KR20140101482A - Mab2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이코박테리움 압세수스 (Mycobacterium abscessus) 유래의 MAB2560 단백질을 유효 성분으로 포함하는 수지상 세포 성숙화 유도 조성물, 및 이를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MAB2560 단백질은 미성숙 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킴으로써 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시킬 수 있다.

Description

MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물 {Compositon for inducing maturation of dendritic cell comprising MAB2560}

본 발명은 마이코박테리움 압세수스 (Mycobacterium abscessus) 유래의 MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 및 이를 이용하여 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

수지상 세포 또는 수상돌기 세포 (dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재하며 특히 피부에 있는 세포를 랑게르한스 세포라 한다. 수지상 세포는 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있으며, 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작된다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기(dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포 (hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화하며, 높은 엔도시토시스 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스 및 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR (toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 화학적 특징을 인식하며, 미성숙 수지상 세포는 살아있는 자가세포로부터 니블링 (nibbling)이라는 과정을 통해 세포막을 탐식한다. 이들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 탐식하고 자신의 단백질을 작은 조각들로 분해해서, 성숙하였을 때 이 조각들이 MHC (Major Histocompatibility Complex) 분자를 이용하여 그 세포 표면에 나타나게 된다. 동시에, 그것은 CD(Cluster of Differentiation)80, CD86, 및 CD40과 같이 T-세포 활성화에서의 공동-수용체로 작용하는 세포 표면 수용체를 증가시킨다. 그것들은 비 항원성 특정 공동자극 신호와 함께 병원체에서 유래한 항원을 나타냄으로써 헬퍼 T-세포, 킬러 T-세포뿐만 아니라, B 세포를 활성화시킨다.

모든 헬퍼 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포(대식세포, B림프구 및 수지상 세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 헬퍼 T-세포를 활성화시킨다. 그러나 대식세포와 B림프구는 메모리 T-세포만 활성화시킬 수 있는 반면에 수지상 세포는 메모리 및 처녀 (naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포로도 대식세포로도 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNF-로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미숙한 DC와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 DC는 고 수준의 MHC (Major Histocompatibility Complex)I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이들 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포 상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화의 양을 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 DC는 다량의 사이토카인을 생성하며, 이 사이토카인은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토카인 중 2 가지는 인터루킨 10 (IL-10) 및 인터루킨 12 (IL-12)이다. 이들 사이토카인은 유도된 T 세포 반응의 방향에 대해 정반대의 효과를 갖는다. IL-10이 생성되면 Th-2형 반응이 유도되는 반면, IL-12가 생성되면 Th-1 형 반응이 유도된다. 후자의 반응이 세포 면역 반응이 요구되는 경우, 예를 들면 암 면역요법에서 특히 바람직하다. Th-1형 반응에 의해 세포 면역계의 작동인자 공격수단인 세포독성 T 림프구(CTL)가 유도 및 분극화된다. 이러한 작동인자 공격수단은 종양 성장을 억제하는데 가장 효과적이다. IL-12는 또한 자연살해(NK) 세포의 성장을 유도하고, 항-혈관신생 활성을 갖고, 이는 모두 효과적인 항-종양 공격수단이다. 따라서, IL-12를 생성하는 수지상 세포의 사용은 면역자극에 사용하는데 이론상 최적으로 적합하다.

수지상 세포는 흔치 않고 분리하기 어렵기 때문에 서로 다른 유형과 서브셋의 수지상 세포의 정확한 생성과 발달 및 그 상호관계에 대해서는 오직 대략적으로만 알려졌다. 수지상 세포는 신체의 다른 세포들과 끊임없는 소통을 한다. 이러한 소통은 세포 표면 단백질의 상호작용에 근거한 직접적인 세포 대 세포 접촉의 형태를 취할 수 있다.

수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인은 세포의 유형에 따라 다르다. 림프구성 수지상 세포는 다량의 타입-1 IFN을 생산할 수 있는데 그것은 더 많은 활성화된 대식 세포를 모아서 탐식 작용을 가능하게 한다. 림프구성 수지상 세포는 중추와 말초 면역조절에 관여하고, 골수성 수지상 세포는 외래성 항원이나 감염에 대한 면역유도에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상 세포가 정상 기능을 못할 경우 당뇨병, 류머티스성 관절염, 알레르기성 과민반응과 같은 자가 면역 질환이 나타나거나 감염성 질환이나 암 발생에 대해 정상적인 면역반응이 일어나지 않게 된다.

