KR20140096514A - 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

암 예방 또는 치료용 조성물

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KR20140096514A
KR20140096514A KR1020130009101A KR20130009101A KR20140096514A KR 20140096514 A KR20140096514 A KR 20140096514A KR 1020130009101 A KR1020130009101 A KR 1020130009101A KR 20130009101 A KR20130009101 A KR 20130009101A KR 20140096514 A KR20140096514 A KR 20140096514A
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김형국
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보령제약 주식회사
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Abstract

본 발명은 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 안전하고 효과적으로 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of cancer}
본 발명은 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
문명이 발달되어 갈수록 암의 발생률이 증가되고 있음에도 불구하고 암 환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 강한 세포독성을 나타내는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있다. 그러나, 이러한 치료법들은 대개 조기 암 환자나 특정 암에만 처치가 국한되어 있을 뿐 아니라 다양한 부작용을 초래하므로 안전 프로파일을 가지면서 효과적이고 부작용이 적은 항암제 개발이 요구되고 있다.
한편, 피마살탄은 본 출원의 출원인(보령제약)이 개발한 하기 도 1에 표시된 화학적 구조를 갖는 화합물{2-부틸-5-디메틸아미노티오카르보닐메틸-6-메틸-3-[[2'-(1H-테트라졸-5-일)비페닐-4-일]메틸] 피리딘-4(3H)-온}이다(대한민국 특허등록번호 제0354654호). 피마살탄은 고혈압에 사용되는 새로운 안지오텐신 II 수용체 길항제(Angiotensin II Receptor Blocker; ARB)로 20-480mg의 빠른 구강 복용 용량 후에도 안전 프로파일을 가지며, 효과적이다[Chi YH., Lee H., Paik SH., Lee JH, Yoo BW, Kim JH, Tan HK, Kim SL., Am J Cardiovasc Drugs., 11(5), 335-346(2011)]. 그런데, 피마살탄에 대한 항암 효과에 대해서는 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 암세포주를 이용하여 연구한 결과 안전하고 효과적인 항암 약물로 이용할 수 있는 본 발명의 조성물을 완성하였다.
대한민국 특허등록번호 제0354654호, 2005년 10월 7일, 전체
Chi YH., Lee H., Paik SH., Lee JH, Yoo BW, Kim JH, Tan HK, Kim SL., Am J Cardiovasc Drugs., 11(5), 335-346 (2011)
따라서 본 발명의 목적은 안전하고 효과적인 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 피마살탄은 하기 도 1에 표시된 화학적 구조를 갖는 화합물{2-부틸-5-디메틸아미노티오카르보닐메틸-6-메틸-3-[[2'-(1H-테트라졸-5-일)비페닐-4-일]메틸] 피리딘-4(3H)-온}이다.
본 발명에서, 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물은 결정형이거나 무정형일 수 있으며, 본 발명은 이들의 결정형 및/또는 무정형을 포함한다.
본 발명에서, 약제학적으로 허용되는 염은 통상적으로 의약 제조업자가 의약품을 제조하는데 사용하는 무기산염, 유기산염, 금속염을 의미하며, "무기산"으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, "유기산"으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 말레인산, 벤조산, 글루콘산, 글리콜산, 숙신산, 4-모폴린에탄술폰산, 캠포술폰산, 4-니트로벤젠술폰산, 히드록시-O-술폰산, 4-톨루엔술폰산, 칼룩투론산, 엠보산, 글루탐산, 아스파르트산, 아디페이트염, 캠실레이트염 또는 베실레이트염 등을 사용할 수 있으며, "금속"에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 등이 있다.
본 발명에서, 상기 피마살탄의 약제학적으로 허용가능한 염으로는 피마살탄 칼륨염, 염산염, 칼슘염, 황산염, 아디페이트염, 캠실레이트염 또는 베실레이트염이 바람직하며, 피마살탄 칼륨염이 보다 더 바람직하다.
본 발명에서, 상기 피마살탄의 약제학적으로 허용가능한 염의 수화물로는 피마살탄 삼수물 칼륨염이 바람직하다.
