KR20140124067A

KR20140124067A - 그래피틱 물질과 결합하는 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 파지

Info

Publication number: KR20140124067A
Application number: KR1020130041173A
Authority: KR
Inventors: 이현정; 이기영; 장차운; 장준연
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-04-15
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2014-10-24
Also published as: KR101548329B1; US20140309126A1

Abstract

본 발명은 그래피틱 물질에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 이를 포함하는 파지, 상기 펩타이드 또는 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질을 제공한다.

Description

그래피틱 물질과 결합하는 펩타이드 및 그 펩타이드를 포함하는 파지{Graphitic materials-binding peptide and phage comprising the peptide}

본 명세서에 기재된 내용은 그래피틱 물질과 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

최근 그래핀, 탄소 나노 튜브 등 저차원 탄소 물질의 우수한 전기적, 열적, 광학적, 기계적 특성을 다양한 용도에 응용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

일반적으로 나노 탄소 물질의 특성을 개질하기 위해서는 화학 반응을 이용하여 표면을 영구적으로 바꾸는 방법이 선택되고 있으나, 화학 반응을 이용하여 표면을 영구적으로 개질시키는 경우 저차원 탄소 물질의 고유한 특성, 예를 들어 빠른 전기전도도 등이 크게 저하되는 단점이 있다.

따라서 우수한 나노 탄소 물질의 특성의 파괴는 최소화하면서 추가로 여러 가지 기능을 부여할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 하는 요구가 높아지고 있다.

이에 따른 방법으로서 분자 인식 방법은 바이오 물질이 지닌 선택성을 이용하여 화학적인 반응을 거치지 않고도 원하는 물질과 결합할 수 있는 방법으로써 자연계에 존재하는 DNA 상보적 서열(complementary sequence)간의 결합, 항원-항체 등의 예에서 찾아볼 수 있다. 최근에는 나노 탄소 물질과 분자인식을 통하여 결합하는 펩타이드를 이용하여 나노 탄소 물질의 기능 저하를 최소화 하면서 탄소물질의 표면을 응용에 맞게 개질하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

지금까지 상기와 같은 펩타이드를 이용한 연구의 대부분은 탄소나노튜브 등을 기능화하기 위하여 상업적으로 구입이 가능한 p3 펩타이드 라이브러리(p3 peptide library)를 이용하여 발견한 것으로 보고되고 있다(Fabricating genetically engineered high-Power lithium-ion batteries using multiple virus genes, Yun Jung Lee et al., SCIENCE Vol.324, 2009.05.22.). 그러나 실제로 발견된 펩타이드를 이용하여 나노 탄소물질을 기능화한 예는 이미 바이오 센서에서 보고된 것으로서 대체로 그 응용이 극히 제한적이라는 문제가 있다. 이는 나노탄소 물질을 기능화 하는데 사용되는 펩타이드의 양이 많이 필요한 반면 펩타이드 자체의 크기가 작아서 펩타이드간의 시너지 효과를 기대하기 어렵기 때문이다. 나아가, p3 펩타이드 라이브러리로부터 유래된 펩타이드는 파지가 지니고 있는 복제수(copy number)가 약 5개 정도로 매우 적고 파지의 팁 부분에 위치해 있어서, 펩타이드와 결합한 파지 자체를 이용하여 나노 탄소 물질을 기능화 하기에는 어렵다는 문제가 있었다.

Fabricating genetically engineered high-power lithium-ion batteries using multiple virus genes(Yun Jung Lee et al., SCIENCE Vol.324, 2009.05.22.)

본 발명은 그래피틱 물질에 대한 결합력이 우수하면서도, 파지를 펩타이드의 선별수단으로만 사용했던 것과는 달리 펩타이드를 포함하는 파지자체를 직접 이용해 그래피틱 표면을 갖는 물질을 기능화할 수 있는 펩타이드를 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 이를 포함하는 파지 및 상기 펩타이드 또는 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 펩타이드를 스크리닝하는 방법으로서,

(1)파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리(phage display p8 peptide library)를 제조하는 단계;

(2)상기 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 그래피틱 표면에 콘쥬게이션(conjugation)시키는 단계; 및

(3)그래피틱 표면에 결합되지 않은 펩타이드를 제거하여 상기 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리 중 상기 그래피틱 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 그래피틱 표면에 특이적으로 결합함으로써 기존의 펩타이드보다 우수한 결합력을 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 파지에 포함시 기존의 펩타이드와는 달리 복제수가 많아 매우 많은 양으로 포함될 수 있으므로 파지를 이용하여 손쉽게 증폭시킬 수 있다. 추가적인 단백질 정제가 필요없어 경제적이다.

나아가, 본 발명은 상기 펩타이드 뿐만 아니라, 상기 펩타이드를 포함하는 파지 자체를 직접 이용해 그래피틱 표면을 갖는 물질을 기능화할 수 있다. 즉, 파지에 포함된 펩타이드의 그래피틱 표면에 대한 강한 결합력과 펩타이드보다 상대적으로 큰 크기를 갖는 파지자체의 구조를 이용함으로써, 그래피틱 표면에 일정한 방향성을 갖고 배열하여 파지가 배열된 물질자체로 하나의 시스템을 형성할 수 있어, 그 배열 방향 또는 배열 형태에 따라 그래피틱 표면을 갖는 물질 자체의 특성을 다양하게 변화시킬 수 있다.

