KR20140090974A - 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서 NUG 또는 NAC 상향 조절 유전자 (up-regulated gene)로 언급되는, NAC1 또는 NAC5-코딩 유전자의 과발현시 상향 조절된 핵산의 식물에서의 발현을 조절함으로써 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법이 제공된다. 또한 NUG의 발현이 조절된 식물체가 제공되며, 상기 식물체는 해당 야생형 식물 또는 다른 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 갖는다. 또한 비생물적 스트레스 조건 하에서 생장한 식물에서의 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산의 발현 조절을 포함하는, 식물에서의 비생물적 스트레스 내성을 부여하는 방법이 제공된다. NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산을 발현하는 식물은 증가된 비생물적 스트레스 내성을 가질 뿐만 아니라, 해당 야생형 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는다. 또한 상기 방법에 유용한 유전자 구축물 및 상기 방법에 의해 생산된 식물체가 제공된다.

Description

향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 {Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same}
본 발명은 일반적으로 분자생물학 분야에 관한 것이며, 본 발명에서 NUG 또는 "NAC up-regulated gene"으로 언급되는, NAC1 또는 NAC5-코딩 유전자의 과발현에 의해 상향 조절된 핵산의 식물에서의 발현을 조절함으로써 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NUG의 발현이 조절된 식물체에 관한 것이며, 상기 식물체는 해당 야생형 식물 또는 다른 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는다. 본 발명은 또한 비생물적 스트레스 조건 하에서 생장한 식물에서의 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 조절을 포함하는, 식물에서의 비생물적 스트레스 내성을 부여하는 방법에 관한 것이다. NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 발현하는 식물은 증가된 비생물적 스트레스 내성을 가질 뿐만 아니라, 해당 야생형 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 유용한 유전자 구축물 및 본 발명의 방법에 의해 생산된 식물체를 제공한다.
세계 인구의 증가와 농업에 유용한 경작지의 감소는 농업의 효율성을 증가시키는 연구에 박차를 가하게 만들었다. 작물 및 원예농업 향상을 위한 전통적인 방식은 바람직한 특성을 갖는 식물체를 동정하기 위하여 선택적 육종기법을 이용한다. 그러나, 상기 선택적 육종기법에는 몇가지 약점이 있는데, 즉 노동집약적이며 양친으로부터 원하는 형질이 항상 전해지는 것이 아닌 이종의 유전적 요소를 갖는 식물로 귀착된다는 것이다. 분자생물학의 진보는 인간이 동물 및 식물의 생식질 (germplasm)을 변형하게 허용했다. 식물유전공학은 유전물질 (전형적으로 DNA 또는 RNA 형태)의 분리와 조작 및 이 유전물질을 식물체 내로 도입하게 했다. 상기 기술은 다양한 향상된 경제적, 농업적, 원예적 형질을 갖는 작물 또는 식물을 제공하는 능력이 있다.
특히 경제적으로 관심 있는 형질은 증가된 수확량이다. 수확량은 보통 작물로부터 경제적 가치의 측정할 수 있는 산물로 정의된다. 이는 양 및/또는 질의 면에서 정의될 수 있다. 수확량은 몇 요인에 직접적으로 의존되는데, 예를 들면 기관의 수와 크기, 식물체 형상 (예를 들면, 가지의 수), 종자 생산, 잎의 노화 등이다. 뿌리 발달, 양분 흡수, 스트레스 내성, 및 초기 활력 또한 수확량 결정에 중요한 요인일 수 있다. 상기 요인들을 최적화하는 것이 작물 수확량 향상에 기여할 수 있다.
많은 식물의 종자는 인간과 동물의 영양에 중요하므로 종자 수확량은 특히 중요한 형질이다. 옥수수, 벼, 밀, 캐놀라 및 대두와 같은 작물이 종자 자체의 직접적인 소비 또는 가공 종자로 육성된 육류 소비를 통해서 전체 인간 칼로리 흡수량의 절반 이상을 차지한다.
상기 작물들은 설탕, 오일 및 산업적 가공공정에 사용되는 많은 종류의 대사물의 재료이기도 하다. 종자는 배 (어린 줄기와 뿌리의 근원) 및 배유 (발아 동안 및 실생의 초기 생장 동안 배의 양분의 공급원)를 포함한다. 종자 발달에는 많은 유전자가 관여되며, 뿌리, 잎 및 줄기로부터 생장하는 종자로 대사물의 이동이 필요하다. 특히 배유는 탄수화물, 오일 및 단백질의 대사 전구체를 동화하여, 이들을 알곡을 채우기 위한 저장성 고분자로 합성한다.
많은 작물에 있어 또 하나의 중요한 형질은 초기 활력 (early vigour)이다. 초기 활력을 향상시키는 것은 온대 및 열대 벼 품종에 있어 현대 벼 육종 프로그램의 중요한 목표이다. 긴 뿌리는 물에 파종하는 벼에서는 적절하게 토양에 박히기 위하여 중요하다. 벼를 직접 논에 파종한 곳에서와 식물이 물 밖으로 급속히 나와야 하는 곳에서는 긴 줄기가 활력과 연관되어 있다. 조파지에서는 긴 중배축과 자엽초가 좋은 실생 출현 (seedling emergence)에 있어서 중요하다. 식물체 내로 초기 활력을 부여하는 능력은 농업에서 매우 중요하다. 예를 들면, 불충분한 초기 활력은 대서양 연안 유럽에서 옥수수 지대 생식질에 기초한 옥수수 (Zea mays L.) 교배종의 도입에 대해서 제한되어 왔다.
추가의 중요한 형질은 향상된 비생물적 스트레스 내성이다. 비생물적 스트레스는 대다수 주요 작물의 평균 수확량을 50% 이상 감소시키는 전 세계적인 작물 손실의 주요 원인이다 (Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003). 비생물적 스트레스는 건조, 염분, 극단적인 기온, 화학적 독성 및 산화적 스트레스에 의해 야기될 수 있다. 비생물적 스트레스에 대한 식물의 내성을 향상시키는 것은 전세계의 농부들에게 매우 경제적 가치가 있는 것이며, 불리한 상황에서 그리고 작물재배가 가능하지 않은 곳에서도 작물재배를 가능하게 한다.
작물 수확량은 따라서 상기 요인들 중 어느 하나를 최적화함으로써 증가시킬 수 있다.
최종 목적에 따라, 임의의 수확량 형질의 변형이 다른 것에 비해 월등히 유리할 수 있다. 예를 들면, 사료 또는 목재 생산, 또는 바이오연료 자원과 같은 적용에 대해, 식물체의 영양기관 부분의 증가가 바람직하며, 곡분, 전분 또는 유지 생산과 같은 경우에는 종자에 관련된 매개변수의 증가가 특히 바람직하다. 종자 매개변수 중에서도 용도에 따라 특정한 일부의 것이 다른 것에 비해 훨씬 중요하다. 종자 크기의 증가 또는 종자 수의 증가의 형태로 다양한 기작이 종자 수확량 증가에 영향을 미칠 수 있다.
광범위하게 연구된 가뭄-반응성 유전자들은 NAC (NAM, ATAF 및 CUC) 유전자 패밀리에 속하는 전사 조절자이다. NAC 유전자 패밀리 멤버는 식물에서만 발견되며, 대다수가 스트레스 반응에 관여한다. NAC 단백질은 고도로 보존된 N-말단, 단백질이 호모다이머 (homodimer) 또는 헤테로다이머 (heterodimer)를 형성할 수 있어서 β-판 구조를 만들 수 있는 DNA 결합 도메인 (Ernst et al., 2004; Hegedus et al., 2003; Jeong et al., 2009; Takasaki et al., 2010; Xie et al., 2000) 및 고도로 가변적인 C-말단 영역 (Zheng et al., 2009)으로 구성된다.
WO 2007/144190은 스트레스가 없는 조건 또는 순한 가뭄 조건 하에서 식물의 수확량을 증가시키는 다양한 NAC-코딩 뉴클레오티드 서열의 용도를 기술한다.
이제 NAC1 또는 NAC5 유전자/핵산의 과발현에 의해 상향 조절된 핵산의 식물에서의 발현을 조절함으로써 식물의 다양한 수확량 관련 형질이 향상될 수 있다는 것이 밝혀졌다. NAC1 또는 NAC5 유전자/핵산의 과발현에 의해 상향 조절된 핵산은 본 발명에서 NUG 또는 NAC 상향 조절 유전자 ( N AC u p-regulated g ene)로 언급된다.
또한, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에서, 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 과발현은 해당 야생형 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물체를 제공한다는 것이 밝혀졌다.
또한, 식물에서 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 과발현함으로써 식물의 비생물적 스트레스 내성이 부여될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 본 발명에서 NUG 또는 NAC 상향 조절 유전자 ( N AC u p-regulated g ene)로 언급되는, NAC1 또는 NAC5 유전자/핵산의 과발현에 의해 상향 조절된 핵산의 식물에서의 발현 조절이 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 제공한다는 것을 보여준다.
또한, 본 발명은 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에서, 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 과발현이 해당 야생형 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물체를 제공한다는 것을 보여준다.
1. NUG 또는 NAC 상향 조절 유전자
본 발명의 첫 번째 양상에 따라, NUG의 식물에서의 발현 조절 및 임의로 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물의 선발을 포함하는 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양상에 따라, 본 발명에 기술된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절 단계 및 임의로 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물의 선발을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는 증가를 위한 바람직한 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및 발현이다.
이후 "본 발명의 방법에 유용한 단백질"은 본 발명에 정의된 NUG 폴리펩티드를 의미한다. 이후 "본 발명의 방법에 유용한 핵산"은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 것이 가능한 핵산을 의미한다. 식물에 도입되는 핵산 (따라서 본 발명의 방법 수행에 유용한)은 하기에 기재될 유형의 단백질을 코딩하는 임의의 핵산이며, 이후 또한 "NUG 핵산" 또는 "NUG 유전자"라고 칭한다.
본 발명에서 정의된 "NUG 폴리펩티드"는 표 12 또는 표 15에 기재된 폴리펩티드 또는 표 12 또는 표 15에 기재된 임의의 폴리펩티드의 상동체를 의미한다.
본 발명에서 정의된 "NUG" 또는 "NUG 핵산"은 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드 또는 이의 상동체를 코딩하는 것이 가능한 임의의 유전자/핵산을 의미한다.
NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 예는 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시했으며, 상기 핵산은 본 발명의 방법 수행에 유용하다. NUG 폴리펩티드의 상동체 또한 본 발명의 방법 수행에 유용하다.
표 12는 비형질전환 대조구에 비해 RCc3:OsNAC1 및 GOS2:OsNAC1 식물체에서 상향 조절된 뿌리 발현 유전자를 나타낸다.
표 15는 비형질전환 대조구에 비해 RCc3:OsNAC5 및/또는 GOS2:OsNAC5 식물체에서 상향 조절된 유전자를 나타낸다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 특히 바람직한 NUG는 하기를 포함한다:
a) O-메틸트랜스퍼라아제, 특히 Os09g0344500, OS10g0118000, OS10g0118200.
b) AAA-유형 ATPase, 특히 OS09g0445700.
c) LRR (Leucine rich repeat), 특히 OS08g0202300.
d) DNA 결합/호메오도메인 (homeodomain), 특히 OS11g0282700.
e) 옥시도리덕타아제 (Oxidoreductase), 20G-Fe(II)옥시게나아제, OS04g0581100.
f) 칼슘 전이 ATPase, 특히 OS10g0418100.
g) 9-시스 에폭시카르티노이드 디옥시게나아제, 특히 OS07g0154100.
h) 신나모일 CoA 리덕타아제 1, 특히 OS02g0811800.
i) LLR 키나아제, 특히 OS07g0251800.
j) WRKY40, 특히 OS09g0417600.
k) Germin-유사 GLP 옥시도리덕타아제, 특히 OS03g0694000.
I) C4 디카르복실레이트 운반체, 특히 OS04g0574700.
m) 프럭토스 비스포스페이트 알돌라아제, 특히 OS08g0120600.
n) MnT, 특히 OS10g0118200.
o) OPDA (Oxo phytodienoic acid) 리덕타아제, 특히 OS06g0215900.
p) 시토크롬 p450, 특히 OS12g0150200.
NUG 폴리펩티드 또는 이의 상동체는 표 12 또는 표 15에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 전체 서열 동일성을 갖는 것으로 본 발명에서 정의된다.
표 12 및 15에 제시된 NUG 폴리펩티드의 오쏘로그 (orthologues) 및 패럴로그 (paralogues)도 용어 "상동체"에 포함되며, 용어 "오쏘로그" 및 "패럴로그"는 본 발명에 정의되어 있다. 오쏘로그 및 패럴로그는 정의 섹션에 기재된 소위 상호간 블라스트 (reciprocal blast) 탐색을 수행하여 용이하게 동정될 수 있다.
전체의 서열 동일성은 바람직하게는 디폴트 매개 변수 및 성숙 단백질 서열을 이용하여 (즉, 분비 신호 또는 수송 펩티드를 고려하지 않고), GAP 프로그램 (GCG Wisconsin Package, Accelrys)의 Needleman Wunsch 알고리즘과 같은, 전체적인 정렬 알고리즘을 이용하여 결정한다. 일 구현예에서 서열 동일성 수준은 표 12 및 표 15의 폴리펩티드 서열의 전체 길이에 걸친 폴리펩티드 서열의 비교에 의해 측정된다.
서열 동일성 수준은 또한 불확실한 NUG의 상동 패밀리 멤버에서 해당 보존된 도메인 또는 모티프와 비교하여 표 12 또는 표 15의 폴리펩티드 서열 중 하나에 존재하는 하나 이상의 보존된 도메인 또는 모티프의 비교에 의해 측정될 수 있다. 전체적인 서열 동일성에 비해, 서열 동일성은 일반적으로 보존된 도메인 또는 모티프만 고려되었을 때 더 높을 것이다. 용어 "도메인", "시그너처" 및 "모티프"는 본 발명의 "정의" 섹션에 정의되어 있다.
도메인 동정을 위한 도구는 당업계에 알려져 있고, 표 12 또는 표 15의 단백질 서열 또는 그것의 상동 서열의 단백질 서열과 함께 InterPro (Hunter et al., Nucleic Acids Res. 37 (Database Issue):D224-228, 2009)와 같은 데이터베이스로 조회하는 것을 포함한다. 또한, 예를 들면 MEME 알고리즘 (Bailey and Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994)을 이용하는 모티프의 동정이 당업계에 알려져 있다. 이를 위해, 상동 단백질 서열의 세트가 입력값 (input)으로 사용된다. MEME 모티프 내의 각 위치에서, 잔기는 0.2보다 높은 빈도로 서열의 조회 (query) 세트에 존재하는 것을 나타낸다. 대괄호 (square bracket) 안의 잔기는 대체를 나타낸다.
NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 본 발명의 상기 핵산 서열이 살아있는 식물 세포에서 전사되거나 번역될 때, 본 발명에서 기재된 것처럼 수확량 또는 수확량 관련 형질을 증가시키는 NUG의 합성을 위한 정보를 부여한다.
핵산 변이체도 본 발명의 방법 수행에 유용할 수 있다. 상기 변이체의 예는 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 상동체 및 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하며, 용어 "상동체" 및 "유도체"는 본 발명에 정의되어 있다.
본 발명의 방법에는 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그의 상동체 및 유도체를 코딩하는 핵산도 유용하다. 본 발명의 방법에 유용한 상동체 및 유도체는 상기 상동체 및 유도체가 유래된 변형되지 않은 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 및 기능적 활성을 가진다. 본 발명의 방법 수행에 유용한 추가의 변이체는 코돈 사용 빈도(codon usage)가 최적화된 또는 miRNA 표적 위치가 제거된 변이체이다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 일부, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화하는 핵산, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 스플라이스 변이체, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링에 의해 얻은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 변이체를 포함한다. 용어 혼성화하는 서열, 스플라이스 변이체, 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링은 본 발명에 기재되어 있다.
본 발명의 방법의 수행은 전체 길이 핵산 서열의 사용에 의존하지 않으므로, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 전체 길이의 핵산일 필요는 없다. 본 발명에서는, 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 일부 또는 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산의 일부를 식물에 도입 및 발현하는 것을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
핵산의 일부분은 예를 들면, 핵산에 하나 이상의 결실을 만들어서 제조될 수 있다. 그 일부분은 분리된 형태로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 몇 가지 활성을 조합한 단백질을 생산하기 위하여 다른 코딩 (또는 비코딩) 서열에 융합될 수도 있다. 다른 코딩 서열에 융합될 경우, 해독으로 생성된 결과적인 폴리펩티드는 단백질 부분에 대해 예측된 것보다 클 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 일부분은 본 발명에 정의된 NUG 폴리펩티드 또는 적어도 이의 일부를 코딩하며, 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 일부분은 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 핵산 중 임의의 하나의 일부분, 또는 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산의 일부분이다. 바람직하게는 상기 일부분은 적어도 길이 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개의 연속적인 뉴클레오티드이며, 상기 연속적인 뉴클레오티드는 표 12 또는 표 15에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나, 또는 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산일 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 감소된 스트린전시 조건 하에서, 바람직하게는 스트린전트 조건 하에서, 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 본 발명에서 정의된 일부분과 혼성화가 가능한 핵산이다. 본 발명에 따라, 표 12 또는 표 15에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산, 또는 표 12 또는 표 15에 제시된 임의의 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산과 혼성화가 가능한 핵산의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 혼성화 서열은 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 혼성화 서열에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 표 12 또는 표 15에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥에, 또는 본 발명에 정의된 일부인 임의의 이들 서열 중 일부에, 또는 표 12 또는 표 15에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그, 패럴로그를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥에 혼성화가 가능하다. 상기 혼성화 조건은 본 발명에 정의된 중간 스트린전시 조건 또는 높은 스트린전시 조건일 수 있다.
바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 적어도 혼성화 서열에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열에 존재하는 모티프 또는 보존된 영역의 일부를 포함하고/하거나, 혼성화 서열에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 혼성화 서열에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 표 12 또는 표 15에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체의 식물로의 도입 및 발현, 또는 표 12 또는 표 15에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산의 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
바람직한 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체는 적어도 비변이체 (non-variant) 서열에서 발견되는 모티프 또는 다른 보존된 영역의 일부를 포함하고/하거나, 비변이체 서열과 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 비변이체 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체에 의해 코딩된 아미노산 서열이다. 대립인자 변이체는 자연계에 존재하며, 본 발명의 방법은 상기 자연적인 대립인자의 사용을 포함한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 표 12 또는 표 15에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 변이체의 식물로의 도입 및 발현, 또는 표 12 또는 표 15에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 변이체 핵산은 유전자 셔플링으로 얻어진다.
바람직하게는, 유전자 셔플링으로 얻어진 변이체 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열은 적어도 비변이체 서열에서 발견되는 일부 모티프 또는 다른 보존된 영역을 포함하고/하거나, 비변이체 서열과 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 변이체가 유래된 비변이체 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
더욱이, 핵산 변이체는 또한 자리지정 돌연변이유발에 의해서도 얻을 수 있다. 몇 가지 방법이 자리지정 돌연변이유발을 이루는데 유용하며, 가장 흔한 것은 PCR에 근거한 방법이다 (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds). 하나 또는 몇 가지 아미노산 (본 발명에 정의된 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들))에 의한 표 12 또는 표 15의 서열과 다른 NUG 폴리펩티드는 본 발명의 방법 및 유전자 구축물 및 식물에서 식물의 수확량을 증가시키는데 동등하게 유용할 수 있다.
NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 임의의 자연적 또는 인공적인 출처로부터 유래될 수 있다. 상기 핵산은 고의적인 인간의 조작을 통해 조성 및/또는 게놈 환경에 있어서 그것의 자연 형태로부터 변형될 수 있다.
바람직하게는 상기 NUG 폴리펩티드 코딩 핵산은 식물 유래, 더 바람직하게는 단자엽 식물 유래, 더욱 바람직하게는 벼과 (family Poaceae) 유래, 가장 바람직하게는 상기 핵산은 벼 (Oryza sativa) 유래이다.
본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 핵산 서열을 포함하는 재조합 염색체 DNA의 사용에도 확장되며, 상기 핵산은 재조합 방법의 결과 염색체 DNA에 존재하나, 이의 천연 유전적 환경에서는 존재하지 않는다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 재조합 염색체 DNA는 식물 세포에 포함된다.
본 발명의 방법 수행은 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물체를 제공한다. 본 발명의 특정한 구현예에서, 본 발명의 방법 수행은 대조구 식물에 비해 증가된 초기 활력 및/또는 증가된 수확량 및/또는 증가된 생물량 및/또는 증가된 종자 수확량을 갖는 식물체를 제공한다. 용어 "초기 활력", "생물량", "수확량" 및 "종자 수확량"은 본 발명의 "정의" 섹션에 더 상세하게 기재되어 있다.
따라서 본 발명은 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비해 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 본 발명의 방법 수행은 대조구 식물에 비해 증가된 생장 속도를 갖는 식물체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 식물의 생장 속도를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 스트레스가 없는 조건 또는 순한 가뭄 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 스트레스가 없는 조건 또는 순한 가뭄 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 가뭄 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라, 가뭄 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 양분 결핍 조건 하에서, 특히 질소 결핍 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라, 양분 결핍 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 염분 스트레스 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라, 염분 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및/또는 발현을 용이하게 하는 유전자 구축물 및 벡터를 제공한다. 상기 유전자 구축물은 상업적으로 유용하고, 식물 또는 숙주 세포의 형질전환에 적절하며, 형질전환된 세포에서 목적 유전자의 발현에 적절한 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 있어 본 발명에서 정의된 유전자 구축물의 용도를 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 구축물을 제공한다:
(a) 상기 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
(b) (a)의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(c) 전사 종결 서열.
바람직하게는, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 상기에 정의된 바와 같다. 용어 "조절 서열" 및 "종결 서열"은 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 유전자 구축물은 숙주 세포, 식물 세포, 종자, 농산물 또는 식물체에 포함될 수 있다. 식물체 또는 숙주 세포는 상기 기재된 임의의 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 발현 카세트와 같은 유전자 구축물로 형질전환된다. 따라서 본 발명은 상기 기재된 구축물로 형질전환된 식물체 또는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 기재된 구축물로 형질전환된 식물체를 제공하며, 상기 식물체는 본 발명에 기재된 증가된 수확량 관련 형질을 갖는다.
일 구현예에서 본 발명의 유전자 구축물은 상기 식물체에 도입되었을 때, 식물체에 증가된 수확량 또는 수확량 관련 형질(들)을 부여하며, 상기 식물체는 유전자 구축물에 포함된 NUG 코딩 핵산을 발현한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 구축물은 유전자 구축물이 도입된 식물 세포를 포함하는 식물체에 증가된 수확량 또는 수확량 관련 형질(들)을 부여하며, 상기 식물 세포는 유전자 구축물에 포함된 NUG 코딩 핵산을 발현한다.
당업자는 목적 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선발 및 증식시키기 위하여 유전자 구축물에 존재해야 하는 유전적 요소를 주지하고 있다. 목적 서열은 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.
