KR20140109927A

KR20140109927A - 고효율 나노입자형 이중나선 올리고 rna 구조체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20140109927A
Application number: KR1020147018685A
Authority: KR
Inventors: 채제욱; 한보람; 김한나; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2014-09-16
Also published as: KR101752812B1; WO2013103249A1; CN107988227A; CN104114704A; BR112014016562A2; AU2013206989A1; BR112014016562A8; RU2577227C1; US20150005364A1; BR112014016562B1; JP6060178B2; CA2860527A1; AU2013206989B2; CA2860527C; EP2801615A1; US9326941B2; JP2015508998A; EP2801615A4

Abstract

본 발명은 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이중나선 올리고 RNA의 생체 내 안정성 향상 및 세포전달 효율 개선을 위해 이중나선 올리고 RNA에 고분자 화합물을 공유결합으로 연결시킨 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 상기 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
상기와 같이 최적화된 구조를 가지는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 이중나선 올리고 RNA의 기능이 저해되지 않으며, 이중나선 올리고 RNA의 안정성 및 효율적으로 세포막 투과 기능을 향상시킬 수 있으므로, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 이중나선 올리고 RNA를 세포 내로 전달할 수 있어 암 및 감염성 질병 등에서 이중나선 올리고 RNA 치료용 도구뿐만 아니라, 새로운 형태의 이중나선 올리고 RNA 전달 시스템으로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고효율 나노입자형 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 그의 제조방법{HIGH-EFFICIENCY NANOPARTICLE-TYPE DOUBLE-HELICAL OLIGO-RNA STRUCTURE AND METHOD FOR PREP ARING SAME}

본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 화학적으로 합성된 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것이다.

상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용한 이중나선 올리고 RNA 전달 기술에 관한 것이다.

간섭 RNA (RNA interference, 이하 'RNAi'라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적으로 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다(Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J. Mol. Med., 2005, 83: 764-773).

긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23 염기쌍(base pair, bp)로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 'siRNA'라고 한다)로 변환된다. siRNA는 19 내지 27 염기의 짧은 RNA 이중나선 구조로서 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).

외부에서 전달된 긴 사슬의 RNA 이중가닥은 포유동물 세포에서 인터페론(interferon) 발현을 통해 비 서열특이적인 면역반응을 유발하는 문제점을 가지는데, 이는 짧은 가닥의 siRNA를 통해 극복된다는 사실이 밝혀졌다 (Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001. 411, 494-498).

화학적으로 합성된 siRNA는 대개 약 19 내지 27 염기쌍(base pair, bp)의 이중가닥이며, 3'말단부위에 2-nt(nucleotide) 오버행(overhang) 구조로 이루어져 있고, siRNA 이중가닥이 활성을 나타내기 위해서는 3'수산기(OH, hydroxyl group)와 5'인산기 (PO₄ _,phosphate group)로 구성된 구조가 알려져 있다(Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008: 5812-5821; Strand-specific 5 -O-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity. RNA 1 February 2008: 263-274).

상용화된 합성 siRNA는 양 말단에 수산기가 있는 구조이며, 합성 siRNA가 세포 내로 전달되면, 인산화 효소(kinase)에 의해 siRNA 5'말단이 인산화 되어 siRNA 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다 (siRNA function in RNAi: A chemical modification analysis. RNA 2003. 9: 1034-1048).

베르트랑(Bertrand) 연구진의 연구에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 siRNA가 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296: 1000-1004).

또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 (small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).

siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 siRNA의 안정성 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되도록 되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).

또한 siRNA도 여전히 비특이적인 세포 면역반응(innate immune stimulation)을 가지고 있어서 이를 극복하기 위해 2-메톡시, 2 플루오로 치환체들이 개발되었다.

siRNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 소수성인 세포의 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵다

생체 내 (in vivo) 또는 생체 외(in vitro)에서 siRNA의 전달 효율을 높이기 위해 많은 종류의 세포전달 물질들이 개발 되었다. 리포좀, 양이온계 계면활성제 등이 일반적으로 많이 사용되고 있으며 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등의 전달체를 이용하기도 하고, siRNA를 화학적으로 변형 하거나, 접합체(conjugate)를 이용하는 방법이 알려져 있다(Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul; 36(12):4158-71).

siRNA는 음전하를 띄고 있기 때문에, 소수성인 세포의 인지질 이중막을 통과하지 못하므로 단순 확산을 통한 세포 내 전달이 어렵기 때문에, 이를 극복하기 위하여 siRNA의 결합 기본구조를 메틸포스포네이트(methylphosphonate)나 PNA(peptide nucleic acid)를 사용하기도 한다. 리포좀에 유전자를 융합시키는 방법이나 양이온을 지닌 지질이나 고분자를 이용한 방법 등의 전달체를 이용하기도 한다 (Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov. Today. 2008 Oct; 13(19-20):842-855).