본 발명에서, "용매화물" 중 용매는 유기화합물 제조에 사용되는 통상의 유기용매를 의미하며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 1-아세테이트, 아세톤, 초산, 아니솔, 테트라히드로푸란, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 프로필아세테이트, 이소프로필아세테이트, 이소부틸아세테이트, n-부틸아세테이트, 디메틸설폭시드, 펜탄, 헵탄 등이 있으나, 이들의 예로 본 발명의 용매화물이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "수화물" 및 "용매화물"은 피마살탄의 1몰에 대하여 0.25 내지 10몰비로 함유될 수 있으며, 예를 들어 0.5몰, 1몰, 1.5몰, 2몰, 2.5몰, 3몰, 5몰 등일 수 있으나, 이들의 예로 본 발명이 제한 되는 것은 아니다.
본 발명에서, 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물은 시중에서 구입할 수 있으며, 공지된 방법으로 제조할 수 있다(예를 들어, 대한민국 특허등록번호 제0354654호 및 제0521980호 등).
본 발명에서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 피부암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 암은 전립선 암일 수 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기한 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명 조성물은 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 피마살탄의 유효량은 60kg 정도의 체중의 일반 성인을 기준으로 150mg 내지 900mg이다.
본 발명의 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제, 또는 키트 형태의 경구 투여용 제형일 수 있으며, 경구투여용이 보다 바람직하고, 단일정제인 것이 보다 더 바람직하다.
또한, 본 발명은 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 인간을 포함하는 포유류에 투여함으로써, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서 인간이 제외될 수도 있다.
또한 암을 예방 또는 치료를 위한 약제학적 제조를 위한 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 안전하고 효과적으로 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 피마살탄의 화학적 구조를 보여주는 도이다.
도 2는 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 안지오텐신 II 수용체 길항제(피마살탄, 로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄) 처리에 의한 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 전립선암 세포주인 DU-145에 안지오텐신 II 수용체 길항제(피마살탄, 로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄) 처리에 의한 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 전립선암 세포주인 LNCap-LN3에 안지오텐신 II 수용체 길항제(피마살탄, 로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄) 처리에 의한 항암 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 피마살탄 처리한 후의 자가섭식작용(Autophagy)에 관련된 단백질 발현 변화를 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6은 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 피마살탄 처리 후의 LC3-II의 LC3-I에 대한 상대적인 비율 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄을 각각 처리한 후의 자가섭식작용(Autophagy)에 관련된 단백질 발현 변화를 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 8은 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 로사르탄 처리 후 LC3-II의 LC3-I에 대한 상대적인 비율 변화를 보여주는 그래프이다.
도 9는 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 발사르탄 처리 후 LC3-II의 LC3-I에 대한 상대적인 비율 변화를 보여주는 그래프이다.
도 10은 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 에프로살탄 처리 후 LC3-II의 LC3-I에 대한 상대적인 비율 변화를 보여주는 그래프이다.
도 11은 면역 형광법을 이용하여 전립선암 세포주인 PC-3 세포주의 피마살탄 처리에 의한 자가섭식작용 여부를 확인한 공초점 현미경 관찰 결과를 보여주는 도이다.
도 12는 면역 형광법을 이용하여 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 피마살탄 처리한 후 전체 세포수 대비 LC3 반점(Dot) 형성 세포 수를 보여주는 그래프이다.
도 13은 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 피마살탄 처리 시의 항전이 효과를 보여주는 도이다.
도 14는 전립선암 세포주인 PC-3 세포주에 피마살탄 처리한 시의 항전이 효과의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 전립선암 세포주인 DU145 세포주에 피마살탄 처리 시의 항전이 효과를 보여주는 도이다.
도 16은 전립선암 세포주인 DU145 세포주에 피마살탄 처리한 시의 항전이 효과의 효과를 보여주는 그래프이다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예 . 피마살탄의 항암 효과의 확인
1. 실험재료 및 방법
가. 실험재료
DMEM, 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린, 및 스트렙토마이신은 Life Technologies Inc.(GrandIsland, NY, USA)로부터 입수하였다. iNOS, p65, cJun, cFos, PARP[poly(ADP ribose)polymerase], β-액틴(actin) 단일클론 항체, 및 퍼록시다제-컨주게이트 2차 항체 (peroxidase-conjugated secondary antibody)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (SantaCruz, CA, USA)로부터 구매하였다. 임의적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(Random oligonucleotide primers) 및 M-MLV 역전사효소는 Promega (Madison, WI, USA)로부터 구매하였다. SYBR green ex Taq는 TaKaRa (시가, 일본). iNOS, β-액틴 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 바이오니어(서울, 한국)로부터 구매하였다. 피마살탄 삼수물 칼륨염은 보령제약(서울, 한국)으로부터 입수하였다. MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tertazolium bromide), PMSF, DTT(DL-Dithiothreitol), NS-398, LPS(Escherichia coli, serotype 0111:B4) 및 다른 모든 화합물은 Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA)로부터 구매하였다.