유리하게, 자연적이든 인공적이든 임의의 유형의 프로모터가 핵산 서열의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있으나, 바람직하게는 프로모터는 식물 유래이다. 항시성 (constitutive) 프로모터가 본 발명의 방법에 특히 유용하다. 본 발명의 "정의" 섹션에서 다양한 프로모터 유형의 정의에 대해 참고한다.
항시성 프로모터는 바람직하게는 중간 강도의 편재하는 (ubiquitous) 항시성 프로모터이다. 더 바람직하게는 상기 항시성 프로모터는 식물 유래 프로모터, 예를 들면 GOS2 프로모터와 같은 식물 염색체 유래의 프로모터 또는 실질적으로 동일한 강도 및 실질적으로 동일한 발현 양상 (기능적으로 동등한 프로모터)을 갖는 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터이다. 본 발명의 "정의" 섹션에서 항시성 프로모터의 추가의 예에 대해 참고한다.
선택적으로, 하나 이상의 종결 서열이 식물에 도입된 구축물에 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명을 수행하는데 사용하기 적절한 종결 서열을 주지하고 있다. 바람직하게는, 상기 구축물은 NUG 폴리펩티드 코딩 핵산에 작동 가능하게 연결된 항시성 프로모터 (GOS2와 같은)를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 상기 구축물은 NUG 코딩 서열의 3' 말단에 연결된 종결 서열 (zein 종결 서열과 같은)을 추가로 포함할 수 있다. 게다가, 선발 마커를 코딩하는 하나 이상의 서열이 식물에 도입된 구축물에 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 조절된 발현은 증가된 발현이다. 핵산 또는 유전자, 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문서화되어 있으며, 정의 섹션에 예가 제시되어 있다.
상기에 언급된 바와 같이, NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 바람직한 방법은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및 발현이다; 그러나 상기 방법의 수행 효과 즉, 수확량 관련 형질을 향상시키는 효과는 T-DNA 활성화 태깅, 틸링 (TILLING), 상동 재조합을 포함하여 다른 잘 알려진 기술을 사용하여 행해질 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술의 설명은 정의 섹션에서 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물체를 생산하는 방법을 제공한다.
더욱 상세하게, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물체를 생산하는 방법을 제공한다:
(i) NUG 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 NUG 폴리펩티드-코딩 핵산을 포함하는 유전자 구축물을 식물 또는 식물 세포로 도입 및 발현하는 단계; 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 단계.
상기 (i)의 핵산은 본 발명에서 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 임의의 핵산일 수 있다.
식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 식물 세포의 배양은 재분화 및/또는 성숙기까지의 생장을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 형질전환된 식물 세포는 형질전환 식물체로 재분화될 수 있다. 또 다른 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 형질전환된 식물 세포는 형질전환 식물체로 재분화되지 않을 수 있으며, 즉 세포를 당업계에 알려진 세포 배양 기술을 사용하여 식물체로 재분화하는 것이 불가능할 수 있다. 식물 세포는 일반적으로 전체 형성능 특성을 갖는 반면에, 일부 식물 세포는 상기 세포로부터 온전한 식물체로 재분화 또는 증식하는데 사용될 수 없다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 상기 세포이다. 또 다른 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 독립영양 방법으로 그들 자신을 유지할 수 없는 식물 세포이다.
상기 핵산은 식물 세포로 또는 식물체 자체 (조직, 기관 또는 식물체의 임의의 다른 부분으로의 도입 포함)로 직접적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 핵산은 바람직하게는 형질전환에 의해 식물체 또는 식물 세포로 도입될 수 있다. 용어 "형질전환"은 본 발명의 "정의" 섹션에 더 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서 본 발명은 본 발명에 기재된 임의의 방법으로 생산된 임의의 식물 세포 또는 식물체 및 모든 식물체 부분 및 그의 번식체로 확장된다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 식물 또는 그의 부분 (종자 포함)을 포함한다. 식물 또는 그의 일부 또는 식물 세포는 상기에 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 외래유전자 (transgene)를 포함하며, 바람직하게는 발현 카세트와 같은 유전자 구축물을 포함한다. 본 발명은 앞서 언급한 임의의 방법으로 생산된 일차 형질전환된 또는 감염된 세포, 조직, 기관 또는 전체 식물의 자손을 포함하기 위해 더 확장될 수 있으며, 자손이 본 발명에 따른 방법으로 양친이 생산한 것과 동일한 유전형적 및/또는 표현형적 특징(들)을 나타내는 것만이 요구된다.
추가의 구현예에서 본 발명은 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 유전자 구축물, 또는 상기 기재된 NUG 코딩 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 종자로 확장된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 식물 세포, 효모, 박테리아 또는 곰팡이이다. 본 발명에 따른 방법에 사용된 핵산, 유전자 구축물, 발현 카세트 또는 벡터에 대한 숙주 식물은 원칙적으로 유리하게 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능한 모든 식물이다. 특정한 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 본 발명의 핵산 분자를 과발현한다.
본 발명의 방법은 유리하게 임의의 식물에, 특히 본 발명에 정의된 임의의 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 비리디플란태 (Viridiplantae) 수퍼패밀리에 속하는 모든 식물, 특히 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 본 발명의 구현예에 있어서, 식물은 작물이다. 작물 식물의 예는 치커리, 당근, 카사바, 토끼풀 (trefoil), 대두, 비트 (beet), 사탕무, 해바라기, 캐놀라, 알팔파, 유채, 아마, 목화, 토마토, 감자 및 담배를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물이다. 단자엽 식물의 예는 사탕수수를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 식물은 곡물이다. 곡물의 예는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호맥 (rye), 라이밀 (triticale), 수수 (sorghum), 에머밀 (emmer), 스펠트밀 (spelt), 외알밀 (소맥, einkorn), 테프 (teff), 마일로 (milo) 및 귀리를 포함한다. 특정한 구현예에서 본 발명의 방법에 사용된 식물체는 옥수수, 밀, 벼, 대두, 목화, 캐놀라를 포함하는 평지 (oilseed rape), 사탕수수, 사탕무 및 알팔파로 이루어진 군에서 선택된다. 유리하게 본 발명의 방법은 본 발명의 식물체가 동등한 방법에 사용된 대조구 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 환경 스트레스에 대한 내성을 갖기 때문에 알려진 방법보다 더 효율적이다.
본 발명은 또한 종자, 잎, 열매, 꽃, 줄기, 뿌리, 지하경, 괴경 및 인경과 같은 식물의 수확가능한 부분까지 확장되나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 수확 가능한 부분은 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 본 발명은 더욱이 건조 펠렛, 가루 또는 분말, 오일, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질 같은 상기 식물의 수확 가능한 부분으로부터 유래된 또는 생산된, 바람직하게는 직접적으로 유래된 또는 생산된 생산물에 관련된다.
본 발명은 또한 a) 본 발명의 식물체의 성장 단계 및 b) 본 발명의 식물체 또는 종자를 포함하는 그의 일부로부터 또는 식물체 또는 종자를 포함하는 그의 일부에 의한 상기 산물의 생산 단계를 포함하는 산물의 제조 방법을 포함한다. 추가의 구현예에서 상기 방법은 a) 본 발명의 식물체의 성장 단계, b) 식물체로부터 본 발명에 기재된 수확 가능한 부분의 제거 단계 및 c) 본 발명에 따른 식물체의 수확 가능한 부분으로부터, 또는 식물체의 수확 가능한 부분과 함께 상기 산물을 생산하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 본 발명의 방법으로 생산된 산물은 식료품, 사료, 식품 첨가물, 사료 첨가물, 섬유질, 화장품 또는 의약품과 같은 식물 제품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서 생산을 위한 방법은 식물 추출물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지방, 오일, 폴리머, 비타민 등과 같은 농산물을 제조하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 농산물에 포함된다. 특정한 구현예에서 본 발명의 핵산 서열 및 단백질 서열은 예를 들면, 농산물이 본 발명의 방법으로 생산된 경우 생산 마커로 사용될 수 있다. 상기 마커는 과정의 더 높은 효율성뿐만 아니라, 과정에 사용된 식물 원료 및 수확 가능한 부분의 향상된 질 때문에 산물의 질을 향상시키는 유리한 과정에 의해 생산된 산물을 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 마커는 당업계에 알려진 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 핵산 검출을 위한 PCR에 근거한 방법 또는 단백질 검출을 위한 항체에 근거한 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 용도 및 식물에서 앞서 언급한 임의의 수확량 관련 형질을 향상시키는 상기 NUG 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 기재된 NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 NUG 폴리펩티드 그 자체는 NUG 폴리펩티드 코딩 유전자에 유전적으로 연결될 수 있는 마커가 동정된 육종 프로그램에서 용도를 찾을 수 있다. 상기 핵산/유전자, 또는 NUG 폴리펩티드 그 자체는 분자 마커를 정의하는데 사용될 수 있다. 이 DNA 또는 단백질 마커는 본 발명의 방법에 정의된 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 선발하는 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 게다가, NUG 폴리펩티드 코딩 핵산/유전자의 대립인자 변이체는 마커 보조 육종 프로그램에서 용도를 찾을 수 있다. NUG 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 이 유전자의 일부에 대한 유전자지도 및 물리지도 제작용 탐침으로서 및 그 유전자에 연관된 형질에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 정보는 원하는 표현형을 갖는 라인 개발을 위한 식물 육종에 유용할 것이다.
2. NAC1 NAC5
본 발명의 두 번째 양상에 따라, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
특정한 구현예에서, 식물이 비생물적 스트레스 조건 하에서 자랄 경우, NAC1 또는 NAC5 코딩 핵산의 발현은 조직 특이적 프로모터에 의해, 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
추가의 구현예에서, 향상된 수확량 관련 형질은 증가된 종자 수확량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 포함한다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, 비생물적 스트레스 하에서 자란 식물에서의 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 조절 단계 및 임의로 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물의 선발을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 양상에 따라, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함하는 식물에 비생물적 스트레스 내성을 부여하는 방법을 제공한다.
NAC1 또는 NAC5에 관하여 본 발명의 명세서에서, "본 발명의 방법에 유용한 단백질"은 본 발명에 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 의미한다. 이후 "본 발명의 방법에 유용한 핵산"은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 것이 가능한 핵산을 의미한다. 식물에 도입되는 핵산 (따라서 본 발명의 방법 수행에 유용한)은 하기에 기재될 유형의 단백질을 코딩하는 임의의 핵산이며, 이후 또한 "NAC1 핵산" 또는 "NAC1 유전자" 또는 "NAC5 핵산" 또는 "NAC5 유전자"라고 칭한다.
본 발명에 정의된 "NAC1 폴리펩티드" 또는 "NAC5 폴리펩티드"는 하기에 기재된 모티프의 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명에 정의된 "NAC1 유전자" 또는 "NAC5 유전자"는 본 발명에 정의된 NAC1 폴리펩티드 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산을 의미한다.
모티프 I: KIDLDIIQELD, 또는 모티프 I의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 I은 바람직하게는 K/P/R/G l/S/M D/A/E/Q L/l/V D l/V/F I Q/V/R/K E/D L/l/V D 이다.
모티프 II: CKYGXGHGGDEQTEW, 또는 모티프 II의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프이며, 'X'는 임의의 아미노산으로 간주된다.
모티프 II는 바람직하게는 C K/R Y/L/l G XXX G/Y/N D/E E Q/R T/N/S EW 이며, 'X'는 임의의 아미노산이다.
모티프 III: GWVVCRAFQKP, 또는 모티프 III의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 III는 바람직하게는 GWVVCR A/V F X1 K X2 이고, 'X1' 및 'X2'는 임의의 아미노산일 수 있으며, 바람직하게는 X1은 Q/R/K, X2는 P/R/K 이다.
모티프 IV: PVPIIA, 또는 모티프 IV의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 IV는 바람직하게는 A/P/S/N V/L/l/A P/S/D/V/Q V/l I A/T/G 이다.
모티프 V: NGSRPN, 또는 모티프 V의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 V는 바람직하게는 N G/S S/Q/A/V RP N/S 이다.
모티프 VI: CRLYNKK, 또는 모티프 VI의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 VI는 바람직하게는 C/Y R/K L/l Y/H/F N/K K K/N/C/S/T 이다.
모티프 VII: NEWEKMQ, 또는 모티프 VII의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 VII는 바람직하게는 N E/Q/T WEK M/V Q/R/K 이다.
모티프 VIII: WGETRTPESE, 또는 모티프 VIII의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 VIII는 바람직하게는 WGE T/A RTPES E/D 이다.
모티프 IX: VPKKESMDDA, 또는 모티프 IX의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 IX는 바람직하게는 V/L PK K/E E S/R/A/V M/V/A/Q/R D/E D/E/L A/G/D 이다.
모티프 X: SYDDIQGMYS, 또는 모티프 X의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 X는 바람직하게는 S L/Y DD L/l Q G/S L/M/P G/Y S/N 이다.
모티프 XI: DSMPRLHADSSCSE, 또는 모티프 XI의 서열에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 모티프.
모티프 XI은 바람직하게는 DS M/V/l P R/K L/l/A H T/A/S D/E SS C/G SE 이다.
모티프 I 내지 XI의 각각은 임의의 위치에서 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드는 상기 정의된 모티프의 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 적어도 11개를 포함할 수 있다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드에 존재하는 추가의 모티프는 MEME 알고리즘 (Bailey and Elkan , Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994) 또는 당업계에 알려진 다른 방법 또는 도구를 사용하여 동정될 수 있다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 (바람직하게는, 증가시키는) 바람직한 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및 발현이다.
본 발명의 하나의 양상에 따라, 본 발명에서 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비해 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법을 제공한다.
부가적으로 또는 대안적으로, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드는 상동 단백질이 상기에 기술된 보존된 모티프의 임의의 하나 이상을 포함한다면, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시된 아미노산 서열에 대해, 증가하는 순으로 선호되는 적어도 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 전체 서열 동일성을 갖는다. 특정한 구현예에서 NAC1 폴리펩티드는 서열번호 2로 표시된다. 특정한 구현예에서 NAC5 폴리펩티드는 서열번호 4로 표시된다.
전체의 서열 동일성은 바람직하게는 디폴트 매개 변수 및 성숙 단백질 서열을 이용하여 (즉, 분비 신호 또는 수송 펩티드를 고려하지 않고), GAP 프로그램 (GCG Wisconsin Package, Accelrys)의 Needleman Wunsch 알고리즘과 같은, 전체적인 정렬 알고리즘을 이용하여 결정한다. 일 구현예에서 서열 동일성 수준은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열의 전체 길이에 걸친 폴리펩티드 서열의 비교에 의해 측정된다.
다른 구현예에서, 서열 동일성 수준은 다른 NAC1 및 NAC5 폴리펩티드의 해당 보존된 도메인 또는 모티프와 서열번호 2 또는 서열번호 4의 하나 이상의 보존된 도메인 또는 모티프의 비교에 의해 측정된다. 전체적인 서열 동일성에 비해, 서열 동일성은 일반적으로 보존된 도메인 또는 모티프만 고려되었을 때 더 높을 것이다. 바람직하게는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드의 모티프는 서열번호 5 내지 서열번호 15 (모티프 I 내지 XI)로 표시된 모티프의 임의의 하나 이상에 대해 증가하는 순으로 선호되는 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 용어 "도메인", "시그너처" 및 "모티프"는 본 발명의 "정의" 섹션에 정의되어 있다.
바람직하게는, Ooka 등 (DNA Research 10, 239-247, 2003)에 제시된 것과 같은 계통수의 구축에 이용될 때, 상기 폴리펩티드 서열은 임의의 다른 NAC보다 다른 NAC1 또는 NAC5 패밀리 멤버와 함께 클러스터링된다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본 발명의 실시예 섹션에 기술된 본 발명의 방법에 따라 벼에서 발현될 때, 생물학적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에 향상된 수확량 관련 형질, 특히 증가된 종자 수확량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 제공한다. NAC1 및 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 다른 기능은 본 발명의 상기 핵산 서열이 살아있는 식물 세포에서 전사 및 번역될 때, 본 발명에 기재된 수확량 또는 수확량 관련 형질을 증가시키는 NAC1 및 NAC5의 합성을 위한 정보를 부여하는 것이다.
본 발명은 서열번호 2의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 서열번호 1로 표시된 핵산 서열 및 서열번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 3으로 표시된 핵산 서열로 식물체를 형질전환함으로써 예시된다. 그러나, 본 발명의 수행은 상기 서열에 제한되지 않으며; 본 발명의 방법은 본 발명에 정의된 임의의 NAC1 코딩 또는 NAC5 코딩 핵산 또는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 사용하여 유리하게 수행될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "NAC1" 또는 "NAC1 폴리펩티드"는 하기에 정의된 서열번호 2의 상동체도 포함한다. 본 발명에 사용된 용어 "NAC5" 또는 "NAC5 폴리펩티드"는 하기에 정의된 서열번호 4의 상동체도 포함한다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 예는 본 발명의 표 16에 제시하였다. 상기 핵산은 본 발명의 방법 수행에 유용하다. 실시예 섹션의 표 16에 제시된 아미노산 서열이 각각 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시된 NAC1 및 NAC5 폴리펩티드의 오쏘로그 및 패럴로그 서열의 예이며, 용어 "오쏘로그" 및 "패럴로그"는 본 발명에 정의되어 있다. 추가의 오쏘로그 및 패럴로그는 정의 섹션에 기재된 소위 상호간 블라스트 (reciprocal blast) 탐색을 수행하면 용이하게 동정될 수 있으며; 조회 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에서, 두 번째 BLAST (back-BLAST)는 벼 서열과 대조하는 것이다.
핵산 변이체도 본 발명의 방법의 수행에 유용할 수 있다. 상기 핵산 변이체의 예는 본 발명의 표 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 상동체 및 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하며, 용어 "상동체" 및 "유도체"는 본 발명에 정의되어 있다. 본 발명의 방법에는 실시예 섹션의 표 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그의 상동체 및 유도체를 코딩하는 핵산도 유용하다. 본 발명의 방법에 유용한 상동체 및 유도체는 상기 상동체 및 유도체가 유래된 변형되지 않은 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 및 기능적 활성을 가진다. 본 발명의 방법 수행에 유용한 추가의 변이체는 코돈 사용 빈도가 최적화된 또는 miRNA 표적 위치가 제거된 변이체이다.
본 발명의 방법 수행에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 NAC1 및 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 일부, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화하는 핵산, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 스플라이스 변이체, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링에 의해 얻은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 변이체를 포함한다. 용어 혼성화하는 서열, 스플라이스 변이체, 대립인자 변이체 및 유전자 셔플링은 본 발명에 기재되어 있다.
본 발명의 방법의 수행은 전체 길이 핵산 서열의 사용에 의존하지 않으므로, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 전체 길이의 핵산일 필요는 없다. 본 발명에서는, 본 발명의 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산 서열의 일부 또는 표 16에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산의 일부를 식물에 도입 및 발현하는 것을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
핵산의 일부분은 예를 들면, 핵산에 하나 이상의 결실을 만들어서 제조될 수 있다. 그 일부분은 분리된 형태로 사용될 수 있거나, 또는 예를 들면, 몇 가지 활성을 조합한 단백질을 생산하기 위하여 다른 코딩 (또는 비코딩) 서열에 융합될 수도 있다. 다른 코딩 서열에 융합될 경우, 해독으로 생성된 결과적인 폴리펩티드는 단백질 부분에 대해 예측된 것보다 클 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 일부분은 본 발명에 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 적어도 그의 일부분을 코딩하며, 본 발명의 표 16에 제시된 아미노산 서열 및 상기 일부분이 유래된 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 일부분은 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 일부분 또는 표 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산의 일부분이다. 바람직하게는 상기 일부분은 적어도 길이 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개의 연속적인 뉴클레오티드이며, 상기 연속적인 뉴클레오티드는 본 발명의 표 16에 제시된 핵산 서열 중 임의의 하나, 또는 표 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 일부분은 서열번호 2 또는 서열번호 4를 코딩하는 핵산의 일부분이다. 바람직하게는, 상기 일부분은 모티프 I 내지 XI (서열번호 5 내지 서열번호 15)의 하나 이상을 포함하고/하거나, NAC1 또는 NAC5와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단편을 코딩한다.
본 발명의 방법에 유용한 또 다른 핵산 변이체는 감소된 또는 중간 스트린전시 조건 하에서, 바람직하게는 스트린전트 조건 하에서, 본 발명에서 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥, 또는 본 발명에서 정의된 일부분과 혼성화가 가능한 핵산이다. 본 발명에 따라, 본 발명의 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산 또는 표 16에 제시된 임의의 핵산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산에 혼성화가 가능한 핵산의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 혼성화 서열은 본 발명에서 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하며, 상기 혼성화 서열에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 표 16에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 가진다. 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 본 발명의 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥에, 또는 본 발명에 정의된 일부분인 임의의 이들 서열 중 일부분에, 또는 표 16에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥에 혼성화가 가능하다. 가장 바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상보적인 가닥 또는 양쪽의 일부분에 혼성화가 가능하다. 일 구현예에서, 상기 혼성화 조건은 본 발명에 정의된 중간 스트린전시, 바람직하게는 높은 스트린전시이다.
바람직하게는, 상기 혼성화 서열은 모티프 I 내지 XI (서열번호 5 내지 서열번호 15)의 하나 이상을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고/하거나, NAC1 또는 NAC5와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 임의의 하나의 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체, 또는 본 발명의 표 16에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산의 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
바람직한 스플라이스 또는 대립인자 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 4를 코딩하는 핵산의 스플라이스 또는 대립인자 변이체, 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산의 스플라이스 또는 대립인자 변이체이다. 바람직하게는, 스플라이스 변이체 또는 대립인자 변이체에 의해 코딩된 아미노산 서열은 모티프 I 내지 XI (서열번호 5 내지 서열번호 15)의 하나 이상을 포함하고/하거나, NAC1 또는 NAC5와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 추가의 구현예에 따라, 본 발명의 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산의 대립인자 변이체 또는 스플라이스 변이체의 식물로의 도입 및 발현, 또는 본 발명의 표 16에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산의 대립인자 변이체 또는 스플라이스 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 대립인자 변이체 또는 스플라이스 변이체에 의해 코딩된 폴리펩티드는 서열번호 2의 NAC1 폴리펩티드 또는 서열번호 5의 NAC5 폴리펩티드 또는 본 발명의 표 16에 도시된 임의의 아미노산과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는다. 대립인자 변이체는 자연계에 존재하며, 본 발명의 방법은 상기의 자연적인 대립인자의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 대립인자 변이체 또는 스플라이스 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 4를 코딩하는 핵산의 변이체 또는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 오쏘로그 또는 패럴로그를 코딩하는 핵산의 변이체이다. 바람직하게는, 상기 대립인자 변이체 또는 스플라이스 변이체에 의해 코딩된 아미노산 서열은 모티프 I 내지 XI (서열번호 5 내지 서열번호 15)의 하나 이상을 포함하고/하거나, NAC1 또는 NAC5와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 표 16에 제시된 단백질 중 임의의 하나를 코딩하는 핵산 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 또는 표 16에 제시된 임의의 아미노산 서열의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산 변이체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 변이체 핵산은 유전자 셔플링으로 얻어진다.
