KR20160139059A - 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것으로, 림프조직 친화성 바이러스의 감염 여부를 보다 신뢰성 있게 결정하고, EIA 및 PCR 시험 중 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 검사하는 혈액에서 위음성(false negative) 반응을 없애며, EIA 또는 PCR 방법의 임계 감도(sensitivity threshold)보다 낮은 바이러스 입자의 농도를 갖는 시료에서 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 평가 및 탐지하는 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법에 관한 것이다.
즉, 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법은 시료를 수집하는 단계와, 상기 생시료가 바이러스 RNA 또는 DNA를 함유하고 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 림프구 현탁액은 건강한 사람의 혈액에서 채취되며, 동일 부피의 시료를 상기 림프구 현탁액에 첨가한다. 상기 두 조합물(combination)을 혼합하여, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양한 후, 상기 림프구에서 혈장을 씻어낸 후 파괴한다. 그 후, 림프구 세포질에 대하여 PCR 검사를 수행한다. 림프구 세포질에서 바이러스 RNA 또는 DNA가 탐지될 경우에는 상기 바이러스가 생존능을 유지하고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에서 바이러스RNA 또는 DNA가 탐지되지 않을 경우에는 상기 바이러스가 비활성화되어 있음을 나타낸다.

Description

림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법{METHOD FOR ASSESSING THE VIABILITY OF VIRUSES WITH LYMPHOTROPISM}

본 발명은 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법에 관한 것으로, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 감염 여부를 보다 신뢰성 있게 결정하고, EIA 및 PCR 시험 중 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 존재 여부를 검사하는 혈액에서 위음성 반응을 없애며, EIA 또는 PCR의 임계 감도(sensitivity threshold)보다 낮은 농도를 갖는 림프조직 친화성 바이러스의 존재 여부를 평가 및 검출하는 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 기질에 함유된 바이러스를 세포 배양액에서 분리하여 탐지하는 방법은 공지 기술이다. 세포배양법에 의해 분리된 바이러스는 혈구흡착법(haemadsorption), 혈구응집법(hemagglutination) 또는 면역형광법(immunofluorescence)의 방법에 의해 확인할 수 있다. 시의적절한 샘플 채취와 이를 신속히 실험실 내 배양액으로 이동하는 것은 배양을 통해 바이러스를 분리함에 있어서 아주 중요하며, 박테리아와 곰팡이의 증식을 억제하면서 바이러스의 생존능을 유지할 수 있다.(Laboratory diagnostic of virus infections, Online: http://www.center-hc.ru/)

수많은 바이러스들, 특히 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)는 인간 세포에 영향을 미치는 안트로포노틱(anthroponotic) 바이러스들로서, 오직 사람에게만 질병을 야기한다. 이들에 대한 실험 모델은 아직 없으며, 특히 우즈베키스탄에서는 배양된 배양액이 없으며, 생체 외(in vitro)에서 이들 바이러스의 세포 병원성 특성 및 바이러스 생존능을 연구할 수 있다. 세포 배양액에서 바이러스를 분리하는 방법은 그 복잡성으로 인해 진단 목적으로는 사용되지 않는다.

생체 시료에 있는 바이러스를 탐지하는 면역학적 방법으로 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 있는데, 이 방법은 감염세포로부터 추출되거나, 바이러스 항원 수에 대한 항체 탐지에 의해 유전공학적으로 생산된 특수 바이러스 단백질들을 사용한다.

HCV와 같은 일부 바이러스에 있어서, EIA는 항체만을 탐지하기 때문에 감염의 진행 및 활성을 평가하는 능력이 상당히 제한되며, 또한, EIA는 감응 임계점이 있어, 임계점 이하에서는 바이러스의 탐지가 불가능하다.

생체 시료에서 림프조직 친화성을 갖는 바이러스를 검출하는 방법에 가장 근접한 방법은 바이러스의 생존력을 평가하는 방법이며, EIA 및 PCR 검사의 위음성을 제거하는 것은 생체 시료를 채취하여 바이러스의 RNA 또는 DNA를 탐지하고, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 바이러스의 RNA 또는 DNA의 존재여부를 탐지하는 것이다.