이중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용하는 방법들은 나노입자 형성을 통하여 siRNA를 나노전달체(nanocarrier)에 실어서 세포에 siRNA를 전달하는 것이다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다(Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93(21):11493-8).

또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov 11; 432(7014):173-8). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스 (antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129(2):107-16). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.

최근 siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 공보 제883471호 참조).

하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타겟 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. siRNA의 화학적 변형을 할 때, RISC에 결합하여 타겟 mRNA를 인식하는 안티센스(가이드) 가닥의 5'말단에 변형을 가하지 않는 것이 RNAi 메커니즘의 개시에 매우 중요하며, 센스(패신저)가닥의 경우, 기존 연구를 통해 양 말단 모두 접합체가 결합 했을 경우에도 siRNA의 기능이 확인되어, 센스(패신저) 가닥이 접합체 결합에 활용되었다(siRNA Conjugate Delivery Systems.Bioconjugate Chem., 2009, 20 (1), pp 5-14).

이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 경우 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되며, 상기의 자가조립 나노입자를 'SAMiRNA'라고 지칭한다(대한민국 공개 특허 공보 2009-0042297호).

상기 이중나선 올리고 RNA에 소수성 및 친수성 물질을 핵산 말단에 결합시켜 자가조립 나노입자(SAMiRNA)를 형성하도록 하는 기술은 이중나선 올리고 RNA 가닥 바이어스(strand bias), 즉 친수성 및 소수성 물질이 결합된 위치에 따라 RNAi 기능이 저해될 수 있는 가능성이 있다. 따라서 이중나선 올리고 RNA 구조체의 최적화를 통해 이중나선 올리고 RNA의 기능이 저해되지 않으며, 효율적으로 세포막을 투과할 수 있는 이중나선 올리고 RNA 전달 기술 개발이 필연적으로 요구된다.

발명의 요약

본 발명은 자가조립 나노입자인 SAMiRNA의 생체 내 효율을 극대화 할 수 있는 구조를 제공하고자 한다. 본 발명에서의 SAMiRNA는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체들에서 소수성 물질간의 소수성 상호작용에 의해 형성된 나노입자를 의미한다.

본 발명의 목적은 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합된 친수성 및 소수성 물질의 위치에 따라 RNAi 효능이 달라지는 것을 규명하고 이에 따라, SAMiRNA를 형성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 최적화를 통해 RNAi 기능이 극대화된 SAMiRNA 전달 기술을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 전달을 도와주는 친수성 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 결합시킨 형태로, 수용액상에서 나노입자(SAMiRNA)로 자가 조립될 수 있는 능력을 가지므로, 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 고효율의 RNA 저해제로 사용가능하며, 이러한 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 질병 치료용 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 특히, 낮은 농도의 SAMiRNA 투여량으로도 고효율의 RNA 저해 활성을 나타낼 수 있어, 암 및 감염성 질병 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 나노입자형 합성 올리고 RNA 저해제인 SAMiRNA를 이용하며, 생체 내에서 최적의 활성을 가지도록 SAMiRNA에서 친수성 및 소수성 물질의 결합과 안티센스 가닥의 5 인산화를 통해 유전자 특이적으로 RNA 저해를 하는데 있어서, 그 효율을 극대화시킬 수 있다.

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도 1은 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자(SAMiRNA)의 모식도.
도 2는 S-SAMiRNALP-PO₄의 안티센스 가닥의 제조결과를 나타내는 도면.
(A) 서열번호 1번과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥 (blue, M.W. 6593.1)의 MALDI-TOF MS 분석결과
(B) 서열번호 1번과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 5'말단에 한 개의 인산기가 결합된 형태(Red, M.W. 6673.1)의 MALDI-TOF MS 분석결과
(C) 서열번호 1번과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 인산기 결합에 따른 MALDI-TOF MS 비교 그래프로, 인산기가 결합되지 않은 서열(blue)에 비해 인산기가 한 개 결합된 경우(red) 인산기의 분자량(약 MW 80)만큼 증가함을 확인.
도 3은 본 발명에 따른 최적화된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자(SAMiRNA)의 물성분석 결과를 나타내는 도면.
(A) 나노입자의 크기 및 다분산지수(Polydispersity index, PDI)의 그래프
(B) 나노입자의 임계 미셀농도 그래프
(C) 나노입자의 전자현미경 사진
도 4는 HeLa 세포주에 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(SAMiRNA)를 처리하여 타겟 유전자의 발현저해 효과를 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative real time PCR)으로 확인한 그래프.
도 5는 HeLa 세포주에 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형질주입(transfection) 물질과 함께 처리하여 타겟 유전자의 발현저해 효과를 실시간 중합효소 연쇄반응(Quantitative real time PCR)으로 확인한 그래프.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 식(1)의 구조를 갖는 화학물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공한다.

