부와 바이러스 역가의 정량을 확인한다. HCV에 대한 PCR 검사결과는 양성이다. 부검 샘플은 냉장고의 냉동고에 -25 ?이하로 저장한다.

건강한 사람의 림프구 현탁액은 < 실시예 1 >에 기재된 바와 같이 준비된다. 간 부검 샘플 균질화액(homogenate)의 상등액은 실온에서 해동한 후, 동일 부피(300 ㎕) 의 상등액과 림프구 현탁액을 자동 피펫을 이용하여 튜브에 넣고, 그 결과 얻어지는 용액을 혼합 후 37 ℃ 항온조에 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 시험관은 매 1.5 내지 2 시간마다 흔들어서 혼합한다.

상기 튜브를 항온조에서 꺼낸 후 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하고, 혼합 후 1500 rpm으로 20분 동안 원심분리한다. 림프구는 튜브의 바닥에 침전한다. 상등액(혈장 및 생리 식염수의 혼합물)을 완전히 제거한다. 상등액(혈장 및 생리 식염수의 혼합물)을 제거 후, 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하고, 림프구 침전은 상기와 동일하게 실행한다. 최종 원심분리 후, 상등액을 제거하고 림프구 현탁액(침전물)에 300 ㎕의 생리 식염수를 첨가 후, 시험관을 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 넣어 림프구 막을 파괴한다.

그 후 림프구 막을 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 넣어 파괴한다. 그 다음 날, 튜브를 실온에서 해동한다. 그 다음, 파괴된 림프구 막을 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 현탁액으로부터 제거한다. 상기 막은 튜브의 바닥에 침전하고, 림프구 내용물은 튜브의 상등액에 남게 된다. 상기 상등액을 튜브에서 회수하고 정량 PCR을 수행하여 림프구 세포질 내의 HBV 바이러스의 존재 여부를 확인한다. PCR 검사결과가 음성 반응이면 바이러스 생존능이 상실(비활성화)되었음을 의미한다.

< 실시예 3 > EIA 및 PCR 이 감도 임계점 이하인 생체 시료에서 림프조직 친화성 바이러스의 탐지

혈액센터에서, 6 내지 8 ml의 혈액의 혈장을 이용하여 림프조직 친화성 바이러스의 탐지한다. 상기 혈장의 일부에 대해 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 존재 여부 및 이들 바이러스 역가의 정량을 확인한다. 바이러스 존재유무에 대한 검사가 음성반응을 나타낸다. 검사한 혈장은 -25 ℃이하의 냉동고에 보관한다.

건강한 피검자의 림프구 현탁액을 하기 < 실시예 1 >과 같이 수행한다.

냉동고에서 검사용 혈장을 꺼내어 실온에서 해동한다. 동일 부피(300 ㎕)의 혈장 및 림프구 현탁액을 자동 피펫을 사용하여 깨끗한 원심분리관에 옮겨, 혼합한 후 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 상기 튜브는 매 1.5 내지 2 시간 마다 흔들어서 혼합한다.

상기 튜브를 항온조에서 꺼내어 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하고, 혼합 후 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 림프구는 튜브의 바닥에 침전한다. 상등액(혈장과 생리 식염수의 혼합물)은 완전히 제거한다. 상등액(혈장과 생리 식염수의 혼합물)을 제거 후 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하고 림프구 침전을 상기와 같이 실행한다. 최종 원심분리 후, 상등액을 제거하고 림프구 현탁액(침전물)을 300 ㎕의 생리 식염수에 희석한다.

그 후, 림프구 막을 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 넣어 파괴한다. 그 다음 날, 상기 튜브들을 실온에서 해동한다. 파괴된 림프구의 막을 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 현탁액으로부터 제거한다. 상기 림프구 막은 튜브의 바닥에 침전되고 림프구 세포질 내용물은 상등액에 남게 된다. 상등액을 튜브에서 회수하여 림프구의 세포질에 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부를 탐지하기 위하여 정량 PCR을 수행한다. PCR 결과 HCV에 대해 양성반응이 나타나면 공여자의 혈장에 HCV 바이러스가 존재하는 것을 의미하므로 (상기 혈장은) 헌혈에 부적합하다.

< 실시예 4 > EIA 및 PCR 검사에서 위음성 결과 제거

금식 중인 공여자의 척골 정맥에서 6 내지 8 ml의 혈액을 채취한다. 전혈을 튜브에 옮긴 후, 침전시켜서 혈장을 수득한다. 혈장의 일부를 사용하여 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 존재 여부를 확인하고 이들 바이러스의 역가를 정량한다. PCR 검사 결과들은 음성반응이다. 나머지 혈장은 튜브에 보관하고, 건강한 피검자의 림프구 현탁액을 < 실시예 1 >에 기재한 바와 같이 수행한다.