상기 방법은 생체 시료에서 병원균을 직접 탐지하는 방법으로서, 바이러스 프로세스의 활성을 평가할 수 있다. PCR 반응에서 양성 반응이 나타나면 간과 혈액에 바이러스가 존재할 가능성이 높다. 림프조직 친화성을 갖는 바이러스가 림프조직에서 상당히 높은 농도(PCR의 위음성)로 존재할 수는 있지만, 생체 시료(혈장 또는 혈액 단백질, 조직 또는 기관의 부검 물질)의 PCR 반응을 통해 림프조직 친화성을 갖는 바이러스에 의한 감염이 항상 탐지될 수는 없다. 마찬가지로 그 반대의 경우에 있어서도, 바이러스가 존재하지 않음에도 불구하고 PCR 반응에서 양성반응이 나타날 수도 있다. 또한, PCR은 임계감도가 있어, 임계감도 이하에서는 바이러스의 검출이 불가능하다.

Ilyina, E.N. et. al. Chronic virus liver diseases "Khronicheskiye virusnye zabolevaniya pecheni Methodological manual for physicians Metodicheskoye posobiye dlya vrachej Moscow, 2001, p. 7-11

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로, 본 발명에 따른 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법은 혈장에 바이러스의 RNA 또는 DNA가 함유되어 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법은 PCR 검사를 수행하여, 생체 시료에 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출될 경우에는 상기 바이러스가 생존력을 유지하고 있음을 나타내며, 생체 시료에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되지 않을 경우에는 바이러스가 비활성화되는 것으로 평가하는 데 목적이 있다.

본 발명은 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 감염 검출에 대한 신뢰도를 높이고, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위한 검사에서 위음성 결과를 EIA 및 PCR를 통해 제거하며, EIA 또는 PCR의 임계 감도보다 낮은 농도의 림프조직 친화성 바이러스를 검출하는데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 생체 시료에서 림프조직 친화성을 가진 바이러스를 검출하는 방법, 바이러스의 생존력을 평가하는 방법, EIA 및 PCR을 통해 위음성 결과를 제거하는 방법에 대한 것으로서, 의학 산업 및 바이오테크놀로지 분야에서 사용하는 데 목적이 있다.

본 발명에 따른 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법은 혈장에 바이러스의 RNA 또는 DNA가 함유되어 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함하며, 혈장을 건강한 사람의 혈액에서 얻은 림프구 현탁액과 동일한 양으로 혼합하여 교반 후, 37℃에서 6 내지 8시간 배양한 다음, 세척하여 혈장으로부터 림프구를 수득한 후, 냉동보관하여 림프구를 파괴시키며, 림프구의 세포질 내용물에 대하여 PCR을 수행하여, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존력을 평가할 수 있다. 림프구 세포질 내용물에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되면 이는 바이러스의 생존력이 유지되고 있음을 나타내며, 림프구 세포질 내용물에 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되지 않으면 바이러스가 림프구 세포질에서 비활성화되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 생체 시료는 혈장, 혈청, 조직 또는 기관의 부검 샘플, 의료기구 세척 시 얻은 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은 본발명에 따른 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법을 이용하여 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 생존력을 평가하는 것을 특징으로 한다.

