KR20140105047A - 췌장의 ｒｎａ 제조방법 및 상기 ｒｎａ를 포함하는 항암 조성물 - Google Patents
췌장의 ｒｎａ 제조방법 및 상기 ｒｎａ를 포함하는 항암 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 췌장 분쇄물을 (a) (ⅰ) SDS, (ⅱ) NaCl, (ⅲ) NaSeO3 및 (ⅳ) NaOAc를 포함하는 완충액 A; 및 (b) 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 혼합하고 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 RNA의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 제조가 용이하고 경제적인 RNA 제조방법을 제공하며, 상기 제조방법에 의해 제조된 RNA를 포함하는 항암 조성물, 항-HIV(Human Immnudeficiency Virus) 조성물 및 면역증강용 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 췌장의 ＲＮＡ 제조방법 및 상기 ＲＮＡ를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.
DNA는 생명체의 전체 유전 정보를 전송하는 물질이고, RNA는 생체 내에서 유전적 정보의 기준이 되는 단백질 생합성에 중요한 역할을 하는 물질이다. 최근에, DNA 분석에 의해 생명체의 수많은 유전자 서열 정보가 규명되었다. 이 때문에, RNA 분석에 의한 유전자 기능의 설명의 중요성이 증가되었으며, 생물 시료로부터 RNA를 추출하는 것이 필요하게 되었다. RNA 분석법은 대개 RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 및 노던 블럿을 포함한다.
이러한 RNA 분석법을 통해 유의한 결과를 얻기 위해서는 고순도의 RNA가 요구된다. 특히, RNA 내에 DNA가 존재할 경우에 RT-PCR을 통한 RNA의 분석은 쉽지 않다. 따라서, 세포 내 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물에 오염되지 않은 고순도의 RNA를 추출하는 방법이 필요한 것이다.
가장 대중적인 RNA 분리 방법은 페놀 추출법, 카오트로픽염(chaotropic salts) 용액 침전법 및 실리카 흡착법이 있다(US 4,843,155, US 5,346,994, US 5,945,515 및 Ausubel et al, 2002)
종래의 RNA 분리 방법은 페놀 및 클로로포름과 같은 독성 화학물질을 사용하거나 상대적으로 장시간이 요구되는 에탄올 또는 이소프로판올 침전법과 같은 핵산 추출법은 카오트로픽제 존재 하에 핵산이 실리카에 결합하는 특성을 이용하여 아가로즈 젤로부터 핵산을 되찾는 방법 및 카오트로픽제 및 실리카 입자를 사용하여 생물 시료로부터 핵산을 추출하는 방법을 포함한다. 그러나, 이러한 방법은 RNA 및 DNA간의 선별력이 없어, 핵산 추출물 내에 RNA 및 DNA가 혼재하게 된다. 따라서, RNA를 분리하기 위해서는 핵산 추출물 내 포함된 DNA를 제거하는 과정이 요구된다. DNA의 제거는 DNase를 처리하고 효소를 적절하게 제거하는 방법을 통해 수행할 수 있다. 일반적으로, DNase를 처리하는데 1시간이 소요되는데 이는 DNA를 제거를 위한 과정에 필수적이다. 또한, 효소의 제거는 페놀/클로로포름 추출법 및 에탄올 침전법과 같은 복잡한 과정에 요구되나, 결과적으로 RNA가 손실된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 고순도의 췌장 RNA를 분리하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하는 완충액을 이용하여 단백질로 오염되지 않은 고순도의 췌장 RNA를 분리하는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 RNA 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항-HIV 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-HIV 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 췌장 분쇄물을 (a) (ⅰ) SDS, (ⅱ) NaCl, (ⅲ) NaSeO3 및 (ⅳ) NaOAc를 포함하는 완충액 A; 및 (b) 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 혼합하고 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 RNA의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 항암 조성물을 개발하고자 노력하였고, 그 결과, SDS를 포함하는 완충액을 이용하여 분리한 고순도의 췌장 RNA가 항암 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 RNA의 제조방법의 주요한 단계는 췌장 분쇄물을 완충액 A 및 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 혼합하고 상층액을 수득하는 단계이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 췌장 분쇄물은 췌장을 동결 및 해동 과정을 반복하여 세포막을 파쇄하고 균질화한 상태이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 췌장 분쇄물은 소에서 유래한 췌장의 분쇄물이다.