암환자에서는 수지상 세포의 기능이 저하되어 있어 정상적 항암 면역능을 유도하는 것이 어렵다. 지금까지 수지상 세포의 분화를 조절(활성화)하는 물질들(LPS, TNF-, IL-1)은 많이 알려져 있으나 생체독성의 부작용으로 생체에의 직접적인 응용에 문제가 많다.

한편, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 속에는 결핵, 우형결핵, 나병과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종 (species)뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물 기생의 균종 (saprophytic species) 등 현재까지 약 72 종(species)이 알려져 있으며, 그 중 인체 질환과 관련된 것이 25종에 이르는 것으로 알려져 있다.

마이코박테리움 압세수스는 토양, 물 등 자연계에 널리 존재하는 세균으로 마이코박테리아 중 유일하게 현재 사용 중인 모든 항결핵제에 내성을 보이고 있다. 과거에는 면역기능이 저하된 사람에게서 질병을 유발시키는 기회감염균으로 인식되었으나 최근에는 면역기능의 정상 유무에 관계없이 인체에 심각한 질환을 일으키는 항원으로 인정되었다. 마이코박테리움 압세수스의 게놈 (ATCC19977) 크기는 약 5Mb이며 다른 마이코박테리아와는 다르게 특징적인 삽입 서열은 갖고 있지 않지만 81 kb에 달하는 전장 프로파지(full-length prophage)를 보유하고 있다. 마이코박테리움 압세수스는 결핵균에 비하여 상대적으로 보존되어있는 유전자가 많으며 유전자의 구성은 병원성이 없는 M. smegmatis와 유사하다고 알려져 있다.

상기와 같이 수지상 세포는 신체 자체의 면역 기능을 높이는데 중요한 역할을 하고 있어, 수지상 세포의 분화를 촉진하여 성숙시킴으로써 강력한 면역 반응을 일으키는 무독성의 면역조절제의 개발과 그 물질의 작용기전을 명확히 이해하는 것은 수지상 세포를 이용한 세포 면역 치료에 중요한 과제가 되고 있다

본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 연구를 거듭한 결과 마이코박테리움 압세수스에서 유래한 MAB2560 단백질이 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킨다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화 시키는 단계;를 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화 시키는 단계;를 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 수지상 세포 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 MAB2560은 미성숙 수지상 세포의 분화를 촉진함으로써 수지상 세포를 효과적으로 성숙시킬 수 있으며, 이를 통해 신체의 면역 반응을 효과적으로 증강시키는 효과가 있다.

도 1은 클로닝을 통해 분리한 재조합 단백질 MAB2560을 나타낸 도이다.
도 2는 MAB2560을 처리한 수지상 세포의 생존률 측정 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 MAB2560을 처리한 수지상 세포에서 특이적인 단백질 표면인자인 CD80, CD86, MHC class I, II의 발현량을 나타낸 도이다.
도 4는 MAB2560을 처리한 수지상 세포에서 사이토카인(TNF-, IL-6, IL-1, IL-12 p70, IL-10)의 분비량을 나타낸 도이다.
도 5는 MAB2560을 처리한 수지상 세포의 덱스트란-FITC 탐식능력 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 MAB2560을 처리한 수지상 세포의 T세포 자극에 의한 활성 효과 및 T세포의 사이토카인의 분비량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 MAB2560을 처리한 수지상 세포에서 신호전달계의 변화를 나타낸 도이다.

본 발명은 MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 MAB2560은 마이코박테리움 압세수스로부터 유래한 것으로, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명의 MAB2560 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. MAB2560 단백질의 변이체란 MAB2560 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 MAB2560 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명은 마이코박테리움 압세수스의 전체 유전자 중 MAB2560 부분만을 클로닝한 후 대장균 발현시스템을 이용하여 분리, 정제하여 수지상 세포 성숙화를 유도할 수 있다.

미숙한 수지상 세포는 성숙하여 성숙한 수지상 세포를 형성한다. 성숙한 수지상 세포는 항원을 포획하고 동시 자극하는 세포 표면 분자 및 각종 사이토카인의 상향-조절된 발현을 나타내는 능력을 상실한다. 특히, 성숙한 수지상 세포는 MHC I형 및 II형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, CD (Cluster of Differentiation) 80+, CD83+, CD86+ 및 CD14-을 조절한다. 더 많은 MHC 발현으로 수지상 세포 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포 상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 신호를 강화한다.

