KR20140123374A - 야관문 추출물을 함유한 창상치유 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 창상치유용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 야관문 추출물을 함유하여 상처치유 및 조직재생을 위한 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로 야관문 추출물을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 야관문 추출물로 세포독성 실험 및 항염증 활성실험을 시행하는 단계와; 창상을 유발한 마우스에 베이스 세럼(base serum), 시판 연고, 야관문 추출물을 함유한 세럼을 도포하여 비처리구와 비교, 평가하는 단계를 통하여 달성되며 본 발명 야관문 추출물을 함유한 화장료 조성물은 창상치유 및 항염효과가 있다.

Description

야관문 추출물을 함유한 창상치유 기능성 화장료 조성물{Cosmetic composition for healing wound comprising Lespedeza cuneata extract}

본 발명은 창상치유 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 야관문 추출물을 함유하여 상처치유 및 조직재생 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부(Skin)는 외부자극으로부터 몸을 보호하는 신체방어에 중요한 역할을 하며 피부를 구성하는 외피 및 진피가 손상되어 피부구조의 연속성이 파괴되는 것을 창상(wound)이라고 한다. 본 발명에서 창상치유(wound healing)라 함은 염증반응과 신생조직형성 및 재상피화 단계가 복합적으로 이루어져 창상부위를 복구하는 과정을 말한다. 염증반응에는 산화적 스트레스 원인물질과 이로 인해 발현되는 염증관련 사이토카인이 관여하며 이를 개선 및 치료하기 위한 천연 항산화소재 개발이 진행되고 있으며 다양한 활성성분의 함유로 인하여 부작용이 적고 우수한 치유효과를 지닌 천연물을 약이나 화장품 소재로 개발하려는 연구가 진행중이다.

현대사회에서는 여성의 사회진출 증가와 생활수준의 향상 및 문화적, 사회적 가치관의 변화로 인해 남녀노소를 불문하고 피부와 화장품에 대한 관심과 수요가 계속 증가하고 있다. 최근에는 미용기능성을 강조하는 기능성 화장품과 구분하여 피부미용 및 치료기능까지 포함한 기능성 화장품을 의미하는 코스메슈티컬 (cosmeceuticals)에 대한 소비자 관심과 요구도 증가하고 있다. 화장품의 기능성 소재로서 피부에 부작용이 적고 입증된 안전성을 가지는 천연물 소재를 개발하려는 노력이 활발하다.

야관문(Lespedeza cuneata G.Don)은 콩과의 여러해살이 식물로 비수리, 삼엽초 등 여러 이름으로 불리며 우리나라를 비롯한 일본, 중국 및 대만 등지에 분포하고 있는 자원으로서 간과 콩팥의 기능을 보호해주고 폐 기능강화 및 혈액순환에 효능이 있어 관련질병에 약재로 쓰이고 있다(Lee et al, Antibacterial and antioxidative activity of Lespedeza cuneata g. don. Korean J Microbiol Biotechnol, 39, 2011, 63-69). 야관문에 함유된 유용 생리활성 물질은 피티톨(pinitol), 아비큘라린(avicularin), 트리폴린(trifolin), 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 및 퀘세틴(quercetin), 캠퍼롤(kaempferol), 비텍신(vitexin) 등 여러 종류의 플라보노이드가 있다(Numata et al.,C-glycosylflavones in Lespedeza cuneata. Chem Pharm Bull, 23, 1980, 964-965). 야관문은 노화방지에 유용한 비타민 E 함량이 높을(Cha et al., Analysis of minerals, amino acids and vitamin of Lespedeza cuneata. Korean J Biotechnol Bioeng, 21, 2006, 414-41) 뿐만 아니라 항균, 항산화 효과(Kim et al.,Antioxidative activity of hot water and ethanol extracts of Lespedeza cuneta seeds. Korean J Food Preserv, 14, 2007, 332-335) 및 피부 광노화 억제효과가 있다는 것이 알려져 있다(Kim et al.,Inhibitory effects of Lespedeza cuneata ethanol extract on ultraviolet-induced photo aging. J Korean Soc Food Sci Nutr, 41, 2012, 1540-1545).

국내 등록특허 제10-0309071호에는 곽향, 첨호 및 침향 추출물을 함유한 주름개선 및 창상치유 작용이 있는 피부용 조성물이 개시된 바 있다. 국내 등록특허 제10-0992216호에는 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 포함하는 창상 치료용 미네랄 조성물이 개시된 바 있다. 국내 등록특허 제10-0542824호에는 상륙, 토사자 및 백강잠 추출물을 포함하는 탄력증진 및 창상피부용 피부 조성물이 개시된 바 있다. 그러나 상기 특허문헌 어디에도 야관문 추출물(Lespedeza cuneata G.Don)을 함유하는 창상치유용 조성물 및 이를 유효성분으로 하는 조직재생 기능성 화장료 조성물은 전혀 개시되거나 암시된 바 없다.