또한, 펩타이드의 그래피틱 표면에 대한 강한 결합력을 이용하여 리튬 이온전지, 태양 전지, 슈퍼 커패시터(super capacitor) 등과 같은 다양한 에너지 저장소자, 디스플레이, 바이오 센서 등의 분야에서 널리 활용할 수 있다.

도 1 및 2는 본 발명의 일 실시예로서 사용되는 M13KE 벡터의 유전자 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 그래피틱 표면과 반응하는 펩타이드 서열을 찾기 위한 바이오 패닝방법을 나타낸 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 M13 파지의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 파지를 그래핀의 표면에 결합시킨 후 원자력현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 펩타이드의 아미노산 서열에 따른 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교한 실험결과를 나타낸 도이다.
도 7은 각 펩타이드의 아미노산 서열과 소수성 특성과의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 펩타이드를 포함하는 파지를 그래핀의 표면에 정렬시킨 후 원자력현미경으로 측정한 이미지를 나타낸 것이다.

본 명세서에서 "그래피틱 물질(graphitic materials)"이라 함은, 탄소원자가 육각형 모양으로 배열되어 있는 표면, 즉 그래피틱 표면(graphitic surface)을 지니는 물질을 의미하는 것으로서, 그래피틱 표면을 포함하는 물질이라면 물리적, 화학적 성질, 구조적 특성을 불문하는 최광의의 개념이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 이때 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열은 하기와 같다.

DSWAADIP (서열번호 1)

DNPIQAVP (서열번호 2)

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 서열번호 1 및 2 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드는 그래피틱 물질(graphitic materials)에 선택적, 특이적으로 결합(conjugating)할 수 있으며, 그래피틱 물질은 예를 들어 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes), 풀러린(fullerene) 등 육각형으로 배열된 탄소원자를 포함하는 표면을 가지고 있는 물질이라면 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 그래피틱 물질 중 그래핀은 탄소로 구성된 나노물질로서 두께가 약 0.3nm로 매우 얇으면서도 전도도 및 물리적, 화학적 안정성이 높은 물질로, 본 발명의 일 실시예로서 상기 펩타이드는 그래핀의 표면에 선택적 특이적으로 강하게 결합할 수 있다. 이로써 그래핀의 초박막 특성에 영향을 주지 않으면서도 그래핀의 표면에 기능적인 특성을 제공할 수 있다. 또한, 결합력이 매우 높으므로 기존의 결합력이 낮은 펩타이드가 응집 또는 용해되는 단점을 해결할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로서 상기 펩타이드는 필라멘터스 파지(filamentous phage)를 예로 들 수 있는 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리(phage display p8 peptide library)로부터 유래하며, 구체적으로 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리로부터 얻을 수 있다.

이때 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리로부터 본 발명에 따른 펩타이드를 스크리닝하는 방법은

(1) M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;

(2) 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 그래피틱 표면에 콘쥬게이션(conjugation)시키는 단계;및

(3)그래피틱 표면에 결합되지 않은 펩타이드를 제거하여 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리 중 상기 그래피틱 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리는 벡터를 부위-특이적 변이(site-directed mutation)한 후, 변이된 벡터에 펩타이드를 삽입하여 제조할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예로서 상기 (1)단계에서 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리는

(a) M13 파지 벡터를 부위-특이적 변이(site-directed mutation)하여 변이된 M13 파지 벡터를 제조하는 단계;및

(b)상기 변이된 M13 파지 벡터에 제한효소를 이용하여 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로서 M13 파지 벡터는 M13KE 벡터(NEB, product#N0316S)를 사용할 수 있다. 그리고 M13KE 벡터를 사용할 경우에는 본 발명의 일 실시예로서 M13KE 벡터의 1381번째 염기쌍(base pair)인 C를 G로 변이(site-directed mutation)하여 M13HK 벡터를 제조하여 사용한다.

이때 상기 M13KE 벡터(NEB, product#N0316S)는 7222bp의 DNA로 이루어진 클로닝 벡터(Cloning vector M13KE)로서, 유전자 정보는 인터넷 사이트 (https://www.neb.com/~/media/NebUs/Page%20Images/Tools%20and%20Resources/Interactive%20Tools/DNA%20Sequences%20and%20Maps/Text%20Documents/m13kegbk.txt)에 개시되어 있으며, 개시된 M13KE 벡터의 유전자 서열(서열번호 3)은 도 1 및 2에 나타내었다. 또한, 이는 하기의 참조문헌에서도 확인할 수 있으며, 하기 문헌들은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

- 참조문헌 1 (bases 1 to 7222): The maltose-binding protein as a scaffold for monovalent display of peptides derived from phage libraries; Zwick,M.B., Bonnycastle,L.L., Noren,K.A., Venturini,S., Leong,E., Barbas,C.F. III, Noren,C.J. and Scott,J.K.; Anal Biochem 264 (1), 87-97 (1998)

- 참조문헌 2 (bases 1 to 7222): Construction of high-complexity combinatorial phage display peptide libraries; Noren,K.A. and Noren,C.J.; Methods 23 (2), 169-178 (2001)

- 참조문헌 3 (bases 1 to 7222): Sequence of M13KE; Stewart,F.J.