림프구는 가정용 냉장고에서 하룻밤 동안 냉동하여 분리 및 파괴한다. 그 다음 날, 상기 튜브를 실온에서 해동한다. 그 후, 파괴된 림프구를 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 현탁액으로부터 제거한다. 상기 림프구 막은 튜브의 바닥에 침전되고 림프구 세포질 내용물은 상등액에 남게 된다. 상등액을 튜브에서 회수하여 림프구의 세포질에 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부를 탐지하기 위하여 정량 PCR을 수행한다. PCR 결과 HBV에 대해 양성반응이 나타나면 혈액 공여자의 혈액에 HBV 바이러스가 존재하는 것을 의미한다.

표준 PCR로 검사 시, 우즈베키스탄에서 HBV 및 HCV 바이러스 탐지율은 2.7 %이다. 역학 데이터(epidemiological data)에 따르면, 감염 혈액 또는 이들 성분에 의한 신규 B형 간염 및 C형 간염 발병률은 2.2 내지 5.6 %이다. 관련 자료를 밝히고 수혈자의 HBV 감염을 없애고자 바이러스의 림프조직 친화성을 이용하였다.

309명의 혈액 공여자로부터 채취한 혈청을 사용하여 PCR을 통해 HBV 마커 탐지율을 조사했다.

PCR검사 결과 209개의 혈청 샘플 중 6개의 혈청에서 HBV가 탐지되었고, 이는 천체 혈청 공여자의 1.94 %에 해당한다. 동일한 PCR 검사(동일 혈청 고영자로부터 림프구 내용물 검사) 결과 309개의 샘플 중 17개에서 HBV가 탐지되었고, 이는 천체 혈청 공여자의 7.44 %에 해당한다. 따라서, 혈청을 표준 PCR로 검사한 결과 위음성 비율은 5.50 %이었고, 감염 혈액 또는 그 성분을 수혈 받은 수혈자의 HBV 감염 원인이 됨이 밝혀졌다.

혈액센터에서 PCR검사를 통해 림프구에서 바이러스의 존재여부를 확인함으로써, 혈액 또는 그 성분의 수혈에 따른 HBV, HCV, HIV 바이러스의 감염확률을 현저히 낮추거나 제거할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명에서 설명한 것은 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법을 위한 실시예에 불과한 것으로, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

Claims

바이러스 RNA 또는 DNA의 존재 여부를 탐지하기 위하여 PCR을 이용하여 생체 시료를 채취하는 단계를 포함하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 있어서, 상기 방법은 건강한 인간 검체로부터 동일한 양의 생체 시료와 림프구 현탁액을 혼합한 후 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 혈장으로부터 세척 후 파괴하고, 림프구의 세포질에 대하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여, 바이러스의 생존능을 나타내는 림프구의 세포질에 있는 바이러스 RNA 또는 DNA를 탐지하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 생체 시료는 혈장, 혈액 단백질, 생검 조직 및 기관, 및 의료기구 세척물 중 어느 하나 이상을 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가방법은 HBV, HCV 또는 HIV의 생존능을 평가하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법.
생체시료를 채취하는 단계를 포함하는, 바이러스 농도가 EIA 및 PCR 감응 임계점 이하인 생체시료에서 림프조직 친화성 바이러스를 탐지하는 방법에 있어서, 상기 방법은 건강한 사람의 혈액을 채집 후, 동일한 양의 생체 시료를 첨가하고, 혼합한 후 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 혈장으로부터 세척하고, 림프구를 파괴한 후, 림프구의 세포질에 대하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여, 바이러스의 존재를 나타내는 바이러스 RNA 또는 DNA를 세포질에서 탐지하며, 상기에서 검사된 생체 시료에 바이러스 RNA 또는 DNA가 존재하지 않을 경우에는 상기 생체 시료에 바이러스가 존재하지 않는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 탐지 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 생체 시료는 혈장 또는 혈액 단백질을 사용하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 탐지 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가방법은 HBV, HCV 또는 HIV의 생존능을 평가하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 탐지 방법.
림프조직 친화성 바이러스의 감염이 의심되는 환자의 혈액을 채취하는 것을 포함하는 위음성 (false-negative) EIA 및 PCR 결과를 제거하는 방법에 있어서, 상기 방법은 채취된 혈액 2.0 ml를 2.0 ml의 생리 식염수 및 2 내지 3 방울의 헤파린이 포함된 시험관에 넣은 후, 6 내지 8 ml의 혈액으로부터 림프구를 분리 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 혈장으로부터 세척하고, 림프구를 파괴한 후, 림프구의 세포질에 대하여 PCR을 수행하여, 환자의 혈액에서 바이러스의 존재 여부를 나타내는 바이러스 RNA 또는 DNA를 탐지하며, 상기에서 검사된 생체시료에 바이러스 RNA 또는 DNA가 존재하지 않을 경우에는 상기 환자의 혈액에 바이러스가 존재하지 않는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 탐지 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 환자의 혈액으로부터 분리된 림프구 세포질은 PCR을 통하여 검사하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성 바이러스의 탐지 방법.