따라서 본 발명의 목적은 야관문 추출물을 함유하는 창상치유용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 추출물을 유효성분으로 하는 조직재생 기능성 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 야관문 추출물을 제조하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 야관문 추출물로 세포독성 실험 및 항염증 활성실험을 시행하는 단계와; 창상을 유발한 마우스에 베이스 세럼(base serum), 시판 연고, 야관문 추출물을 함유한 세럼을 도포하여 비처리구와 비교, 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 창상치유 및 항염효과가 있는 야관문 추출물을 함유한 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 야관문 추출물에 따른 세포생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 야관문 추출물의 NO 생성저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 Hematoxylen and eosin 염색한 모습을 나타낸 사진도이다. A: 비처리군(NO), B: base serum 도포군(SCO), C: 시판 연고 도포군(PCO), D: 본 발명 야관문 추출물 함유 serum 도포군(본 발명 SSP)이다.
도 4는 Masson trichrome 염색한 모습을 나타낸 사진도이다. A: NO군, B: SCO군, C: PCO군, D:본 발명 SSP군이다.
도 5는 실험군의 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 화장료 조성물은 야관문 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다. 또 본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 사용되는 성분들을 포함할 수 있으며 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등 보조제와 이 밖에 담체를 포함할 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서, 상기 야관문 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01∼30중량% 함유되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡시화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 기술적 사항을 실시예 및 실험예를 들어 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 상기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 야관문 추출물 함유 시제품의 제조

본 발명에 사용한 야관문(Lespedeza cuneata G.Don) 추출농축액은 야관문에 70%(v/v) 에탄올을 첨가하여 추출기에 넣고 95℃에서 6∼10시간 동안 가열하여 유효성분을 추출하였다. 상온까지 추출액을 식힌 후 감압농축기에 넣어 1차 농축한 다음 5,000×g의 원심력으로 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액을 분자량 10kD 막 필터로 여과한 후 2차 농축하여 본 발명 야관문 추출물을 제조하였다.

본 발명에 사용한 야관문 추출농축액(고형분 35%) 및 창상 유발 마우스모델 동물실험에 사용된 야관문 추출농축액을 함유한 세럼타입의 제품은 소리소(Soriso Co.,경산,한국)에서 제공받아 사용하였다. 창상 유발 마우스모델 동물실험에 사용한 제품의 조성은 [표 1]에 나타내었다.

실험예 1: 야관문 추출물의 세포 독성효과

본 발명에 사용된 마우스 대식세포(RAW264.7)는 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. RAW264.7 대식세포는 100 unit/mL 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, 미국)과 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)(Welgene, 한국)이 함유된 DMEM 배지(Welgene, 한국)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

야관문 추출물에 대한 세포 독성을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)환원법을 이용하였다. RAW264.7 대식세포를 24-웰 플레이트에 3×10⁴ cells/well 농도로 분주하여 CO₂ 인큐베이터 (37℃, 5% CO₂)에서 24시간 배양한 후 야관문 추출물을 다양한 농도(0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5 mg/mL)로 처리하였다. 상기 세포들을 24시간 배양한 후 MTT(Sigma, 미국)용액을 최종농도 0.5 mg/mL 농도로 첨가하고 다시 4시간 동안 추가 배양한 다음 배지를 제거하고 형성된 formazan crystal을 1 mL dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해시켜 Microplate reader(Infinite M200 PRO, Tecan, Groedig Salzburg, Austria)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 대한 세포 독성은 시료를 처리하지 않은 세포의 흡광도 값을 100%로 하여 세포 생존율을 상대적인 값으로 나타내었다.

실험결과, [도 1]에서와 같이 무처리군 세포 생존율을 100%로 하여 상대적으로 비교해 볼 때 야관문 추출물을 농도별(0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5 mg/mL)로 처리한 결과는 0.5 mg/mL 조건에서 89%의 세포생존율을 보였으나 0.2 mg/mL 이하의 농도에서는 모두 95% 이상의 세포생존율을 나타냈다. 따라서 0.2 mg/mL 이하 농도의 야관문 추출물은 RAW264.7 대식세포의 생육에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.