바람직하게는, 유전자 셔플링으로 얻어진 변이체 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열은 모티프 I 내지 XI (서열번호 5 내지 서열번호 15)의 하나 이상을 포함하고/하거나, NAC1 또는 NAC5와 동일한 생물학적 활성을 갖고/갖거나, 서열번호 2 또는 서열번호 4에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는다.
더욱이, 핵산 변이체는 또한 자리지정 돌연변이유발에 의해서도 얻을 수 있다. 몇 가지 방법이 자리지정 돌연변이를 유발하는데 유용하며, 가장 흔한 것은 PCR에 근거한 방법이다 (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds). 하나 또는 몇 가지 아미노산 (본 발명에 정의된 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들))에 의한 서열번호 2 또는 서열번호 4의 서열과 다른 NCG 폴리펩티드는 본 발명의 방법 및 유전자 구축물 및 식물에서 식물의 수확량을 증가시키는데 동등하게 유용할 수 있다.
NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 임의의 자연적 또는 인공적인 출처로부터 유래될 수 있다. 상기 핵산은 고의적인 인간의 조작을 통해 조성 및/또는 게놈 환경에 있어서 그것의 자연 형태로부터 변형될 수 있다. 바람직하게는 상기 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 식물 유래, 더 바람직하게는 단자엽 식물 유래, 더욱 바람직하게는 벼과 (family Poaceae) 유래, 가장 바람직하게는 상기 핵산은 벼 (Oryza sativa) 유래이다.
또 다른 구현예에서 본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 핵산 서열을 포함하는 재조합 염색체 DNA에도 확장되며, 상기 핵산은 재조합 방법의 결과 염색체 DNA에 존재하나, 이의 천연 유전적 환경에서는 존재하지 않는다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 재조합 염색체 DNA는 식물 세포에 포함된다.
본 발명의 방법 수행은 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물체를 제공한다. 특히, 본 발명의 방법 수행은 증가된 종자 또는 곡물 수확량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물체를 제공한다. 용어 "종자 수확량"은 본 발명의 "정의" 섹션에 더 상세하게 기재되어 있다. 본 발명에 정의된 용어 "변형된 뿌리 형태"는 바람직하게는 하기의 임의의 하나 이상의 증가 또는 변화를 포함하거나, 하기의 임의의 하나 이상의 증가 또는 변화 때문이다: 생체 중량 또는 건조 중량 형태의 뿌리 생물량의 증가, 증가된 뿌리의 수, 증가된 뿌리 직경, 확대된 뿌리, 확대된 중심주 (stele), 확대된 통기 조직 (aerenchyma), 증가된 통기 조직 형성, 확대된 수피 (cortex), 확대된 수피 (cortical) 세포, 확대된 목질부, 변형된 분지, 향상된 침투 (penetration) 능력, 확대된 외피 (epidermis), 줄기에 대한 뿌리 비율의 증가.
따라서 본 발명은 대조구 식물에 비하여 종자 수확량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 대조구 식물에 비하여 식물의 비생물적 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 본 발명의 방법 수행은 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에 대조구 식물에 비하여 증가된 생장 속도를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 식물의 생장 속도를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 비생물적 스트레스 조건 하에서 자란 식물에서의 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 그들의 영양 생장 (vegetative growth) 단계 동안, 스트레스가 없는 조건 또는 순한 가뭄 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 그들의 식물 생장 단계 동안 및 스트레스가 없는 조건 또는 순한 가뭄 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상기 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 가뭄 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 가뭄 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터의 조절 하에서 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
항시성 프로모터 및 뿌리 특이적 프로모터의 조절하에서 발현될 때, 정상 또는 스트레스가 없는 생장 조건 하에서 NAC1 코딩 핵산 서열을 발현하는 벼 식물체는 증가된 종자 수확량을 제공한다. 비교하면, 종자 또는 곡물 수확량의 현저하게 증가된 수준은 뿌리 특이적 프로모터의 조절 하에서 NAC1 코딩 핵산을 발현하는 식물에서 가뭄 조건 하에서 얻어졌다. 반면에, 형질전환되지 않은 대조구와 비교하여 가뭄 스트레스 하에서 자란 식물 및 항시성 프로모터의 조절 하에서 NAC1 코딩 핵산 서열을 발현하는 식물의 종자 또는 곡물 수확량의 두드러진 차이는 없었다.
NAC5의 경우에, 뿌리 특이적 프로모터의 조절 하에서 NAC5 코딩 핵산을 발현하는 식물체 및 항시성 프로모터의 조절 하에서 NAC5 코딩 핵산을 발현하는 식물체는 영양 생장 단계 동안 가뭄 및 고염에 대해 증가된 내성을 나타낸다. 정상, 스트레스가 없는 생장 조건 하에서, 이들 식물체는 증가된 종자 또는 곡물 수확량을 나타낸다. 그러나, 가뭄 스트레스 조건 하에서, 뿌리 특이적 프로모터의 조절 하에서 NAC5를 발현하는 식물체는 현저하게 증가된 종자 또는 곡물 수확량을 나타내는 반면에, 항시성 프로모터의 조절 하에서 NAC5를 발현하는 식물체는 형질전환되지 않은 대조구 식물에 비해 유사한 또는 감소된 수확량을 나타낸다.
본 발명의 방법 수행은 양분 결핍 조건 하에서, 특히 질소 결핍 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라 양분 결핍 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명의 방법 수행은 염분 스트레스 조건 하에서 자란 식물에 동등한 조건 하에서 자란 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 제공한다. 따라서, 본 발명에 따라, 염분 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물에서의 발현 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및/또는 발현을 용이하게 하는 유전자 구축물 및 벡터를 제공한다. 상기 유전자 구축물은 상업적으로 유용하고, 식물 또는 숙주 세포의 형질전환에 적절하며, 형질전환된 세포에서 목적 유전자의 발현에 적절한 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 있어 본 발명에서 정의된 유전자 구축물의 용도를 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 구축물을 제공한다:
(a) 상기 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
(b) (a)의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(c) 전사 종결 서열.
바람직하게는, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 상기에 정의된 바와 같다. 용어 "조절 서열" 및 "종결 서열"은 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 유전자 구축물은 숙주 세포, 식물 세포, 종자, 농산물 또는 식물체에 포함될 수 있다. 식물체 또는 숙주 세포는 상기 기재된 임의의 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 발현 카세트와 같은 유전자 구축물로 형질전환된다. 따라서 본 발명은 또한 상기 기재된 구축물로 형질전환된 식물체 또는 숙주 세포를 제공한다. 특히, 본 발명은 상기 기재된 구축물로 형질전환된 식물체를 제공하며, 상기 식물체는 본 발명에 기재된 증가된 수확량 관련 형질을 갖는다.
일 구현예에서 본 발명의 유전자 구축물은 상기 식물체에 도입되었을 때, 식물체에 증가된 수확량 또는 수확량 관련 형질(들)을 부여하며, 상기 식물체는 유전자 구축물에 포함된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산을 발현한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 구축물은 유전자 구축물이 도입된 식물 세포를 포함하는 식물체에 증가된 수확량 또는 수확량 관련 형질(들)을 부여하며, 상기 식물 세포는 유전자 구축물에 포함된 NAC1 또는 NAC5 코딩 핵산을 발현한다.
당업자는 목적 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선발 및 증식시키기 위하여 유전자 구축물에 존재해야 하는 유전적 요소를 주지하고 있다. 목적 서열은 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.
유리하게, 자연적이든 인공적이든 임의의 유형의 프로모터가 식물의 영양 생장 단계 동안 핵산 서열의 발현을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는 프로모터는 식물 유래이다. 본 발명의 "정의" 섹션에서 다양한 프로모터 유형의 정의에 대해 참고한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 특히 바람직한 프로모터는 뿌리 특이적 프로모터이다. 상기 뿌리 특이적 프로모터는 바람직하게는 RCc3 프로모터 (Plant Mol Biol. 1995 Jan;27(2):237-48) 또는 실질적으로 동일한 강도 및 실질적으로 동일한 발현 양상 (기능적으로 동등한 프로모터)을 갖는 프로모터이며, 더 바람직하게는 상기 RCc3 프로모터는 벼 유래이며, 더욱 바람직하게는 상기 RCc3 프로모터는 서열번호 21에 대해 실질적으로 유사한 핵산 서열로 표시되며, 가장 바람직하게는 상기 프로모터는 서열번호 21로 표시된다. 또한 본 발명의 방법 수행에 사용될 수 있는 다른 뿌리 특이적 프로모터의 예는 "정의" 섹션의 표 3에 제시하였다.
항시성 프로모터는 또한 스트레스 또는 스트레스가 없는 조건 하에서 자란 식물에, 특히 식물의 영양 생장 단계 동안 사용될 수 있다. 항시성 프로모터는 또한 실질적으로 스트레스가 없는 조건 하에서 자라고, NAC1 또는 NAC5 코딩 핵산을 발현하는 식물에서 사용될 수 있다. 상기 항시성 프로모터는 바람직하게는 중간 강도의 편재하는 (ubiquitous) 항시성 프로모터이다. 더 바람직하게는 상기 항시성 프로모터는 식물 유래 프로모터, 예를 들면 GOS2 프로모터와 같은 식물 염색체 기원의 프로모터 또는 실질적으로 동일한 강도 및 실질적으로 동일한 발현 양상 (기능적으로 동등한 프로모터)을 갖는 프로모터이며, 더 바람직하게는 상기 프로모터는 벼 유래의 GOS2 프로모터이다. 더욱 바람직하게는 상기 항시성 프로모터는 서열번호 20에 대해 실질적으로 유사한 핵산 서열로 표시되며, 가장 바람직하게는 상기 항시성 프로모터는 서열번호 20으로 표시된다. 본 발명의 "정의" 섹션에서 항시성 프로모터의 추가의 예에 대해 참고한다.
본 발명의 적용은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산에 제한되지 않으며, 본 발명의 적용은 식물에서 NAC1 또는 NAC5의 발현을 유도하기 위한 벼 GOS2 또는 RCc3 프로모터에 제한되지 않는다는 것은 명백하다.
선택적으로, 하나 이상의 종결 서열이 식물에 도입된 구축물에 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명을 수행하는데 사용하기 적절한 종결 서열을 주지하고 있다.
바람직하게는, 상기 구축물은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산에 작동 가능하게 연결된 RCc3 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 구축물은 NAC1 또는 NAC5 코딩 서열의 3' 말단에 연결된 zein-종결 서열 (t-zein) 또한 포함한다. 게다가, 선발 마커를 코딩하는 하나 이상의 서열이 식물에 도입된 구축물에 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 특징에 따라, 조절된 발현은 증가된 발현이다. 핵산 또는 유전자, 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문서화되어 있으며, 정의 섹션에 예가 제시되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 바람직한 방법은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 식물로의 도입 및 발현이다; 그러나 상기 방법의 수행 효과 즉, 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 효과는 T-DNA 활성화 태깅, 틸링 (TILLING), 상동 재조합을 포함하여 다른 잘 알려진 기술을 사용하여 행해질 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 기술의 설명은 정의 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 핵산의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 형질전환 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
더욱 상세하게, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 향상된 수확량 관련 형질, 특히 증가된 종자 수확량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 형질전환 식물을 생산하는 방법을 제공한다:
(i) NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산 또는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산을 포함하는 유전자 구축물을 식물 또는 식물 세포로 도입 및 발현하는 단계; 및
(ii) 비생물적 스트레스 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 단계.
상기 (i)단계의 핵산은 본 발명에 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산일 수 있다.
식물 세포의 배양은 재분화 및/또는 성숙기까지의 생장을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 형질전환된 식물 세포는 형질전환 식물체로 재분화될 수 있다. 또 다른 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법으로 형질전환된 식물 세포는 형질전환 식물체로 재분화되지 않을 수 있으며, 즉 세포를 당업계에 알려진 세포 배양 기술을 사용하여 식물체로 재분화하는 것이 불가능할 수 있다. 식물 세포는 일반적으로 전체 형성능 특성을 갖는 반면에, 일부 식물 세포는 상기 세포로부터 온전한 식물체로 재분화 또는 증식하는데 사용될 수 없다. 본 발명의 일 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 상기 세포이다. 또 다른 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 독립영양 방법으로 그들 자신을 유지할 수 없는 식물 세포이다.
상기 핵산은 식물 세포로 또는 식물체 자체 (조직, 기관 또는 식물체의 임의의 다른 부분으로의 도입 포함)로 직접적으로 도입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 핵산은 바람직하게는 형질전환에 의해 식물체 또는 식물 세포로 도입될 수 있다. 용어 "형질전환"은 본 발명의 "정의" 섹션에 더 상세하게 기재되어 있다.
일 구현예에서 본 발명은 본 발명에 기재된 임의의 방법으로 생산된 임의의 식물 세포 또는 식물체 및 모든 식물체 부분 및 그의 번식체로 확장된다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 얻을 수 있는 식물 또는 그의 부분 (종자 포함)을 포함한다. 식물 또는 그의 일부 또는 식물 세포는 상기에 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 외래유전자 (transgene)를 포함하며, 바람직하게는 발현 카세트와 같은 유전자 구축물을 포함한다. 본 발명은 앞서 언급한 임의의 방법으로 생산된 일차 형질전환된 또는 감염된 세포, 조직, 기관 또는 전체 식물의 자손을 포함하기 위해 더 확장될 수 있으며, 자손이 본 발명에 따른 방법으로 양친이 생산한 것과 동일한 유전형적 및/또는 표현형적 특징(들)을 나타내는 것만이 요구된다.
추가의 구현예에서 본 발명은 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 유전자 구축물, 또는 상기 기재된 NAC1 또는 NAC5 코딩 핵산 및/또는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 포함하는 종자로 확장된다.
본 발명은 또한 상기 정의된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 일 구현예에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 식물 세포, 효모, 박테리아 또는 곰팡이이다. 본 발명에 따른 방법에 사용된 핵산, 유전자 구축물, 발현 카세트 또는 벡터에 대한 숙주 식물은 원칙적으로 유리하게 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 합성하는 것이 가능한 모든 식물이다. 특정한 구현예에서 본 발명의 식물 세포는 본 발명의 핵산 분자를 과발현한다.
본 발명의 방법은 유리하게 임의의 식물에, 특히 본 발명에 정의된 임의의 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법에 특히 유용한 식물은 비리디플란태 (Viridiplantae) 수퍼패밀리에 속하는 모든 식물, 특히 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 본 발명의 구현예에 있어서, 식물은 작물이다. 작물 식물의 예는 치커리, 당근, 카사바, 토끼풀 (trefoil), 대두, 비트 (beet), 사탕무, 해바라기, 캐놀라, 알팔파, 유채, 아마, 목화, 토마토, 감자 및 담배를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 식물은 단자엽 식물이다. 단자엽 식물의 예는 사탕수수를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 식물은 곡물이다. 곡물의 예는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호맥 (rye), 라이밀 (triticale), 수수 (sorghum), 에머밀 (emmer), 스펠트밀 (spelt), 외알밀 (소맥, einkorn), 테프 (teff), 마일로 (milo) 및 귀리를 포함한다. 특정한 구현예에서 본 발명의 방법에 사용된 식물체는 옥수수, 밀, 벼, 대두, 목화, 캐놀라를 포함하는 평지 (oilseed rape), 사탕수수, 사탕무 및 알팔파로 이루어진 군에서 선택된다. 유리하게 본 발명의 방법은 본 발명의 식물체가 동등한 방법에 사용된 대조구 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 환경 스트레스에 대한 내성을 갖기 때문에 알려진 방법보다 더 효율적이다.
본 발명은 또한 종자, 잎, 열매, 꽃, 줄기, 뿌리, 지하경, 괴경 및 인경과 같은 식물의 수확가능한 부분까지 확장되나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 수확 가능한 부분은 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 본 발명은 더욱이 건조 펠렛, 가루 또는 분말, 오일, 지방 및 지방산, 전분 또는 단백질 같은 상기 식물의 수확 가능한 부분으로부터 유래된 또는 생산된, 바람직하게는 직접적으로 유래된 또는 생산된 생산물에 관련된다.
본 발명은 또한 a) 본 발명의 식물체의 성장 단계 및 b) 본 발명의 식물체 또는 종자를 포함하는 그의 일부로부터 또는 식물체 또는 종자를 포함하는 그의 일부에 의한 상기 산물의 생산 단계를 포함하는 산물의 제조 방법을 포함한다. 추가의 구현예에서 상기 방법은 a) 본 발명의 식물체의 성장 단계, b) 식물체로부터 본 발명에 기재된 수확 가능한 부분의 제거 단계 및 c) 본 발명에 따른 식물체의 수확 가능한 부분으로부터 또는 식물체의 수확 가능한 부분으로 상기 산물을 생산하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 본 발명의 방법으로 생산된 산물은 식료품, 사료, 식품 첨가물, 사료 첨가물, 섬유질, 화장품 또는 의약품과 같은 식물 제품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서 생산을 위한 방법은 식물 추출물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지방, 오일, 폴리머, 비타민 등과 같은 농산물을 제조하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 농산물에 포함된다. 특정한 구현예에서 본 발명의 핵산 서열 및 단백질 서열은 예를 들면, 농산물이 본 발명의 방법으로 생산된 경우 생산 마커로 사용될 수 있다. 상기 마커는 과정의 더 높은 효율성뿐만 아니라, 과정에 사용된 식물 원료 및 수확 가능한 부분의 향상된 질 때문에 산물의 질을 향상시키는 유리한 과정에 의해 생산된 산물을 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 마커는 당업계에 알려진 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 핵산 검출을 위한 PCR에 근거한 방법 또는 단백질 검출을 위한 항체에 근거한 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 용도 및 식물에서 앞서 언급한 임의의 수확량 관련 형질을 향상시키거나 뿌리 형태를 변형시키는 상기 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 기재된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 그 자체는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 유전자에 유전적으로 연결될 수 있는 마커가 동정된 육종 프로그램에서 용도를 찾을 수 있다. 상기 핵산/유전자, 또는 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 그 자체는 분자 마커를 정의하는데 사용될 수 있다. 이 DNA 또는 단백질 마커는 본 발명의 방법에 정의된 향상된 수확량 관련 형질 또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물을 선발하는 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 게다가, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 코딩 핵산/유전자의 대립인자 변이체는 마커 보조 육종 프로그램에서 용도를 찾을 수 있다. NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 이 유전자의 일부에 대한 유전자지도 및 물리지도 제작용 탐침으로서 및 그 유전자에 연관된 형질에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 상기 정보는 원하는 표현형을 갖는 라인 개발을 위한 식물 육종에 유용할 것이다.
또한, 본 발명은 하기의 특정한 구현예에 관한 것이다.
A: 표 12 또는 표 15에 제시된 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 NAC 상향 조절 유전자 (NUG) 또는 이의 상동체의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 대조구 식물에 비하여 식물의 수확량 관련 형질을 향상시키는 방법.
B: 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 이의 상동체의 식물에서의 발현 조절을 포함하는, 비생물학적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법.
C: 구현예 A 또는 구현예 B에 있어서, 상기 조절된 발현은 NUG, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 이의 상동체의 식물로의 도입 및 발현에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
D: 구현예 A에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량 및/또는 생물량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
E: 구현예 B에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 증가된 종자 또는 곡물 수확량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 및/또는 상기 변형된 뿌리 형태는 하기의 어느 하나 이상의 증가 또는 변화를 포함하거나, 하기의 어느 하나 이상의 증가 또는 변화 때문인 것을 특징으로 하는 방법: 생체 중량 또는 건조 중량 형태의 뿌리 생물량의 증가, 증가된 뿌리의 수, 증가된 뿌리 직경, 확대된 뿌리, 확대된 중심주 (stele), 확대된 통기 조직 (aerenchyma), 증가된 통기 조직 형성, 확대된 수피 (cortex), 확대된 수피 (cortical) 세포, 확대된 목질부, 변형된 분지, 향상된 침투 (penetration) 능력, 확대된 외피 (epidermis), 어린줄기에 대한 뿌리 비율의 증가.
F: 구현예 A 또는 C 내지 E 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 스트레스가 없는 조건 하에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
G: 구현예 A 내지 F 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 가뭄 스트레스, 염분 스트레스 또는 질소 결핍 조건 하에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
H: 구현예 B 내지 G 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드는 서열번호 5 내지 서열번호 15로 표시된 모티프의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
I: 구현예 A 내지 H 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 NUG, NAC1 또는 NAC5를 코딩하는 핵산은 식물 유래, 바람직하게는 단자엽 식물 유래, 더 바람직하게는 벼과 (family Poaceae) 유래, 더욱 바람직하게는 벼속 (genus Oryza) 유래, 가장 바람직하게는 벼 (Oryza sativa) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
J: 구현예 A 내지 I 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 NA\UG, NAC1 또는 NAC5를 코딩하는 핵산은 표 12, 표 15 또는 표 16에 열거된 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하거나, 상기 핵산의 일부이거나, 상기 핵산과 혼성화가 가능한 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
K: 구현예 A 내지 J 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열은 표 12, 표 15 또는 표 16에 제시된 어느 하나의 폴리펩티드의 오쏘로그 (orthologue) 또는 패럴로그 (paralogue)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
L: 구현예 A 내지 K 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2로 표시된 NAC1 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
M: 구현예 A 내지 L 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 4로 표시된 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
N: 구현예 A 및 C 내지 M 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 핵산은 식물 유래의 항시성 프로모터에, 바람직하게는 식물 유래의 중간 강도 항시성 프로모터에, 더 바람직하게는 GOS2 프로모터에, 가장 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
O: 구현예 B 내지 M 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 조직 특이적 프로모터는 뿌리 특이적 프로모터, 바람직하게는 RCc3 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 유래의 RCc3 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
P: 표 12, 표 15 또는 표 16에 제시된 NUG, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드, 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 구현예 A 내지 O 중 어느 한 구현예의 방법에 의해 수득 가능한 식물체, 또는 식물체의 일부, 또는 식물 세포.
Q: 하기를 포함하는 유전자 구축물 (construct):
(i) 표 12, 표 15 또는 표 16에 제시된 NUG, NAC1, NAC5 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산;
(ii) (i)의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
(iii) 전사 종결 서열.
R: 구현예 Q에 있어서, 상기 핵산은 식물 유래의 항시성 프로모터에, 바람직하게는 식물 유래의 중간 강도 항시성 프로모터에, 더 바람직하게는 GOS2 프로모터에, 가장 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 구축물.
S: 구현예 Q에 있어서, 상기 핵산은 조직 특이적 프로모터에, 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터에, 바람직하게는 RCc3 프로모터에, 더욱 바람직하게는 벼 유래의 RCc3 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 구축물.