- 참조문헌 4 (bases 1 to 7222): Direct Submission; Paschal,B.M.; Submitted (19-OCT-2007) Research Department, New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938, USA

또한, 제한효소로는 BspHI(NEB, product# R0517S), BamHI 제한효소(NEB, product#R3136T)를 사용할 수 있으나, 유전자 재조합이 가능한 것이라면 이에 한정되지 않고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예로서 상기 (2)단계에서 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 그래피틱 표면에 콘쥬게이션시키는 단계는 바이오 패닝(bio-panning) 방법에 의해 이루어지며, 바이오 패닝 방법은 구체적으로 하기와 같은 방법을 예로 들 수 있다(도 3 참조).

먼저 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 완충액에 준비하고 그래피틱 표면과 반응(conjugating)시킨다. 기존에는 그래피틱 표면으로써 생산과정에서 대부분 표면이 손상되는 탄소나노튜브필름 표면 등을 이용하였기 때문에, 결합력이 높은 펩타이드를 도출하기 어렵다는 단점이 있었다. 이에 본 발명은 이를 보완하기 위하여, 일 실시예로서 HOPG와 같은 그래피틱 표면을 갖는 기판 등을 사용하면서, 사용 직전에 표면을 테이프로 떼어내어 깨끗한 표면을 사용하면 샘플 표면의 산화 등으로 인한 결함을 최소화시킬 수 있다.

그리고 p8 펩타이드 라이브러리를 상기 그래피틱 표면과 반응 시킨 다음, 용액을 제거한 후, 완충액으로 세척(washing)하고, 세척된 HOPG 표면에 산성 완충액을 반응시켜 비선택적으로 반응하는 펩타이드를 용리시킨다. 산성 완충액으로 용리가 되지 않고 남은 파지는 미드-로그(mid-log) 상태의 대장균 배양물(E.coli culture)로 용리시킨다. 용리된 배양물의 일부는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing) 및 펩타이드 식별(peptide identification)을 위하여 남겨두고 나머지는 증폭(amplification)해서 다음 라운드를 위한 서브 라이브러리(sub-library)를 만든다. 이 때 만들어진 서브 라이브러리를 이용하여 상기의 과정을 반복한다. 한편, 남겨둔 플라크(plaque)는 DNA를 분석하여 p8 펩타이드 서열을 구할 수 있으며 이 때 얻어진 서열을 분석하여 본 발명의 그래피틱 표면과 반응하는 펩타이드 서열을 얻을 수 있다.

종래에도 원하는 물질과 반응하는 펩타이드를 찾기 위한 바이오 패닝 방법이 널리 이용되고 있었지만, 상기와 같은 방법으로 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 제조하고 이를 이용하여 펩타이드를 스크리닝한 방법은 없었다.

이때 본 발명의 일 실시예에 따라 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리로부터 스크리닝된 펩타이드는 기존의 파지 디스플레이 p3 펩타이드 라이브러리로부터 스크리닝된 펩타이드가 약 5개의 복제수(copy number)를 갖는 것과는 달리, 약 2700개의 많은 양의 복제수를 가지고 있으므로 제조과정에서 파지를 이용하여 손쉽게 증폭시킬 수 있어 추가적인 단백질 정제과정이 필요없다. 따라서 펩타이드의 제조비용을 매우 절약할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 M13 파지 등의 파지 표면에 나타나는 p8 펩타이드를 사용함으로써 파지 증폭을 통하여 펩타이드를 손쉽게 얻을 수 있다.

그리고 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 신소재로서 높은 부가가치를 갖는 나노 탄소 물질들인 그래핀, 탄소나노튜브, 풀러린 등의 그래피틱 표면과 선택적, 특이적으로 결합하므로 이들 나노 물질의 특성을 손상시키지 않으면서 추가적인 기능 부여를 할 수 있다. 무엇보다도 상기 본 발명의 스크리닝 방법에서 제한효소를 이용하여 변이되지 않은 대조군(negative control) 펩타이드보다 그래피틱 표면에 대하여 약 10배 이상의 높은 강한 결합력을 지닌다.

이에 본 발명은 다른 일 실시예로서 상기와 같은 서열번호 1 및 서열번호 2 중 하나 이상의 펩타이드가 특이적으로 결합된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질을 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명은 또 다른 일 실시예로서 상기 서열번호 1 및 2 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 파지를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 일 실시예로서 서열번호 1 및 2 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 외피 단백질에 디스플레이(display)한 필라멘터스 파지(filamentous phage)를 제공하며, 필라멘터스 파지로는 M13 파지를 예로 들 수 있다. 이때 M13 파지는 그래피틱 표면에 선택적으로 결합하기 위한 펩타이드를 포함하도록 유전적으로 설계하는 것이 용이하다.