나. 세포 배양
다음의 세포주들은 ATCC 및 한국 세포주 은행(KCLB)으로부터 취득하였다: PC-3, DU145 및 LNCap-LN3
PC-3, DU145 및 LNCap-LN3 세포주들은 10% 우태아 혈청(FBS), 페니실린 100 units/ml 및 스트렙토마이신 100 ug/ml이 보충된 DMEM에서 5%의 CO2 농도, 습한 조건, 37℃ 온도에서 배양되었다.
다. WST -1 세포 증식 분석 ( WST -1 proliferation assay )
96-웰 플레이트에 전립선암 세포주인 PC-3, DU-145 및 LNCap-LN3을 1×103 cell/well로 seeding한 후, ARBs인 Fimasartan, Losartan, Eposartan, Valsartan을 각 전립선암 전립선암 세포주에 200, 400 uM으로 처리한 군과 ARBs를 처리하지 않은 대조군으로 나누었으며 세포배양과 동일한 조건에서 72시간 및 120시간 동안 세포배양을 실시하였다. 상기 각각의 well에 10㎕의 WST-1 (Roche Co., Catalog No. 11-644-807-001) 용액을 처리하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 3시간 동안 반응시켰다. 450nm와 690nm에서 흡광도(A450과 A690)를 측정하고 A450 값에서 reference 값인 A690을 뺀 A450-A690 값을 구하였다. 대조군에 대한 시료의 상대적인 A450-A690 값으로부터 생존세포의 비율을 계산하여 각 화합물의 세포성장 억제정도를 비교하였다.
라. 웨스턴 블롯 분석
전립선암 세포주인 PC-3에 피마살탄 200 μM을 처리한 후, 0 h(control) 24 시간(h), 48 시간, 72시간, 96 시간 이 후에 세포를 수득(harvest)하여 웨스턴 블롯을 실시하였다.
PC-3는 원심분리에 의해 모아졌고, PBS(phosphate-buffered saline)으로 한 번 세척되었다. 세척된 세포 펠렛은 RIPA buffer solution(1 % protein inhibitor)에 의해 파쇄 되었으며, 이로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 농도는 제조자의 지시에 따라 Bradford assay 시약을 이용하여 결정하였다. 처리 및 미처리 세포 추출물로부터의 세포 단백질을 10-15% SDS-PAGE 상에서 분리한 후 PVDF 막 상에서 전기블롯(electroblot)하였다. 면역 블롯(immunoblot)을 블로킹 용액(5% 탈지 우유)과 함께 1 시간(h) 배양하였고, 이어서 1차 항체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 블롯은 Tween 20/TBS(Tris-buffered saline)로 3번 세척하였고 1:1000으로 희석한 서양고추냉이 퍼옥시다아제 콘쥬게이트 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)와 함께 상온에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 블롯을 다시 Tween 20/TBS로 3번 세척하고 그리고 나서 ECL (enhanced chemiluminescence) [Amersham Life Science 사]에 의해 현상하였다.
마. 공초점 현미경 관찰
GFP-LC3로 트랜스펙션된 PC-3 세포주에 피마살탄 200 μM을 처리한 후 37℃, 0.1μM bafilomycin A1이 포함된 행스용액(Hanks' solution)에서 0시간(대조군), 24시간, 48시간, 72시간별로 세포를 면역형광 공초점 현미경((Olympus, FV1000)으로 오토파지 바이오마커인 GFP-LC3 반점 형성을 분석하였다.
바. 세포 이동 분석 ( Cell migration assay )
트렌스웰에 전립선암 세포주인 PC-3와 DU-145를 1×104/well로 seeding한 후, 피마살탄 200 μM을 각각 처리한 군과 처리하지 않은 대조군으로 나누어 37℃ 이산화탄소 배양기에서 24시간 내지 6시간 배양하였다. 배양 후, 트렌스웰의 배지를 제거한 후, 100% 메탄올에서 15분간 고정시켰고, 그 후 증류수를 이용하여 2번 씻어 준 후, H&E 염색 용액에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 증류수에서 3번 씻어 준 후, 면봉을 이용하여 트랜스웰을 통과하지 못한 세포들을 면봉을 이용하여 완전히 제거해 주었다. 트랜스웰을 완전히 말린 후, 트랜스웰을 통과한 세포들을 관찰하기 위하여 100배의 배율로 관찰 및 사진을 촬영하였다. 정량적 분석을 위해서는 사진 촬영이 끝난 후, 트랜스웰에 10% 초산 용액(acetic acid)에 담구어서 추출 한 후 560nm 파장에서 측정하여 흡광도를 분석하였다.