T: 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질, 바람직하게는 증가된 종자 수확량 및/또는 증가된 생물량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물을 제조하는 방법에 대한 구현예 Q 내지 구현예 S 중 어느 한 구현예에 따른 유전자 구축물의 용도.
U: 구현예 Q 내지 구현예 S 중 어느 한 구현예에 따른 유전자 구축물로 형질전환된 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포.
V: 하기 단계를 포함하는, 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질, 바람직하게는 대조구 식물에 비하여 증가된 및/또는 증가된 종자 수확량 및/또는 증가된 생물량을 갖는 형질전환 식물의 제조 방법:
(i) 표 12 또는 표 15에 제시된 NUG 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산을 식물 세포 또는 식물에 도입 및 발현하는 단계; 및
(ii) 식물의 생장 및 발달을 촉진하는 조건 하에서 (i)단계의 상기 식물 세포 또는 식물을 배양하는 단계; 또는
(iii) 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 표 16에 제시된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산을 식물 세포 또는 식물에 도입 및 발현하는 단계; 및
(iv) 비생물적 스트레스 조건 하에서, 상기 (iii)단계의 식물 세포 또는 증가된 종자 수확량 및 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물을 배양하는 단계.
W: 표 12, 표 15 또는 표 16에 제시된 NUG, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산의 조절된 발현으로 인하여 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물.
X: 구현예 P, 구현예 U 또는 구현예 W 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 식물은 비트, 사탕무 또는 알팔파와 같은 작물; 또는 사탕수수와 같은 단자엽 식물; 또는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호맥 (rye), 라이밀 (triticale), 수수 (sorghum), 에머밀 (emmer), 스펠트밀 (spelt), 외알밀 (소맥, einkorn), 테프 (teff), 마일로 (milo) 또는 귀리 같은 곡물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물 또는 상기 형질전환 식물로부터 유래된 형질전환 식물 세포.
Y: 수확 가능한 부분이 바람직하게는 뿌리 생물량 및/또는 종자인 것을 특징으로 하는, 구현예 X에 따른 식물의 수확 가능한 부분.
Z: 구현예 X에 따른 식물 및/또는 구현예 Y에 따른 식물의 수확 가능한 부분 유래의 산물.
A': 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한 표 12, 표 15 또는 표 16에 제시된 NUG, NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산의 용도.
B': 구현예 P, 구현예 U, 구현예 W 또는 구현예 X에 따른 식물의 재배 단계 및 종자를 포함하는 상기 식물 또는 식물의 일부로부터 또는 종자를 포함하는 상기 식물 또는 식물의 일부를 이용하여 산물을 생산하는 단계를 포함하는, 산물의 제조 방법.
정의
하기 정의는 본 출원의 전체에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 섹션 제목 및 표제는 단지 편의 및 참조 목적이며, 본 명세서의 의미 또는 해석에 어떤 식으로도 영향을 미쳐서는 안된다. 본 출원의 범위 내에 사용된 기술적 용어 및 표현은 일반적으로 식물 생물학, 분자 생물학, 생물정보학 및 식물 육종 관련 기술에서 그들에게 일반적으로 적용되는 의미를 제공한다. 하기의 모든 용어 정의는 본 출원의 전체 내용에 적용된다. 특성 또는 값과 관련된 용어, 특히 "필수적으로", "약", "대략" 등은 또한 각각 정확하게 특성 또는 정확하게 값을 정의한다. 본 명세서에서 제시된 수치 또는 범위에 대한 용어 "거의"는 특히 제시된 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내, 또는 5% 이내의 값 또는 범위에 관한 것이다.
펩티드(들)/단백질(들)
용어 "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호 교체 사용되며, 다른 방법으로 본 발명에서 언급하지 않는 한, 펩티드 결합으로 연결된 임의의 길이의 아미노산의 중합형을 말한다.
폴리뉴클레오티드(들)/핵산(들)/핵산 서열(들)/뉴클레오티드 서열(들)
용어 "폴리뉴클레오티드(들)", "핵산 서열(들)", "뉴클레오티드 서열(들)", "핵산(들)", "핵산분자"는 본 발명에서 상호 교체 사용되며, 임의의 길이의 미분지된 중합형인, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 양자의 조합인 뉴클레오티드를 말한다.
상동체 (들)
단백질의 "상동체"는 문제의 변형되지 않은 단백질에 대해 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지며, 이들이 유래되는 변형되지 않은 단백질과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 갖는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다.
오쏘로그 (orthologue) 및 패럴로그 (paralogue)는 상동체의 두 가지 다른 형태이며, 유전자의 조상관계를 기재하는데 사용되는 진화적 개념을 포함한다. 패럴로그는 조상 유전자의 복제로 생긴 동일한 종 내의 유전자이고; 오쏘로그는 종분화로 인하여 비롯되고, 또한 공통 조상 유전자로부터 유래한 다른 생물체의 유전자이다.
"결실"은 단백질로부터 하나 또는 하나 이상의 아미노산의 제거를 말한다.
"삽입"은 단백질 내의 예정된 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되는 것을 말한다. 삽입은 하나 또는 다수 아미노산의 서열 내 삽입뿐 아니라 N-말단 및/또는 C-말단 융합을 포함할 수 있다. 일반적으로 아미노산 서열 내 삽입은 N- 또는 C-말단 융합보다 작을 것이며, 약 1 내지 10 개 정도의 잔기이다. N- 또는 C-말단 융합 단백질 또는 펩티드의 예는 효모 투-하이브리드(two-hybrid) 시스템에 사용된 전사 활성제의 결합 도메인 또는 활성화 도메인, 파아지 외피 단백질, (히스티딘)-6-태그, 글루타치온 S-전달효소-태그, 단백질 A, 말토스-결합 단백질, 디히드로폴레이트 환원효소, Tag·100 에피토프, c-myc 에피토프, FLAG®-에피토프, lacZ, CMP (칼모둘린-결합 펩티드), HA 에피토프, 단백질 C 에피토프 및 VSV 에피토프를 포함한다.
"치환"은 유사한 성질 (유사한 소수성, 친수성, 항원성, 알파 나선 구조 또는 베타 병풍 구조를 형성하거나 파괴하는 경향 같은)을 갖는 다른 아미노산으로 단백질의 아미노산의 치환을 말한다. 아미노산 치환은 전형적으로 하나의 잔기의 치환이나, 폴리펩티드에 부여된 기능적 제약에 따라 클러스터될 수도 있으며, 1 내지 10개의 아미노산일 수 있다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환 표는 당업계에 주지되어 있다 (예를 들면, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company (Eds) 및 하기 표 1 참고).
보존된 아미노산 치환의 예
잔기 보존적 치환 잔기 보존적 치환
Ala Ser Leu Ile; Val
Arg Lys Lys Arg; Gln
Asn Gln; His Met Leu; Ile
Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
Gln Asn Ser Thr; Gly
Cys Ser Thr Ser; Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp; Phe
His Asn; Gln Val Ile; Leu
Ile Leu, Val
아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 고체상 펩티드 합성 등과 같은 당업계에 주지된 펩티드 합성 기술을 이용하거나 또는 재조합 DNA 조작에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 단백질의 치환, 삽입 또는 결실 변이체를 제조하기 위한 DNA 서열 조작 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들면, DNA 상의 예정된 위치에 치환 돌연변이를 제조하기 위한 기술은 당업자에게 주지되어 있으며, M13 돌연변이유발, T7-Gen 시험관 내 돌연변이유발 (USB, Cleveland, OH), QuickChange 자리지정 돌연변이유발 (Stratagene, San Diego, CA), PCR-매개 자리지정 돌연변이유발 또는 다른 자리지정 돌연변이유발 프로토콜을 포함한다 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates) 참고).
유도체
"유도체"는 목적 단백질과 같이 자연발생 형태의 단백질의 아미노산 서열에 비교하여, 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기로 아미노산의 치환 또는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기의 첨가를 포함할 수 있는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 단백질의 "유도체"는 또한 자연발생 형인 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비교하여 자연적으로 발생하는 변형된 (글리코실화, 아실화, 프레닐화, 인산화, 미리스토일화, 황화 등) 또는 자연적으로 발생하지 않는 변형된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 유도체는 또한 원래의 아미노산 서열에 비교하여 하나 이상의 비아미노산의 치환 또는 첨가를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 이의 검출을 용이하게 하기 위해 결합되는 리포터 분자와 같은 아미노산 서열에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합한 리포터 분자나 다른 리간드, 및 자연적으로 발생하는 단백질의 아미노산 서열에 대해 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기이다. 더욱이, "유도체"는 또한 단백질의 자연적으로 발생하는 형태와 FLAG, HIS6 또는 티오레독신 같은 태깅 펩티드 (태깅펩티드 리뷰를 위해, Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003 참고)와의 융합을 포함한다.
도메인, 모티프/일치 서열/ 시그너처
용어 "도메인"은 진화적으로 연관된 단백질의 서열 정렬 시 특정 위치에서 보존된 아미노산의 세트이다. 다른 위치의 아미노산은 상동체들 간에 다양할 수 있는 반면, 특정 위치에서 고도로 보존된 아미노산은 단백질의 구조, 안정성 또는 기능에 필수적일 것인 아미노산을 나타낸다. 단백질 상동체 패밀리의 정렬된 서열상에서 고도로 보존된 부분은 임의의 문제되는 폴리펩티드가 이전에 동정된 폴리펩티드 패밀리에 속하는지를 결정하는 동정부위로 사용될 수 있다.
용어 "모티프", "일치 서열" 또는 "시그너처"는 진화적으로 연관된 단백질의 서열에 있어 짧은 보존된 영역을 말한다. 모티프는 흔히 도메인의 고도로 보존된 부분뿐만 아니라, 도메인의 일부만을 포함할 수도 있거나 또는 보존된 도메인 외부에 있을 수도 있다 (만일 모티프의 아미노산 모두가 지정된 도메인 외부에 있으면).
전문가 데이터베이스는 예를 들면, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), 또는 Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))이 도메인의 확인을 위해 존재한다. 단백질 서열의 인실리코 분석을 위한 도구 세트는 ExPASy 프로테오믹스 서버에서 이용가능하다 (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)). 도메인 또는 모티프는 또한 서열 정렬과 같은 일상적인 기술을 이용해서도 확인할 수 있다.
비교를 위한 서열정렬 방법은 당업계에 주지되어 있으며, 상기 방법은 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. GAP은 일치되는 (match) 수는 최대로, 공백 (gap)의 수는 최소로 되는 두 서열의 전체적인 (즉, 전체 서열에 걸쳐) 정렬을 찾기 위해 Needleman 및 Wunsch ((1970) J MoI Biol 48: 443-453)의 알고리즘을 사용한다. BLAST 알고리즘 (Altschul et al. (1990) J MoI Biol 215: 403-10)은 서열 동일성의 백분율을 계산하여, 두 서열 간에 유사도의 통계적 분석을 수행한다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 NCBI (National Centre for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 상동체는 예를 들면, ClustalW 다중 서열 정렬 알고리즘 (multiple sequence alignment algorithm; version 1.83)을 사용하여, 디폴트 페어와이즈 정렬 매개변수(default pairwise alignment parameter) 및 백분율 평점법으로 용이하게 동정된다. 유사성 및 동일성의 전체 백분율은 MatGAT 소프트웨어 패키지 (Campanell et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: 단백질 또는 DNA 서열을 사용하여 유사성/동일성 매트릭스를 생성하는 적용)에서 유용한 방법 중의 하나를 사용하여 결정될 수 있다. 당업자에게 명백한 것으로서 보존된 모티프 간에 정렬을 최적화하기 위하여 약간의 수작업의 편집을 수행할 수 있다. 더욱이, 상동체 동정을 위하여 전체 길이의 서열을 사용하는 대신에, 특정 도메인 또한 사용될 수 있다. 서열 동일성 값은 핵산 또는 아미노산 전체 서열에 걸쳐, 또는 선정된 도메인 또는 보존된 모티프(들)에 걸쳐 상기 기재된 프로그램으로 디폴트 매개변수(default parameter)를 사용하여 결정될 수 있다. 국부적인 정렬을 위해서는, Smith-Waterman 알고리즘이 특히 유용하다 (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7).
상호간 블라스트 ( Reciprocal BLAST )
전형적으로 공개적으로 유용한 NCBI 데이터베이스 같은 임의의 서열 데이터베이스에 대해 조회 서열 (예를 들면, 실시예 섹션의 표 12에 열거된 서열 이용)을 BLASTing하는 것을 포함하는 첫 번째 BLAST를 포함한다. BLASTN 또는 TBLASTX (표준 디폴트값 사용)은 일반적으로 뉴클레오티드 서열로부터 시작할 때, BLASTP 또는 TBLASTN (표준 디폴트값 사용)은 단백질 서열로부터 시작할 때 사용된다. BLAST 결과를 선택적으로 필터할 수도 있다. 필터한 결과물 또는 필터하지 않은 결과물의 전체 길이의 서열을 조회 서열이 유래된 생물체의 서열과 대조하여 다시 BLAST한다 (두 번째 BLAST). 첫 번째와 두 번째 BLAST의 결과물을 비교한다. 첫 번째 BLAST로부터의 높은 랭킹 히트(ranking hit)이 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터라면 패럴로그가 동정되고, 후에 다시 BLAST (BLAST back)하면 이상적으로는 조회 서열이 가장 높은 히트를 보일 것이며; 첫 번째 BLAST로부터의 높은 랭킹 히트가 조회 서열이 유래한 것과 동종으로부터가 아니라면 오쏘로그가 동정되며, 바람직하게는 다시 BLAST하면 가장 높은 히트 중에 조회 서열이 있다.
높은 랭킹 히트는 낮은 E-값을 가진 것이다. E-값이 낮을수록, 점수가 더 의미 있다 (또는 다른 말로, 우연히 히트가 발견될 기회가 더 적다). E-값의 계산은 당업계에 주지되어 있다. E-값에다가, 비교는 또한 백분율 동일성에 의하여 점수화된다. 백분율 동일성은 특정 길이에 걸쳐 두 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 큰 패밀리의 경우, 연관 유전자의 클러스터링을 시각화하는데 도움을 주고 오쏘로그 및 패럴로그를 동정하기 위해서 ClustalW 다음에 neighbour joining tree가 사용된다.
혼성화
본 발명에 정의된 용어 "혼성화"는 사실상 상동인 상보적인 뉴클레오티드 서열이 서로 어닐링하는 과정이다. 혼성화 과정은 전적으로 용액 내에서, 즉 상보적인 두 핵산이 용액 내에 있을 때 일어날 수 있다. 혼성화 과정은 또한 상보적인 핵산의 하나가 자성 비드, 세파로오스(Sepharose) 비드 또는 어떤 다른 수지 (resin) 같은 기질에 고정되었을 때도 일어날 수 있다. 혼성화 과정은 더욱이 상보적인 핵산 중의 하나가 니트로셀룰로스 또는 나일론 막 같은 고체 지지체에 고정되었거나 또는 사진석판술에 의하여 규산질의 유리 지지체 (핵산 어레이, 마이크로어레이 또는 핵산 칩이라 알려짐)에 고정되었을 때에도 일어날 수 있다. 혼성화가 일어나게 하기 위하여, 핵산분자는 일반적으로 열적으로 또는 화학적으로 변성되어 이중 가닥을 2개의 단일가닥으로 녹이고/녹이거나 단일 가닥 핵산으로부터 헤어핀 또는 기타 이차 구조를 제거한다.
용어 "스트린전시"는 혼성화가 일어나는 조건을 말한다. 혼성화의 스트린전시는 온도, 염 농도, 이온 강도 및 혼성화 완충액 조성 같은 조건의 영향을 받는다. 일반적으로 낮은 스트린전시 조건은 정해진 이온강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 용해점 (Tm)보다 약 30℃ 낮은 온도가 선택된다. 중간 스트린전시 조건은 Tm 보다 20℃ 낮은 온도일 때, 높은 스트린전시 조건은 Tm 보다 10℃ 낮은 온도이다. 높은 스트린전시 혼성화 조건은 전형적으로 표적 핵산 서열에 높은 서열 유사성을 갖는 혼성화 서열을 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 핵산은 서열 상의 차이가 있더라도 유전암호의 축퇴로 인하여 실제로는 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 그러므로, 중간 스트린전시 혼성화 조건은 종종 상기 핵산분자를 동정하는데 필요할 수 있다.
Tm은 정해진 이온 강도 및 pH 하에서 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 탐침에 혼성화하는 온도이다. Tm은 용액 조건, 염기 조성 및 탐침의 길이에 의존적이다. 예를 들면, 보다 긴 서열일수록 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 최대 혼성화율은 Tm보다 약 16℃에서 32℃까지 낮을 때 얻어진다. 1가 양이온이 혼성액에 있으면 두 핵산 가닥 간에 정전기적 반발이 감소하여 혼성화가 촉진되고; 이 효과는 0.4M (보다 높은 농도에서는 이 효과가 무시될 수 있다)까지의 나트륨 농도에서 보여진다. 포름아미드는 DNA-DNA 및 DNA-RNA 이중가닥의 용해 온도를 포름아미드 퍼센트 당 0.6 내지 0.7℃ 내리며, 50% 포름아미드의 첨가는 혼성화율은 낮아지더라도 혼성화가 30 내지 45℃에서 일어나게 한다. 염기쌍 미스매치는 혼성화율 및 이중가닥의 온도 안정성을 감소시킨다. 평균적으로 그리고 큰 탐침에 대하여, Tm은 염기 미스매치 % 당 약 1℃ 감소한다. Tm은 혼성체의 유형에 따라 하기의 식으로 계산할 수 있다:
1) DNA-DNA 혼성체 (Meinkoth 및 Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm=81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x%[G/Cb]-500x[Lc]-1 -0.61x%포름아미드
2) DNA-RNA 또는 RNA-RNA 혼성체:
Tm= 79.8℃ + 18.5 (log10[Na+]a)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2-820/Lc
3) 올리고-DNA 또는 올리고-RNAd 혼성체:
20개 뉴클레오티드 미만에 대해: Tm=2(In)
20-35개 뉴클레오티드에 대해: Tm=22+1.46(In)
a 또는 다른 1가 양이온에 대하여, 0.01-0.4 M 범위 내에서만 정확.
b 30% 내지 75% 범위 내에서 %GC에 대하여만 정확.
c L = bp으로 표시된 이중가닥의 길이.
d 올리고, 올리고뉴클레오티드; In,= 효과적인 프라이머 길이 = 2x(G/C의 수)+(A/T의 수)
비특이적 결합은 예를 들면, 단백질 함유 용액으로 막을 차단하고, 혼성화 완충액에 이종의 RNA, DNA, 및 SDS를 첨가하고, RNase 처리하는 것과 같은 많은 알려진 기술 중 임의의 하나를 사용하여 조절할 수 있다. 비상동 탐침에 대하여, 일련의 혼성화 과정은 (i) 점차적으로 어닐링 온도를 낮추거나 (예를 들면 68℃에서 42℃까지) (ii) 점차적으로 포름아미드 농도를 낮추거나 (예를 들면 50%에서 0%까지) 중 하나를 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 당업자는 혼성화 중에 변할 수 있는, 그리고 스트린전시 조건을 유지하거나 바꾸는 다양한 매개변수를 인식하고 있다.
혼성화 조건 외에, 혼성화의 특이성은 또한 전형적으로 혼성화 후 세척 기능에 의존한다. 비특이적 혼성화로 생기는 백그라운드를 제거하기 위하여, 시료를 묽은 염 용액으로 세척한다. 이런 세척의 결정적인 요인은 최종 세척액의 이온 강도 및 온도를 포함한다: 염 농도가 낮고 세척 온도가 높을수록 세척의 스트린전시는 높아진다. 세척 조건은 전형적으로 혼성화 스트린전시에서 또는 보다 낮게 수행된다. 양성 혼성화는 적어도 백그라운드의 2 배의 신호로 나타난다. 일반적으로 핵산 혼성화 분석이나 유전자 증폭 검출 과정에 적절한 스트린전트 조건은 상기와 같다. 다소 스트린전트한 조건 또한 선택될 수 있다. 당업자는 세척 중에 변할 수 있는, 그리고 스트린전시 조건을 유지하거나 바꾸는 다양한 매개변수를 인식하고 있다.
예를 들면, 50개 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 전형적인 높은 스트린전시 혼성화 조건은 65℃, 1x SSC에서 또는 42℃, 1x SSC 및 50% 포름아미드에서 혼성화 후 65℃, 0.3x SSC에서 세척하는 것이다. 50개 뉴클레오티드보다 긴 DNA 혼성체에 대한 중간 스트린전시 혼성화 조건은 50℃, 4x SSC 또는 40℃, 6x SSC 및 50% 포름아미드에서 혼성화 후, 50℃, 2x SSC에서 세척하는 것이다. 혼성체의 길이는 혼성화하는 핵산에 대해 예측된 길이이다. 알려진 서열의 핵산이 혼성화 될 때 혼성체의 길이는 서열을 정렬하고 본 발명에서 기재된 보존된 영역을 동정하면 결정될 수 있다. 1X SSC는 0.15M NaCl 및 15mM 소듐 시트레이트이며; 혼성액 및 세척액에는 부가적으로 5x Denhardt's reagent, 0.5-1.0% SDS, 100 ㎍/ml 변성된, 단편화된 연어 정자 DNA, 0.5% 소듐 피로포스페이트가 포함된다.
스트린전시 수준을 결정하기 위해서는 [Sambrook 등 (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989, 매년 개정됨)]을 참조하면 된다.
스플라이스 변이체
본 발명에서 사용된 용어 "스플라이스 변이체"는 선정된 인트론 및/또는 엑손이 절단되거나, 치환되거나, 대체되거나, 부가된, 또는 인트론이 짧아지거나 길어진 핵산 서열의 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 단백질의 생물학적 활성이 사실상 보유되며; 이는 단백질의 기능적 단편을 선택적으로 보유함으로써 달성될 수 있다. 상기 스플라이스 변이체는 자연계에서 발견되거나 인공적으로 만들 수도 있다. 상기 스플라이스 변이체를 예측하고 분리하는 방법은 당업계에 주지되어 있다 (예를 들면 Foissac 및 Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25 참고).
대립인자 변이체
"대립인자" 또는 "대립인자 변이체"는 동일한 염색체 상에 위치한 해당 유전자의 또 다른 형태이다. 대립인자 변이체는 작은 삽입/결실 다형성 (Insertion/Deletion Polymorphisms, INDELs) 뿐만 아니라 단일염기다형성 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)을 포함한다. INDELs의 크기는 보통 100 bp 미만이다. SNPs 및 INDELs이 대부분의 생물체의 자연적으로 발생하는 다형 균주에 있어 가장 큰 서열 변이체를 형성한다.
내재적 유전자
본 발명에서 "내재적" 유전자는 자연적 형태 (즉, 임의의 인간의 개입이 없는)로 식물에서 발견되는 것으로서 문제의 유전자뿐 아니라, 분리된 형태로 연이어 식물체에 (재)도입된 동일한 유전자 (또는 사실상 상동인 핵산/유전자)(외래유전자, transgene)를 말한다. 예를 들면, 상기 외래유전자를 갖는 형질전환 식물체에서는 외래유전자 발현의 실질적인 감소 및/또는 내재적 유전자 발현의 실질적인 감소가 있을 수 있다. 분리된 유전자는 생물체로부터 분리되거나, 또는 예를 들면 화학적 합성에 의하여 인위적으로 만들 수도 있다.