식 1

상기 식(1)에서 A 와 B 중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 소수성 물질이고, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, 그리고 AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 나타낸다. S와 AS는 서로 상보적 결합을 통해 이중나선 구조를 이루며, 상기 상보적 결합은 반드시 완벽한 상보적(perfect match) 결합일 필요는 없으며, 일부 서열이 상이한 경우(mismatch)도 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 식(2)의 구조를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공한다.

식2

상기 식(2)에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 소수성 물질이고, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, pAS는 RNA의 5'말단 부위에 인산기가 결합된 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥을 나타낸다. 이때, 5'말단 부위에 인산기는 하나에서 세 개까지 결합이 가능하다.

본 발명의 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 상기 이중나선 올리고 RNA 가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용 가능한 이중나선 올리고 RNA는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한 이중나선 올리고 RNA도 채택될 수 있다.

상기 이중나선 올리고 RNA는 생체 내 안정성 향상을 위해 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위해 다양한 변형(modification)이 이루어진 형태를 가질 수도 있는데, 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2'탄소 위치에서 -OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 또는 둘 이상 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다(Crooke 등, Ann. Rev. Med. Vol.55: pp61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch D. A. 등 Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. 등., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. 등, Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 17 5761-5773, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832 참조).

상기 소수성 물질은 소수성 상호작용을 일으켜 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(SAMiRNA)를 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질 중에서도 특히 탄소 사슬이나 콜레스테롤의 경우, 이중나선 올리고 RNA 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 이중나선 올리고 RNA 구조체 제조에 매우 적합하다.

또한, 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하다.

특히, 상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 탄화수소사슬인 경우 12 내지 50개의 탄소 수를 포함한 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

특히, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화 지방산임을 특징으로 한다.

또한, 상기 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 친수성 물질은 필요에 따라 타겟 특이적 리간드와 같은 다른 물질과의 결합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)은 다양한 분자량과 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 이중나선 올리고 RNA의 생체 내에서의 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시키므로 본 발명의 이중나선 올리고 RNA 구조체 제조에 매우 적합하다.

또한, 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질(또는 소수성 물질)과 이중나선 올리고 RNA의 말단에서 공유결합을 하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서 상기 링커는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조과정 중 올리고 RNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다.

상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 하기 식(3)과 같이 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥의 5'말단에 소수성 물질이 결합되고, 3'말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공하며, 이러한 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 과정은

식 3

(상기 식(3)에서 A는 소수성 물질이고, B는 친수성 물질이며, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, 그리고 AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 나타낸다.)

(1) 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;

(2) 상기 친수성 물질이 결합된 RNA 5'말단에 소수성 물질을 공유결합시켜 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계;

(3) 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계;

(4) 상기 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형성하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 바람직한 구체적인 예는,

(1') 고형지지체{solid support), 바람직하게는 CPG를 기반으로 친수성 물질을 결합 시키는 단계;

(2') 상기 친수성이 결합된 고형지지체(CPG)를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;

(3') 상기 RNA 단일가닥 5'말단에 소수성 물질을 공유결합 시켜 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계;

(4') 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계;

(5') 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;

를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 단계 (4) 또는 (5') 이후, 제조가 완료 되면, 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서 (1) 또는 (2') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1) 또는 (1') 단계 이전에 이루어질 수 있으며, 또한 (1) 단계 내지 (4)나 (1') 내지 (5') 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.

또한, (1) 또는 (2') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 하기 식(4)와 같이 5'말단에 인산기가 결합된 형태로 이용될 수 있다.

식 4

(상기 식(4)에서 A는 소수성 물질이며, B는 친수성 물질이고, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, pAS는 5'말단 부위에 인산기가 결합된 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥을 나타낸다. 이때, 5'말단 부위에 인산기는 하나에서 세 개까지 결합이 가능하다.

본 발명은 또한 하기 식(5)와 같은 올리고 RNA의 센스가닥의 5'말단에 친수성 물질이 결합하고, 3'말단에 소수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공하며, 이를 제조하는 과정은

식 5

(상기 식(5)에서 A는 소수성 물질이며, B는 친수성 물질이고, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, 그리고 AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 나타낸다.)