아울러, 본발명에 따른 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법은 림프구의 세포질 내용물에 대하여 PCR 반응을 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 감염 검출에 대한 신뢰도를 높이고, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위한 검사에서 위음성 결과를 EIA 및 PCR를 통해 제거하며, EIA 또는 PCR의 임계 감도보다 낮은 농도의 림프조직 친화성 바이러스를 검출하는 림프조직 친화성을 가진 바이러스를 평가하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 바이러스의 RNA 또는 DNA를 PCR을 이용하여 검출하는 것으로, 건강한 사람의 혈액에서 얻은 림프구 현탁액과 동일한 양의 혈장을 혼합하여 교반한 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 배양한 다음, 상기 혈장으로부터 림프구를 세척하여 파괴시키고, 림프구 세포질에 대하여 PCR을 수행하여 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존력을 평가하며, 림프구 세포질에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되면 바이러스의 생존력이 유지되고 있음을 나타내며, 림프구 세포질에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되지 않으면 바이러스가 림프구 세포질에서 비활성화되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 생체 시료는 혈장, 혈청, 조직 또는 기관의 부검 샘플, 의료기구 세척 시 얻은 물질을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본발명에 따른 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법을 이용하여 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 생존력을 평가하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 림프조직 친화성을 갖는 바이러스에 감염된 것으로 추정되는 혈액의 EIA 및 PCR 검사에서 위음성 결과를 제거하는 것으로, 혈액 6 내지 8 ml를 2.0 ml의 생리 식염수 및 2 내지 3방울의 헤파린이 포함된 시험관에 넣고, 상기 혈액으로부터 림프구를 분리한 후, 37 ℃에서 6 내지 8시간 동안 배양하고, 림프구를 세척하여 파괴시킨 다음, 림프구의 세포질에 대하여 PCR을 수행하여, 림프구의 세포질에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되면 상기 혈액에 바이러스가 존재하는 것을 나타내고, 림프구의 세포질에서 바이러스의 RNA 또는 DNA가 검출되지 않을 경우에는 상기 혈액에 바이러스가 없는 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

아울러, 본발명은 림프구의 세포질 내용물에 대하여 PCR 반응을 수행하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

수많은 바이러스들, 특히 HBV, HCV 및 HIV 바이러스는 단핵 혈액세포에서 복제할 수 있으며, 특히 림프구 및 대식세포에서 복제가 가능함이 알려져 있다. HBV 및 HCV 바이러스에 감염되면 모든 간염 진행과 더불어 동시에 간에서 염증과정이 진행되며 다양한 수준의 T 림프구 감소증과 B 림프구 감소증을 동반하는 2차 면역결핍증, T 림프구 (헬퍼 T세포 및 억제 T세포)의 조절 부분모집단(regulatory subpopulations)의 불균형, 면역조절 지표(IRI)의 감소 및 이상 감마 글로블린 혈증(dysgammaglobulinemia) 등이 초래됨이 알려져 있다. 면역결핍증의 정도 및 단계는 간에서의 병적 과정의 진행 정도(degree of pathogenic process)와 무관하다.

만성 B형 간염 및 C형 간염 환자들은 일정 시간 경과 후, 간 조직에서 병적 과정의 강도가 미약한 증세로부터 드러나는 정도까지 그 차이가 있으나, 이와 상관없이 일정하게 지속적으로 2차 면역 결핍증을 초래한다.

각종 질병 분류학(nosological) 형태의 만성 바이러스 간염에 있어서 간 조직 손상 정도 및 2차 면역 결핍 정도를 분리하는 것은 HBV 및 HCV감염에 있어서 간염과 2차 면역 결핍증이 상호 관련되어 서로 악화시킨다는 주장을 뒷받침하지만 상호 조건부적(mutually conditional)이지 않다. 즉, HBV 및 HCV는 간 친화성과 더불어 림프조직 친화성(2차 면역결핍증을 초래하는 직접적 원인)을 갖고 있다. HBV 및 HCV 감염에 있어서 간 조직 손상과 면역 결핍증 정도의 임상적 양상의 차이는 이들 바이러스의 간 친화성 및 림프조직 친화성의 차이에 기인한다.

즉, 이들 바이러스의 간 친화성 및 림프조직 친화성 정도에 있어서의 편차가 발병(pathogenesis)의 차이를 결정하고, 만성 HBV 및 HCV 감염의 각 단계에서 임상적 양상과 항바이러스 치료 효과의 패턴을 결정한다.

HBV, HCV 및 HIV가 야기하는 2차 면역 결핍증 외에 림프조직 친화성은 이들 바이러스의 역학적 양상(epidemiological features), 전이 메커니즘, 기회성 감염(빈번한 호흡기 질환 및 장관 감염(intestinal infection))의 공통점, 특히, 유기체의 각종 조직에서 림프 육아종(lymphogranulomatosis)을 발병시킴이 확인되었다. 각종 유기체의 기관 및 조직에서 림프 육아종인 림프 소절 클러스터즈(lymphoid follicles' clusters)의 발병은 림프 세포계(lymphoid cell system)의 바이러스 감염이 내재적 원인으로 생각된다.