유전자 셔플링 ( shuffling )/방향진화 ( directed evolution )
"유전자 셔플링" 또는 "방향진화"는 DNA 셔플링의 반복에 이은 변형된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산이나 그 일부분의 변이체 생성을 위해 적절한 탐색 및/또는 선발로 구성된다 (Castle 등, (2004) Science 304(5674): 1151-4; 미국 특허 제5,811,238호 및 제6,395,547호).
구축물 ( construct )
인공적인 DNA (플라스미드 또는 바이러스 DNA와 같은, 그러나 이에 제한되지 않음)는 숙주 세포에서 복제가 가능하고, 숙주 세포 또는 숙주 개체로의 목적 DNA 서열의 도입을 위해 사용된다. 본 발명의 숙주 세포는 대장균 또는 아그로박테리움 종 세포와 같은 박테리아 세포, 효모 세포, 곰팡이, 조류 (algal) 또는 남조류 세포 또는 식물 세포에서 선택된 임의의 세포일 수 있다. 당업자는 목적 서열을 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환, 선발 및 증식시키기 위하여 벡터 내에 존재해야 하는 유전적 요소를 주지하고 있다. 목적 서열은 본 발명에 기재된 하나 이상의 조절 서열 (적어도 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 부가적인 조절 인자는 해독뿐만 아니라 전사 인핸서를 포함한다. 본 발명을 수행함에 있어 사용하기에 적절한 종결신호 및 인핸서 서열이 당업자에게 공지되어 있다. "정의" 섹션에 기재된 바와 같이, 세포질 내에 축적되는 성숙한 메시지의 양 증가를 위하여 인트론 서열이 또한 5' 비해독 영역 (UTR) 또는 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 다른 조절 서열 (프로모터, 인핸서, 사일런서, 인트론 서열, 3'UTR 및/또는 5'UTR 영역 외에)은 단백질 및/또는 RNA 안정화 인자들일 수 있다. 상기 서열은 알려져 있거나, 당업자가 쉽게 얻을 수 있다.
본 발명의 유전자 구축물은 특정 세포 유형에서 유지 및/또는 복제에 필요한 복제원점 서열을 포함한다. 한 예는 에피좀 유전자 요소 (예를 들면, 플라스미드 또는 코스미드 분자)로서 유전자 구축물이 세균 세포 내에 유지되어야 할 때이다. 바람직한 복제 원점은 f1-ori 및 colE1를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 사용된 핵산 서열이 성공적으로 전달되었는지 검출 및/또는 이들 핵산 서열을 포함하는 형질전환 식물의 선발을 위해서 마커 유전자 (또는 리포터 유전자)를 사용하는 것이 유리하다. 따라서, 유전자 구축물은 선택적으로 선발 마커 유전자를 포함한다. 선발 마커는 본 발명의 "정의" 섹션에서 더 상세히 기재된다. 마커 유전자는 더 이상 필요하지 않을 시 형질전환 세포로부터 제거 또는 절단될 수 있다. 마커 제거 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 유용한 기술은 상기 정의 섹션에 기재되어 있다.
조절 인자/조절 서열/프로모터
용어 "조절 인자", "조절 서열" 및 "프로모터"는 본 발명에서 상호 호환적으로 사용되며, 결합되는 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 핵산 서열을 말하는 것으로 사용된다. 용어 "프로모터"는 전형적으로 유전자의 전사 개시점의 업스트림에 있으며, RNA 중합효소 및 다른 단백질의 인지 및 결합에 관여하여 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열을 말한다. 상기 언급한 용어에는 전형적인 진핵세포 게놈 유전자 (CCAAT 박스 서열이 있거나 없이 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스를 포함) 및 발달 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 유전자 발현을 변경하는 부가적인 조절 인자 (즉, 업스트림 활성화 서열, 인핸서 및 사일런서)로부터 유래한 전사 조절 서열이 포함된다. 또한 상기 용어에는 -35 박스 서열 및/또는 -10 박스 전사 조절 서열을 포함하는 전형적인 원핵생물 유전자의 전사 조절 서열이 포함된다. 용어 "조절 인자"는 또한 세포, 조직 또는 기관에 핵산분자의 발현을 하게 하거나 활성화 또는 증가시키는 합성 융합 분자 또는 유도체를 포함한다.
"식물 프로모터"는 식물 세포에 코딩 서열 단편의 발현을 중재하는 조절 인자를 포함한다. 따라서, 식물 프로모터는 식물에서 유래해야 하는 것은 아니며, 예를 들면 식물 세포에 침범하는 바이러스 또는 미생물 기원일 수도 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포, 예를 들면, 본 발명의 방법에서 발현되며, 본 발명에 기재된 핵산 서열로 형질전환된 식물 기원일 수 있다. 이는 또한 "식물" 종결신호 같은 "식물" 조절 신호에도 해당된다. 본 발명의 방법에 유용한 뉴클레오티드 서열의 프로모터 업스트림은 프로모터, 개방형해독틀 (ORF) 또는 종결신호 또는 ORF로부터 떨어져 있는 다른 3' 조절 영역 같은 3'-조절 영역의 기능성 또는 활성을 방해하지 않고 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환(들), 삽입(들) 및/또는 결실(들)에 의하여 변형될 수 있다. 더욱이 서열의 변형에 의하여 프로모터 활성은 증가될 수 있거나, 또는 보다 활성이 큰 프로모터, 심지어 이종 생물체의 프로모터로 완전히 대체되는 것도 가능하다. 식물체에서의 발현을 위해서는 상기 언급된 것처럼 핵산분자는 올바른 시점 에 요구되는 공간적 발현 양상으로 유전자를 발현하는 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 프로모터를 포함해야 한다.
기능적으로 동등한 프로모터 동정을 위해, 후보 프로모터의 프로모터 강도 및/또는 발현 양상은 예를 들면, 리포터 유전자에 프로모터를 작동하게 연결하여 다양한 식물 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준 및 양상을 검정함으로써 분석할 수 있다. 적절한 주지된 리포터 유전자는 예를 들면 베타-글루쿠로니다제 또는 베타-갈락토시다제를 포함한다. 프로모터 활성은 베타-글루쿠로니다제 또는 베타-갈락토시다제의 효소 활성을 측정함으로써 검정된다. 프로모터 강도 및/또는 발현 양상은 기준 프로모터의 것에 비교된다 (본 발명의 방법에 사용된 것과 같은 것). 다르게는, 프로모터 강도는 방사선 사진의 농도계 분석을 이용한 노던 블럿, 정량적 실시간 PCR 또는 RT-PCR 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, mRNA 수준을 정량화하거나 본 발명의 방법에 사용된 핵산의 mRNA 수준과 18S rRNA 같은 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 mRNA 수준을 비교함으로써 분석될 수 있다 (Heid 등, 1996 Genome Methods 6: 986-994). 일반적으로 "약한 프로모터"는 코딩 서열의 발현을 낮은 수준으로 이끄는 것이다. "낮은 수준"은 세포당 약 1/10,000 전사체 내지 약 1/100,000 전사체, 약 1/500,0000 전사체까지의 수준을 말한다. 역으로, "강력한 프로모터" 는 코딩 서열의 발현을 높은 수준으로 또는 세포당 약 1/10 전사체 내지 약 1/100 전사체 내지 약 1/1000 전사체로 이끄는 것이다. 일반적으로 "중간 강도 프로모터"는 강한 프로모터보다 낮은 수준으로 특히 모든 경우에 있어서 35S CaMV 프로모터의 조절하에 있을 때 얻어지는 것보다 낮은 수준으로 코딩 서열의 발현을 이끄는 프로모터를 의미한다.
작동가능하게 연결된
본 발명에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 프로모터 서열과 해당 유전자 간의 기능적 연관을 말하는 것으로, 그럼으로써 프로모터 서열이 해당 유전자의 전사를 개시할 수 있다.
항시성 프로모터
"항시성 프로모터"는 반드시 항상은 아니더라도 생장 및 발달의 대부분 기간 중에 그리고 대부분의 환경적 조건 하에서 적어도 하나의 세포, 조직 또는 기관에서 전사적으로 활성인 프로모터를 말한다. 하기 표 2가 항시성 프로모터의 예이다.
항시성 프로모터의 예
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Super 프로모터 WO 95/14098
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편재하는 프로모터
"편재하는 프로모터"는 사실상 생물체의 모든 조직이나 세포에서 활성을 갖는 것이다.
발달적으로 조절된 프로모터
"발달적으로 조절된 프로모터"는 특정 발달 단계 중에 또는 발달적 변화가 일어나는 식물체의 부위에서 활성을 갖는 것이다.
유도성 프로모터
"유도성 프로모터"는 화학적 (리뷰를 위해, Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108 참조), 환경적 또는 물리적 자극에 반응하여 전사 개시가 유도되거나 증가되거나 또는 식물이 다양한 스트레스 환경에 노출될 때 "스트레스 유도성", 즉 활성화될 수 있거나 또는, 식물이 다양한 병원균에 노출될 때 "병원균 유도성", 즉 활성화될 수 있다.
기관 특이적/조직 특이적 프로모터
"기관 특이적" 또는 "조직 특이적 프로모터"는 잎, 뿌리, 종자 조직 등과 같이 특정 기관 또는 조직에서 우선적으로 발현 개시가 가능한 것이다. 예를 들면, "뿌리 특이적 프로모터"는 식물의 다른 부위에 약간 누설된 (leaky) 발현을 허용하지만, 사실상 식물의 다른 부위를 제외하고 식물 뿌리에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 프로모터이다. 특정 세포에서만 전사를 개시할 수 있는 프로모터는 본 발명에서 "세포 특이적"이라 한다.
뿌리 특이적 프로모터의 예는 하기 표 3에 열거된다:
뿌리 특이적 프로모터의 예
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"종자 특이적 프로모터"는 종자 조직에서만 반드시 배타적으로는 아니지만 (누설 발현의 경우) 종자조직에서 우세하게 전사적으로 활성인 것이다. 종자 특이적 프로모터는 종자발달 및/또는 발아 중에 활성일 것이다. 종자 특이적 프로모터는 배유/호분층/배 특이적일 수 있다. 종자 특이적 프로모터 (배유/호분층/배 특이적)의 예는 하기 표 4 내지 표 7에 제시된다. 종자 특이적 프로모터의 추가적인 예는 Qing Qu 및 Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004)에 제시되며, 이의 개시는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 원용에 의해 포함된다.
종자 특이적 프로모터의 예
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보리 Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6:849-60, 1994
Chi26 Leah et al., Plant J. 4:579-89, 1994
옥수수 B-Peru Selinger et al., Genetics 149;1125-38,1998
본 발명에서 정의된 "녹색 조직 특이적 프로모터"는 식물의 다른 부위에 약간 누설된 발현을 허용하지만, 식물의 다른 부위를 제외하고 실질적으로 녹색 조직에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 녹색 조직 특이적 프로모터의 예는 하기의 표 8에 있다.
녹색 조직 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 발현 참고문헌
옥수수 오쏘포스페이트 디키나아제
(Orthophosphate dikinase)
잎 특이적 Fukavama et al., Plant Physiol. 2001 Nov;127(3):1136-46
옥수수 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 잎 특이적 Kausch et al., Plant Mol Biol. 2001 Jan;45(1):1-15
벼 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 잎 특이적 Lin et al., 2004 DNA Seq. 2004 Aug;15(4):269-76
벼 작은 서브유닛 루비스코 잎 특이적 Nomura et al., Plant Mol Biol. 2000 Sep;44(1)99-106
벼 베타 익스팬신(expansin) EXBP9 어린줄기 특이적 WO 2004/070039
Pigeonpea 작은 서브유닛 루비스코 잎 특이적 Panguluri et al., Indian J Exp Biol. 2005 Apr;43(4):369-72
완두 RBCS3A 잎 특이적
조직 특이적 프로모터의 다른 예는 식물의 다른 부위에 약간 누설된 발현을 허용하지만, 식물의 다른 부위를 제외하고 실질적으로 분열조직에서 우세하게 전사적으로 활성이 있는 분열조직 특이적 프로모터이다. 본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 녹색 분열조직 특이적 프로모터의 예는 하기의 표 9에 있다.
분열조직 특이적 프로모터의 예
유전자 출처 발현 패턴 참고문헌
벼 OSH1 어린줄기 정단 분열조직,
구상배 단계에서 실생단계까지
Sato et al. (1996) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93:8117-8122
벼 메탈로티오네인
(metallothionein)
분열조직 특이적 BAD87835.1
WAK1 & WAK2 어린줄기 및 뿌리, 정단 분열조직,
및 팽창 잎 및 꽃받침
Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell
13(2): 303-318
종결신호 ( Terminator )
용어 "종결신호"는 일차 전사체의 3' 프로세싱 및 폴리아데닐화와 전사 종결의 신호가 되는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열인 조절 서열이다. 종결신호는 자연 유전자, 다양한 다른 식물 유전자, 또는 T-DNA로부터 유래될 수 있다. 첨가된 종결신호는 예를 들면, 노팔린 신타아제 또는 옥토파인 신타아제 유전자, 또는 또 다른 식물 유전자, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵세포 유전자로부터 유래된다.
선발 마커 (유전자)/리포터 유전자
"선발 마커", "선발 마커 유전자" 또는 "리포터 유전자"는 본 발명의 핵산 구축물로 감염되거나 형질전환된 세포의 동정 및/또는 선발을 촉진하기 위하여 발현된 세포에 표현형을 부여하는 임의의 유전자를 포함한다. 이들 마커 유전자는 일련의 상이한 원리를 통해 핵산 분자의 성공적인 전달을 확인 가능하게 한다. 적절한 마커는 항생제나 제초제 저항성을 주거나 새로운 대사 형질을 도입하거나 또는 시각적인 선발을 가능하게 하는 마커로부터 선택된다. 선발 마커 유전자의 예는 항생제 (네오마이신 및 카나마이신을 인산화하는 nptII, 하이그로마이신을 인산화하는 hpt, 또는 예를 들면, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 앰피실린, 겐타마이신, 제네티신 (G418), 스펙티노마이신, 블라스티시딘에 저항성을 주는 유전자), 제초제 (예를 들면, Basta®에 저항성을 제공하는 bar; 글리포제이트에 대한 저항성을 제공하는 aroA 또는 gox, 또는 예를 들면, 이미다졸리논, 포스피노트리신, 설포닐우레아에 저항성을 주는 유전자)에 저항성을 주는 유전자 또는 대사적 형질을 제공하는 유전자 (식물이 유일한 탄소원으로 만노즈를 이용하게 하는 manA 또는 자일로스 이용을 위한 자일로스 이성화효소, 또는 2-데옥시글루코스에 대한 저항성 같은 반영양적 마커)를 포함한다. 가시적 마커 유전자의 발현으로 발색 (예를 들면 베타-글루쿠로니다제, GUS, 또는 발색된 기질, 예를 들면 X-Gal을 가진 베타-갈락토시다제), 발광 (루시페린/루시파라제 시스템 같은) 또는 형광 (녹색 형광 단백질, GFP, 및 이의 유도체)이 형성된다. 이 목록은 소수의 가능한 마커만을 나타낸다. 당업자는 상기 마커에 친숙하다. 생물체 및 선발 방법에 따라 다른 마커가 선호된다.
식물 세포로 핵산의 안정적인 또는 일시적인 통합에 따라 소수의 세포만이 외래 DNA를 취하여, 필요 시 사용된 발현벡터 및 사용된 감염 기술에 따라 게놈 내로 이를 통합한다는 것이 알려져 있다. 통합체를 동정하고 선발하기 위하여, 선발 마커를 코딩하는 유전자 (상기 기재된 것과 같은)가 보통 목적 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 이들 마커는 예를 들면 이들 마커 유전자가 예를 들면 전통적인 방법에 의한 결실에 의하여 기능이 없는 돌연변이체에 사용될 수 있다. 더욱이, 선발 마커를 코딩하는 핵산분자는 본 발명의 또는 본 발명의 방법에 사용된 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 동일한 벡터 또는 그 외 별개 백터 상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 감염된 세포는 예를 들면 선발에 의해서 동정될 수 있다 (예를 들면, 통합된 선발 마커를 갖는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).
마커 유전자, 특히 항생제 및 제초제에 저항성이 있는 유전자는 일단 핵산이 성공적으로 도입되면 형질전환 숙주 세포에서 더 이상 필요하지 않거나, 바람직하지 않으므로, 핵산 도입을 위한 본 발명의 방법에서는 이들 마커 유전자가 제거 또는 절단되게 하는 기술을 사용한다. 하나의 상기 방법이 동시형질전환 (co-transformation)으로 알려진 것이다. 동시형질전환 방법은 형질전환을 위해 두 벡터를 동시에 사용하여, 하나의 벡터에는 본 발명에 따른 핵산이 있고, 둘째 벡터에는 마커 유전자(들)이 있다. 대부분의 형질전환체는 양 벡터를 받거나, 식물의 경우 (형질전환체의 40% 이상까지) 포함한다. 아그로박테리아로 형질전환한 경우, 형질전환체는 보통 벡터의 일부, 즉 보통 발현 카세트인 T-DNA에 의해 플랭킹된 서열만을 받는다. 마커 유전자는 연이어 교배를 하여 형질전환 식물체로부터 제거될 수 있다. 다른 방법에서는, 마커 유전자가 트랜스포존 (transposon)에 통합되어 원하는 핵산과 함께 형질전환에 사용된다 (Ac/Ds 기술로 알려짐). 형질전환체는 트랜스포자제 (transposase) 공급원과 교배될 수 있거나 또는 트랜스포자제가 발현되게 하는 핵산 구축물로 일시적으로 또는 안정적으로 형질전환된다. 어떤 경우에 (약 10%), 일단 형질전환이 성공적으로 되면 트랜스포존은 숙주 세포의 게놈 밖으로 튀어나가 소실된다. 더 많은 경우에, 트랜스포존은 다른 구역으로 튄다. 이들 경우에 마커 유전자는 교배에 의하여 제거되어야 한다. 미생물학에서 상기 일이 있어났는지 검출을 가능하게 하거나 용이하게 하는 기술이 개발되었다. 보다 편리한 방법은 재조합 시스템이라 알려진 것에 의존하는 것으로; 이점은 교배에 의한 제거가 면제될 수 있다는 것이다. 이 유형의 가장 잘 알려진 시스템은 Cre/lox 시스템이다. Cre1은 loxP 서열 사이에 위치한 서열을 제거하는 리콤비나아제이다. 만일 마커 유전자가 loxP 서열 사이에 통합되면 리콤비나아제의 발현에 의해서 마커 유전자는 제거된다. 다른 재조합 시스템은 HIN/HIX, FLP/FRT 및 REP/STB 시스템 (Tribble 등, J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan 등, J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566)이다. 본 발명에 따른 핵산 서열의 식물 게놈 내로 위치 특이적 통합이 가능하다. 자연적으로, 이들 방법은 또한 효모, 균류 또는 세균 같은 미생물에 응용될 수 있다.
형질전환된 ( transgenic )/외래유전자 ( transgene )/재조합
본 발명에서 "형질전환된", "외래유전자" 또는 "재조합"은 예를 들면, 핵산 서열, 발현카세트, 핵산 서열을 포함하는 유전자 구축물 또는 벡터, 또는 본 발명에 따른 핵산 서열, 발현 카세트나 벡터로 형질전환된 생물체, 하기에 기재된 재조합 방법에 의해 생성된 모든 구조물에 관한 의미이다:
(a) 본 발명의 방법에 유용한 단백질을 코딩하는 핵산서열, 또는
(b) 본 발명에 따른 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 조절 서열 (들), 예를 들면 프로모터, 또는
(c) a) 및 b)
가 자연적인 유전적 환경에 있지 않거나, 재조합 방법으로 변형되어 왔으므로 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 잔기의 치환, 부가, 결실, 역위 또는 삽입의 유형의 변형이 가능하다. 자연적인 유전적 환경은 원래의 식물에서 자연적인 게놈 또는 염색체상의 위치나 게놈 라이브러리에서의 존재를 의미하는 것으로 이해된다. 게놈 라이브러리의 경우, 핵산 서열의 자연적인 유전적 환경은 바람직하게는 적어도 부분적으로는 보유된다. 환경은 적어도 한쪽의 핵산 서열을 플랭킹하며 적어도 50 bp, 바람직하게는 적어도 500 bp, 특히 바람직하게는 적어도 1000 bp, 가장 바람직하게는 적어도 5000 bp 길이의 서열을 갖는다. 자연적으로 발생하는 발현 카세트, 예를 들면 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 해당 핵산 서열과 핵산 서열의 자연적 프로모터의 자연적으로 생긴 조합은 이 발현 카세트가 예를 들면 돌연변이 처리 같은 비자연적인 합성 ("인위적") 방법으로 변형될 때 형질 전환 발현카세트가 된다. 적절한 방법이 예를 들면 US 5,565,350 또는 WO 00/15815에 기재되어 있다.
본 발명의 목적상, 형질전환된 식물은 상기처럼 본 발명의 방법에서 사용된 핵산이 상기 식물의 게놈에 존재하지 않거나, 상기 식물로부터 유래하지 않거나, 상기 식물의 게놈에 존재할 수 있지만, 상기 식물의 게놈상의 자연적 위치에 있지 않아 핵산이 동종에서 또는 이종에서 발현될 수 있다는 의미로 이해된다. 그러나, 언급된 바와 같이, 형질전환은 또한 본 발명에 있어 또는 본 발명 방법에 사용된 핵산이 식물 게놈 내의 자연적 위치에 있는 반면, 그 서열이 자연적 서열에 대하여 변형되었고 및/또는 자연적 서열의 조절 서열이 변형되었음을 의미한다. 형질전환은 핵산의 동종 또는 바람직하게는 이종 발현이 일어나는 게놈 내의 비자연적 위치에서 본 발명에 따른 핵산의 발현을 의미하는 것으로 바람직하게는 이해된다. 바람직한 형질전환된 식물이 본 발명에서 언급된다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "분리된 핵산" 또는 "분리된 폴리펩티드"는 어떤 경우에는 각각 "재조합 핵산" 또는 "재조합 폴리펩티드"와 동의어로서 생각될 수 있으며, 이의 천연 유전적 환경에서 존재하지 않고/않거나 재조합 방법에 의해 변형된 핵산 또는 폴리펩티드를 말한다는 것을 더 주목할 수 있다.