본 발명의 주요한 특징 중 하나는 신규한 조성을 갖는 완충액 A를 사용하는 것이다. 상기 완충액 A는 (ⅰ) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), (ⅱ) NaCl, (ⅲ) NaSeO3 및 (ⅳ) NaOAc를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 완충액 A는 상기 SDS를 0.1 중량% 내지 0.5 중량% 포함하고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 SDS를 0.2 중량% 내지 0.4 중량% 포함하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 SDS를 0.25 중량% 내지 0.35 중량% 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 완충액 A는 상기 NaCl을 0.50 중량% 내지 1.5 중량% 포함하고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 NaCl을 0.7 중량% 내지 1.2 중량%를 포함하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 NaCl을 0.8 중량% 내지 1.1 중량%를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 완충액 A는 상기 NaSeO3를 0.005 중량% 내지 0.07 중량%를 포함하고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 NaSeO3를 0.01 중량% 내지 0.05 중량%이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 상기 NaSeO3를 0.02 중량% 내지 0.04 중량%를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 완충액 A는 상기 NaOAc을 0.1 중량% 내지 1.6 중량% 포함하고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 NaOAc을 0.4 중량% 내지 1.3 중량%를 포함하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 NaOAc을 0.6 중량% 내지 1.0 중량%를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 완충액 A의 pH 값은 pH 4-8이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 완충액 A의 pH 값은 pH 4.6-7.0이며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 완충액 A의 pH 값은 pH 5.3-6.0이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 완충액 A의 반응온도는 55℃ 내지 65℃이다.
본 발명에서 췌장 분쇄물에 첨가하는 상기 페놀-클로로포름은 페놀과 클로로포름을 4:1의 부피비로 혼합한 용액이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 췌장 분쇄물에 완충액 A 및 페놀-클로로포름을 첨가하고 3,000 rpm에서 18℃로 20분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상층액에 페놀-클로로포름을 첨가하고 원심분리를 실시하여 다시 상층액을 수득한다.
상기 원심분리 후 형성되는 단백질층이 없어질 때까지 완충액 A 및 페놀-클로로포름과 혼합하여 상층액을 수득하는 단계를 반복하여 실시한 후, 제2상층액을 수득한다.
마지막으로, 상기 제2상층액에 NaOAc 및 에탄올을 첨가하고 원심분리를 실시하여 침전물을 수득한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 NaOAc의 최종 농도는 0.05 M 내지 0.25 M이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 NaOAc의 최종 농도는 0.1 M 내지 0.2 M이며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 NaOAc의 최종 농도는 0.13 M 내지 0.17 M이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 에탄올의 농도는 50 부피% 내지 100 부피%이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 에탄올의 농도는 60 부피% 내지 100 부피%이며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 에탄올의 농도는 80% 내지 100%이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 단계 (b)에서 수득한 제2상층액에 2.5 M NaOAc(pH 5.1)을 최종농도 0.15 M가 되게 첨가하고 100% 에탄올을 2배 부피로 첨가하여 -20℃에서 항온반응한 후, 원심분리를 실시하여 침전물을 수득한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 침전물에 2배 부피의 0.15 NaOAc 및 2.5배 부피의 90% 에탄올을 첨가하고 4℃에서 1시간동안 항온반응한 후, 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하는 과정을 3차례 반복한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 RNA 제조방법을 통해 수득한 RNA의 A260/A280 비는 1.9 내지 2.0으로 단백질 오염이 거의 없는 고순도를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 RNA의 제조방법을 통해 제조된 RNA가 비장 용액에 용해된 항-HIV(Human Immnudeficiency Virus)용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항-HIV 조성물은 15.0-99.9%의 HIV 억제율을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 RNA의 제조방법을 통해 제조된 RNA가 비장 용액에 용해된 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항암 조성물은 200-400 ㎍/㎖ 농도에서 80-100%의 암 세포 사멸 효과를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 RNA의 제조방법을 통해 제조된 RNA가 비장 용액에 용해된 면역증강용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 면역증강용 조성물은 혈 중 면역 글로불린의 양을 증가시킨다.
본 발명의 조성물은 상기 RNA의 제조방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 RNA의 제조방법을 통해 수득한 침전물을 전달 인자(transfer factors)를 포함하는 비장 용액에 용해한다.