실험예 2: 야관문 추출물의 항염증 효과

야관문 추출물의 염증반응 저해효능을 확인하기 위해 야관문 추출물을 처리한 RAW264.7 대식세포에 염증유발을 위해 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 처리한 후 NO(Nitric oxide) 생성 정도를 확인하였다. RAW264.7 대식세포로부터 생성된 NO의 양은 Griess법으로 측정하였다. 24-웰 플레이트 혈관내포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 야관문 추출물을 다양한 농도(0.05, 0.075, 0.1, 0.2 mg/mL)로 처리하고 2시간 동안 반응시킨 다음 지질다당류(LPS) 1 g/mL를 처리하여 18시간 동안 추가 배양하였다. 대식세포로부터 생성된 NO의 양은 배양액 100 L와 같은 양인 Griess reagent(Sigma, 미국)를 넣어주고 15분간 상온에서 반응시킨 다음 Microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(Sodium nitrite, NaNO₂)의 농도별 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 산출하여 나타내었다.

실험결과, [도 2]에서와 같이 RAW264.7 대식세포에 LPS를 처리하지 않고 배양한 대조군에서 NO 생성량은 1.04±0.60 M이었으며 LPS를 처리한 양성대조군에서는 31.02±4.30 M로 대조군에 비해 약 30배 정도 증가하였다. 야관문 추출물 0.05, 0.075, 0.1, 0.2 mg/mL를 처리하고 LPS로 활성화된 대식세포에서 NO의 생성량은 각각 18.51±0.47, 5.92±1.66, 2.44±0.32 및 1.91±0.23 M로 야관문 추출물 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 따라서 야관문 추출물은 대식세포의 NO 생성 저해에 관여하여 염증반응 억제 및 창상치유에 효과가 있는 것을 확인하였다.

실험예 3: 창상유발 및 창상치유효과 동물실험

본 발명에서 실험동물은 체중 180∼210 g의 4주령 수컷 Sprague-Dawley rat을 (주)중앙실험동물(한국)에서 구입하여 사료와 물은 충분히 공급하면서 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 안정화 기간이 지난 후 실험동물은 Zoletil 50(Virbac, Carros, France) 주사 마취하에 등 부위를 제모한 다음 피혁용 펀치(biopsy punch; 8 mm)를 이용하여 좌우대칭의 원형 결손창을 2개소 만들어 창상을 유발하였다.

실험군은 하기 [표 2]와 같이 창상유발 후 약물을 처리하지 않은 비처리군(NO), 창상을 유발한 후 베이스 세럼(base serum) 도포군(SCO), 20 mg/g의 후시딘산나트륨이 함유된 시판 연고를 도포한 양성대조군(PCO)과 2중량%의 야관문 추출물이 함유된 본 발명 세럼(serum) 타입 화장품 도포군(본 발명 SSP) 총 4개 군으로 분류하였으며 각 군당 5마리씩 총 20마리로 실험을 수행하였다. 약물 도포량은 가피가 탈각될 때까지 매일 1회씩 창상 유발 부위가 덮일 정도로 충분하게 도포하였으며, 외부 공기와 접촉을 최소화하였다.

상처치유의 진행과정을 관찰하기 위해서는 창상유발 후 3일 간격으로 디지털 카메라(CAMEDIATM, 일본)를 이용하여 각 군별로 일정한 거리에서 창상 부위를 촬영하여 상처의 변화를 창상의 크기로 육안검사에 의해 관찰하였으며 객관적 지표로 나타내기 위하여 digital calliper(Mitutoyo Co.,일본)로 창상의 면적을 측정하였다.

각 실험군의 창상치유를 통한 신생조직의 형성으로 인해 감소되는 창상면적을 [표 3]에 나타내었다.

실험결과, 8 mm 창상 유발 후 상처의 면적은 치료 3일째 약물을 도포하지 않은 NO군, base serum을 도포한 SCO군과 시판 연고를 도포한 PCO군은 약 5%정도 감소하였으나 야관문 추출물 세럼을 도포한 본 발명 SSP군에서는 약 17%의 상처 치유율을 보였다. 시료처리 12일째에는 NO군, SCO군과 PCO군은 각각 4.33±1.09, 3.86±0.28, 3.56±0.11 mm로 상처 면적을 나타낸 반면, 본 발명 SSP군에서는 1.92±0.19 mm로 유의적으로 크게 상처 면적감소를 보였으며 NO군과 비교해 약 30% 정도 빠른 회복을 나타내었다. 시료처리 21일째 반흔형성(scar)을 비교해 본 결과 NO군, SCO군, PCO군 및 본 발명 SSP군에서 반흔은 각각 5.65±0.51, 5.88±0.70, 5.64±0.37과 4.66±0.29 mm로 야관문 추출물이 함유된 제품 처리군이 대조군에 비해 유의적으로 적게 형성되었다.