조절 ( modulation )
용어 "조절"은 발현 또는 유전자 발현에 관한 것으로, 대조구 식물에 비하여 발현 수준이 상기 유전자 발현에 의하여 변화되는, 발현 수준이 증가되거나 감소되는 과정이다. 원래의 조절되지 않은 발현은 구조 RNA (rRNA, tRNA) 또는 연이어 해독되는 mRNA 같이 임의의 종류의 발현일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 원래의 조절되지 않은 발현은 또한 임의의 발현의 부재일 수 있다. 용어 "활성 조절"은 식물의 증가된 수확량 관련 형질로 이끄는, 본 발명의 핵산 서열 또는 코딩된 단백질의 발현의 임의의 변화를 의미한다. 발현은 없는 상태 (zero) (부재, 또는 측정 불가능한 발현)에서 특정 양까지 증가하거나, 특정 양에서 측정 불가능한 적은 양 또는 없는 상태까지 감소할 수 있다.
발현
용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특정 유전자 또는 특정 유전자들 또는 특정 유전자 구축물의 전사를 의미한다. 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 특히 유전자 또는 유전자들 또는 유전자 구축물의 구조 RNA (rRNA, tRNA), 또는 단백질로의 이은 번역이 있거나 없는 mRNA로의 전사를 의미한다. 상기 과정은 DNA의 전사 및 생성된 mRNA 산물의 가공을 포함한다.
증가된 발현/과발현
본 발명에 사용된 용어 "증가된 발현" 또는 "과발현"은 원래의 야생형 발현 수준에 부가적인 임의의 형태의 발현을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 원래의 야생형 발현 수준은 또한 없는 상태 (zero), 즉 발현의 부재 또는 측정 불가능한 발현일 수 있다.
유전자 또는 유전자 산물의 발현을 증가시키는 방법은 당업계에 잘 문서화되어 있으며, 예를 들면, 적절한 프로모터에 의한 과발현, 전사 인핸서 또는 해독 인핸서의 사용을 포함한다. 프로모터 또는 인핸서 인자로 작용하는 분리된 핵산 서열은 비이질성 형태의 폴리뉴클레오티드의 적절한 위치 (전형적으로 업스트림)에 도입되어 목적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 상향 조절한다. 예를 들면, 내재적 프로모터는 돌연변이, 결실, 및/또는 치환에 의해 생체 내에서 변할 수 있거나 (Kmiec, US 5,565,350; Zarling 등, WO9322443 참고), 또는 분리된 프로모터는 본 발명의 유전자로부터 적절한 거리와 방향으로 식물 세포 내에 도입될 수 있어 해당 유전자의 발현을 조절한다.
폴리펩티드 발현을 원한다면, 일반적으로 폴리뉴클레오티드 코딩 영역의 3'-말단에 폴리아데닐화 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 영역은 자연 유전자, 다양한 다른 식물 유전자, 또는 T-DNA로부터 유래할 수 있다. 부가된 3' 말단 서열은 예를 들면, 노팔린 신타아제 또는 옥토파인 신타아제 유전자, 또는 대안으로 또 다른 식물 유전자, 또는 덜 바람직하게는 임의의 다른 진핵세포 유전자로부터 유래된다.
세포질 내에 축적되는 성숙된 메세지 양의 증가를 위하여 인트론 서열이 또한 부분적인 코딩 서열의 5' 비해독 영역 (UTR) 또는 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 식물 및 동물 발현 구축물에 있어 전사 단위 내에 스플라이스 가능한 인트론이 포함되면 mRNA 및 단백질 수준에서 유전자 발현이 1000배까지 증가함이 보였다 (Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis 등 (1987) Genes Dev 1:1183-1200). 인트론에 의한 유전자 발현의 상승효과는 전형적으로 전사 단위의 5' 말단 가까이에 위치하였을 때 가장 컸다. 옥수수 인트론 Adh1-S 인트론 1, 2, 및 6, Bronze-1 인트론의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 전반적인 정보는 하기를 참고한다: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).
감소된 발현
본 발명에서 "감소된 발현" 또는 발현의 "감소 또는 실질적인 제거"는 대조구에 비하여 내재적 유전자 발현 및/또는 폴리펩티드 수준 및/또는 폴리펩티드 활성의 감소를 의미한다. 감소 또는 실질적인 제거는 대조구 식물에 비하여 증가하는 순으로 선호되는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 감소된 것이다.
식물체에 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위해서는 충분한 길이의 핵산 서열의 상당히 연속적인 뉴클레오티드가 필요하다. 유전자 침묵을 수행하기 위한 뉴클레오티드는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10개 또는 더 소수의 뉴클레오티드만큼 적을 수도 있고, 대신에 전체 유전자 (5' 및/또는 3' UTR을 포함하여, 일부분 또는 전체)만큼 많을 수도 있다. 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (표적 유전자)로부터, 또는 목적 단백질의 오쏘로그 (orthologue), 패럴로그 (paralogue) 또는 상동체 (homologue)를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산 서열로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 표적 유전자 (센스 또는 안티센스 가닥)와 수소결합을 형성할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드는 표적 유전자 (센스 또는 안티센스 가닥)에 증가하는 순으로 선호되는, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일한 서열을 갖는다. (기능성) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위해 본 발명에서 논의된 다양한 방법에 대한 필요조건은 아니다.
상기 발현의 감소 또는 실질적인 제거는 통상적인 수단 및 기술을 사용하여 이룰 수 있다. 내재적 유전자의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위한 바람직한 방법은 핵산 (이 경우, 목적 유전자 유래의, 또는 목적 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드)이 스페이서 (spacer: 비코딩(non-coding) DNA)로 분리되어 역반복 (inverted repeat: 부분적으로 또는 완전히)으로 클로닝된 유전자 구축물의 식물체로의 도입 및 발현이다.
상기 바람직한 방법에 있어, 내재적 유전자의 발현은 핵산 또는 그 일부 (이 경우, 목적 유전자 유래의, 또는 목적 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드)의, 바람직하게는 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성하는 것이 가능한 역반복을 사용한 RNA 매개 침묵에 의해 감소되거나 또는 실질적으로 제거된다. 상기 역반복 (inverted repeat)은 조절서열을 포함하는 발현벡터로 클로닝된다. 비코딩 DNA 핵산 서열 (스페이서, 예를 들면 matrix attachment region fragment (MAR), 인트론, 폴리링커 등)은 두 역위 핵산 사이에 위치하여 역반복을 형성한다. 역반복의 전사 후, 자체 상보적인 (self-complementary) 구조를 가진 키메릭 (chimeric) RNA가 형성된다 (부분적인 또는 완전한). 상기 이중가닥 RNA 구조를 hpRNA (hairpin RNA)라고 한다. 상기 hpRNA는 식물에 의해 RISC (RNA-induced silencing complex)로 통합되는 siRNA로 가공된다. 상기 RISC는 mRNA 전사물로 쪼개어져, 폴리펩티드로 번역될 mRNA 전사물의 수를 실질적으로 감소시킨다. 더욱 상세한 내용은 예를 들면, Grierson 등 (1998) WO 98/53083; Waterhouse 등 (1999) WO 99/53050를 참고하면 된다.
본 발명의 방법의 수행은 핵산이 역반복으로 클로닝된 유전자 구축물의 식물로의 도입 및 발현에 의존하지 않으나, 임의의 하나 이상의 몇 가지 공지된 "유전자 침묵 (gene silencing)" 방법이 동일한 효과를 얻기 위해 사용될 수 있다.
내재적 유전자 발현의 감소를 위한 상기 방법 중 하나는 유전자 발현의 RNA-매개 침묵 (하향조절 (downregulation))이다. 상기의 경우 침묵 (Silencing)은 목적 내재적 유전자에 실질적으로 유사한 이중가닥 RNA 서열 (dsRNA)에 의해 식물체에서 유발된다. 상기 dsRNA는 식물에 의해 siRNAs (short interfering RNAs)라는 약 20 내지 약 26개의 뉴클레오티드로 더 가공된다. 상기 siRNAs는 내재적 표적 유전자의 mRNA 전사물을 쪼개는 RISC (RNA-induced silencing complex)로 통합되며, 그로 인하여 실질적으로 폴리펩티드로 해독될 mRNA 전사물의 수를 감소시킨다. 바람직하게는, 이중가닥 RNA 서열이 표적 유전자에 해당한다.
RNA 침묵 방법의 또 다른 예는 핵산 서열 또는 그 일부 (이 경우, 관심있는 유전자 유래의, 또는 관심있는 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드)를 센스 방향으로 식물체로의 도입을 포함한다. "센스 방향"은 해당 mRNA 전사물에 상동인 DNA 서열을 말한다. 식물로 도입되면 따라서 적어도 한 카피의 핵산 서열이다. 부가적인 핵산 서열은 내재적 유전자의 발현을 감소시켜, 공억제 (co-suppression)라 알려진 현상이 생긴다. 높은 전사물 수준 및 공억제 (co-suppression)의 유발 간에는 양의 상관관계가 있으므로 유전자 발현의 감소는 몇 부가적인 카피의 핵산 서열이 식물체 내로 도입되면 더욱 현저해질 것이다.
RNA 침묵 방법의 또 다른 예는 안티센스 (antisense) 핵산 서열의 사용을 포함한다. "안티센스" 핵산 서열은 단백질을 코딩하는 "센스 (sense)" 핵산 서열에 상보적인, 즉 이중 가닥 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적인 또는 mRNA 전사물 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 안티센스 핵산 서열은 바람직하게는 침묵 (silencing)하게 될 내재적 유전자에 상보적이다. 상기 상보성은 유전자의 "코딩 영역" 및/또는 "비코딩 영역 (non-coding region)"에 위치할 수 있다. 용어 "코딩 영역"은 아미노산 잔기로 해독되는 코돈 (codon)을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 말한다. "비코딩 영역 (non-coding region)"은 전사는 되나 아미노산으로 해독되지 않는, 코딩 영역을 플랭킹하는 5' 및 3' 서열을 말한다 (또한 5' 및 3' 비해독 영역이라 한다).
안티센스 핵산 서열은 Watson 및 Crick 염기 페어링 (base pairing)의 방식에 따라 디자인될 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 전체 핵산 서열 (이 경우, 목적 유전자 유래의, 또는 목적 단백질의 오쏘로그, 패럴로그 또는 상동체를 코딩하는 것이 가능한 임의의 핵산 유래의 상당한 길이의 연속적인 뉴클레오티드)에 상보적일 수 있으나, 또한 핵산 서열의 일부 (mRNA 5' 및 3' UTR 포함)에 대해서만 안티센스인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 전사물의 해독 개시부위 주변의 영역에 상보적일 수 있다. 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열의 길이는 당업계에 공지되어 있으며 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10개의 뉴클레오티드 길이 또는 그 이하일 수 있다. 본 발명에 따른 안티센스 핵산 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적 합성 및 효소적 라이게이션 반응으로 구축될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 핵산 서열 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열)은 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 또는 안티센스 및 센스 핵산 서열 간에 형성된 이중선 (duplex)의 물리적 안정성을 증가시키기 위해 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 유도체 및 아크리딘 (acridine) 치환 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산 서열의 생성에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 당업계에 주지되어 있다. 알려진 뉴클레오티드 변형은 메틸화 (methylation), 고리화 (cyclization) 및 '캡 (caps)' 및 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 이노신 (inosine)과 같은 유사체 (analogue)로의 치환을 포함한다. 뉴클레오티드 변형의 다른 경우는 당업계에 주지되어 있다.
안티센스 핵산 서열은 핵산 서열이 안티센스 방향으로 서브클로닝된 (즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 목적 핵산에 대해 안티센스 방향일 수 있다) 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 식물에서 안티센스 핵산 서열의 생성은 프로모터, 작동가능하게 연결된 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 종결신호 (terminator)를 포함하여 안정적으로 통합된 핵산 구축물을 통해 일어난다.
본 발명의 방법에서 침묵에 사용된 핵산 분자 (식물로 도입되거나 또는 인 시투로 생성되거나)는 mRNA 전사물 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA와 혼성화하거나 또는 이들에 결합하여, 그로 인하여 예를 들면, 전사 및/또는 해독을 저해함으로서 단백질의 발현을 저해한다. 상기 혼성화는 안정적인 이중선 (duplex)를 형성하기 위해 전형적인 뉴클레오티드 상보성에 의해 이루어질 수 있거나, 또는, 예를 들면, DNA 이중선 (duplexes)에 결합하는 안티센스 핵산 서열의 경우에, 이중 나선 (double helix)의 깊은 홈 (major groove)에서의 특정 상호작용을 통해 이루어질 수 있다. 안티센스 핵산 서열은 형질전환에 의해 또는 특정 조직 부위에서 직접적인 주입에 의해 식물체로 도입될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 핵산 서열은 선발된 세포를 표적화하기 위해 변형되어, 체계적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 체계적인 도입을 위해, 안티센스 핵산 서열은 변형될 수 있어, 상기 서열은 예를 들면, 안티센스 핵산 서열을 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩티드 또는 항원에 연결함으로써 선발된 세포 표면상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합한다. 상기 안티센스 핵산 서열은 또한 본 발명에서 기재된 벡터를 사용하여 세포로 전달될 수 있다.
추가적인 양상에 따라, 상기 안티센스 핵산 서열은 a-아노머 핵산 서열이다. a-아노머 핵산 서열은 상보적인 RNA와 특정 이중가닥 혼성체 (hybrid)를 형성하며, 상기에서 보통의 b-units과 달리 상기 이중 가닥은 서로 평행이다 (Gaultier 등 (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). 상기 안티센스 핵산 서열은 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue 등 (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) 또는 키메릭 (chimeric) RNA-DNA 유사체 (analogue) (Inoue 등 (1987) FEBS Lett. 215, 327-330)를 포함할 수 있다.
내재적 유전자 발현의 감소 또는 사실상의 제거는 또한 리보자임 (ribozyme)을 사용하여 수행될 수 있다. 리보자임 (ribozyme)은 상보적인 영역을 갖는 부위에서 mRNA와 같은 단일 가닥인 핵산 서열을 절단할 수 있는 리보핵산가수분해효소 (ribonuclease) 활성을 가진 촉매성 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임 (예를 들면, 햄머헤드 (hammerhead) 리보자임 (Haselhoff 및 Gerlach (1988) Nature 334, 585-591 참조)은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 전사물의 촉매적 절단에 사용될 수 있어, 그로 인하여 폴리펩티드로 해독될 mRNA 전사물의 수를 실질적으로 줄인다. 핵산 서열에 대해 특이성을 가진 리보자임이 디자인될 수 있다 (예를 들면: Cech 등 U.S. Patent No. 4,987,071; 및 Cech 등 U.S. Patent No. 5,116,742 참고). 대안적으로, 핵산 서열에 해당하는 mRNA 전사물이 RNA 분자의 풀 (pool)로부터 특정 리보핵산가수분해효소 (ribonuclease) 활성을 가진 촉매성 RNA의 선발에 사용될 수 있다 (Bartel 및 Szostak (1993) Science 261, 1411 -1418). 식물에서 유전자 침묵 (gene silencing)을 위한 리보자임의 사용은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, Atkins 등 (1994) WO 94/00012; Lenne 등 (1995) WO 95/03404; Lutziger 등 (2000) WO 00/00619; Prinsen 등 (1997) WO 97/13865 및 Scott 등 (1997) WO 97/38116).
유전자 침묵 (gene silencing)은 또한 삽입 돌연변이 유발 (예를 들면, T-DNA 삽입 또는 트랜스포존 삽입)에 의해 또는 Angell 및 Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), 또는 Baulcombe (WO 99/15682)에 기재된 전략에 의해서도 수행될 수 있다.
유전자 침묵은 또한 내재적 유전자상에 돌연변이 및/또는 실질적으로 식물체로 도입될 분리된 유전자/핵산에 돌연변이의 존재 시 발생할 수 있다. 상기 감소 또는 사실상의 제거는 기능이 없는 폴리펩티드에 의해서도 야기될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드가 다양한 상호작용하는 단백질에 결합할 수 있다; 하나 이상의 돌연변이(들) 및/또는 절단(들)은 따라서, 상호작용하는 단백질 (수용체 단백질과 같은)에 결합할 수는 있으나 정상적인 기능(신호전달 리간드와 같은)을 나타낼 수 없는 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
유전자 침묵의 또 다른 방법은 표적 세포 내 유전자의 전사를 막는 3중 나선 (triple helical) 구조를 형성하기 위해 유전자의 조절 영역 (예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 핵산 서열을 표적화하는 것이다. [Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene 등 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; 및 Maher, LJ. Bioassays 14, 807-15, 1992]을 참조하면 된다.
식물체 내에서의 기능 저해를 위해 내재적 폴리펩티드에 대한 항체의 사용, 또는 폴리펩티드가 관여되는 신호전달 경로 (signalling pathway)의 방해와 같은 다른 방법들이 당업자에게 주지되어 있다. 특히, 인공합성 분자가 표적 폴리펩티드의 생물학적 기능을 저해하거나 또는 표적 폴리펩티드가 관여되는 신호전달 경로의 방해에 유용할 수 있다는 것을 고려할 수 있다.
대안적으로, 유전자의 식물 개체군 자연 변이체를 동정하기 위해 스크리닝 프로그램이 셋업될 수도 있으며, 상기 변이체는 활성이 감소된 폴리펩티드를 코딩한다. 상기 자연 변이체는 또한 예를 들면, 상동 재조합의 수행에 사용될 수 있다.
인공적인 및/또는 자연적인 miRNAs (microRNAs)가 유전자 발현 및/또는 mRNA 해독을 넉아웃 (knock out)하는 데 사용될 수 있다. 내재적 miRNAs는 전형적으로 19-24개 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥의 작은 RNAs이며, 주로 유전자 발현 및/또는 mRNA 해독을 조절하는 작용을 한다. 대부분의 식물 miRNAs (microRNAs)는 표적 서열에 완전한 또는 완전에 가까운 상보성을 가진다. 그러나, 5개까지의 미스매치 (mismatches)를 가진 자연적인 표적이 있으며, 다이서 (Dicer) 패밀리의 이중 가닥 특정 RNases에 의해 특징적인 폴더백 (fold-back) 구조를 가진 더욱 긴 넌코딩 (non-coding) RNAs로부터 가공될 수 있다. 가공 (processing)으로, 주성분인 Argonaute 단백질에 결합함으로써 RISC (RNA-induced silencing complex)로 통합된다. MiRNAs는 세포질 내에서 표적 핵산, 대개 mRNAs와 염기쌍을 이루므로 RISC의 특이성 요소로서 작용한다. 연이은 조절은 표적 mRNA 절단 및 붕괴 및/또는 해독 저해를 포함한다. miRNA 과발현의 효과는 따라서 표적 유전자의 감소된 mRNA 수준으로 흔히 반영된다.
전형적으로 21개 뉴클레오티드 길이인 인공적인 microRNAs (amiRNAs)가 하나 또는 다수의 목적 유전자의 유전자 발현을 특이적으로 음성적으로 조절하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 식물 microRNA 표적 선발의 결정인자는 당업계에 주지되어 있다. 표적 인지에 대한 경험적 매개변수는 정해져 있으며, 특정 amiRNAs의 디자인에 도움이 되게 사용될 수 있다 (Schwab 등 Dev. Cell 8, 517-527, 2005). amiRNAs 및 이의 전구체의 디자인 및 생성을 위한 편리한 수단은 또한 공개되어 있다 (Schwab 등 Plant Cell 18, 1 121-1 133, 2006).
최적의 수행을 위해, 내재적 유전자의 식물에서의 발현을 감소시키기 위해 이용하는 유전자 침묵 기술은 단자엽 식물의 형질전환을 위해서는 단자엽 식물 유래의 핵산 서열을, 쌍자엽 식물의 형질전환을 위해서는 쌍자엽 식물 유래의 핵산 서열을 사용할 것이 요구된다. 바람직하게는, 임의의 해당 식물 종의 핵산 서열이 동일 생물종에 도입된다. 예를 들면, 벼 유래의 핵산 서열은 벼 식물로 형질전환된다. 그러나, 도입될 핵산 서열이 도입될 식물과 동일 식물 종으로부터 유래해야 한다는 것은 절대적인 필요조건은 아니다. 내재적 표적 유전자 및 도입될 핵산 간에 실질적인 상동성이 있으면 충분하다.
상기 기재된 것은 내재적 유전자의 식물에서의 발현의 감소 또는 실질적인 제거를 위한 다양한 방법의 예이다. 당업자는 전체 식물 또는 그 일부에서 내재적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 침묵을 위해, 예를 들면, 적절한 프로모터를 사용하여 상기 언급된 방법을 용이하게 변형할 수 있다.
형질전환
본 발명에 언급된 용어 "도입" 또는 "형질전환"은 전달에 사용된 방법에 관계없이 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 전달을 포함한다. 기관 발생이나 배발생에 의하여 연이은 클론 번식이 가능한 식물 조직은 본 발명의 유전자 구축물로 형질전환될 수 있으며, 전체 식물체가 이로부터 재생된다. 선택된 특정 조직은 형질전환될 특정 종에 이용 가능하며 가장 잘 맞는 클론 번식 시스템에 따라 다양할 것이다. 전형적인 조직 표적은 잎 디스크, 화분, 배, 자엽, 하배축, 대배우체, 캘러스 조직, 분열조직 (예를 들면, 정단 분열조직, 액아, 및 뿌리 분열조직), 및 유도된 분열조직 (예를 들면, 자엽 분열조직 및 하배축 분열조직)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 일시적으로 또는 안정적으로 숙주 세포에 도입되며 예를 들면, 플라스미드처럼 비통합적으로 유지된다. 다르게는, 숙주 게놈으로 통합된다. 결과적인 형질전환 식물 세포는 당업자에게 주지된 방식으로 형질전환 식물을 재생하는데 사용된다. 대안적으로, 식물로 재분화되지 못하는 식물 세포가 숙주 세포로, 즉 (전체) 식물로 재분화하는 능력을 갖지 않는 형질전환된 식물 세포가 숙주 세포로 선발될 수 있다.