HBV의 림프조직 친화성을 고려해 보면, 혈청 역가(serum titer)와 상관없이, HBV는 림프 성분의 세포질에서 고농도로 영구적으로 존재할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 현상은 바이러스를 EIA 또는 PCR 검사의 임계 감도 이하의 농도로 갖고 있는 생체 시료에서 신뢰도를 높이고, EIA 및 PCR 반응의 위음성을 제거하며, 림프조직 친화성을 갖는 바이러스를 검출하는 방법에 사용된다.

본 발명의 발명자들은 바이러스의 생존력(생체 외 배양에서 바이러스가 건강한 사람의 림프구에서 세포 내로(intracellularly) 통과 및 존재하는 능력)을 평가하는 방법에서 HBV, HCV 및 HIV의 림프조직 친화성을 이용하였다.

림프조직 친화성을 갖는 HBV, HCV 및 HIV 바이러스를 장기 보관 후 이들의 생존능을 평가하려면 항바이러스 치료법 외에도 이들 바이러스에 대한 각종 바이러스 제거용(disinfecting) 물리 화학적 요소들의 항바이러스 효능을 조절하는 것이 필요하다.

림프조직 친화성을 갖는 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 생존력을 평가 및 검출하는 방법을 하기에 기재하였다.

이하, 본 발명은 제조예, 실시예, 및 시험예에 의해 상세히 설명한다.

하기 제조예, 실시예, 및 시험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 제조예, 실시예, 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1 > 림프조직 친화성을 갖는 바이러스 현탁액의 제조예 1

바이러스 현탁액을 제조하기 위해, 생체 시료(혈장, 혈청, 조직 또는 기관의 부검 샘플, 의료기구의 세척물)에 대해 정량적 PCR을 수행하여 림프조직 친화성을 갖는 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부 및 바이러스 역가(virus titer)를 검증한다. 바이러스를 포함하는 생체 시료는 -25 ℃이하의 냉장고에 냉동 보관하여, 바이러스 현탁액을 제조하였다.

< 제조예 2 > 림프구 현탁액의 제조예 2

a) 건강한 자원자들을 EIA를 통해 림프조직 친화성을 갖는 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 감염 여부를 검사한다. 상기 바이러스에 대해 음성 결과를 보이는 건강한 사람들의 림프구를 연구한다.

b) 금식 중인 건강한 사람의 척골 정맥(ulnar vein)으로부터 20 내지 30 ml의 혈액을 채취한 다음, 채취된 혈액 중 7 내지 8 ml를 2 ml의 생리 식염수 및 2 내지 3 방울의 헤파린(5000 ME/ml의 헤파린 농도, 3방울은 750 ME/ml의 헤파린을 함유)을 포함하고 있는 원심분리관에 넣은 후, 충분히 교반한다.

c) 밀도가 1.077 g/ml인 피콜-페로그라핀 구배(ficoll-verografin gradient)에서 상기 b)단계의 혈액을 함유하는 헤파린으로부터 림프구를 분리한다(Garib, F.Yu., Gurary, N.I., Garib, V.F. "Sposob opredeleniya subpopulyatsij limfotsitov (Determination method of lymphocytes' subpopulations)" // Rasmij Akhborotnoma. Tashkent, 1995, #1, p. 90 UZ DP 2426). 2 ml의 피콜-페로그라핀 구배를 깨끗한 원심분리관에 부어 넣은 후, 헤파린화된 혈액을 표면에 놓고 1500 rpm으로 20분간 원심 분리한다. 원심분리를 진행하는 동안, 림프구를 제외한 모든 혈액 세포들은 피콜-페로그라핀 구배를 통과하고, 혈액의 혈장은 상기 피콜-페로그라핀 구배의 위에 남게 된다. 피콜-페로그라핀 구배와 혈장의 경계에 순수한 림프구로 구성된 혼탁한 고리가 형성된다. 상기 림프구가 포함된 고리는 피펫을 이용하여 조심스럽게 흡인하여 깨끗한 원심분리관으로 옮긴다.