사. 통계 분석
결과는 3번의 실험의 평균±표준편차(S.D.)로 나타내었다. 통계학적으로 유의한 값은 Student's T 테스트를 이용하여 비교하였고, 0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다. (*P<0.05, **P<0.01; ***P<0.001)
2. 결과
가. WST -1 세포 증식 분석 결과
도 2 내지 4에서 나타낸 바와 같이, 동일 농도 처리 시 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제(로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄) 보다 피마살탄이 전립선 암세포주 PC-3, DU-145 및 LNCap-LN3의 항증식 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
나. 피마살탄과 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제( 로사르탄 , 발사르탄 및 에프로살탄)의 자가섭식작용에 의한 세포사멸 기작 발생여부 확인
웨스턴 블롯을 통하여 피마살탄과 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제(로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄)의 자가섭식작용에 의한 세포사멸 기작 발생여부 확인하였다.
도 5 및 6에서 나타낸 바와 같이, 전립선암 세포주인 PC-3에 피마살탄을 처리하면 시간이 경과함에 따라 자가섭식작용의 마커인 LC3-II/LC3-I의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.
또한 도 7 내지 10에서 나타낸 바와 같이, 암세포주인 전립선암 세포주인 PC-3에 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제(로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄)를 처리한 경우에도 시간이 경과함에 따라 자가섭식작용의 마커인 LC3-II/LC3-I의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.
그러나, 전립선암 세포주인 PC-3에 피마살탄을 처리하고 96 시간 경과 후의 LC3-II/LC3-I의 비율은 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제인 로사르탄, 발사르탄 및 에프로살탄과 비교할 때 각각 약 23배, 35배 및 76배 이상 높음을 확인할 수 있었다. 다시 말해, 피마살탄은 다른 안지오텐신 II 수용체 길항제 보다 현저하게 암세포에서 자가섭식작용을 발생시킬 수 있음을 확인하였다.
다. 피마살탄의 자가섭식작용의 확인
공초점 현미경 관찰을 통하여 피마살탄의 자가섭식작용을 다시 확인하였다.
도 11 및 12에서 나타낸 바와 같이, 피마살탄을 처리하지 않은 전립선암 세포주인 PC-3에서는 GFP-LC3가 널리 퍼진 염색 패턴을 보이는 반면, 피마살탄을 처리한 전립선암 세포주인 PC-3에서는 시간이 경과하면서 GFP-LC3 반점을 나타내는 세포가 증가되는 것이 관찰되었다. 이는 피마살탄이 인간 전립선암 세포주인 PC-3에 자가섭식작용을 강력하게 발생시킬 수 있음을 보여준다.
따라서, 공초점 현미경 관찰 결과 피마살탄은 암세포에서 자가섭식작용을 발생시켜 세포사멸을 유도하여 암의 예방 및 치료효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있다.
라. 피마살탄의 암세포에 대한 항전이 능력 확인
세포 이동 분석을 통하여 전립선암 세포주인 PC-3와 DU-145에 피마살탄 200 μM을 처리하고 6시간 경과 후에 항전이 효과를 확인하였다.
도 13 및 14에서 나타낸 바와 같이, 전립선암 세포주인 PC-3에 피마살탄 200 μM 처리하고 6시간 경과 후, 12% 이상 세포 이동이 억제되어 암세포가 전이되는 것을 억제할 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 15 및 16에서 나타낸 바와 같이, 전립선암 세포주인 DU-145에 피마살탄 200 μM 처리하고 6시간 경과 후, 13% 이상 세포 이동이 억제되어 암세포가 전이되는 것을 억제할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 세포 이동 분석 결과 피마살탄은 암세포의 사멸을 유도할 뿐 아니라 전이를 억제하기 때문에 암의 예방 및 치료효과를 가질 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims (4)

  1. 피마살탄, 이의 약제학적으로 허용되는 염, 이들의 용매화물 또는 이들의 수화물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 피마살탄 삼수물 칼륨염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 대장암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 피부암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 암의 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 전립선암인 암의 예방 및 치료용 조성물.
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