(1") 기능기가 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;

(2") 단계 (1")에서 수득된 물질에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;

(3") 단계 (2")에서 수득된 물질을 고형지지체로부터 분리하는 단계;

(4") 단계 (3")에서 수득된 물질의 3'말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합 시켜 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계;

(5") 단계 (4")에서 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형성하는 단계;

를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서의 기능기는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 아민기(Amine), 티올기(Thiol), 카르복실기(carboxyl), 알데하이드기(aldehyde), 비오틴기(biotin) 등에서 선택될 수 있다.

또한, 소수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 형성하고, 이에 친수성 물질을 공유결합시켜 RNA 고분자 구조체를 제조한 후, 상기 RNA 단일가닥에 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형성시키는 방법을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법도 가능하다.

상기 단계 (5") 이후, 제조가 완료 되면, 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서 (1") 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1") 단계 이전, 또는 (1") 단계 내지 (5") 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.

또한, (1")단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 하기 식(6)과 같이 5'말단에 인산기가 결합된 형태로 이용될 수 있다.

식 6

상기 식(6)에서 A는 소수성 물질이며, B는 친수성 물질이고, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, pAS는 이중나선 올리고 RNA의 5'말단부위에 인산기가 결합된 안티센스가닥을 나타낸다.

한편, 본 발명의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합된 친수성 물질의 특정위치, 특히 말단에 타겟 특이적 리간드를 추가적으로 구비할 수 있다. 상기 타겟팅 모이어티는 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진다. 이러한 물질은 타겟 특이적 항체나 앱타머(aptamer), 수용체 특이적 리간드 등에서 선택되는 펩타이드 또는 엽산, N-아세틸갈락토사민(N-acetyl galactosamine, NAG) 및 만노스(mannose)를 비롯한 화학물질 등이 될 수 있다. 이 때 타겟팅 모이어티는 타겟 수용체 특이적으로 결합하여 전달을 수행할 수 있는 물질이라면 어떠한 것이라도 사용이 가능하며 상기 항체, 앱타머, 펩타이드 및 화학물질에만 한정되는 것만은 아니다.

리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 과정은 예를 들어,

(1''') 기능기가 결합되어 있는 고형지지체(CPG)에 친수성 물질을 결합시키는 단계;

(2''') 기능기-친수성 물질이 결합되어 있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;

(3''') 상기 RNA 단일가닥의 5'말단에 소수성 물질을 공유결합 시켜 기능기-RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계;

(4''') 고형지지체(CPG)로부터 기능기-RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계;

(5''') 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시켜 리간드가 결합된 RNA 고분자 구조체를 제조하는 단계;

(6''') 제조된 리간드가 결합된 RNA 고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계; 를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 (6''') 단계 이후, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 등을 이용하여 상기 반응물들과 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 상보적인 RNA가 제조되었는지를 확인 할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2''') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1''') 단계 이전 또는 (1''') 단계 내지 (6''') 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(SAMiRNA)를 제공한다. 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자(SAMiRNA)를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 이중나선 올리고 RNA의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 이중나선 올리고 RNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다(도면 1 참조). 이렇게 형성된 나노입자는 이중나선 올리고 RNA의 세포 내 전달 향상 및 이중나선 올리고 RNA의 효능을 향상시키며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 구조체의 합성과 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.

또한, 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 SAMiRNA를 이용한 치료방법을 제공한다.

구체적으로 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(SAMiRNA)를 준비하는 단계와 상기 나노입자(SAMiRNA)를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.

더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.

이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절 방법을 제공한다. 그리고 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절방법을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조

이하 실시예에서는 서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈에 대한 이중나선 올리고 RNA를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질 변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7): 553-62).

본 발명의 서바이빈에 대한 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 1번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있으며, 대조군으로 사용되는 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 2번으로 기재되는 센스가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 본 실시예에 사용된 이중나선 올리고 RNA의 염기서열은 하기와 같다.

(서열번호 1) 5'AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3'

(서열번호 2) 5'CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3'

상기 이중나선 올리고 RNA는 β-시아노에틸포스포아미디트(β-cyanoethylphosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여, 상기 이중나선 올리고 RNA 단일가닥 합성하였다 (Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoethyl-N, N-dialkylamino- /N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).

합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 결합된 고형지지체(CPG) 상으로부터 시작하여 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복함으로써, 원하는 서열의 RNA단일가닥을 얻게 된다. 해당 일련의 이중나선 올리고 RNA의 합성과정은 RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하였다.