d) 상기 c) 단계에서 분리한 림프구가 포함된 고리는 10 ml의 생리 식염수로 2 내지 3회 세척한 후, 1500 rpm으로 20분간 원심 분리를 하고, 추가로 1500 rpm으로 20분간 원심 분리를 한다

e) 최종 원심분리를 한 후, 상층액을 제거한다. 림프구를 포함하는 침전물은 600 ㎕의 생리 식염수로 희석하여 림프구 현탁액을 제조한다. 림프구 현탁액은 4 ℃에서 하루 이상 보관하면 안 된다.

< 시험예 1 > 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존력의 평가

1) 제조예 1에서 제조한 바이러스 현탁액을 냉장고에서 꺼내어 실온에서 해동한다.

2) 상기 바이러스 현탁액과 제조예 2에서 제조한 림프구 현탁액을 동일한 양(300 ㎕)으로 깨끗한 원심분리관에 넣어 혼합한 후, 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8시간 동안 배양한다. 이때, 상기 원심분리관을 매 1.5 내지 2시간마다 흔들어서 혼합한다.

3) 림프구의 세척.

상기 원심분리관을 항온조에서 꺼낸 후, 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하여 혼합 다음, 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 원심분리관의 바닥에 림프구들은 침전되며, 상층액(혈장과 식염수의 혼합물)을 모두 제거한다. 상기 림프구들은 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하여 침전시킨다. 최종 원심분리를 한 후, 상층액은 제거하고, 침전물을 500 ㎕의 생리 식염수에 희석한 후 1.5 ml 잠금 튜브(에펜도르프 튜브; Eppendorf tube)에 옮긴다.

4) 상기 잠금 튜브를 가정용 냉장고의 냉동고에 하룻밤동안 보관한다. 상기 잠금 튜브의 림프구들은 냉동조건에서 파괴된다.

5) 파괴된 림프구들의 막 제거.

그 다음 날, 상기 잠금 튜브를 냉동고에서 꺼내어 실온에서 해동한 다음, 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 림프구의 막을 제거한다. 이때, 림프구의 막은 잠금 튜브의 바닥에 침전되며, 림프구의 세포질 내용물은 상층액에 위치한다.

6) 상기 잠금 튜브로부터 상층액을 옮긴 후, 혈장에 있었던 림프구의 세포질 내용물에 있는 바이러스의 RNA 또는 DNA를 정량 PCR을 수행한다.

< 결과 분석 >

1. 림프구의 세포질 내용물에 바이러스의 RNA 또는 DNA의 존재 여부에 대한 PCR 검사결과가 양성이면, 바이러스의 생존력이 있음을, 즉 생체 외에서 인간의 림프구를 통과하고 림프구에 존재하는 활성이 있음을 의미한다.

2. 림프구의 세포질 내용물에 바이러스의 RNA 또는 DNA의 존재 여부에 대한 PCR 검사결과가 음성이면 바이러스 생존력이 상실(비활성화)됨을, 즉, 생체 외에서 인간의 림프구를 통과하고, 림프구에 존재하는 활성이 상실되었음을 의미한다.

상기 방법들을 하기 실시예를 통하여 확인하고자 한다:

< 실시예 1 > 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존력 분석의 실시예 1

C형 간염 항바이러스 치료를 받은 환자의 혈액을 척골 정맥으로부터 채취한다. 혈액(whole blood)으로부터 혈장을 분리한 후, 정량 PCR을 수행하여 HCV 바이러스의 존재 여부 및 바이러스 역가를 확인한다. PCR 결과가 음성이었고, 검사한 혈장은 냉동고에 -25 ℃이하의 온도로 보관하여, 검사용 혈장을 제조한다.