실험예 4: 실험동물 창상조직의 조직학적 관찰

각 군별 실험동물의 조직병리학적 검사를 하기 위해 창상 21일째에 에틸에테르(ethyl ether)로 마취한 후 각 실험동물의 창상부위가 포함된 상처 조직절편을 채취하여 10% 중성 포르말린(formalin) 용액에 24시간 동안 고정하였다. 고정된 조직은 창상 중앙을 통과하는 절편을 취하여 탈수하고 파라핀(paraffin) 블록에 포매한 후 조직절편기(RM2125, Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 4 μm 두께로 절단한 다음 폴리라이신(polylysin)으로 코팅된 슬라이드에 부착하였다. 이후 Hematoxylin-Eosin(H&E) 염색을 통한 피부세포 및 조직의 재생을 관찰하였으며 진피 교원섬유 변화를 관찰하기 위하여 Masson's trichrome 염색을 실시하였다.

광학현미경을 통해 관찰한 실험결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다. 창상 부위의 염색소견에서 NO군, SCO군, PCO군 및 본 발명 SSP군의 모든 실험군에서 섬유아세포의 증식 및 교원질의 합성이 관찰되었다. 야관문 추출물이 함유된 제품을 도포한 본 발명 SSP군과 후시딘을 도포한 PCO의 경우 NO군에 비해 상피층(Epidermis, ED)의 두께가 얇고 일정하고 부드럽게 형성된 것을 확인 할 수 있었다. 또한 본 발명 SSP군이 진피층(Dermis, DM)에서의 모낭과(hair follicle, HF)을 비롯한 기타 피부부속기관과 구성조직의 재형성이 NO군에 비해 더욱 치밀하고 활발하게 일어난 것을 확인하였다. 그리고 SSP군을 제외한 다른 실험군은 아직 육아조직을 보이는 반면 본 발명 SSP군은 창상을 유발시키지 않은 피부조직구성과 가까운 재생조직을 나타내었다. 또한 본 발명 SSP군의 교원질은 다른 군에 비해 일정하게 가장 빨리 재형성된 것을 관찰할 수 있었다

실험예 5: 창상치유에 관련된 유전자 발현비교

도포한 시료가 창상치유에 관여하는 것으로 알려진 성장인자(growth factor) 및 사이토카인(cytokine) 중에 VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor beta), IL-10(interleukine-10) 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 창상부위 조직을 채취한 후 RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen, Hilden,독일)를 이용하여 각 조직의 RNA를 추출한 다음 정량하였다. 그리고 RT-PCR을 통해 [표 4] 유전자들의 mRNA발현을 비교분석하였다. 각 RNA 2 g은 Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit를 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA 0.5ul, Forward primer(10 pmole) 1 μL, Reverse primer(10 pmole), 2X SYBR Green(Bio-rad,미국) 12.5 μL를 최종 25 μL 부피가 되도록 멸균수를 첨가하여 Real time PCR(IQ5, Bio-rad, 미국)반응을 통해 [표 4] 유전자들의 발현정도(%)를 확인하였다.

실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 창상유발 21일째 실험군들의 조직에서 VEGF 유전자는 NO 실험군 66.6%, SCO 실험군 66.1%, PCO 실험군 65.5%, 본 발명 SSP 실험군 61.4%로서 SSP 군이 유의적으로 낮은 발현정도를 나타내었으며 TGF-1 유전자는 NO실험군 75.2%, SCO 실험군 70.33%, PCO 실험군 70.3%, 본 발명 SSP 실험군 79.8%로서 SSP 군이 유의적으로 높은 발현정도를 나타내었다.

통계분석

본 발명의 실험 결과는 3회 반복실험에 대한 평균값(mean)과 평균의 표준편차(SD)으로 나타내었으며 각 그룹간의 통계적 유의성은 SPSS ver 10.0(SPSS Inc., IL., USA)을 이용하여 one-way ANOVA 검정을 적용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

Claims (4)

1. 야관문(Lespedeza cuneata G.Don) 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상치유용 화장료 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 야관문 추출물은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.01∼30중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 창상치유용 화장료 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 등 보조제 및 담체를 추가적으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상치유용 화장료 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제형화된 것을 특징으로 하는 창상치유용 화장료 조성물.
   
   
   
   

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