이중나선 올리고 RNA 구조체를 구성하는 이중나선 올리고 RNA와 고분자 물질의 결합 위치에 따른 이중나선 올리고 RNA의 타겟 유전자 발현 저해 효율 비교를 통해, 이중나선 올리고 RNA 구조체의 최적화를 수행하기 위해 다음과 같은 구조의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하였다.

본 발명에서 제조한 이중나선 올리고 RNA 구조체는 표 1과 같은 구조를 갖는다.

표 1에서 S는 이중나선 올리고 RNA의 센스 가닥; AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥; PO₄는 인산기; PEG는 친수성 물질로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol); C₂₄는 소수성 물질로 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산(tetradocosane); 5'및 3'은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.

이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥은 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 합성을 진행한 뒤, 추가적으로 5'말단 부위에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 결합시켜 이중나선 올리고 RNA 구조체의 SAMiRNALP 센스 가닥을 만들었다.

상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 센스가닥과 어닐링(annealing)을 수행할 안티센스가닥의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 합성을 진행한 뒤, 추가적으로 5'말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산(tetradocosane)(C₂₄)을 결합시켜 SAMiRNALP 안티센스 가닥을 만들었다.

S-SAMiRNALP의 센스가닥의 경우, 기존 특허(대한민국 공개 특허 공보2009-0042297호)의 실시예 1에서 제조된 3'폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)-CPG를 지지체로 하여 상기 반응을 수행하여, 3'말단부위에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 결합된 센스가닥의 이중나선 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산(tetradocosane)(C₂₄)을 5'말단에 결합하여 원하는 S-SAMiRNALP의 센스 가닥을 제조하였다. 상기 S-SAMiRNALP의 센스가닥과 어닐링(annealing)을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.

AS-SAMiRNALP 센스가닥의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조하였다.

상기 AS-SAMiRNALP의 센스가닥과 어닐링(annealing)을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 기존 특허(대한민국 공개특허 공보2009-0042297호)의 실시예 1에서 제조된 3'PEG-CPG를 지지체로 하여 상기 반응을 수행하여, 3'말단부위에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 결합된 안티센스가닥의 이중나선 올리고 RNA-친수성 고분자 구조체를 합성한 뒤, 이황화결합이 포함되어 있는 테트라도코산(tetradocosane)(C₂₄)을 5'말단에 결합하여 원하는 AS-SAMiRNALP의 안티센스 가닥을 제조하였다.

S-SAMiRNALP-PO₄는 이중나선 올리고 RNA의 효과를 극대화하기 위하여 센스가닥에 친수성 및 소수성 물질의 구조체를 결합 시키고, 안티센스 가닥의 5'말단부위에 인산기가 결합된 형태이다.

S-SAMiRNALP-PO₄는 상기 S-SAMiRNALP의 센스가닥과 동일한 방법으로 제조하였고, 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우도 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조한 뒤에 5'말단에 인산기를 결합하기 위해 화학적 인산화 시약(Chemical Phosphorylation Reagent, CPR)인 [3-(4, 4'디메톡시트리틸옥시-2, 2-디카르복시에틸] 프로필-(2-시아노에틸)- (N,N-디이소프로필)-포스포아미디트([3-(4,4'Dimethoxytrityloxy)-2,2-dicarboxyethyl]propyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite)을 이용하여 5'말단에 인산기가 결합된 S-SAMiRNALP-PO₄의 안티센스 가닥을 제조하였다(도 2 참조). 또는 RNA 단일가닥을 CPG로부터 회수한 뒤 인산화 효소(kinase)를 처리하여 5'말단에 인산기를 결합시키는 방법을 사용하여 인산기가 결합된 S-SAMiRNALP-PO₄의 안티센스 가닥을 제조하였다.

합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28％(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드(triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2 TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다.

또한 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 고분자 말단부위에 리간드를 결합시키기 위하여 3'CPG에 리간드가 결합될 수 있는 기능기를 결합시킨 뒤, 친수성 고분자를 결합시키고 상기 반응을 수행하여 리간드가 결합될 수 있는 SAMiRNALP 센스 가닥을 제조하였다. 좀 더 자세히 설명하면, 아민기와 같은 기능기가 결합되어 있는 amine-CPG 에 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)포스포아미디트 시약을 이용하여 3'amine-PEG-RNA의 형태로 합성된 후, 3'amine-PEG-RNA 올리고에 C₂₄와 같은 소수성 물질인 결합시켜 3'amine-PEG-RNA-C₂₄를 합성한 뒤, 합성된 3'amine-PEG-RNA-C₂₄를 60℃의 온탕기(water bath)에서 28％(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection)반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드(triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2'TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다. 이로부터 회수된 3'amine-PEG-RNA-C₂₄를 엔-하이드로숙시니미드 (N-Hydroxysuccinimide) 리간드 형태로 구성된 결합 가능한 리간드 물질과 에스터(ester) 반응을 통해 3'리간드 결합 PEG-RNA-C₂₄ 올리고를 합성하였다. 상기 반응물들로부터 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 RNA 단일가닥, RNA-고분자 구조체 및 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 RNA-고분자 구조체와 부합하는지 확인하였다.