동시에, 건강한 사람의 척골 정맥에서 20 내지 30 ml의 혈액을 채취한 후, PCR을 수행하여 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 감염 여부를 확인한다. 감염 결과가 음성으로 확인된 혈액 7 내지 8 ml을 2 ml의 생리 식염수 및 3 방울의 헤파린(헤파린의 농도는 5000 ME/ml이고, 3 방울에는 750 ME/ml의 헤파린이 포함됨)이 포함된 원심분리관에 넣어 혼합한다. 가리브(Garib, F.Yu. et al method)의 방법에 따라, 1.077 g/ml의 밀도를 갖는 피콜-페로그라핀 구배에서 혈액으로부터 림프구를 분리한다. 깨끗한 원심분리관에 2 ml의 피콜-페로그라핀 구배를 넣은 후, 상기의 헤파린과 혼합된 혈액을 구배의 표면에 넣어 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 이때, 림프구를 제외한 모든 혈액세포들은 피콜-페로그라핀 구배를 통과하여 그 아래에 침전되고, 혈장은 상기 구배 위에 존재하며, 피콜-페로그라핀 구배와 혈장의 경계에는 깨끗한 림프구가 포함된 혼탁한 고리가 생성된다. 상기 림프구를 포함하는 고리는 피펫으로 흡인하여 깨끗한 원심분리관으로 옮긴 후, 생리 식염수로 2-3회 세척하여 림프구를 침전시키고, 최종 원심분리한 다음, 상층액을 제거한다. 림프구를 포함하는 침전물은 600 ㎕의 식염수에 희석하여 림프구 현탁액을 제조한다. 림프구 현탁액은 4 ℃에서 하루 이상 보관할 수 없다.

상기 검사용 혈장을 냉동고에서 꺼내어 실온에서 해동한다. 깨끗한 원심분리관에 검사용 혈장과 림프구 현탁액을 동일한 부피(300 ㎕)로 넣어 혼합한 후, 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 이때, 상기 원심분리관을 매 1.5 내지 2시간마다 흔들어서 혼합한다.

배양 후, 상기 원심분리관을 항온조에서 꺼내어, 6 내지 8 ml 의 식염수를 첨가하여 혼합한 후, 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리를 한다. 이때, 림프구는 상기 원심분리관의 바닥에 침전되고, 혈장과 생리 식염수의 혼합물은 상층액에 존재한다. 상층액을 제거한 후, 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하여 림프구를 상기와 동일하게 침전시킨다. 최종 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 침전물(림프구 현탁액)을 300 ㎕의 생리 식염수로 희석한 후 1.5 ml 잠금 튜브(에펜도르프 튜브)에 옮긴다.

그 후, 상기 잠금 튜브는 가정용 냉장고의 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여 림프구 막을 파괴시킨다. 다음 날, 잠금 튜브를 실온에서 해동한 후, 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여, 상기 파괴된 림프구 막을 제거한다. 이때, 상기 파괴된 림프구 막은 잠금 튜브의 바닥에 침전되고, 림프구의 세포질 내용물은 상층액에 남게 된다. 상기 잠금 튜브에서 상층액을 회수하여 림프구의 세포질 내용물에 HCV 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위한 정량 PCR을 수행한다. HCV에 대한 PCR 양성 반응은 HCM 바이러스 생존력이 유지됨을 나타내며, 따라서 추가적인 항바이러스 치료가 필요하다.

< 실시예 2 > 림프조직 친화성을 갖는 바이러스의 생존력 분석의 실시예 2

B형 간염 항바이러스 치료를 받은 환자의 간에서 간조직을 채취한다. 채취한 간조직을 1.5 ml의 생리 식염수에서 균질화한 후, 원심분리관에 넣어 1500 rpm으로 원심분리하여 얻어진 상층액을 튜브에 옮긴다. 상기 상층액의 일부는 정량 PCR검사를 통해 HBV 바이러스의 존재 여부와 바이러스 역가의 정량을 확인한다. HBV에 대한 PCR 검사결과는 양성이었고, 상기 상층액은 25 ℃이하의 냉장고의 냉동고에서 보관한다.

상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 림프구 현탁액을 준비하고, 상기 상층액을 실온에서 해동한 후, 동일한 부피(300 ㎕)의 상층액과 림프구 현탁액을 자동 피펫을 이용하여 시험관에 넣고 혼합한 다음, 37 ℃의 항온조에 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 이때, 상기 시험관을 매 1.5 내지 2시간마다 흔들어서 혼합한다.