본 발명은 MAB2560을 포함하는 조성물을 통해 성숙한 수지상 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 본 발명의 MAB2560은 이에 제한되는 것은 아니나 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml농도로 조성물에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리하여 성숙 수지상 세포로 성숙화 시키는 단계;를 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도방법을 제공한다.

본 발명의 MAB2560 단백질은 미성숙 수지상 세포에 아니나 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml농도로 처리될 수 있다.

본 발명은 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리하여 성숙화를 유도하기 위하여 MAB2560이 처리된 세포를 배양할 수 있다. 적절한 성숙 수지상 세포로의 분화 유도를 위하여, 상기 세포를 12~36시간 동안 배양하여 성숙시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 MAB2560 단백질 처리를 통해 성숙이 촉진된 성숙된 수지상 세포는 성숙된 수지상 세포가 가지는 일반적인 특징을 발현할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, MAB2560을 미성숙 수지상 세포에 처리함으로써 미성숙 수지상 세포가 분화되어 성숙한 수지상 세포로 변화하며, 보다 바람직하게는 TNF-α, IL-12p70, IL-6, IL-1β의 생성이 증가된 성숙 수지상 세포로 변화할 수 있다.

또한, 본 발명은 MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리함으로써 미성숙의 수지상 세포가 성숙되며, 수지상 세포의 성숙으로 표면 단백질 표시인자의 발현이 증가될 수 있다. 보다 구체적으로는 미성숙 수지상 세포에 MAB2560을 처리함으로써 수지상 세포를 성숙시키고 결과적으로 T 세포의 활성을 유도하여 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 MAB2560은 면역 증강을 위한 의약품 및 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있으며 세포 표면 마커를 유세포 분석기 (flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 또한 상기 세포를 사이토카인 생성 (예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정)을 통해 모니터링할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 수지상 세포의 분리 및 재조합 MAB2560 의 클로닝

1. 1 수지상 세포의 분리 및 유도

6~8주령된 C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포는 RPMI 1640 (10% FBS(Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-4를 포함)배지가 포함된 6-웰 플레이트에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 8일간 배양하였다. GM-CSF 및 IL-4은 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

1.2 재조합 MAB2560 의 클로닝

마이코박테리움 압세수스의 게놈 DNA (ATCC19977)을 주형으로 이용하여, PCR을 통해 MAB2560 부위를 증폭하였다. 정방향 프라이머로 5’-CAT ATG ACG AGC GTT GAC GTG CCC TCG-3’, 역방향 프라이머로 5’-AAG CTT TAG GCC GGA GGG CAC GAC CTT-3’를 이용하였다. 분리된 PCR 산물을 NdeI 과 HindIII 효소로 절단하고, 발현벡터인 pET-28a 벡터에 삽입하였다. MAB2560 유전자가 삽입된 pET-28a 벡터로 형질 전환시킨 E. coli BL21을 LB 배지에서 (100 μg/ml 앰피실린 포함) 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후, 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하고 6시간 동안 배양하고, 용해 완충액 (lysis buffer, 1M DTT, 리소자임, PMSF 포함)으로 세포를 녹였다. 재조합 단백질은 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로오스를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 단백질은 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다.

결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 재조합 MAB2560 단백질은 26 kDa 위치에서 나타났다.

실시예 2. MAB2560 의 세포 독성 확인

MAB2560 이 수지상 세포의 생존에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 수지상 세포를 1, 2.5 μg/ml 농도의 MAB2560 또는 대조군으로 50 ng/ml 농도의 LPS (lipopolysaccharide)로 24 시간 동안 처리하였다. 이 후 요오드화 프로피듐 (propidium iodide, PI) 및 아넥신-V로 이중 염색하고 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 분석하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 2.5 μg/ml 농도의 MAB2560은 수지상 세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 3. MAB2560 에 의한 수지상 세포의 표면 인자 발현 분석

MAB2560이 수지상 세포의 성숙에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 모든 세포의 성숙도를 균일하게 하기 위하여 GM-CSF 와 IL-4가 함유된 OptiMEM 배지에서 유지한 후, 수지상 세포에 2.5 μg/ml 농도의 MAB2560 또는 대조군으로 50 ng/ml 농도의 LPS를 각각 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. LPS 는 수지상세포의 성숙을 촉진하는 것으로 잘 알려진 물질이다. 수지상 세포의 성숙과 관련된 표면 인자 발현 분석을 위해 항-CD80, 항-CD86, 항-MHC I 및 II와 같은 세포 표면 인자 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.