그 후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37℃에서 반응시켜, 목적하는 SAMiRNALP 및 인산기가 결합된 S-SAMiRNALP-PO₄를 각각 제조하였다. 제조된 SAMiRNALP의 전기영동을 통하여 어닐링을 확인하였다.

실시예 2. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자(SAMiRNA)의 물성분석

S-SAMiRNALP 및 S-SAMiRNALP-PO₄는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다(도 1 참조).

실시예 1에서 제조된 S-SAMiRNALP의 나노입자 크기 및 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC) 값과 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 분석을 통해 해당 SAMiRNALP로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 형성을 확인하였다.

실시예 2-1. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자의 입자 크기 및 다분산지수(polydispersity index, 이하 'PDI'라 한다) 측정

제타-전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, 상기 SAMiRNALP를 1.5 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 50㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20％)하였다. 균질화된 나노입자는 제타-전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.459, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 PBS(phosphate buffered saline)의 온도 25℃ 및 그에 따른 점도(viscosity)는 1.0200 및 굴절률은 1.335의 값을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20 번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3 회 반복하였다.

S-SAMiRNALP로 구성된 나노입자의 경우 약 150 nm의 크기와 0.4 가량의 PDI 값을 가지는 것이 확인되었다(도 3 (A)참조). PDI 값이 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 나타내는 수치로, S-SAMiRNALP로 구성된 나노입자는 비교적 균일한 크기의 나노입자를 형성함을 알 수 있었다. 상기 구조체로 구성된 나노입자의 크기는 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내로 섭취되기에 적절한 크기임을 확인하였다(Nanotoxicology: nanoparticles reconstruct lipids.Nat. Nanotechnol. 2009 Feb;4(2):84-5).

실시예 2-2. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자의 임계 미셀농도 측정

단일 분자에 소수성기와 친수성기가 함께 들어있는 양친매성인 물질(amphiphile)은 계면활성제가 될 수 있는데, 계면활성제는 수용액에 용해되면 소수성기는 물과의 접촉을 피하기 위해 가운데로 모이고 친수성기는 바깥쪽으로 향하여 미셀을 형성하게 된다. 이때, 최초로 미셀을 형성하게 되는 농도를 임계 미셀농도(critical micelle concentration, CMC)라고 한다. 형광 염료를 이용하여 CMC를 측정하는 방법은 미셀이 형성되기 전/후에 형광염료의 형광값(intensity) 그래프 곡선의 기울기가 급격하게 변하는 특성에 근거한 것이다.

S-SAMiRNALP로 구성된 나노입자의 임계 미셀농도 측정을 위하여 형광염료인 0.04 mM DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, SIGMA, USA)를 준비한다. S-SAMiRNALP 1 nmole/㎕를 0.0977㎍/㎖에서 최고 50㎍/㎖의 농도로 DPBS로 단계별로 희석하여, 총 180㎕의 S-SAMiRNALP시료를 준비한다. 준비된 시료에 0.04 mM DPH와 대조군으로 쓰일 DPH의 용매인 메탄올을 각각 20㎕씩 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭 20％)하였다. 균질화된 시료는 빛을 차단된 상온 조건에서 약 24 시간 반응시킨 뒤, 형광값(excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read)을 측정하였다. 측정된 형광값들은 상대적인 형광값을 확인하는 것이기 때문에 동일 농도에서 DPH 포함된 시료의 형광값-메탄올만 포함된 시료의 형광값을 구하여(Y축) 처리한 S-SAMiRNALP 농도의 log 값(X축)에 대한 그래프로 도시하였다(도 3 (B) 참조).

각 농도 별 측정된 형광값은 저농도 구간에서 고농도 구간으로 이동하면서 급격하게 증가하게 되는데, 이렇게 급격하게 증가하는 지점의 농도가 CMC농도가 된다. 따라서 형광량이 증가하지 않는 저농도 구간과 형광량이 증가한 고농도 구간을 몇 지점으로 구분하여 추세선을 그리고, 두 추세선이 만나는 교차점의 X 값이 CMC농도가 된다. 측정된 S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자의 CMC는 2.53㎍/㎖로 매우 낮게 형성됨이 관찰되었으며, 이로써 S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자가 매우 낮은 농도에서도 미셀을 잘 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 2-3. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자의 투과전자현미경 관찰

S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자가 형성된 형태를 확인하기 위해 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 관찰하였다.