본 명세서에서 용어, ‘전달 인자’는 포유류의 면역계에서 감염된 병원체에 대한 2차 면역반응의 하나인 작은 단백질을 생산한다. 상기 전달 인자는 포유류 면역계의 비세포성(noncellular) 부분이다. 항원-특이 전달 인자는 항체와 구조적으로 유사하나, 훨씬 작은 크기이다. 항원-특이 전달 인자 및 항체는 항원에 특이적인 부분을 갖는다. 또한, 그들 각자의 주효세포와 반응하는 고도의 보존 부분을 포함하고 있으며, 항원-특이 부분과 고도로 보존된 부분을 연결하는 링커 부분을 갖는다. 전달 인자는 림프구의 적은 분자량을 갖는 격리체(isolate)이다. 제한적으로, 전달 인자는 하나의 항원에 대한 특이성을 가질 것이다. Kirkpatrick 등에 의해 발표된 US 5,840,700 및 US 5,470, 835(이하, ‘Kirkpatrick 특허’라고 명명함.)는 특정 항원에 대해 특이적인 전달 인자의 분리를 나타낸다. 더 광범위하게는, “특이적인” 전달 인자는 단일클론 림프구의 세포 배양물에서 생성된다. 전달 인자가 단일 병원체에 대해 생성됨에도 불구하고, 항원의 부위에 대해 다양하게 특이성을 갖는다. 따라서, 이러한 특징으로 전달 인자를 “항원-특이적”이 아닌 “병원체-특이적”이라고 말한다. 일반적으로, 전달 인자는 면역적으로 활성화된 포유류로부터 얻은 약 10,000 달톤 이하의 분자량을 갖는 단백질의 분리물을 포함한다. 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)로 전달 인자를 포유류 면역 세포에 처리하였을 때 면역계가 개선되거나 정상화되어 ‘전달 인자’라고 명명되었다.
본 발명에서 이용 할 수 있는 비장은, 소 비장, 돼지 비장, 양 비장, 염소 비장, 말 비장, 개 비장, 고양이 비장, 랫트 비장 또는 쥐 비장이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 비장 영액은 소 비장을 이용하여 제조한다.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 자바강황 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 자바강황 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 자바강황 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 자바강황 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 단백질의 오염이 거의 없는 고순도의 RNA의 제조방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 제조가 용이하고 경제적인 항-HIV 조성물의 제조방법을 제공한다.
(c) 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 RNA를 포함하는 항암 조성물, 항-HIV 조성물 및 면역증강용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: RNA의 제조
실험재료 및 실험방법
A. 1 ㎏ 소 췌장으로부터 결합 조직 및 지방을 제거하고 0.3% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 용액(완충액 A)으로 세척하였다.
B. 8 L 완충액 A의 제조
24 g SDS, 72 g NaCl(sodium chloride) 및 3 g NaSeO3을 60℃의 5 L 증류수에 용해하고, 32 ㎖의 2.5 M NaOAc(sodium acetate, pH 5.1)를 첨가하였다. 최종적으로 pH 5.3-6.0으로 조절하였다. 증류수를 첨가하여 최종 부피를 8 L로 조절하였다.
C. 단계 A의 결과물을 -80℃ 동결 및 해동 과정을 3차례 반복하여 세포막을 파쇄하고, 균질화하였다.
D. 상기 균질화된 소 췌장 혼합물(1 L) 및 58℃ 완충액 A(6 L)를 혼합하고 6 L 페놀-클로로포름(phenol-chloroform, 4:1)을 첨가하였다. 혼합물을 58℃, 120 rpm의 조건으로 20분 동안 혼합하고 18℃에서 신속하게 냉각하였다. 다음, 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 수득하였다.
E. 단계 D의 상층액에 동일한 부피의 페놀-클로로포름 용액을 첨가하고 중간층에 위치한 단백질 층이 없어질 때까지 단계 D의 과정을 3차례 반복하였다.
F. 단계 E로부터 수득한 상층액에 2.5 M NaOAc(pH 5.1)를 첨가하여 최종 NaOAc 농도가 0.15 M이 되게 하였다. 다음, 100% 에탄올을 2배 부피로 첨가하고 이 혼합물을 -20℃에서 항온반응하였다.
G. 2.5 M NaOAc(sodium acetate, pH 5.1)의 제조
205 g NaOAc를 500 ㎖ 증류수에 용해하고 62.5 ㎖ 고농도 HCl를 첨가하여 pH 5.1로 조정하였다.
H. 단계 F의 결과물을 3,000 rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리를 실시하여 침전물을 수득하였다. 상기 침전물에 2배 부피의 0.15 M NaOAc 및 2.5배 부피의 90% 에탄올을 첨가하고 1시간 동안 4℃에서 정치하였다. 다음, 혼합물을 3,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하는 과정을 3차례 반복하였다. 상기 과정을 반복하여 수득한 소 췌장의 침전물을 수집하여 -20℃에서 48 시간동안 보관하고, 3,500 rpm, 4℃ 조건으로 30분 동안 원심분리를 실시하여, 상층액을 제거하였다. 수득한 침전물을 70% 에탄올로 3,000 rpm으로 4℃에서 5 분 동안 원심분리를 실시하여 세척하였다. 이후, 30분 동안 실온에서 건조하였다.