상기 시험관을 항온조에서 꺼낸 후, 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하여 혼합한 다음, 1500 rpm으로 20분 동안 원심분리를 한다. 이때, 상기 시험관의 바닥에 림프구가 침전되고, 혈장 및 생리 식염수의 혼합물이 상층액에 존재한다. 상층액을 제거한 후, 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하여, 림프구를 상기와 동일하게 침전시킨다. 최종 원심분리한 후, 상층액은 제거하고, 침전물에 존재하는 림프구 현탁액에 300 ㎕의 생리 식염수를 첨가한 다음, 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여, 림프구 막을 파괴시킨다.

그 다음 날, 상기 시험관을 실온에서 해동한 후, 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상기 파괴된 림프구 막을 제거한다. 이때, 상기 파괴된 림프구 막은 잠금 튜브의 바닥에 침전되고, 림프구의 세포질 내용물은 상층액에 남게 된다. 시험관에서 상기 상층액을 회수한 후, 정량 PCR을 수행하여 림프구 세포질 내의 HBV 바이러스의 존재 여부를 확인한다. PCR 검사결과가 음성 반응이면 바이러스의 생존력이 상실(비활성화)되었음을 의미한다.

< 실시예 3 > EIA 및 PCR의 임계감도 이하인 림프조직 친화성 바이러스의 검출

6 내지 8 ml의 혈액의 혈장을 이용하여, 림프조직 친화성 바이러스를 검출한다. 상기 혈장의 일부에 대해 HBV, HCV 또는 HIV 바이러스의 존재 여부 및 이들 바이러스 역가의 정량을 확인한다. 바이러스의 존재유무에 대한 검사가 음성반응을 나타내었다. 검사한 혈장은 -25 ℃이하의 냉동고에서 보관하여, 검사용 혈장으로 준비한다.

상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 림프구 현탁액을 준비하고, 검사용 혈장을 냉동고에서 꺼내어 실온에서 해동한다. 동일한 부피(300 ㎕)의 검사용 혈장과 림프구 현탁액을 자동 피펫을 사용하여 깨끗한 원심분리관에 넣어 혼합한 후, 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8 시간 동안 배양한다. 이때, 상기 원심분리관을 매 1.5 내지 2 시간 마다 흔들어서 혼합한다.

상기 원심분리관을 항온조에서 꺼내어 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하여 혼합한 후, 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한다. 이때, 림프구는 원심분리관의 바닥에 침전되며, 혈장과 생리 식염수의 혼합물은 상층액에 존재한다. 상층액을 제거한 후, 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하고, 림프구를 상기와 동일하게 침전시킨다. 최종 원심분리 후, 상층액을 제거하고, 침전물에 존재하는 림프구 현탁액에 300 ㎕의 생리 식염수를 첨가하여 희석한다.

그 다음, 가정용 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여, 림프구 막을 파괴시킨다. 그 다음 날, 상기 원심분리관을 실온에서 해동시킨 후, 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상기 파괴된 림프구 막을 제거한다. 이때, 상기 파괴된 림프구 막은 원심분리관의 바닥에 침전되고, 림프구의 세포질 내용물은 상층액에 남게 된다. 상층액을 원심분리관에서 회수한 후, 림프구의 세포질에 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부를 탐지하기 위하여 정량 PCR을 수행한다. PCR 결과가 HCV에 대해 양성반응이 나타나면 공여자의 혈장에 HCV 바이러스가 존재하는 것을 의미하므로 (상기 혈장은) 헌혈에 부적합하다.

< 실시예 4 > EIA 및 PCR 검사에서 위음성 결과의 제거

금식 중인 공여자의 척골 정맥에서 채취한 6 내지 8 ml의 혈액을 튜브에 옮긴 후, 침전시켜서 혈장을 수득한다. 수득한 혈장의 일부를 사용하여 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부와 이들 바이러스의 역가를 확인한 결과, PCR 결과는 음성반응이었다. 나머지 혈장은 튜브에 보관하고, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 림프구 현탁액을 준비한다.