구체적으로 S-SAMiRNALP를 DPBS에 최종 100㎍/㎖의 농도로 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20％)하였다. S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자는 전자밀도가 높은 물질로 음성염색(negative staining)법을 통해 관찰되었다(도 3 (C) 참조).

TEM을 통해 관찰된 나노입자는 실시예 2-1에서 측정된 나노입자의 크기와 유사한 정도로 나노입자가 잘 형성되었음이 확인되었다.

실시예 3. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 이용한 종양 세포주에서의 타겟 유전자의 발현 억제

상기 실시예 1에서 제조한 각각의 SAMiRNALP, S-SAMiRNALP 및 AS-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 이용하여, 형질주입(transfection) 된 종양세포주의 서바이빈(Survivin) 유전자의 발현 양상을 분석하였다.

실시예 3-1. 종양 세포주의 배양

미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 획득한 인간 자궁암 세포(HeLa)는 EMEM 배양배지(ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, 미국)에 10％(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37℃에서 5％(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다.

실시예 3-2. SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 이용한 종양세포주의 형질 전환

상기 실시예 3-1에서 배양된 종양 세포주(1.3×10⁵)를 실시예 3-1의 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 EMEM 배양배지에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 동량의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.

Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 SAMiRNALP, S-SAMiRNALP 및 AS-SAMiRNALP를 50㎍/㎖의 농도로 DPBS에 첨가하여, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 SAMiRNALP, S-SAMiRNALP 및 AS-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 균질화(700 W; 진폭 20％)하여 용액을 제조하였다. 그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입(transfection) 용 용액을 100 nM과 200 nM의 농도로 처리하고, 37℃에서 5％(v/v) CO₂의 조건하에 총 48 시간 동안 배양하였다.

실시예 3-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석

상기 실시예 3-2에서 형질주입(transfection)된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈(Survivin) mRNA 발현량을 대한민국 공개특허 공보 제2009-0042297호의 방법에 따라서 상대 정량하였다 (도 4 참조).

AS-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우, 이중나선 올리고 RNA 메커니즘에서 타겟 mRNA와 결합하는 안티센스 가닥에만 구조체가 결합된 경우로, 기존의 SAMiRNALP를 처리한 경우에 비하여 낮은 저해 효율을 나타내었다. S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우는 AS-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우와는 반대로 센스가닥에만 구조체가 결합된 경우로, 기존의 SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우에 비하여 낮은 농도에서도 높은 저해효율을 나타내었다(도 4 참조).

Sur584는 SAMiRNALP의 구조 별로 타겟 유전자인 서바이빈에 특이적인 이중나선 올리고 RNA 서열(서열번호 1)을 가진 SAMiRNALP를 의미하며, CON은 타겟유전자의 발현에 영향을 끼치지 못하는 대조군 서열(서열번호 2)을 포함하는 SAMiRNALP를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA 발현 저해 정도는 CON을 처리한 시료의 타겟유전자 발현량에 대한 Sur584를 처리한 시료의 타겟유전자 발현량으로 상대적인 정량법(Comparative Quantitation)을 통해 계산되었다.

최적화된 구조인 S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우, 형질주입(transfection) 물질이 없는 조건에서도 세포에 잘 전달되어 타겟 유전자의 mRNA 발현 저해 효과가 관찰되었으며, 이는 기존의 구조였던 SAMiRNALP로 이루어진 나노입자를 처리한 경우에 비해 100 nM 처리 조건에서 비교하였을 때 약 3배 이상(SAMiRNALP로 이루어진 나노입자 처리군-23.4％ 발현저해 vs . S-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자처리군-77％ 발현저해)의 이중나선 올리고 RNA의 효과가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 음성 대조군으로 모든 구조체가 안티센스 서열에 결합된 AS-SAMiRNALP로 이루어진 나노입자가 처리된 실험군은 고농도 처리군에서도 타겟 유전자의 mRNA 발현 저해 효과가 낮게 관찰되었다.

실시예 4. SAMiRNALP들을 이용한 종양 세포주에서의 타겟 유전자 발현 억제

상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 1, 2번의 S-SAMiRNALP 및 S-SAMiRNALP-PO₄를 형질주입(transfection) 물질을 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 형질주입(transfection) 시키고, 형질주입(transfection) 된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.