외래 유전자의 식물 게놈으로 전달을 형질전환이라 부른다. 식물 종의 형질전환은 일상적인 기술이다. 유리하게도, 임의의 몇 가지 형질전환 방법이 목적 유전자를 적절한 조상 세포로의 도입에 사용될 수 있다. 식물 조직 또는 식물 세포로부터 식물의 형질전환 및 재생에 관하여 기재된 방법은 일시적인 또는 안정한 형질전환에 이용될 수 있다. 형질전환 방법은 리포좀, 전기천공법, 유리 DNA 흡수를 증가시키는 화학물질, 식물체 내로 DNA의 직접적인 주입, 입자총 충격법, 바이러스 또는 화분을 이용한 형질전환 및 미세주입 (microprojection)을 포함한다. 방법은 원형질에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법 (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); 원형질의 전기천공법 (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); 식물로 미세주사 (microinjection) (Crossway et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); DNA 또는 RNA 코팅된 입자 충격법 (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) (비통합적) 바이러스로 감염 등으로부터 선택할 수도 있다. 형질전환 작물을 포함한 형질전환 식물은 바람직하게는 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 제조된다. 유리한 형질전환방법은 식물체에서의 형질전환이다. 이를 위해, 예를 들면, 아그로박테리아를 식물 종자 상에 작용하게 하거나 식물 분열조직을 아그로박테리아로 접종하는 것이 가능하다. 형질전환된 아그로박테리아의 현탁액을 온전한 식물이나 적어도 꽃 원기에 작용하게 하는 것이 본 발명에 따라 특히 편리하다는 것이 입증되었다. 처리된 식물의 종자를 얻을 때까지 식물체를 키운다 (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). 벼의 아그로박테리움 매개 형질전환 방법은 하기 임의의 것에 기재된 것처럼 벼 형질전환에 관한 잘 알려진 방법들을 포함한다: 유럽특허출원 EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan 등 (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei 등 (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), 상기 명세서는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 참조문헌으로 통합된다. 옥수수 형질전환의 경우에, 바람직한 방법은 Ishida 등 (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) 또는 Frame 등 (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002)에 기재된 것이며, 상기 명세서는 충분히 설명한 것처럼 본 발명에 참조문헌으로 통합된다. 상기 방법들은 [B. Jenes 등, Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143] 및 [Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225]에 예로서 기재되어 있다. 핵산 또는 발현될 구축물은 바람직하게는 아그로박테리움 투머파시엔스 형질전환에 적절한 벡터, 예를 들면 pBin19 내로 클로닝된다 (Bevan 등, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리아가 애기장대처럼 모델로 사용된 식물 (본 발명의 범위 내의 애기장대 (아라비돕시스 탈리아나)는 작물로 고려되지 않는다)이나 예로서 담배 같은 작물의 예를 들면, 상처 내거나 잘게 썬 잎을 아그로박테리아 용액에 적신 후 적절한 배지에 배양하는 것과 같은 식물 형질전환을 위해 알려진 방식으로 사용될 수 있다. 아그로박테리움 투머파시엔스에 의한 식물의 형질전환은 예를 들면, [Hofgen and Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877]에 의하여 기재되었거나, 특히 [F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38]에 알려져 있다.
온전한 식물로 재생되는 체세포의 형질전환 외에, 식물의 분열조직 세포 특히 배우자로 발달하는 세포의 형질전환이 가능하다. 이 경우에, 형질전환된 배우자는 자연적인 식물 발달 과정을 거쳐 형질전환 식물이 된다. 따라서 예를 들면, 애기장대의 종자가 아그로박테리아로 처리되고, 발달하는 식물체로부터 취한 종자 중의 일부분이 형질전환되어 형질전환 식물체로 된다 [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1-9; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. 또 다른 방법은 화서의 반복적인 제거에 근거하며 근생엽 중앙의 절단 부위를 형질전환된 아그로박테리아와 함께 배양하면 형질전환된 종자를 이후에 얻을 수 있다 (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). 그러나, 특히 효과적인 방법은 화서 담그기 ("floral dip") 방법의 변형인 진공 침윤 (vacuum infiltration)이다. 애기장대의 진공 침윤의 경우, 감압 하에 온전한 식물체를 아그로박테리아 현탁액으로 처리하는 것이고 [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], "화서 담그기법"에서는 발달 중인 화서 조직을 계면활성제가 처리된 아그로박테리아 현탁액과 잠깐 배양하는 것이다 [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. 양 경우에 특정 비율의 형질전환 종자가 수확되며, 이들 종자는 상기 기재된 선발 조건 하에서 재배함으로써 형질전환되지 않은 종자와 구분된다. 색소체는 모계로 유전되기 때문에 색소체의 안정적인 형질전환의 이점은 대부분의 작물에서 화분을 통한 외래유전자의 흐름의 위험이 감소되거나 제거된다는 점이다. 엽록체 게놈의 형질전환은 일반적으로 Klaus 등, 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]에 체계적으로 표시된 과정에 의하여 수행된다. 간단히, 형질전환될 서열을 선발 마커 유전자와 함께 엽록체 게놈에 상동인 플랭킹 서열 사이에 클로닝한다. 이들 상동 플랭킹 서열이 플라스톰 (plastome) 내로 특이적으로 통합된다. 색소체 형질전환은 많은 다른 식물 종에 대해 기술되어 왔으며, 개관은 [Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 or Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28]에 있다. 추가의 생물공학적 진보는 마커 없는 색소체 형질전환체의 형태로 최근 보고되었으며, 이는 일시적인 동시통합된 (co-integrated) 마커 유전자에 의해 생성될 수 있다 (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
유전적으로 변형된 식물 세포는 당업자에게 친숙한 모든 방법을 통해서 재분화될 수 있다. 적절한 방법은 앞서 언급된 S.D. Kung 및 R. Wu, Potrykus 또는 Hofgen 및 Willmitzer의 문헌에서 찾을 수 있다. 대안적으로, 유전적으로 변형된 식물 세포는 전체 식물체로의 재분화가 불가능할 수 있다.
일반적으로 형질전환 후, 식물 세포 또는 세포 집단은 목적 유전자와 함께 전달된 식물에서 발현 가능한 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 마커의 존재에 대하여 선발되어, 형질전환된 재료는 온전한 식물로 재분화된다. 형질전환 식물을 선발하기 위하여, 형질전환에서 얻은 식물 재료는 대체로 선택적 조건 하에 두어, 형질전환 식물이 형질전환되지 않은 식물과 구분될 수 있게 한다. 예를 들면, 상기 기재된 방식으로 얻은 종자를 심고, 초기 생장기간 후, 분무에 의해 적절한 선발을 하게 된다. 추가의 가능한 방법으로는, 종자를 멸균하여 적절한 선발물질을 사용하여 한천 판에 키우면, 형질전환된 종자만 식물체로 자랄 수 있다. 다르게는, 형질전환 식물은 상기 기재된 것과 같은 선발 마커의 존재에 대하여 가려진다.
DNA 전달 및 재분화에 이어, 형질전환된 것으로 추정되는 식물은 또한 예를 들면, 목적 유전자의 존재, 카피 수 및/또는 게놈 조직에 대하여 서던 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 새로이 도입된 DNA의 발현수준을 노던 및/또는 웨스턴 분석으로 측정할 수 있으며, 두 기술은 당업자에게 주지되어 있다.
생성된 형질전환된 식물은 클론 번식 또는 전통적인 육종 기술 같은 다양한 수단으로 증식될 수 있다. 예를 들면, 제1세대 (또는 T1) 형질전환 식물은 자가교배되고, 동형접합 제2세대 (또는 T2) 형질전환체가 선발되어, T2 식물은 전통적인 육종 기술로 더 증식된다. 생성된 형질전환된 생물체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들면, 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포의 키메라; 클론 형질전환체 (예를 들면, 발현카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환된 및 형질전환되지 않은 조직의 그라프트 (graft) (예를 들면, 식물에 있어 형질전환되지 않은 접순에 접목된 형질전환된 대목)일 수 있다.
T- DNA 활성화 태깅
"T-DNA 활성화" 태깅 (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353)은 보통 프로모터 (또한 해독 인핸서 또는 인트론)를 함유하는 T-DNA를 프로모터가 표적 유전자의 발현을 지시하게 배치되어 목적 유전자의 게놈 영역 내로 또는 유전자 코딩 영역의 10 kb 업스트림 또는 다운스트림으로 삽입하는 것을 포함한다. 전형적으로, 자체의 자연 프로모터에 의한 표적 유전자 발현의 조절은 붕괴되고 유전자는 새로 도입된 프로모터의 조절하에 있게 된다. 프로모터는 전형적으로 T-DNA 내에 끼워져 있다. 이 T-DNA는 식물 게놈 내에 예를 들면, 아그로박테리움 감염을 통하여 무작위로 삽입되며 삽입된 T-DNA 인근의 유전자의 변형된 발현을 이끈다. 결과적인 형질전환 식물은 도입된 프로모터에 가까운 유전자의 변형된 발현으로 인하여 우성 표현형을 보인다.
틸링 ( TILLING )
용어 "틸링 (TILLING)"은 "Targeted Induced Local Lesions In Genomes"의 약어이며 변형된 발현 및/또는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산을 생성 및/또는 동정하는데 유용한 돌연변이유도 기술을 말한다. 틸링은 또한 상기 돌연변이체를 갖는 식물의 선발을 가능하게 한다. 이들 돌연변이체는 강도나 위치 또는 시기상의 변형된 발현을 보인다 (만일 돌연변이가 프로모터에 영향을 준다면). 이들 돌연변이체는 자체의 자연적 형태의 유전자에 비하여 훨씬 높은 활성을 나타낸다. 틸링은 고밀도 돌연변이 유발과 고속처리 탐색 방법을 조합한 것이다. 틸링의 전형적인 단계는 하기와 같다: (a) EMS 돌연변이유발 (Redei GP 및 Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chu NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, pp. 1682; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) DNA 준비 및 개체의 풀링 (pooling); (c) 목적 영역의 PCR 증폭; (d) 이형 이중 가닥 (heteroduplexes)이 되게 변성 및 어닐링; (e) DHPLC로 이형 이중 가닥이 풀(pool) 안에 있는지를 크로마토그램 상의 여분의 정점으로 검출; (f) 돌연변이체 개체의 동정; (g) 돌연변이체 PCR 산물의 염기서열결정. 틸링의 방법은 당업계에 주지되어 있다 (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).
상동 재조합
상동 재조합은 정해진 선택된 위치에 선택된 핵산이 게놈 내로 도입되게 한다. 상동 재조합은 생물학에서 효모 또는 선류 (Physcomitrella) 같은 하등생물에 대해 통상적으로 사용되는 표준기술이다. 식물에서 상동 재조합을 수행하는 방법은 모델 식물 (Offring et al. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84)에 대해서 뿐 아니라 작물 예를 들면, 벼 (Terad et al. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; Iid and Terad (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8)에 대해서도 기재된 바 있고, 일반적으로 목적 생물체에 구애받지 않고 적용 가능한 접근법이 존재한다 (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).
수확량 관련 형질(들)
"수확량 관련 형질"은 식물 수확량에 관련된 형질 또는 특징이다. 수확량 관련 형질은 빠른 개화 시기, 수확량, 생물량 (biomass), 종자 수확량, 초기 활력, 녹색지수, 생장 속도, 침수에 대한 내성 (벼에서 수확량 유도)과 같은 농업 형질, 물 이용 효율 (WUE), 질소 이용 효율 (NUE) 등의 특징 중 제한되지 않는 목록의 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 향상된 수확량 관련 형질은 대조구 식물에 비하여 (i) 지상부 및 바람직하게는 수확 가능한 지상부 및/또는 (ii) 지하부 및 바람직하게는 수확 가능한 지하부를 포함하는, 식물의 한 부분 이상의 초기 활력 및/또는 생물량 (중량)의 하나 이상의 증가를 의미한다. 특히, 상기 수확 가능한 부분은 종자이다.
수확량
일반적인 의미에서의 용어 "수확량"은 경제적 가치 있는 측정 가능한 생산량을 말하며, 전형적으로 특정 작물, 면적, 및 기간에 관련이 있다. 개개 식물체 부분이 직접적으로 수, 크기 및/또는 중량에 근거한 수확량에 기여하거나, 또는 실제 수확량은 작물 및 년에 대해 평방 미터 당 수확량이고, 이는 총생산량 (수확된 및 평가된 생산량을 포함)을 재배된 평방 미터로 나눔으로써 결정된다.
용어 식물의 "수확량" 및 "식물 수확량"은 본 발명에서 호환성 있게 사용되고, 뿌리 및/또는 줄기 생물량과 같은 식물의 생물량, 생식 기관, 및/또는 그 식물의 종자와 같은 번식체 (propagule)로 언급될 수 있다.
옥수수의 꽃은 단성 (unisexual)으로 수꽃차례 (male inflorescence, tassel)는 줄기 정단에서 발생하고, 암꽃차례 (ear)는 액아 정점 (axillary bud apex)에서 발생한다. 암꽃차례는 중앙 축 (cob)의 표면에 작은 이삭 쌍을 생성한다. 암꽃 이삭 각각은 2개의 수정가능한 소화 (floret)를 가지며, 그중 하나는 보통 수정되면 옥수수 낱알로 성숙하게 된다. 따라서 옥수수에서 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상으로 표시된다: 평방 미터 당 식물체의 수 증가, 식물체 당 이삭 (열매) 수의 증가, 낱알 줄의 수, 줄 당 낱알의 수, 낱알 중량, 천립 중량, 열매 길이/직경의 증가, 충전된 소화의 수 (즉, 종자를 함유하는 소화)/전체 소화의 수 ×100인 종자 충전율의 증가.
벼 식물에서 꽃차례는 원추화서라고 불린다. 상기 원추화서는 작은 이삭을 지니며, 상기 작은 이삭은 원추화서의 기본 단위이고, 소수경 (pedicel) 및 소화로 구성된다. 소화는 소수경 위에 생기고, 큰 영포 (glume, 포엽, lemma) 및 짧은 영포 (내화영, palea)로 이루어지는 2개의 보호적인 포엽에 감싸진 꽃을 포함한다. 따라서, 벼를 예로 들면, 수확량 증가는 다음 중의 하나 이상의 증가로 표시된다: 평방 미터 당 식물체의 수, 식물체 당 원추화서의 수, 원추화서의 길이, 원추화서 당 작은 이삭의 수, 원추화서 당 꽃 (또는 소화)의 수; 충전된 소화 (즉, 종자를 함유하는 소화)의 수/전체 소화의 수×100인 종자 충전율의 증가; 천립 중량의 증가.
조기 개화 시기
본 발명에 사용된 "조기 개화 시기"를 갖는 식물은 대조구 식물보다 빠르게 개화하기 시작하는 식물이다. 따라서, 상기 용어는 조기 개화 시작을 나타내는 식물을 의미한다. 식물의 개화 시기는 파종과 첫 번째 꽃차례의 출현 사이의 일수 ("개화하는 시간")를 계산하여 평가될 수 있다. 식물의 "개화 시기"는 예를 들면 WO 2007/093444에 기재된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
초기 활력
"초기 활력" 특히 식물 생장의 초기 단계 중에 활기차고 건강하게 잘 균형을 이룬 생장을 말하며, 예를 들면, 식물이 환경에 보다 잘 적응함으로 인하여 (즉, 에너지 자원 사용이 최적화되고 어린 줄기와 뿌리 간에 분배됨) 증가된 식물체의 적응성에 기인할 것이다. 초기 활력을 갖는 식물은 또한 증가된 실생 생존 및 보다 나은 작물 생성을 보여주며, 이는 흔히 고도로 균일한 밭 (균일한 양상으로 자라는 작물, 즉 대다수의 식물이 사실상 거의 동시에 다양한 발달단계에 이르는)과 흔히 보다 낫고 보다 높은 수확량이 된다. 따라서, 초기 활력은 천립 중량, 발아율, 출현율, 실생 생장, 실생 높이, 뿌리 길이, 뿌리 및 어린 줄기 생물량 등과 같은 다양한 요인들을 측정함으로써 결정될 수 있다.
증가된 생장 속도
증가된 생장 속도는 식물체의 하나 이상의 부분 (종자 포함)에 특이적이거나, 또는 실질적으로 전체 식물에 걸쳐서일 수도 있다. 증가된 생장 속도를 가진 식물은 보다 짧은 생활사를 가질 수 있다. 식물의 생활사는 성숙 종자로부터 식물체가 출발 물질과 유사한 성숙한 종자를 생산하는 단계까지 자라는데 필요한 시간을 의미하는 것일 수 있다. 상기 생활사는 발아의 속도, 초기 활력, 생장 속도, 녹색 지수, 개화 시기 및 종자 성숙 속도와 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있다. 생장 속도의 증가는 식물의 생활사 중의 하나 이상의 단계에서 또는 실질적으로 전체 식물 생활사 중에 나타날 수 있다. 식물의 생활사 중의 초기 단계 중에 증가된 생장 속도는 향상된 활력을 반영한다. 생장 속도의 증가는 그렇지 않았으면 가능했을 시기보다 식물을 늦게 파종하고/하거나 이르게 수확하게 함으로써 식물의 수확 주기를 변경할 수도 있다 (비슷한 효과는 보다 이른 개화시기로 얻을 수 있다). 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 동일 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 한 생장기간 내에 벼의 파종 및 수확 후에 잇따라 벼의 파종 및 수확). 유사하게 만일 생장 속도가 충분히 증가하면 다른 식물 종의 잇따른 파종이 가능하다 (예를 들면, 옥수수 식물의 파종 및 수확 후에 예를 들면, 대두, 감자 또는 임의의 다른 적절한 식물의 파종 및 선택적 수확). 일부 작물의 경우 동일한 근경으로부터 부가적인 횟수의 수확도 가능하다. 식물의 수확 주기 변경은 평방 미터 당 연간 생물량 생산의 증가로 이끈다 ((말하자면 일년 내) 임의의 식물을 재배하여 수확하는 횟수의 증가로 인하여). 작물 생육에 대한 지형적인 제한은 이식기에 (초기) 또는 수확기에 (후기) 흔히 불리한 환경 조건에 의해 결정되므로, 생장 속도 증가는 야생형에 비하여 보다 넓은 지리적 지역에 형질전환 식물이 재배되게 한다. 상기 불리한 조건은 수확 주기가 짧아지면 피할 수 있다. 생장 속도는 생장 곡선으로부터 다양한 매개변수를 유도함으로써 결정될 수 있으며, 상기 매개변수는 T-Mid (식물이 최대 크기의 50%에 이를 때까지 걸린 시간) 및 T-90 (식물이 최대 크기의 90%에 이를 때까지 걸린 시간)이다.
스트레스 저항성 ( Stress resistance )
식물이 스트레스가 없는 조건 하에 있든지 식물이 대조구 식물에 비하여 다양한 스트레스에 노출되든지 간에 수확량 및/또는 생장 속도의 증가가 생긴다. 식물은 전형적으로 보다 느리게 성장함으로써 스트레스에 대한 노출에 반응한다. 심각한 스트레스 하에서 식물의 생장이 중단되기도 한다. 다른 한편으로 본 발명에서 순한 스트레스는 식물이 노출됨으로써 생장을 재개하는 능력 없이 생장을 중단하게 하지 않는 임의의 스트레스로 정의된다. 본 발명이 의미하는 순한 스트레스는 스트레스 받은 식물의 생장 감소가 스트레스가 없는 조건 하의 대조구 식물에 비하여 40%, 35%, 30% 또는 25% 미만, 더욱 바람직하게는 20% 또는 15% 미만이다. 실제 농업상의 진전 (관개, 시비, 살충제 처리)으로 인하여 심각한 스트레스가 재배 작물에 가해지지는 않는다. 결과적으로 순한 스트레스에 의해 유도되는 손상된 생장은 흔히 농업에서는 바람직하지 않은 특징이다. 비생물적 스트레스는 가뭄 또는 과도한 수분, 혐기적 스트레스, 염분 스트레스, 화학적 독성, 산화적 스트레스 및 더운, 추운 또는 동결 (freezing) 온도에 의한 것이다.
"생물적 스트레스"는 전형적으로 병원균, 예를 들면, 세균, 바이러스, 균류, 선형동물 및 곤충에 의한 스트레스이다.
"비생물적 스트레스"는 예를 들면 가뭄에 의한 수분 스트레스, 염분 스트레스, 또는 동결 스트레스에 의한 삼투 스트레스일 수 있다. 비생물적 스트레스는 또한 산화적 스트레스 또는 저온 스트레스일 수 있다. "동결 스트레스"는 동결 온도, 즉, 이용가능한 물 분자가 동결되어 얼음으로 바뀌는 온도에 의한 스트레스를 의미한다. "냉각(chilling) 스트레스"로도 불리는 "저온 (cold) 스트레스"는 예를 들면 10℃ 미만의 온도 또는 바람직하게는 5℃ 미만의 온도, 그러나 물 분자가 동결되지 않는 차가운 온도를 의미한다. Wang 등 (Planta (2003) 218: 1-14)에 보고된 바와 같이, 비생물적 스트레스는 일련의 형태적, 생리적, 생화학적 및 분자적 변화를 이끌어 식물 생장 및 생산성에 불리한 영향을 미친다. 가뭄, 염분, 극단적인 온도 및 산화적 스트레스는 상호 연관된 것으로 알려져 있으며, 유사한 기작을 통하여 생장 및 세포 손상을 유도할 수 있다. Rabbani 등 (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767)은 특히 가뭄 스트레스와 고염도 스트레스 간에 고도의 "혼선"을 기재하고 있다. 예를 들면, 가뭄 및/또는 염분은 일차적으로 삼투 스트레스로 나타나서 세포 내 항상성 및 이온 분포의 파괴를 야기한다. 흔히 고온 또는 저온을 동반하는 산화적 스트레스, 염분 또는 가뭄 스트레스는 기능적 및 구조 단백질의 변성을 야기한다. 결국 이들 다양한 환경적 스트레스는 흔히 유사한 세포 신호전달 경로 및 스트레스 단백질 생산, 항산화제 상향조절, 친화성 용질 축적 및 생장 정지 같은 세포 반응을 활성화한다. 본 발명에서 사용된 용어 "스트레스가 없는" 조건은 식물의 최적 생장을 허용하는 환경 조건이다. 당업자는 주어진 위치에서 정상적인 토양 조건 및 기후 조건을 인식하고 있다. 최적의 성장 조건에서 (스트레스가 없는 조건 하에서 자랄 때) 식물은 일반적으로 주어진 환경에서 그 식물의 평균 생산량의 증가하는 순으로 선호되는 적어도 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% 또는 75%를 생산한다. 평균 생산량은 수확 및/또는 계절에 근거해서 계산될 수 있다. 당업자는 작물의 평균 수확량 생산을 인식하고 있다.
특히, 본 발명의 방법은 스트레스가 없는 조건 하에서 수행될 수 있다. 한 예에서 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위해 순한 가뭄 같은 스트레스가 없는 조건 하에서 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 스트레스 조건 하에서 수행될 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위해 가뭄과 같은 스트레스 조건 하에서 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위해 양분 결핍과 같은 스트레스 조건 하에서 수행될 수 있다.
양분 결핍은 질소, 인산염 및 다른 인 함유 화합물, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간, 철 및 붕소 같은 양분 부족의 결과이다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위해 염분 스트레스와 같은 스트레스 조건 하에서 수행될 수 있다. 용어 염분 스트레스는 통상적인 소금 (NaCl)에 제한되는 것이 아니라, NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2 중 임의의 하나 이상일 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 대조구 식물에 비해 증가된 수확량을 갖는 식물을 제공하기 위해 저온 스트레스 또는 동결 스트레스와 같은 스트레스 조건 하에서 수행될 수 있다.
증가/향상/강화
용어 "증가", "향상", 또는 "강화"는 서로 호환성 있게 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 대조구 식물과 비교하여 적어도 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%, 바람직하게는 적어도 15% 또는 20%, 더욱 바람직하게는 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상의 수확량 및/또는 생장을 의미한다.