결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, MAB2560은 성숙한 수지상 세포의 단백질 표면 인자인 CD80, CD86, MHC class I, MHC class II의 발현을 증가시킴을 확인하였다.

실시예 4. MAB2560 이 수지상 세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향 분석

수지상 세포의 성숙 여부에 따라 분비되는 사이토카인의 종류가 달라지므로, MAB2560이 수지상세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 수지상 세포에 2.5 μg/ml 농도의 MAB2560 또는 대조군으로 50ng/ml의 LPS 를 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 상층액을 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10 및 IL-12 p70 에 대한 ELISA 키트에 적용하여 사이토카인 분비량을 측정하였다. IL-12 p70과 IL-10은 수지상 세포에서 분비되는 주요 사이토카인으로 각각 T 세포가 Th1과 Th2로 분화되는데 중요한 역할을 한다. IL-12는 대표적인 Th1형 사이토카인이며, IL-10은 활성화된 단핵구, NK 세포 및 Th1 세포에 의해 생산되는 사이토카인 (IL-12 p70포함)의 활성을 방해하는 것으로 알려져 있다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, MAB2560은 수지상세포에서 전염증 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현을 증가시켰으며, IL-12 p70의 발현을 증가시킴을 확인하였다.

실시예 5. MAB2560 에 의한 수지상세포의 항원 취득 능력 분석

미성숙 수지상세포는 항원취득을 잘하지만, 성숙한 수지상세포는 항원취득 능력이 감소한다고 알려져 있다. 따라서 MAB2560 단백질이 수지상세포의 대식 활동 (endocytic activity)에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 미성숙 수지상 세포를 2.5 μg/ml의 MAB2560 또는 대조군으로 50 ng/ml의 LPS를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양된 수지상 세포에 1 ㎍/ml의 플루오레신 결합 덱스트란(fluoresceinconjugated dextran, 분자량 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)을 1시간 동안 첨가하였다. 37℃와 4℃에서 각각 30분 동안 배양한 후 콜드 스테이닝 완충액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 세포를 세척하였다. 이 후 PE (Phycoerythrin)-결합 CD11c (BD bioscience)로 염색한 후에 유세포분석기를 이용하여 덱스트란-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 탐식능을 측정하였다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, MAB2560을 처리한 수지상 세포가 MAB2560을 처리하지 않은 수지상 세포보다 덱스트란(항원) 포식 능력이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과에 따라, MAB2560이 기능적인 면에서 수지상 세포를 성숙시킴을 알 수 있었다.

실시예 6. MAB2560 에 의한 수지상세포의 T 세포 활성 분석

성숙 수지상 세포의 생체 내에서의 가장 중요한 특징은 T 림프구의 활성을 유도하는 것이다. MAB2560 로 성숙이 유도된 수지상 세포가 T 림프구를 활성화시키는지 확인하기 위하여, 오브알부민 형질전환(Ovalbumin transgenic) 마우스인 OT-I과 OT-II 마우스 (BALB/c 마우스)의 비장으로부터 분리된 CD4+및 CD8+T세포를 C57BL/6 마우스로부터 유래된 MAB2560 처리 수지상 세포와 함께 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 측정하였다. 또한, T 세포에서 분비하는 사이토카인(IFN-γ)의 분비량을 ELISA 키트를 이용하여 분석하였다.

결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, MAB2560로 처리한 경우 대조군에 비해 T 세포의 증식 정도가 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해, MAB2560은 수지상세포를 성숙시켜 T 세포의 증식에 의한 면역 활성 능력을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한 T세포에서 분비하는 사이토카인인 IFN-γ 분비량을 통해 MAB2560 처리가 세포를 Th1형 세포로 편향적으로 분화되도록 함을 알 수 있었다.