실시예 4-1. SAMiRNALP들을 이용한 종양세포주의 형질주입(transfection)

상기 실시예 3-1에서 배양된 종양세포주 1.3×10⁵ 를 상기 실시예의 3-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 EMEM 배양배지에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.

한편, Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 S-SAMiRNALP 및 S-SAMiRNALP-PO₄(25pmole/㎕)를 최종 0.2, 1 및 5 nM의 농도로 처리하고, 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.

그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에형질주입(transfection)용 용액을 각각 200㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 EMEM 배양배지 2.5㎖를 분주한 다음 24 시간 동안 37℃, 5％(v/v) CO₂의 조건하에 배양하였다.

실시예 4-2. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석

상기 실시예 4-1에서 형질주입(transfection)된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 mRNA의 발현량을 대한민국 공개특허 공보2009-0042297호의 방법에 따라서 상대 정량하였다.

S-SAMiRNALP 및 S-SAMiRNALP-PO₄의 타겟 유전자 발현 저해효과를 분석하기 위해 형질주입(transfection) 물질과 함께 형질전환 시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA발현 정도를 비교한 결과, S-SAMiRNALP 및 S-SAMiRNALP-PO₄를 처리한 경우 이중나선 올리고 RNA 말단에 아무것도 접합되지 않은 naked 이중나선 올리고 RNA를 처리한 것과 유사한 정도의 타겟 유전자 발현 저해효과를 나타내었다. S-SAMiRNALP-PO₄는 S-SAMiRNALP를 처리한 경우보다 비교적 높은 발현저해 효율을 나타내었으며, 특히 낮은 농도(0.2 nM)에서 높은 타겟유전자 발현 저해효과를 나타냈다 (도 5참조). S-SAMiRNALP의 고분자가 결합되어 있는 형태는 RNAi의 메커니즘(mechanism)을 저해하지 않는 구조이며, 특히, S-SAMiRNALP-PO₄의 경우, 추가적으로 결합된 인산기에 의하여 이중나선 올리고 RNA의 효과가 증가하는 것이 관찰되었다.

본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 다양한 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히, 낮은 농도의 SAMiRNA 투여량으로도 고효율의 RNA 저해 활성을 나타낼 수 있어 암 및 감염성 질병 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 식(1)의 구조를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
식 1

(식(1)에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 소수성 물질이고; X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 의미한다)
제1항에 있어서, 하기 식(3)과 같이 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥의 5'말단에 소수성 물질이 결합되고, 3'말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체.
식 3

(식(3)에서 A는 소수성 물질이고, B는 친수성 물질이며, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, 그리고 AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 의미한다.)
제1항에 있어서, 이중나선 올리고 RNA 센스가닥 및 안티센스 가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제3항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2 탄소 위치에서 -OH 기가 CH₃(메틸), -OCH₃, -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형이 하나 또는 둘 이상이 조합되어 변형되거나, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 이중나선 올리고 RNA 안티센스 가닥의 5'말단에 인산기가 결합된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제5항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'말단에 결합하는 인산기는 한 개 내지 세 개인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제7항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제8항에 있어서, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제8항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제11항에 있어서, 상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxalzoline)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제13항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제13항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항에 있어서, 상기 이중나선 올리고 RNA는 서바이빈(survivin)의 mRNA 서열에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제16항에 있어서, 상기 서바이빈의 mRNA 서열에 특이적으로 결합하는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥은 5'-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3'(서열번호 1)의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 리간드가 결합된 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제18항에 있어서, 상기 리간드는 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제19항에 있어서, 상기 리간드(ligand)는 타겟 특이적으로 결합하여 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 하는 타겟(target) 특이적 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 수용체 특이적 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
제20항에 있어서, 상기 수용체 특이적 화학물질은 엽산(Folate), N-아세틸 갈락토사민, 만노스 (mannose)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
(1) 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 친수성 물질이 결합된 RNA 5'말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(3) 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계;
(4) 상기 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형성하는 단계;
를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법.
제22항에 있어서, 단계(1)의 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 5'말단에 인산기가 결합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 물질에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계 ;
(3) 단계 (2)에서 수득된 물질을 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(4) 단계 (3)에서 수득된 물질의 3'말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득된 물질과 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 형성하는 단계;
를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법.
제24항에 있어서, 단계 (1)의 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 5'말단에 인산기가 결합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자.
제18항의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물.
제18항의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물.
제26항의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
제27항의 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절 방법.
제26항에 따른 나노입자를 이용한 생체 내 또는 생체 외에서 유전자 발현 조절방법.