본 발명의 일 실시예로서 M13 파지의 외피 단백질은 P3, P6, P7, P8 및 P9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 보다 구체적으로 펩타이드는 p8에 디스플레이 될 수 있다(도 4 참조). 이때 p3, p6, p7 및 p9는 마이너 외피 단백질(minor coat protein)이고 p8은 메이저 외피 단백질(major coat protein)로서, 마이너 외피 단백질은 모두 복제수가 5개 이하로 매우 적은 반면 메이저 외피 단백질인 p8은 복제수가 2700개로 매우 많고 파지의 몸통에 위치하고 있어 펩타이드가 표현될 수 있는 면적이 상대적으로 매우 넓다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예로서 상기 본 발명의 펩타이드가 M13 파지의 몸통 부분에 위치한 외피 단백질인 p8에 디스플레이될 경우, 마이크로 미터 크기(높이 880 nm, 지름 6.5 nm 이하)의 파지 몸통 자체를 직접 이용하여 그래핀과 같은 나노 탄소물질을 기능화할 수 있으므로 실질적인 응용이 가능하다.

또한, 크기가 나노미터에 불과한 펩타이드 자체를 이용하는 경우 그래피틱 물질 간의 결합을 유도할 수 없으나 펩타이드가 몸통에 표현된 마이크로 크기의 파지를 이용하면 동종 혹은 이종 나노 탄소물질 간의 결합도 비파괴적인 방법으로 형성시킬 수 있으므로 에너지 변환 또는 저장 소자, 유연 전자소자, 바이오 센서 등의 응용에 핵심적인 침투 네트워크(percolated network) 구조의 나노 탄소 물질을 다양하게 구현하는 것이 가능하다.

또한, 상기 필라멘터스 파지는 실 형태를 가지고 있으므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 외피 단백질에 디스플레이한 필라멘터스 파지는 그래피틱 표면과 결합시 그래피틱 표면과 펩타이드의 접촉면이 넓어 강한 결합력을 제공할 수 있다.

이에 본 발명은 다른 일 실시예로서 상기 본 발명에 따른 파지가 배열된 그래피틱 물질을 제공할 수 있다.

이는 파지로서 M13 파지가 배열된 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(Highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes) 또는 풀러린(fullerene)을 예로 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 파지는 그래피틱 물질의 그래피틱 표면에 파지 자체가 배열되면서 그 일체로서 하나의 시스템을 형성할 수 있다. 따라서, 파지에 포함된 펩타이드의 그래피틱 표면에 대한 높은 결합력과 특이성 및 파지 자체의 액정(liquid crystalline) 특성까지도 동시에 이용할 수 있으므로 대면적으로 그래피틱 표면을 기능화할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 일 실시예로서, 필라멘터스 파지는 이 파지 자체의 실 형태의 구조를 이용하여 그래피틱 표면상에 방향성을 갖고 배열될 수 있다. 예를 들면 특정 방향으로 일렬로 배열될 수 있으며, 이 경우 파지의 몸체부위에 위치한 펩타이드와 그래피틱 표면과의 결합력이 상승함과 동시에 일자정렬로 인한 와이어 특성도 이용할 수 있다. 일자로 정렬된 파지는 그래피틱 표면에 비등방적 (anisotropic) 기능화를 부여할 수 있으며 이는 펩타이드만을 이용했을 경우에는 등방적(isotropic), 혹은 랜덤한 기능화만 가능한 것과는 차별화된다. 예를 들어, 비등방적 기능화는 그래핀에 추가적인 특이한 전기적 특성을 부여하며 이를 이용하면 신개념의 전자소자를 구현할 수 있다(Anisotropic behaviours of massless Dirac fermions in graphene under periodic potentials, Cheol-Hwan Park et. al, Nature Physics 2008, vol.4, 213-217). 상기와 같은 일자 정렬구조 외에도 본 발명의 일 실시예에 따른 파지는 스멕틱(smectic)구조와 같은 층상구조, 네마틱(nematic) 구조, 나선구조, 격자구조 등 특정 방향성을 갖는 구조를 형성할 수 있으므로, 파지의 배열 구조에 따라 그래피틱 표면상에 다양한 기능을 부여할 수 있다(Chiral Smectic C Structures of Virus-Based Films, Seung-Wuk Lee et. al, Langmuir 2003, Vol.19, no.5, 1592-1598). 상기 논문들은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.

도 5는 상기 본 발명의 펩타이드를 디스플레이한 파지의 일 실시예로서 서열번호 1을 외피 단백질 중 p8에 포함하는 M13 파지를 그래핀(제품명: Kish graphite 제조사: Covalent)의 표면에 결합시킨 후. 원자력현미경(Atomic Force Microscope, AFM)으로 측정한 이미지를 나타낸 것이다. 상기 M13 파지가 결합된 그래핀은, 본 발명의 일 실시예로서 초순수 증류수(pH 5.3)로 1.25 X 10¹³ viral particle/ml의 농도를 갖도록 제조된 상기 M13 파지의 용액에 SiO₂기판에 올려진 그래핀을 담갔다 끌어올리는 딥-코팅 방법(dip-coating method)으로 제조한 것이다. 이때 상기 파지 용액에 사용되는 용매의 pH가 높을수록 파지간의 정전기적 배척력(electrostatic repulsive force)이 커지므로 파지 간의 간격이 커질 수 있으며, 이를 사용하여 제조한 용액의 파지의 농도가 높을수록 그래피틱 표면상에 배열된 파지간의 간격은 더 조밀해질 수 있다. 따라서, 용매의 pH와 파지의 농도를 조절함으로써 그래피틱 표면상에 배열되는 파지의 수 및 간격 등을 조절할 수 있다.