실시예 7. MAB2560에 의한 수지상 세포의 신호전달계 활성화

ERK, JNK, p38 등의 MAPK(mitogenactivated protein kinases) 신호전달계가 활성화는 수지상세포의 성숙화에 필수적인 요소라고 알려져 있다. 따라서, 미성숙 수지상 세포에 MAB2560 2.5 μg/ml을 0분 5 분, 15 분, 30 분, 45분, 60 분간 처리한 후, 세포를 파괴하여 단백질을 모두 분리하고, MAPK (mitogen-activated protein kinases) 신호전달계와 관련된 인자인 ERK, JNK, p38의 인산화 여부를 확인하였다. 단백질 양은 특정 항체를 이용하는 웨스턴 블랏 방법으로 측정하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, MAB2560 처리에 의해 인산화되어 있는 p-p38, p-ERK, p-JNK의 양이 증가하였음을 확인하였다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Compositon for inducing maturation of dendritic cell comprising MAB2560 <130> 135 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Mycobacterium abscessus <400> 1 Met Arg Thr Ile Ala Ile Arg His Arg Ala Val Ile Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Val Ala Leu Ile Thr Val Gly Cys Ser Asn Gly Thr Ser Val Asp Val 20 25 30 Pro Ser Pro Glu Val Gly Leu Ile Ala Thr Thr Ser Ser Ala Ala Pro 35 40 45 Ala Gln Pro Ala Glu Val Lys Leu Ile Gly Glu Arg Asp Val Glu Val 50 55 60 Thr Leu Thr Gly Pro Ile Ala Ala Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Glu Ser 65 70 75 80 Gln Lys Gln Ala Leu Gly Lys Pro Leu Thr Gly Asp His Asn Ala Gly 85 90 95 Thr Arg Glu Ser Gly Ala Val Phe Gln Gln Phe Gln Gly Gly Ala Ile 100 105 110 Ile Ala Lys Asn Asn Gln Ala Gly Thr Pro Ala Phe Ile Val Val Gly 115 120 125 Lys Ile Arg Asp Ala Trp Asn Ile Gln Arg Asp Ala Asp Gly Thr Pro 130 135 140 Ser Ile Thr Gly Asn Asn Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gly Leu Pro Thr 145 150 155 160 Ser Asp Glu Asn Thr Glu Gly Asp Gln Leu Val Ser Thr Phe Glu His 165 170 175 Gly Lys Ile Glu Tyr Asn Ala Lys Ser Gly Glu Val Ala Val Thr Val 180 185 190 Asn Gly Lys Val Val Pro Ser Gly Leu 195 200 <210> 2 <211> 606 <212> DNA <213> Mycobacterium abscessus <400> 2 atgaggacga tcgcaatccg ccacagggca gtcatcggcc tgagcgccgt agcgctgatc 60 actgtgggct gcagcaatgg cacgagcgtt gacgtgccct cgcccgaggt cgggctgatc 120 gccaccacct cgtccgcggc gcctgcgcag cccgccgagg tcaagctgat cggggagagg 180 gacgtcgaag tgacgctgac cggcccgatt gctgccaagt attcatcggc gagtgagagc 240 cagaagcagg ctctcggcaa gccgctgacg ggtgaccaca acgcgggtac acgcgagagt 300 ggcgcggtgt tccagcagtt ccagggtggc gccatcatcg ccaagaacaa ccaggcgggc 360 acgccggcct tcatcgtcgt gggcaagatc cgcgatgcct ggaacatcca gcgcgacgcg 420 gacggcaccc cgtcgatcac cggcaacaat ggctcggccg gcccgttggg cctgcccacc 480 agcgacgaaa acaccgaggg tgatcagctc gtgtcgacct ttgagcacgg caagatcgag 540 tacaacgcga agagcggcga ggtagcggtc acggtcaacg gcaaggtcgt gccctccggc 600 ctatag 606

Claims (8)

1. MAB2560 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 MAB2560 단백질은 마이코박테리움 압세수스 (Mycobacterium abscessus) 유래인 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 MAB2560 단백질은 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 농도로 포함된 것을 특징으로 하는, 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
   
4. 미성숙 수지상 세포에 MAB2560 단백질을 처리하여 성숙 수지상 세포로 분화시키는 단계;를 포함하는 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 MAB2560 단백질은 미성숙 수지상 세포의 성숙 과정 동안 TNF-α, IL-12p70, IL-6 또는 IL-1β의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
6. 제4항에 있어서, 상기 MAB2560 단백질은 0.1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 미성숙 수지상 세포의 성숙화 유도 방법.
   
7. 제1항의 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
   
8. 제1항의 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
   

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