상기 수득한 침전물을 DEPC(Diethylpyrocarbonate)-처리된 물에 첨가하여 1 ㎎/㎖의 농도로 제조하였다. RNA 순도를 결정하기 위해 RNA 추출물을 30 ㎍/㎖로 희석하여 260 ㎚ 및 280 ㎚ 흡광도(Absorbance; A)의 비를 확인하였다. 1 ㎎/㎖ RNA 용액을 아가로즈 젤에 5 ㎕ 로딩하고 EtBr 염색하여 RNA 추출물 내 염색체 RNA를 검출하였다.
실험 결과
소 췌장 RNA의 A
260
/A
280
비는 1.9-2.0이다.
소 췌장으로부터 얻은 RNA 추출물의 단백질 오염을 확인하기 위해, A260 및 A280의 흡광도(Absorbance; A) 비를 확인하였다. A260/A280 비의 값이 높을수록 샘플의 순도가 높다. 본 실시예는 A260/A280 비가 1.9-2.0임을 보여주었고, 이는 대체적으로 단백질 오염이 적음을 나타낸다.
소 췌장
RNA
추출물은 1% 이하의
DNA
를 포함한다.
RNA 추출물 내의 DNA 양을 확인하기 위해, 1% 아가로즈 젤에 1 ㎎/㎖ RNA 추출물을 5 ㎕ 로딩하였다. EtBr 염색을 통해 염색체 DNA가 검출되지 않음을 확인하였다. 따라서, 5 ㎍ RNA 추출물에서 염색체 DNA는 검출되지 않았으며, 이는 본 발명에 의해 제조된 RNA가 DNA 오염 없이 높은 순도로 얻어질 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예
2: 항-
HIV
활성
실험재료 및 실험방법
시약
A. 건조형 BP 시약: 2 ㎎/㎖ 원액을 제조하여, 500 ㎍/㎖, 125 ㎍/㎖ 및 7.8 ㎍/㎖로 희석하여 효과를 확인하였다.
B. 액상 BP 시약: RNA 농도는 10.9 ㎎/㎖이다. 이를 20, 80, 320 및 1280배 희석하여, RNA 농도를 545 ㎍/㎖, 136 ㎍/㎖, 34 ㎍/㎖ 및 8.5 ㎍/㎖로 준비하였다.
세포주
MT4 세포(중국과학기술원, 바이러스연구소)를 사용하였다.
바이러스
HIV SF-33 바이러스(중국과학기술원, 바이러스연구소)를 사용하였다. 50,000 세포에 10 TCID50를 사용하였다.
HIV ⅢB 바이러스(중국과학기술원, 바이러스연구소)를 사용하였다. 50,000 세포에 100 TCID50를 사용하였다.
실험 방법
상기 실시예 1에서 제조한 RNA를 소 비장의 전달 인자(transfer factors)를 포함하는 소 비장 투석 용액에 녹인다. 이를 BP 시약이라고 명명하였다. 상기 소 비장 용액의 제조과정은 다음과 같다:
갓 적출한 비장 또는 -80℃ 동결된 비장을 작은 조각으로 절단하고, RBC(Red Blood Cell) 용해 완충액[155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3 및 0.1 mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic Acid)]을 이용하여 적혈구를 용해한다. 이때 비장과 RBC 용해 완충액의 부피비는 1:50이다(비장 1 g당 RBC 용해 완충액 50 ㎖). 비장 절단물을 1000 g로 10분 정도 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하고 비장 절단물의 5배 부피의 RBC 용해 완충액을 첨가하여 잘 혼합한 다음 다시 같은 조건으로 원심분리를 실시하여 상층액을 제거한다. RBC가 제거된 비장 절단물을 1×PBS(Phosphate Buffered Saline, 1 L에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4)을 1:10의 부피비로 첨가하여 현탁한다. 비장 절단물을 균질화하고 초음파 분해하여 5,000 rpm으로 60분 동안 원심분리한다. 원심분리후 수득한 상층액을 투석 방법 혹은 크로마토그래피 방법으로 분자량이 5,000 달톤(Dalton) 이하의 모든 물질을 (10,000 달톤 이하의 물질이 함유도 허락하고 20,000 달톤 이하의 물질이 포함되어도 도움이 된다. 하지만 분자량이 5,000 달톤 이하의 물질이 주성분이 되어야 한다) 재정제한다. 위 방법으로 수득한 액체를 본 발명의 소 비장 용액으로 이용한다.