AFM으로 나노물질의 표면을 측정하는 경우 표면의 높이가 높을수록 밝게 나타나는데, 도 5에서 알 수 있듯이 SiO₂ 기판은 검정색을 나타내는 것으로 보아 명도가 낮고, 그래핀은 명도가 높다. 이는 본 발명에 따른 서열번호 1을 포함하는 파지가 SiO₂ 기판 위에는 결합되어 있지 않고 그래핀 표면 위에만 결합되어 있어 명도가 더 높게 나타난 것이기 때문이다. 이를 통해 서열번호 1의 펩타이드가 그래핀 표면에 대하여 높은 선택성과 특이성을 지님을 알 수 있다.

한편, 도 5에서 그래핀 표면상에 존재하는 큰 원은 공기 버블에 의해 생긴 구멍으로서, 그 아래로 그래핀 표면이 드러나 있다. 이에 파지는 공기 버블을 제외한 그래핀 표면을 한 층으로 잘 덮고 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 공기버블 주위에는 공기 버블에 의해 고정화된 파지가 그래핀과 직접적으로 결합하지 않고 그래핀과 결합한 파지 위에 이층으로 결합된 형태를 나타내고 있음을 알 수 있다. 특히 도 5의 오른쪽 사진을 보면, 공기 버블 주위의 파지 위에 있는 파지는 서로 밀쳐내는 힘이 있으므로 접촉을 최소화하고 있기 때문에 개별 파지가 또렷이 잘 나타난 반면, 그래핀과 붙어 있는 파지는 파지에 포함된 펩타이드와 그래핀과의 결합력이 강하므로 그 결합 면적을 최대화하기 위하여 옆으로 퍼져 있다. 즉, 개별 파지가 뚜렷하게 나타나지 않고 그래피틱 표면에 파지들이 배열된 하나의 구조로 일체화되어, 그 자체로서 기능화된 시스템을 형성하였음을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 그래핀 등의 그래피틱 표면에 대하여 선택적인 결합력을 지니고 있으며, 파지자체의 형태(morphology)를 변화시킬 정도로 강한 결합력을 지니고 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 파지는 그래피틱 표면의 기능화를 비파괴적으로 할 뿐만 아니라 나노 단위의 펩타이드만 그래피틱 표면에 결합시킬 경우보다 마크로 스케일에서도 기능화가 가능하다. 예를 들면, 파지를 이용하여 동종 혹은 이종 탄소 화합물 간의 결합을 유도할 수 있으며, 나아가 나노 탄소물질들을 서로 연결시킴으로써 도전 네트워크(conducting network)를 구현할 수가 있다. 따라서, 고성능 에너지 전극 소재 및 센서 소재로 사용이 가능하다. 이와 같이, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 그래피틱 물질에 결합시키는 것뿐만 아니라, 펩타이드를 디스플레이한 파지자체를 그래피틱 물질에 결합시킬 수 있으므로, 그래피틱 표면을 갖는 그래피틱 물질의 새로운 응용 분야를 제시하는 데 기여할 수 있을 것으로 예상된다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리의 제조

본 발명의 일 실시예로서, M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 하기의 방법에 의해 제조하였다.

우선, M13KE 벡터(NEB, product#N0316S)의 1381번째 염기쌍(base pair)인 C를 G로 부위특이적 변이(site-directed mutation)하여 M13HK 벡터를 제작하였다.

이때 상기 부위특이적 변이에 사용한 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)의 염기서열은 다음과 같다:

5'-AAG GCC GCT TTT GCG GGA TCC TCA CCC TCA GCA GCG AAA GA-3'(서열번호 4), 및

5'-TCT TTC GCT GCT GAG GGT GAG GAT CCC GCA AAA GCG GCC TT-3'(서열번호 5)

상기 제작된 M13HK 벡터에 제한효소 BspHI (NEB, product# R0517S) 및 BamHI 제한효소(NEB, product#R3136T)를 이용하여 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 제작하였다.

본 발명의 일 실시예로서 상기 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리의 제조에 사용된 올리고뉴클리오티드의 염기서열은 다음과 같다:

5'- TTA ATG GAA ACT TCC TCA TGA AAA AGT CTT TAG TCC TCA AAG CCT CTG TAG CCG TTG CTA CCC TCG TTC CGA TGC TGT CTT TCG CTG CTG -3'(서열번호 6),및

5'- AAG GCC GCT TTT GCG GGA TCC NNM NNM NNM NNM NNM NNM NNM NCA GCA GCG AAA GAC AGC ATC GGA ACG AGG GTA GCA ACG GCT ACA GAG GCT TT -3'(서열번호 7)

상기 제조된 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리의 염기서열은 4.8x10⁷ pfu(plaque form unit)가지의 다양성을 가지며 각각의 서열당 1.3x10⁵개 정도의 복제수(copy number)를 지녔다.