상기 나머지 혈장이 보관된 튜브는 가정용 냉장고에서 하룻밤 동안 냉동하여 림프구를 분리 및 파괴한다. 그 다음 날, 상기 튜브를 실온에서 해동시킨 후, 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리한다. 이때, 상기 튜브의 바닥에 림프구 막이 침전되고 림프구 세포질 내용물은 상층액에 남게 된다. 상층액을 튜브에서 회수하여 림프구의 세포질에 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 존재 여부를 탐지하기 위하여 정량 PCR을 수행한다. PCR 결과 HBV에 대해 양성반응이 나타나면 혈액 공여자의 혈액에 HBV 바이러스가 존재하는 것을 의미한다.

표준 PCR로 검사 시, 우즈베키스탄에서 HBV 및 HCV 바이러스의 검출률은 2.7 %이다. 역학 데이터(epidemiological data)에 따르면, 감염 혈액 또는 이들 성분에 의한 신규 B형 간염 및 C형 간염 발병률은 2.2 내지 5.6 %이다. 관련 자료를 밝히고 수혈자의 HBV 감염을 없애고자 바이러스의 림프조직 친화성을 이용하였다.

309명의 혈액 공여자로부터 채취한 혈청을 사용하여, PCR을 통해 HBV 마커 검출율을 조사했다.

PCR 검사한 결과, 209개의 혈청 샘플 중 6개의 혈청에서 HBV가 탐지되었고, 이는 천체 혈청 공여자의 1.94 %에 해당한다. 동일 혈청 공여자로부터 림프구 세포질 내용물을 동일한 PCR 검사한 결과, 309개의 샘플 중 17개에서 HBV가 탐지되었고, 이는 전체 혈청 공여자의 7.44 %에 해당한다. 따라서, 혈청을 표준 PCR로 검사한 결과, 위음성 비율은 5.50 %이었고, 감염 혈액 또는 그 성분을 수혈 받은 수혈자의 HBV 감염 원인이 됨이 밝혀졌다.

혈액센터에서 PCR검사를 통해 림프구에서 바이러스의 존재여부를 확인함으로써, 혈액 또는 그 성분의 수혈에 따른 HBV, HCV 및 HIV 바이러스의 감염확률을 현저히 낮추거나 제거할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명에서 설명한 것은 림프조직 친화성 바이러스의 생존능 평가 방법을 위한 실시예에 불과한 것으로, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

Claims (1)

1. 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법에 있어서,
   상기 방법은 혈장에 바이러스의 RNA 또는 DNA가 함유되어 있는지 여부를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통하여 결정하는 단계를 포함하며, 상기 혈장은 냉동보관한 후 해동하여 사용하고, 상기 혈장과 기증자의 림프구 현탁액을 동일한 양(300 ㎕)으로 깨끗한 원심분리관에 넣어 혼합한 후, 37 ℃의 항온조에서 6 내지 8시간 동안 배양한 다음, 상기 원심분리관에 6 내지 8 ml의 생리 식염수를 첨가하여 혼합 다음, 1500 rpm으로 20분 동안 원심 분리한 후, 상층액은 제거하고, 원심분리관의 바닥에 침전된 림프구들은 생리 식염수로 2 내지 3회 세척하여 침전시키고, 최종 원심분리를 한 후, 상층액은 제거하고, 침전물을 500 ㎕의 생리 식염수에 희석한 후 1.5 ml 잠금 튜브에 넣어, 가정용 냉장고의 냉동고에 하룻밤동안 보관하여 림프구들을 파괴하며, 그 다음 날, 상기 잠금 튜브를 실온에서 해동한 다음, 3000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 림프구의 막을 제거한 후, 상층액에 존재하는 림프구의 세포질 내용물을 옮긴 후, 바이러스의 RNA 또는 DNA를 정량 PCR을 수행하여, HBV 또는 HCV의 생존능을 평가하는 것을 특징으로 하는 림프조직 친화성을 가진 바이러스의 생존력을 평가하는 방법.