바이러스로 세포를 감염시키기 위해, 1×104의 세포 및 바이러스를 37℃, 5% CO2 항온반응기에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 세포를 감염시키지 않은 바이러스를 포함하는 상층액을 제거하였다. 96 웰에 0.1 ㎖ 감염된 세포를 첨가하고, 0.1 ㎖ BP 시약을 첨가하였다. 모든 실험은 3회 수행하였다. 바이러스 대조군 및 세포 대조군을 구성하였다. 5일 동안 세포를 배양하였고, 3일째에 배지를 교환해 주었다. 5일째 되는 날, OD(Optical Density) 값을 측정하였다. p24 항원의 양으로 표준 곡선을 산출하였다. BP 시약 처리군 및 바이러스 대조군의 p24 항원 비를 이용하여 HIV 억제율을 계산하였다. 또한, MTT 분석법을 이용하여 BP 시약의 세포독성을 측정하였다.
억제율(Inhibition rate)=[(바이러스 대조군 내 P24 항원의 양 - 약물처리군 내 P24 항원의 양)/바이러스 대조군 내 P24 항원의 양] × 100
실험 결과
건조형 BP 시약의 영향을 다음과 같이 정리하였다:
| - | 시약 | RNA(㎍/㎖) | 독성 | OD450 /630 | P24(pg/㎖) | 억제율(%) |
| 1차 | BP(5000배 희석, SF33) | 250 | 유독 | - | - | - |
| 62.5 | - | 0.711 | 59.61 | 36.92 | ||
| 15.6 | - | 0.771 | 65.7 | 30.48 | ||
| 3.9 | - | - | - | - | ||
| 2차 | BP(5000배 희석, IIIB) | 125 | 유독 | - | - | - |
| 31.25 | - | 1.35 | 120.422 | 34.58 | ||
| 7.9 | - | 1.599 | 143.428 | 22.08 | ||
| 1.9 | - | - | - | - | ||
| 3차 | BP(1000배 희석, IIIB) | 80 | 약간 유독 | 0.819 | 71.36 | 49.87 |
| 20 | - | 1.674 | 150.358 | 43.93 | ||
| 5 | - | 1,981 | 178.723 | 33.35 | ||
| 1.25 | - | - | - | - |
액상 BP 시약의 영향을 다음과 같이 정리하였다:
| - | 시약 | RNA(㎍/㎖) | 독성 | OD450 /630 | P24(pg/㎖) | 억제율(%) |
| 1차 | BP(1000배 희석, IIIB) | 273 | 약간 유독 | 0.106 | 5.48 | 72.71 |
| 68 | - | 0.804 | 69.97 | 51.84 | ||
| 17 | - | 1.361 | 121.44 | 16.41 | ||
| 4.3 | - | - | - | - | ||
| 2차 | BP(500배 희석, IIIB) | 273 | 약간 유독 | 0.082 | 3.27 | 73.66 |
| 68 | - | 0.649 | 55.65 | 52.02 | ||
| 17 | - | 1.842 | 165.88 | 0 | ||
| 4.3 | - | 2.322 | - | - | ||
| 3차 | BP(250배 희석, IIIB) | 218 | 약간 유독 | 0.1 | 4.93 | 69.9 |
| 54.5 | - | 0.699 | 60.27 | 58.16 | ||
| 13.6 | - | 0.752 | 65.17 | 54.77 | ||
| 3.4 | - | - | - | - | ||
| 양성대조군 | AZT(Azidothymidine) | 0.04 | - | 0.052 | 0.493 | 99.73 |
| 0.01 | - | 0.062 | 1.417 | 99.23 |
BP 시약은 항-HIV 효과를 갖으며, 비독성의 최대 억제율은 70%이다. 본 발명은 건조형 BP 시약이 최대 40%의 항-HIV 효과를 갖고, 액상 BP 시약이 최대 70%의 항-HIV 효과를 갖는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 RNA의 특성, 순도 및 보존법과 관련 있을 것이다. 예컨대, 시약의 순도를 개선되면 항-HIV 효과를 증가시킬 수 있다.
실시예
3: 항암 효과
실험 방법
상기 실시예 1에서 수득한 BPRNA의 인 비트로 항암 활성을 조사하였다.
A. 중국 의학과학원 약물연구소로부터 얻은 4종류의 세포 주인, EC(Embryonic Carcinoma cell line), P358(murine pancreatic cancer cell line), S180(murine cancer cell line) 및 H22(murine hepatoma cell line)를 실험에 사용하였다.