[실시예 2] 펩타이드의 선별(screening)

본 발명의 일 실시예로서 상기 실시예 1에서 제조된 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 바이오 패닝(bio-panning) 방법에 의해 그래피틱 표면에 결합시켜 펩타이드를 선별하였으며, 바이오 패닝 방법은 하기와 같다.

먼저, 그래피틱 표면을 갖는 물질인 HOPG(highly oriented pyrolytic graphite, SPI, product#439HP-AB)를 실험 전에 테이프로 떼어내어 깨끗한(fresh) 표면을 얻어 샘플 표면의 산화 등으로 인한 결함을 최소화시켰다.

이때 HOPG 기판은 입자크기(grain size)가 100μm 이하의 비교적 큰 HOPG 기판을 사용하였다.

그 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 4.8x10¹⁰가지(4.8x10⁷가지 다양성, 각 서열마다 복제수 1000개)의 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 100μl의 TBS(Tris-Buffered Saline) 완충액에 준비한 다음 HOPG 표면과 1시간 동안 100rpm으로 진탕배양기(shaking incubator)에서 반응(conjugating)시켰다. 1 시간 후 용액을 제거한 다음, TBS에서 10번 반복 세척(washing)하였다. 세척된 HOPG 표면에 산성 완충액으로서 pH 2.2의 Tris-HCl을 8분 동안 반응시켜 비선택적으로 반응하는 펩타이드를 제거(elution)한 후, 미드-로그(mid-log) 상태인 XL-1 blue E. coli 배양물(culture)을 30분 동안 용리시켰다. 용리된 배양물의 일부는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing) 및 펩타이드 식별(peptide identification)을 위하여 남겨두고 나머지는 증폭(amplification)해서 다음 라운드를 위한 서브 라이브러리(sub-library)를 만들었다. 이때 만들어진 서브 라이브러리를 이용하여 상기의 과정을 반복하였다. 한편, 남겨둔 플라크(plaque)는 DNA를 분석하여 p8 펩타이드 서열을 구하고, 이때 얻어진 서열을 분석하여 본 발명의 그래피틱 표면과 반응하는 펩타이드 서열을 얻었다.

하기 표 1은 상기의 바이오 패닝 방법을 이용하여 선별한 펩타이드의 아미노산 서열 중 일부를 나타낸 것이다.

서열번호	아미노산 서열
P8GB#1(서열번호 1)	DSWAADIP
P8GB#3(서열번호 8)	DTKWTGGE
P8GB#5(서열번호 2)	DNPIQAVP
P8GB#6(서열번호 9)	VTAVPNDT
P8GB#8 (M13HK, 음성 대조군, 서열번호 10)	EGE

[시험예 1] 결합력(binding affinity)의 비교

상기 실시예 2에서 선별한 펩타이드 서열 P8GB#1, 3, 5, 6 및 8의 그래피틱 표면에 대한 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

먼저, 상기 실시예 2에서 사용된 바이오 패닝 방법을 사용하여 펩타이드 서열 P8GB#1, 3, 5, 6 및 8을 각각 포함하는 M13 파지를 제작하고, 이를 동일한 조건에서 HOPG와 반응시킨 다음, 세척 후 남아 있는 파지의 개수를 비교함으로써 결합력을 비교하였다.

즉, 상기 5가지의 펩타이드 서열을 각각 100μl TBS(Tris-Buffered Saline) 완충액에 준비한 다음 HOPG 표면과 1시간 동안 100rpm으로 진탕배양기(shaking incubator)에서 반응(conjugating)시켰다. 1 시간 후 용액을 제거한 다음, TBS에서 10번 반복 세척(washing)하였다. 세척된 HOPG 표면에 산성 완충액으로서 pH 2.2의 Tris-HCl을 8분 동안 반응시켜 비선택적으로 반응하는 펩타이드를 제거(elution)한 후, 미드-로그(mid-log) 상태인 XL-1 blue E. coli 배양물(culture)을 30분 동안 용리시켰다. 용리된 배양물 내의 각 5가지 펩타이드 서열의 개수를 타이터(titer) 방법을 이용하여 확인하였으며, 도 6에 그래프로 나타내었다.

도 6에서 알 수 있듯이 본 발명의 일 실시예인 P8GB#1(서열번호 1)은 P8GB#8 (M13HK, 음성 대조군)보다 약 9.6배, 본 발명의 다른 일 실시예인 P8GB#5(서열번호 2)는 약 2.9배 정도 강한 결합력을 가진데 반해, P8GB#3은 P8GB#8(음성대조군)보다 1.1배 정도의 높은 결합력을 보여 큰 차이가 없었다.

따라서, 본 발명에 따른 펩타이드가 동일한 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리에서 유래된 다른 서열을 갖는 펩타이드보다도 매우 높은 결합력을 가짐을 알 수 있었다.

[시험예 2]펩타이드 서열을 소수성 특성 분석

본 발명에 따른 펩타이드 서열인 P8GB#1 및 #5가 P8GB#3 및 #6보다 현저히 높은 결합력을 갖는 원리를 분석하기 위하여, 각 펩타이드 서열의 소수성 특성을 카이트-두리틀 스케일(Kyte-Doolittle scale)을 사용하여 분석하고(window size=5), 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 세로축의 스케일 값이 (+)일수록 소수성을, (-)일수록 친수성이 강함을 의미한다.

도 7에 나타낸 그래프를 살펴보면, 본 발명에 따른 펩타이드 서열인 P8GB#1과 P8GB#5는 모두 아미노산 서열 중 5~6번째 서열구간에서 0.6 이상의 높은 소수성 값을 나타내는 것을 알 수 있다. 이때, P8GB#1이 P8GB#5보다 높은 결합력을 나타내는 것은 P8GB#1의 방향족기인 트립토판(Tryptophan, W) 때문으로 판단된다. 즉, P8GB#1의 서열에는 그래피틱 표면과 반응성이 좋은 방향족기가 아미노산 서열의 가운데 위치함으로써 결합력이 높은 것으로 판단된다.

이에 반해, P8GB#3과 P8GB#6은 아미노산 서열의 가운데, 즉 5~6번째 서열 구간에서 낮은 소수성 값을 나타내기 때문에 그래피틱 표면과의 결합력도 낮게 나타난 것으로 판단된다. 비록 P8GB#3의 경우 방향족기인 트립토판을 갖고 있지만, P8GB#3은 5~6번째 서열이 낮은 소수성을 갖고 있고 소수성 특성과 방향족기의 특성 중 소수성 특성이 방향족기의 특성보다 더 강한 영향력을 갖기 때문이다.

또한, P8GB#6의 경우 시퀀스의 일부가 소수성 특성을 지니지만 5, 6번 위치의 아미노산이 친수성이어서 오히려 결합력은 음성 대조군인 P8GB#8(EGE)보다 낮은 것을 알 수 있다. 이는 추가로 삽입시킨 P8GB#6의 펩타이드가 원래 파지의 비특이적 바인딩까지 억제시키기 때문으로 판단된다.

따라서, 방향족기를 포함하는 펩타이드가 항상 그래피틱 표면과 강한 반응을 하는 것은 아니고 소수성 특성이 중요함을 알 수 있으며 그 중에서도 소수성 패턴이 중요함을 알 수 있다.

[시험예 3] 펩타이드가 디스플레이된 M13 파지가 정렬된 그래핀의 제조

본 발명의 일 실시예로서 서열번호 1의 펩타이드가 디스플레이된 M13 파지를 정렬시킨 그래핀을 제조하였다.

먼저, 상기 실시예 2에서 사용된 바이오 패닝 방법을 사용하여 펩타이드 서열 P8GB#1(서열번호 1)을 포함하는 M13 파지를 제작하고, pH가 높을수록 파지간의 정전기적 배척력(electrostatic repulsive force)이 커지므로 파지 간의 간격이 커질 수 있다는 것을 고려하여, pH를 7.0으로 맞춘 초순수 증류수로 농도가 1 X 10¹³ viral particle/ml인 파지 용액을 제조하였다. 이때 파지 용액의 농도는 하기의 수학식 1로 계산할 수 있다.

그 다음, 테이핑(Taping) 방법을 이용하여 그래핀(제품명:Kish graphite 제조사:Covalent)을 SiO₂/Si 기판(제품명:EPI-Prime Si wafer with 300 nm dry oxidized SiO2, 제조사:SILTRON INC, Korea) 상에 올렸다. 그래핀이 올려져 있는 기판을 상기에서 제조한 P8GB#1 펩타이드가 디스플레이된 파지 용액에 담근 다음, 10 μm/min의 속도로 상기 기판을 다시 용액 밖으로 끌어올렸다(dip-coating method). 그리고 이 끌어올린 기판의 표면에 펩타이드의 결합에 의해 파지가 배열된 모습을 원자력 현미경(Atomic Force Microscope, AFM)으로 관찰하고, 그 이미지를 도 8에 나타내었다.