B. 모든 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)로 배양하였다.
C. BPRNA의 농도는 0 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖으로 실험하였다.
D. 4종류의 세포에 BPRNA를 36시간동안 처리하였다.
E. 트립판 블루(trypan blue) 염색을 이용하여 사멸된 암 세포의 비율을 확인하였다.
F. 트립판 블루로 염색된 세포는 죽은 세포이고, 염색되지 않은 세포는 생존한 세포이다.
G. 트립판 블루로 염색된 세포를 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 계수하였다.
표 3은 사멸세포의 백분율을 나타낸다.
실험 결과
BPRNA는 EC, P358, S180 및 H22와 같은 암 세포를 강하게 사면시킬 수 있다.
| BPRNA 농도(㎍/㎖) | 사멸된 암 세포의 백분율(%) | |||
| EC | P358 | S180 | H22 | |
| 0 | 2.7±2.08 | 3.3±1.53 | 3.3±2.52 | 3.3±2.51 |
| 200 | 88±7.2 | 87±6.7 | 89±5.3 | 85±4.2 |
| 400 | 99.9±0.58 | 99.7±0.58 | 100±0 | 98±1.5 |
실시예
4: 세포성 면역의 증가
실험 방법
T 림프구 로제트(rossete) 방법을 통해 T/B 림프구 비율을 결정하였다.
A. 20 마리의 웅성 마우스를 무작위로 2 군(대조군 및 실험군)으로 나누었다.
B. 대조군은 PBS(Phosphate Buffered Saline)을 적용하였고, 실험군은 BPRNA를 1일 2회 10 ㎍/g의 농도로 2주 동안 정맥 투여 및 복강 투여를 번갈아 투여하였다.
C. 0.5 ㎖의 혈액을 채취하여 원심분리를 500 g로 5분 동안 실시하고 세포를 수득하였다.
D. RBC(Red Blood Cell) 용해 완충액 0.5 ㎖을 이용하여 RBC를 제거하였다.
E. 단계 D을 반복하여 림프구 및 단핵 백혈구를 수득하였다.
F. 림프구 및 단핵 백혈구를 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution )에 2-4×106 세포/㎖로 현탁하였다.
G. 단계 F의 세포 50 ㎕ 및 HBSS에 1% 농도로 함유된 SRBC(Sheep Red Blood Cells) 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 15분 동안 반응하였다.
H. 상기 혼합물을 50 g로 5분 동안 원심분리 하였다.
I. 상층액을 제거하여 침전물을 수득하여 밤새 4℃에서 보관하였다.
J. 파스퇴르 파이펫을 이용하여 침전물을 현탁하고 로제트를 확인하였다.
K. 로제트 세포를 혈구계수기에 열거하여 무작위로 3 현미경 필드를 선정하여 로제트의 비율을 구하였다.
실험 결과
| 마우스 모델 번호 | 대조군 | BPRNA 투여군 |
| 1 | 12/88 | 67/33 |
| 2 | 7/93 | Death |
| 3 | 15/85 | 76/24 |
| 4 | 23/77 | 80/20 |
| 5 | 16/84 | 79/21 |
| 6 | 14/86 | 75/25 |
| 7 | 11/89 | 63/37 |
| 8 | 20/80 | 72/28 |
| 9 | 2/98 | Death |
| 10 | 18/82 | 63/37 |
| 평균값 | 13.8/86.2 | 72.6/27.4 |
T/B 림프구의 비율은 BPRNA를 투여한 마우스에서 T 림프구의 비율이 증가하는 결과를 나타내었다. 이러한 결과는 본 발명의 BPRNA가 세포면역력을 증가시키는 효과가 있음을 의미한다.
실시예
5:
체액성
면역의 증가
실험 방법
래빗에 BPRNA를 투여한 후 말초혈(peripheral blood)에서의 변화를 조사하였다.
A. 20 마리의 웅성 토끼를 무작위로 2 군(대조군 및 실험군)으로 나누었다.
B. 대조군은 PBS(Phosphate Buffered Saline)을 적용하였고, 실험군은 BPRNA를 1일 2회 10 ㎎/㎏의 농도로 정맥투여 하였다.
C. BPRNA 투여 45일 후에 말초혈의 변화를 조사하였다.
실험 결과
BPRNA를 투여한 래빗의 혈중 단백질 중 면역력 증가를 나타내는 혈중 글로불린이 상당히 증가하였다(표 5).
| - | 대조군 | BPRNA 투여군 | P 값 |
| 총 혈청 단백질(g/L) | 62±5.2 | 71±4.3 | <0.01 |
| 글로불린(g/L) | 30±4.6 | 38±4.8 | <0.01 |
| 알부민(g/L) | 31±1.8 | 33±2.0 | >0.05 |
| 헤모글로빈 | 89±6.6 | 88±6.8 | >0.05 |
| 백혈구 | (8.7±2.7)×109 | (8.4±2.0)×109 | >0.05 |
| T/B 세포 비율 | 0.57±0.11 | 0.64±0.13 | >0.05 |
T 세포는 세포 면역력을 말하고 B 세포는 체액 면역력을 의미하므로, 대조군과 비교하여 T 세포 비율이 증가하여 세포 면역력이 증가한 결과를 나타낸다.