도 8을 구체적으로 살펴보면, 그래핀 상에 일정 방향으로 배열된 파지 자체의 정렬구조를 파지와 그래핀 결합에 의한 파지 형태 변화에도 불구하고 배열된 모습이 잘 드러나있다. 구체적으로, 서열번호 1의 펩타이드가 M13 파지의 외피 단백질 중 몸통부분인 p8에 포함되어 있으므로, 이 펩타이드의 그래핀 표면에 대한 강한 결합력에 의해 파지가 실 모양으로 누운 형태로 배열되어 있다. 특히, 상기 실 모양의 파지들이 모두 동일한 방향으로 방향성을 갖고 일렬로 정렬되어 있음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 파지를 그래피틱 표면을 갖는 물질에 방향성을 갖도록 배열할 경우, 그래피틱 표면을 갖는 물질자체를 비등방적으로 기능화시킬 수 있음을 의미한다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Graphitic materials-binding peptide and phage comprising the peptide <130> 13P085/IND <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P8GB#1 <400> 1 Asp Ser Trp Ala Ala Asp Ile Pro 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P8GB#5 <400> 2 Asp Asn Pro Ile Gln Ala Val Pro 1 5 <210> 3 <211> 7222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cloning vector M13KE <400> 3 aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180 gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300 ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360 tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420 cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480 tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540 aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600 ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660 aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720 atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780 tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840 caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900 ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960 aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020 tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080 gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140 caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200 caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260 gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320 caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380 cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440 tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500 attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560 ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtg gtacctttct 1620 attctcactc ggccgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680 ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740 tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800 gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860 ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920 ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980 accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040 agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100 aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160 atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220 atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280 ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340 gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400 attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460 aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520 ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580 gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640 taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700 ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760 tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820 ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880 attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940 taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000 gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060 tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120 ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180 ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240 tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300 ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360 ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420 cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480 cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540 aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600 gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660 ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720 ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780 ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840 ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900 atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttct cgcgttcttt 3960 gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020 aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080 agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140 gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200 ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260 gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320 gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380 actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440 gttttacgtg caaataattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500 aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560 gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620 tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680 tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740 agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800 actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860 ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920 ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980 gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040 attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt tccttttatt 5100 actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160 caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220 ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280 actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340 ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400 atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460 tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520 tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700 tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820 tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 5880 caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940 caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000 gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060 cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120 cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 6180 tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc 6240 atgcctgcag gtcctcgaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 6300 ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 6360 gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 6420 gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 6480 ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 6540 tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 6600 cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 6660 cgcgaattat ttttgatggc gttcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 6720 taatgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 6780 cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 6840 acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc 6900 ctttgtagat ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatt aatttatcag ctagaacggt 6960 tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt tctcaccctt ttgaatcttt 7020 acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc 7080 ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag ggtcataatg tttttggtac 7140 aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg 7200 cctgtatgat ttattggatg tt 7222 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamH I_SM_upper <400> 4 aaggccgctt ttgcgggatc ctcaccctca gcagcgaaag a 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamH I_SM_lower <400> 5 tctttcgctg ctgagggtga ggatcccgca aaagcggcct t 41 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13HK_P8_primer <400> 6 ttaatggaaa cttcctcatg aaaaagtctt tagtcctcaa agcctctgta gccgttgcta 60 ccctcgttcc gatgctgtct ttcgctgctg 90 <210> 7 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13HK_P8 <400> 7 aaggccgctt ttgcgggatc cnnmnnmnnm nnmnnmnnmn nmncagcagc gaaagacagc 60 atcggaacga gggtagcaac ggctacagag gcttt 95 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P8GB#3 <400> 8 Asp Thr Lys Trp Thr Gly Gly Glu 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P8GB#6 <400> 9 Val Thr Ala Val Pro Asn Asp Thr 1 5 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P8GB#8 <400> 10 Glu Gly Glu 1

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 그래피틱 물질(graphitic material)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제2항에 있어서, 상기 그래피틱 물질은 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(Highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes) 및 풀러린(fullerene) 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리(M13 phage display p8 peptide library)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 스크리닝하는 방법으로서,
(1)M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리(M13 phage display p8 peptide library)를 제조하는 단계;
(2)상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 그래피틱 물질의 표면에 콘쥬게이션(conjugation)시키는 단계;및
(3)그래피틱 물질의 표면에 결합되지 않은 펩타이드를 제거하여, 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리 중 상기 그래피틱 물질의 표면에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하는 단계;
를 포함하는 펩타이드의 스크리닝 방법.
제5항에 있어서, 상기 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리는
(a) M13 파지 벡터를 부위-특이적 변이(site-directed mutation)하여 변이된 M13 파지 벡터를 제조하는 단계;및
(b)상기 변이된 M13 파지 벡터에 제한효소를 이용하여 M13 파지 디스플레이 p8 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 펩타이드의 스크리닝 방법.
제1항의 펩타이드가 결합된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.
제7항에 있어서, 상기 그래피틱 물질은 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(Highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes) 및 풀러린(fullerene) 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 펩타이드가 결합된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.
제1항의 펩타이드를 외피 단백질(coat protein)에 디스플레이(display)한 M13 파지.
제9항에 있어서, 상기 외피 단백질은 P3, P6, P7, P8 및 P9로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 M13 파지.
제10항에 있어서, 상기 외피 단백질은 P8인 것을 특징으로 하는 M13 파지.
제9항의 M13 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.
제12항에 있어서, 상기 그래피틱 물질은 그래파이트(graphite), 그래핀(graphene), 고배향성 열분해흑연(Highly oriented pyrolytic graphite; HOPG), 탄소나노튜브(carbon nanotubes) 및 풀러린(fullerene) 중에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 M13 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.
제12항에 있어서, 상기 M13 파지가 그래피틱 표면에 방향성을 갖고 배열된 것을 특징으로 하는 M13 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.
제12항에 있어서, 상기 M13 파지가 그래피틱 표면에 일렬로 배열되어 있는 것을 특징으로 하는 M13 파지가 배열된 그래피틱 표면을 포함하는 그래피틱 물질.