실시예
6: 항암보조작용
실험 방법
A. 30 마리의 BALB/c를 대조군, BPRNA 투여 A군(종양 접종 후 투여) 및 BPRNA 투여 B군(종양 접종 1주 전 투여)로 나누었다.
B. S180 종양세포 107 을 각 마우스에 접종하였다. 1×107의 S180 세포를 포함하는 0.5 ㎖ PBS 완충액을 마우스 등의 피하에 투여하였다.
C. 대조군은 PBS를 매일 100 ㎕씩 투여하였고, BPRNA 투여 A군 및 BPRNA 투여 B군은 BPRNA(50 ㎍/g)을 2개월 동안 매일 정맥주사와 복강주사를 교대로 투여하였다.
D. 10일 간격으로 마우스의 체중을 기록하여 마우스의 수명을 모니터링하였다(표 6).
실험 결과
| - | 대조군 | BPRNA 투여 A군 | BPRNA 투여 B군 | P 값 |
| 수명 | 41±10 | 55±14 | 53±16 | <0.01 |
| 체중(0일) | 18.6±0.62 | 18.3±0.71 | 18.7±0.53 | >0.05 |
| 체중(10일) | 20.2±0.81 | 21.5±0.93 | 21.7±0.87 | >0.05 |
| 체중(20일) | 21.5±1.45 | 23.1±2.15 | 23.8±1.85 | <0.05 |
| 체중(30일) | 22.3±1.75 | 25.2±2.14 | 26.3±2.06 | <0.05 |
| 체중(40일) | 22.7±1.54 | 26.1±2.45 | 27.4±1.85 | <0.05 |
| 체중(50일) | 22.3±1.21 | 26.5±1.77 | 27.1±1.53 | <0.05 |
대조군과 비교하여 BPRNA 투여 A군 및 BPRNA 투여 B군에서 증가된 수명 및 체중이 관찰되었다. 이러한 결과는, BPRNA가 종양으로 인한 수명 단축 및 체중 감소를 완화시키는 효과가 있음을 의미한다.
실시예
7: 임상실험
실험 방법
A. 임상 전 실험결과를 정리하여 임상 의사 선생님들과 논의하였다.
B. 동시에 국가 위생국 임상 실험담당부서에 임상치료효과 관찰실험계회서를 제출하였다.
C. 국가 위생국에서 서류 심사 후 임상치료효과 관찰을 허가하였다.
D. 연변의학원 부속병원에서 BPRNA의 독성실험을 실행하였다. 대상자는 이 연구에 참여한 연구원 중 본인이 원하는 사람과 암 말기 환자, 임상에서 더 이상 치료 할 수 없고 60세 이상의 환자 중 본인이 원하는 환자에 한하여 실시하였다.
실험 결과
| 암 종류 |
BPRNA를 투여하지 않은 환자군 | BPRNA를 투여한 환자군 | ||||||||||
| 환자 수 | CR | PR | CR+PR 비율 |
MR SD |
PD | 환자 수 | CR | PR | CR+PR 비율 |
MR SD |
PD | |
| 췌장 | 48 | 2 | 2 | 8.3 | 0 | 44 | 62 | 10 | 26 | 58.1 | 20 | 6 |
| 결합조직 | 21 | 4 | 4 | 38.1 | 1 | 12 | 21 | 12 | 6 | 85.7 | 1 | 2 |
| 간 | 45 | 1 | 14 | 33.3 | 14 | 16 | 55 | 3 | 31 | 61.8 | 13 | 8 |
| 위 | 60 | 28 | 6 | 56.7 | 4 | 22 | 62 | 42 | 8 | 80.6 | 2 | 10 |
| 대장 | 42 | 14 | 10 | 57.1 | 2 | 16 | 62 | 22 | 18 | 80.0 | 6 | 4 |
| 유방 | 38 | 14 | 8 | 57.9 | 4 | 12 | 44 | 24 | 16 | 90.9 | 2 | 2 |
| 폐 | 66 | 18 | 12 | 48.5 | 2 | 34 | 86 | 21 | 37 | 67.4 | 17 | 11 |
| 기타 | - | - | - | - | - | - | 28 | 10 | 6 | 57.1 | 8 | 4 |
| 합 | 320 | 81 | 56 | - | 27 | 156 | 408 | 144 | 148 | - | 69 | 47 |
| 총 반응 비율 | 320 | 137 | 42.8 | 183 | 408 | 292 | 71.6 | 116 | ||||
상기 표 7의 CR은 ‘Complete Response’를, PR은 ‘Partial Response’를, MR은 ‘Minor Response’을 의미하며 이는 암 개선 정도를 나타내고, SD는 ‘Stable disease’를, PD는 ‘Progressive disease’을 의미하며 이는 암의 진행 정도를 나타낸다.
| - | (CR+PR)의 수 | (SD+PD)의 수 | 총 환자 수 | (CR+PR)의 백분율 | X2 | P |
| BPRNA 처리군 | 292(240.43) | 116(167.57) | 408 | 71.6% | - | - |
| BPRNA 무처리군 | 137(188.57) | 183(131.43) | 320 | 42.8% | - | - |
| 합 | 429 | 299 | 728 | - | X2=61.26 | P<0.001 |
상기 표 8은 BPRNA의 항암효과를 임상에서 암 환자를 대상으로 치료한 관찰결과를 나타낸다. 총 암 환자수는 728명으로 중 408명이 정상적 암 치료요법에 BPRNA를 추가 사용하였고 다른 320명은 정상적인 치료요법만 하였다. 암 치료 효과를 나타낸 환자를 백분율로 환산한 결과, BPRNA 처리군에서는 71.6%이고 BPRNA 무처리군에서는 42.8%를 나타내었다. 두 군의 암 치료효과를 나타낸 프로수의 차이는 통계학적으로 유의하다(P<0.001).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 특정 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 췌장 분쇄물을 완충액 A 및 페놀-클로로포름(phenol-chloroform)과 혼합하고 상층액을 수득하는 단계를 포함하는 RNA의 제조방법으로서; 상기 완충액 A는 (ⅰ) SDS, (ⅱ) NaCl, (ⅲ) NaSeO3 및 (ⅳ) NaOAc를 포함한다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 완충액 A는 pH 4-87의 pH 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 RNA의 A260/A280 비는 1.9 내지 2.0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 상기 제 1 항의 RNA가 비장 용액에 용해된 항-HIV(Human Immunodeficiency Virus)용 약제학적 조성물.
- 상기 제 1 항의 RNA가 비장 용액에 용해된 항암용 약제학적 조성물.
- 상기 제 1 항의 RNA가 비장 용액에 용해된 면역 증강용 식품 조성물.
- 상기 제 1 항의 RNA가 비장 용액에 용해된 면역 증강용 약제학적 조성물.
- 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비장 용액은 비장을 균질화하여 적혈구를 제거한 것으로 분자량이 2,000-5,000 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드를 주성분으로 하고, 10,000-20,000 달톤의 폴리펩타이드 및 전달 인자(transfer factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020130018032A KR101645670B1 (ko) | 2013-02-20 | 2013-02-20 | 췌장의 ｒｎａ 제조방법 및 상기 ｒｎａ를 포함하는 항암 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130018032A KR101645670B1 (ko) | 2013-02-20 | 2013-02-20 | 췌장의 ｒｎａ 제조방법 및 상기 ｒｎａ를 포함하는 항암 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140105047A true KR20140105047A (ko) | 2014-09-01 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020130018032A KR101645670B1 (ko) | 2013-02-20 | 2013-02-20 | 췌장의 ｒｎａ 제조방법 및 상기 ｒｎａ를 포함하는 항암 조성물 |
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|---|---|
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005028622A2 (en) * | 2003-09-15 | 2005-03-31 | 4Life Research, Lc | Compositions including different types of transfer factor, methods for making the compositions, and methods of treatment using the compositions |
-
2013
- 2013-02-20 KR KR1020130018032A patent/KR101645670B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005028622A2 (en) * | 2003-09-15 | 2005-03-31 | 4Life Research, Lc | Compositions including different types of transfer factor, methods for making the compositions, and methods of treatment using the compositions |
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| BMC Research Note, Vol. 4, 474(2011.). 끝.* * |
| Med. Oncol. & Tumor Pharmacother. Vol. 6, No. 1, Pages 5-9(공개일: 1989).* * |
| Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 10, Pages 3091-3092(공개일: 1990년) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101645670B1 (ko) | 2016-08-04 |
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