종자 수확량
증가된 종자 수확량은 다음 중 하나 이상으로 나타난다:
(a) 개별 종자 당 및/또는 식물체 당 및/또는 평방 미터 당의 종자 생물량 (총 종자 중량)의 증가;
(b) 식물체 당 꽃 수의 증가;
(c) 증가된 종자의 수;
(d) 증가된 종자 충전율 (충전된 소화의 수를 총 소화 수로 나눈 비로 나타냄);
(e) 증가된 수확 지수 (종자 같은 수확할 수 있는 부분의 수확량을 식물 지상부의 생물량으로 나눈 비율); 및
(f) 증가된 천립 중량 (TKW) (계수된 종자의 수 및 이의 총 중량으로부터 외삽됨). 증가된 TKW는 증가된 종자 크기 및/또는 종자 중량, 및 배 및/또는 배유 크기의 증가로 인한다.
용어 "충전된 소화" 및 "충전된 종자"는 동의어로 생각될 수 있다.
종자 수확량의 증가는 또한 종자 크기 및/또는 종자 부피의 증가로 나타낼 수 있다. 더욱이, 종자 수확량의 증가는 또한 종자 면적 및/또는 종자 길이 및/또는 종자 폭 및/또는 종자 주계의 증가로 나타난다.
녹색 지수
본 발명에 사용된 "녹색 지수 (greenness index)"는 식물의 디지털 이미지로부터 계산된다. 이미지 상에 식물 대상에 속하는 각 화소에 대하여, 녹색 값 대 적색 값의 비율 (코딩 색상에 대하여 RGB 모델에서)이 계산된다. 녹색 지수는 녹색 대 적색의 비율이 주어진 역치를 능가하는 화소의 백분율로 표시된다. 정상적인 생장 조건 하에서, 염분 스트레스가 있는 생장 조건 하에서, 양분 이용도가 감소된 생장 조건 하에서 식물의 녹색 지수는 개화 전 마지막 이미지에서 측정된다. 대조적으로, 가뭄 스트레스 생장 조건 하에서 식물의 녹색 지수는 가뭄 후의 첫 번째 이미지에서 측정된다.
생물량 ( Biomass )
본 발명에서 사용된 용어 "생물량"은 식물의 총 중량을 의미한다. 생물량의 정의에서, 하기의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있는, 하나 이상의 식물 일부의 생물량 사이에 구별될 수 있다:
- 어린줄기 생물량, 종자 생물량, 잎 생물량 등과 같은 지상부일 수 있으나, 이에 제한되지 않음;
- 어린줄기 생물량, 종자 생물량, 잎 생물량 등과 같은 지상부의 수확 가능한 부분일 수 있으나, 이에 제한되지 않음;
- 뿌리 생물량, 괴경 (tuber), 인경 (bulb)과 같은 지하부일 수 있으나, 이에 제한되지 않음;
- 뿌리 생물량, 괴경, 인경과 같은 지하부의 수확 가능한 부분일 수 있으나, 이에 제한되지 않음;
- 사탕무 및 식물의 다른 하배축 (hypocotyl) 부분, 지하경, 포복경 (stolon) 또는 서행성 근경 (creeping rootstalk)과 같은 지하부의 부분적으로 수확 가능한 부분일 수 있으나, 이에 제한되지 않음;
- 뿌리 생물량, 어린줄기 생물량과 같은 영양적 (vegetative) 생물량;
- 생식 기관; 및
- 종자와 같은 번식체.
마커 보조 육종
상기 육종 프로그램은 때때로 예를 들면, EMS 돌연변이 유발을 사용하여 식물의 돌연변이 유발 처리로 대립인자 변이의 도입을 필요로 하며; 다르게는, 그 프로그램은 자연발생적으로 생성된 "자연적인" 대립인자 변이체의 수집물로부터 시작될 수도 있다. 그러면 대립인자 변이체의 동정은 예를 들면, PCR로 한다. 문제되는 서열의 증가된 수확량을 제공하는 우수한 대립인자 변이체의 선발 단계가 잇따른다. 선발은 전형적으로 문제되는 서열의 다른 대립인자 변이체를 함유하는 식물의 생장 능력을 관찰함으로써 이루어진다. 생장 능력은 온실 또는 야외에서 관찰할 수 있다. 추가의 선택 가능한 단계는 우수한 대립인자 변이체가 동정된 식물과 또 다른 식물의 교배를 포함한다. 이는 예를 들면, 흥미로운 표현형적 특징의 조합을 만드는데 사용될 수 있다.
(유전자 지도 제작에서) 탐침으로 사용
상기 유전자에 대한 유전자 및 물리지도 제작을 위해 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 사용에는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열만이 필요하다. 이 핵산은 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 마커로 사용될 수 있다. 제한효소로 절단된 식물 게놈 DNA의 서던 블럿 (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual)은 목적 단백질을 코딩하는 핵산으로 프로빙될 수 있다. 생성된 밴드 패턴으로 유전자지도 제작을 위하여 MapMaker (Lander 등 (1987) Genomics 1: 174-181) 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 유전적 분석을 하게 된다. 또한, 핵산은 지정된 유전적 교배의 양친 및 자손을 나타내는 개체들 세트의 제한 효소 처리된 게놈 DNA를 포함하는 서던 블럿에 탐침으로 사용될 수 있다. DNA 다형성의 분리를 기록하고, 이 집단을 이용하여 이전에 얻었던 유전자 지도상에 목적 단백질을 코딩하는 핵산의 위치 계산에 사용한다 (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
유전자 지도 제작에 사용하기 위한 식물 유전자 유래 탐침의 생산 및 사용은 [Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41]에 기재되어 있다. 수많은 공개문헌이 상기 개설된 방법론 또는 이의 변형을 사용하여 특정 cDNA 클론의 유전자 지도 제작을 기술한다. 예를 들면, F2 이종교배 개체군, 역교배 개체군, 무작위 교배 개체군, 근동질유전자계통, 및 다른 세트의 개체가 유전자 지도 제작에 사용될 수 있다. 상기 방법론은 당업자에게 주지되어 있다.
핵산 탐침은 또한 물리 지도에 제작 사용될 수 있다 (즉, 물리 지도상에 서열의 위치; Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, 인용된 문헌 참고).
또 다른 구현예에 있어서, 핵산 탐침은 직접적인 형광 인 시투 혼성화 (fluorescence in situ hybridisation, FISH) 지도 제작에 사용될 수 있다 (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). 비록 현 FISH 지도 제작 방법이 큰 클론 사용에 유리하지만 (수 kb 내지 수백 kb; Laan et al. (1995)Genome Res. 5:13-20), 감도가 향상되면 더욱 짧은 탐침으로 FISH 지도 제작이 가능해진다.
유전자지도 및 물리지도 제작을 위한 핵산증폭에 근거한 다양한 방법이 핵산을 사용하여 수행될 수 있다. 예는 대립인자 특이적 증폭 (allele-specific amplification, Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), CAPS (polymorphism of PCR-amplified fragments; Sheffield 등 (1993) Genomics 16:325-332), 대립인자 특이적 라이게이션 (allele-specific ligation, Landegren 등 (1988) Science 241:1077-1080), 뉴클레오티드 연장 반응 (nucleotide extension reactions, Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7:22-28) 및 Happy Mapping (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807)을 포함한다. 이들 방법을 위해서 증폭 반응 또는 프라이머 연장 반응에 사용하기 위한 프라이머 쌍을 고안하고 제작하기 위해 핵산 서열이 사용된다. 상기 프라이머의 고안은 당업자에게는 주지되어 있다. PCR에 근거한 유전자 지도 제작에 사용하는 방법에서는 핵산 서열에 해당하는 영역에서 교배 양친 간의 DNA 서열 차이를 알 필요가 있다. 그러나 이는 일반적으로 지도제작 방법에는 필요하지 않다.
식물
본 발명에서 사용된 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 및 종자, 어린 줄기, 줄기, 잎, 뿌리 (괴경 포함), 꽃, 및 조직과 기관을 포함하는 식물 부분의 조상 및 자손을 포함하며, 이들 각각은 목적 유전자/핵산을 포함한다. 용어 "식물"은 또한 식물 세포, 현탁 배양액, 캘러스 조직, 배, 분열조직, 배우체, 포자체, 화분 및 소포자를 포함하며, 이들 각각은 목적 유전자/핵산을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 특히 유용한 식물은 수퍼패밀리 비리디플란태 (Viridiplantae)에 속하는 모든 식물, 특히 하기를 포함하는 목록에서 선택된 사료 또는 마초용 콩, 관상 식물, 식량 작물, 교목 또는 관목을 포함하는 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다: 에이서 (Acer spp.), 악티니디아 (Actinidia spp.), 아벨모스쿠스 (Abelmoschus spp.), 아가베 시살라나 (Agave sisalana), 아그로피론 (Agropyron spp.), 아그로스티스 스톨로니페라 ( Agrostis stolonifera ), 알리움 (Allium spp.), 아마란투스 (Amaranthus spp.), 암모필라 아레나리아 (Ammophila arenaria), 아나나스 코모수스 ( Ananas comosus ), 안노나 (Annona spp.), 아피움 그라베오렌스 (Apium graveolens), 아라키스 ( Arachis spp.), 알토칼푸스 (Artocarpus spp.), 아스파라거스 오피시날리스 ( Asparagus officinalis ), 아베나 (Avena spp.) (예를 들면, 아베나 사티바 ( Avena sativa ), 아베나 파투아 ( Avena fatua), 아베나 비잔티나 (Avena byzantina), 아베나 파투아 var . 사티바 (Avena fatua var . sativa), 아베나 하이브리다 (Avena hybrida)), 아베로아 카람볼라 (Averrhoa carambola), 뱀부사 (Bambusa sp .), 베닌카사 히스피다 (Benincasa hispida), 벨톨레티아 엑셀세아 (Bertholletia excelsea), 베타 불가리스 (Beta vulgaris), 브라시카 (Brassica spp.) (예를 들면, 브라시카 나푸스 ( Brassica napus), 브라시카 라파 (Brassica rapa ssp.) [캐놀라, 유채, 순무]), 카다바 파리노사 (Cadaba farinosa), 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis), 칸나 인디카 (Canna indica), 칸나비스 사티바 (Cannabis sativa), 캡시쿰 ( Capsicum spp.), 카렉스 엘라타 (Carex elata), 카리카 파파야 (Carica papaya), 카리사 마크로칼파 (Carissa macrocarpa), 카리야 (Carya spp .), 카르타무스 팅크토리우스 (Carthamus tinctorius), 카스타네아 (Castanea spp.), 케이바 펜탄드라 (Ceiba pentandra), 키코리움 엔디비아 (Cichorium endivia ), 신나모뭄 (Cinnamomum spp .), 시트룰루스 라나투스 (Citrullus lanatus), 시트루스 (Citrus spp.), 코코스 (Cocos spp .), 코페아 ( Coffea spp.), 콜로카시아 에스쿨렌타 (Colocasia esculenta), 콜라 (Cola spp.), 콜코루스 (Corchorus sp.), 코리안드룸 사티붐 (Coriandrum sativum), 코리루스 (Corylus spp.), 크라태구스 (Crataegus spp.), 크로쿠스 사티부스 (Crocus sativus), 쿠쿨비타 (Cucurbita spp .), 쿠쿠미스 ( Cucumis spp.), 키나라 ( Cynara spp.), 다우쿠스 카로타 (Daucus carota), 데스모디움 ( Desmodium spp.), 디모칼푸스 론간 (Dimocarpus longan), 디오스코레아 (Dioscorea spp.), 디오스피로스 (Diospyros spp.), 에키노크로아 (Echinochloa spp .), 엘래이스 ((Elaeis (예를 들면, 엘래이스 귀넨시스 (Elaeis guineensis), 엘레이스 올레이페라 (Elaeis oleifera)), 엘레우신 코라카나 (Eleusine coracana), 에라그로스티스 테프 (Eragrostis tef), 에리안투스 (Erianthus sp .), 에리오보트리아 야포니카 (Eriobotrya japonica), 유카립투스 (Eucalyptus spp.), 유게니아 유니플로라 (Eugenia uniflora), 파고피룸 (Fagopyrum spp.), 파구스 (Fagus spp.), 페스투카 아룬디나케아 (Festuca arundinacea), 피쿠스 카리카 (Ficus carica), 폴투넬라 (Fortunella spp.), 프라가리아 (Fragaria spp.), 깅코 빌로바 (Ginkgo biloba), 글라이신 (Glycine spp.) (예를 들면, 글라이신 맥스 (Glycine max), 소야 히스피다 (Soja hispida) 또는 소야 맥스 (Soja max)), 고시피움 힐수툼 (Gossypium hirsutum), 헬리안투스 (Helianthus spp.) (예를 들면, 헬리안투스 안누스 (Helianthus annuus)), 헤메로칼리스 풀바 (Hemerocallis fulva), 히비스쿠스 (Hibiscus spp.) 홀데움 (Hordeum spp.) (예를 들면, 홀데움 불가레 (Hordeum vulgare)), 이포모에아 바타타스 (Ipomoea batatas ), 주글란스 (Juglans spp.), 락투카 사티바 (Lactuca sativa), 라티루스 (Lathyrus spp.), 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris), 리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum), 리치 키넨시스 (Litchi chinensis), 로투스 ( Lotus spp.), 루파 아쿠탄굴라 ( Luffa acutangula ), 루피누스 (Lupinus spp.), 루줄라 실바티카 (Luzula sylvatica), 라이코펠시콘 (Lycopersicon spp.) (예를 들면, 라이코펠시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum), 라이코펠시콘 라이코펠시쿰 (Lycopersicon lycopersicum), 라이코펠시콘 피리폴메 (Lycopersicon pyriforme)), 마크로틸로마 (Macrotyloma spp.), 말루스 (Malus spp.), 말피기아 에말기나타 (Malpighia emarginata), 맘메아 아메리카나 (Mammea americana), 망기페라 인디카 (Mangifera indica), 마니호트 (Manihot spp.), 마닐카라 자포타 (Manilkara zapota), 메디카고 사티바 (Medicago sativa), 메릴로투스 (Melilotus spp.), 멘타 ( Mentha spp.), 미스칸투스 시넨시스 (Miscanthus sinensis), 모몰디카 (Momordica spp.), 모루스 니그라 (Morus nigra), 무사 (Musa spp.), 니코티아나 ( Nicotiana spp.), 올레아 ( Olea spp.), 오푼티아 (Opuntia spp.), 오르니토푸스 (Ornithopus spp.), 오리자 (Oryza spp.) (예를 들면, 오리자 사티바 (Oryza sativa ), 오리자 라티포리아 ( Oryza latifolia)), 패니쿰 미리아케움 (Panicum miliaceum), 패니쿰 벌가툼 ( Panicum virgatum), 파시플로라 에둘리스 (Passiflora edulis), 파스티나카 사티바 (Pastinaca sativa), 페니세툼 (Pennisetum sp .), 펠세아 (Persea spp.), 페트로셀리눔 크리스품 (Petroselinum crispum), 파라리스 아룬디나케아 (Phalaris arundinacea), 파세올루스 (Phaseolus spp.), 플레움 프라텐세 (Phleum pratense), 피닉스 (Phoenix spp .), 프라그미테스 오스트라리스 (Phragmites australis), 피사리스 (Physalis spp.), 피누스 ( Pinus spp.,) 피스타키아 베라 (Pistacia vera ), 피숨 (Pisum spp.), 포아 (Poa spp.), 포푸러스 ( Populus spp.), 프로소피스 (Prosopis spp.), 프루누스 (Prunus spp.), 프시디움 ( Psidium spp.), 푸니카 그라나툼 (Punica granatum), 피루스 코무니스 (Pyrus communis), 켈쿠스 (Quercus spp.), 라파누스 사티부스 (Raphanus sativus), 레움 라발바룸 (Rheum rhabarbarum), 리베스 (Ribes spp.), 리키누스 코무니스 ( Ricinus communis ), 루부스 (Rubus spp.), 사카룸 (Saccharum spp.), 살릭스 ( Salix spp.), 삼부쿠스 (Sambucus spp.), 세카레 세레알레 ( Secale cereale ), 세사뭄 ( Sesamum spp.), 시나피스 ( Sinapis sp .), 솔라눔 ( Solanum spp.) (예를 들면, 솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum ), 솔라눔 인테그리폴리움 (Solanum integrifolium) 또는 솔라눔 라이코펠시쿰 (Solanum lycopersicum)), 솔굼 바이칼라 ( Sorghum bicolor ), 스피나시아 (Spinacia spp.), 시지기움 (Syzygium spp.), 타게테스 ( Tagetes spp.), 타마린두스 인디카 ( Tamarindus indica ), 테오브로마 카카오 (Theobroma cacao ), 트리폴리움 (Trifolium spp.), 트리프사쿰 다크틸로이드 (Tripsacum dactyloides), 트리티코세칼레 림파우이 ( Triticosecale rimpaui ), 트리티쿰 (Triticum spp. (예를 들면, 트리티쿰 아에스티붐 (Triticum aestivum ), 트리티쿰 두룸 (Triticum durum), 트리티쿰 툴기둠 (Triticum turgidum ), 트리티쿰 하이베르눔 (Triticum hybernum), 트리티쿰 마차 (Triticum macha ), 트리티쿰 사티붐 (Triticum sativum), 트리티쿰 모노코쿰 (Triticum monococcum) 또는 트리티쿰 불가레 (Triticum vulgare)), 트로패오룸 미누스 (Tropaeolum minus), 트로패오룸 마주스 (Tropaeolum majus), 박시니움 (Vaccinium spp.), 비시아 (Vicia spp.), 비그나 (Vigna spp.), 비올라 오도라타 (Viola odorata), 비티스 ( Vitis spp.), 제아 메이즈 (Zea mays), 지자니아 팔루스트리스 (Zizania palustris), 지지푸스 (Ziziphus spp.).
대조구 식물(들)
적절한 대조구 식물의 선택은 실험 셋업에서는 통상적인 부분이며, 상기 식물의 야생형 또는 목적 유전자가 없는 해당 식물을 실험에 포함할 수 있다. 대조구 식물은 전형적으로 평가되는 식물과 동일한 식물 종 또는 동일한 변종이다. 대조구 식물은 또한 평가되는 식물의 공접합자 (nullizygote)일 수 있다. 공접합자 (또는 공 (null) 대조구 식물)는 분리에 의하여 외래 유전자가 없는 개체이다. 게다가, 대조구 식물은 본 발명의 식물의 성장 조건과 동등한 성장 조건 하에서, 즉 본 발명의 식물의 인근에서 및 본 발명의 식물과 동시에 키운다. 본 발명에서 사용된 "대조구 식물"은 전체 식물뿐 아니라 종자 및 종자의 일부분을 포함한 식물의 일부분을 말한다.
도 1OsNAC1의 발현에 대한 RNA 겔 블럿 분석을 나타낸다. (a) 스트레스 조건에 대한 벼의 OsNAC1 발현. 14일 된 실생은 표시된 시간 동안 가뭄, 고염, ABA 또는 저온에 노출되었다. 가뭄 스트레스를 위해서, 실생은 28℃의 공기로 건조하였다; 고염 스트레스를 위해서, 실생은 28℃에서 400 mM NaCl에 노출되었다; 저온 스트레스를 위해서, 실생은 4℃에 노출되었다; ABA 처리를 위해서, 실생은 100 μM ABA를 함유하는 용액에 노출되었다. (b) RCc3 : OsNAC1, GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물 세 가지의 동형접합 T5 라인에 대한 RNA 겔 블럿 분석. 동등한 RNA의 로딩은 EtBr (ethidium bromide) 염색을 이용하여 측정하였다. (-) 및 (+)는 각각 형질전환되지 않은 라인 (null) 및 형질전환 라인을 나타낸다.
도 2는 영양 생장 (vegetative) 단계에서 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물체의 스트레스 저항성을 나타낸다. (a) 가뭄 스트레스 동안의 식물체의 모습. RCc3:OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물의 3개의 독립적인 동형접합 T5 라인 및 NT 대조구는 5일의 가뭄 스트레스에 이어서 더하기 (+) 기호로 표시된 7일은 재급수하면서 온실에서 2주 동안 키웠다. (b) 가뭄, 고염 및 저온 스트레스 조건에 노출된 벼 식물체의 엽록소 형광 비교 (Fv/Fm). 각 데이터는 3회 반복 실험의 평균±표준오차로 나타낸다 (n=10).
도 3은 (a) 정상 및 (b) 가뭄 조건 하의 경작지에서 2번의 재배 시기 (2009-2010) 동안 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물체의 농업 형질을 나타낸다. 각 형질전환 식물체에 대한 3개의 독립적인 동형접합 T5 (2009) 및 T6 (2010) 라인과 함께 NT 대조구의 농업 형질은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 구분되었다. 각 데이터는 100%로 지정된 NT 식물체의 평균값 (n=30)의 백분율로 나타냈다. CL, 줄기(culm) 길이; PL, 원추화서 길이, NP, 주 (hill) 당 원추화서의 수; NSP, 원추화서 당 작은 이삭 (spikelet)의 수; TNS, 작은 이삭의 총 수; FR, 충전율; NFG, 충전된 곡물의 수; TGW, 총 곡물 중량; 1000GW, 천립 중량.
도 4는 이삭이 나오는 재생산 단계까지 키운 RCc3 : OsNAC1, GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물체의 뿌리 생장 비교를 나타낸다. (a) 상단 패널은 각 식물의 대표적인 뿌리를 보여주는 반면, 하단 패널은 각 식물의 대표적인 뿌리 1개를 보여준다. 상단 및 하단 패널에서 막대는 각각 10 cm 및 2 mm이다. (b) 가로로 절단된 (cross-sectioned) 형질전환 및 NT 식물 뿌리의 광학 현미경 이미지. 뿌리의 전체 횡단면 (상단 패널), 중심주 (stele) 내의 관다발 (중간 패널) 및 외피 및 수피의 일부 (하단 패널). co, 수피; xy, 목질부; ae, 통기 조직 (aerenchyma); 외피는 화살표로 표시하였다. 막대는 상단 패널에서 500 ㎛, 중간 및 하단 패널에서 100㎛이다. (c) NT 식물에 대해 표준화된 형질전환 식물체 뿌리의 부피, 길이, 건조 중량 및 직경. 값은 뿌리 50개 (5개 식물체 각각의 뿌리 10개)의 평균±표준편차이다. 별표 (**)는 0.01 수준 (LSD)에서 유의한 평균 차이를 나타낸다.
도 5OsNAC5의 발현에 대한 RNA 겔 블럿 분석을 나타낸다.
A. 10 ㎍의 총 RNA는 표시된 기간 동안 가뭄, 고염, ABA 또는 저온에 노출된 14일 된 실생의 잎 및 뿌리 조직으로부터 준비했다. 가뭄 스트레스를 위해서, 실생은 28℃의 공기로 건조하였다; 고염 스트레스를 위해서, 실생은 28℃에서 400 mM NaCl에 노출되었다; 저온 스트레스를 위해서, 실생은 4℃에 노출되었다; ABA 처리를 위해서, 실생은 100 μM ABA를 함유하는 용액에 노출되었다. 총 RNA는 블럿팅되었고, OsNAC5 유전자 특이적 탐침 (probe)으로 혼성화되었다. 이어서 블럿은 스트레스 처리에 따른 핵심 유전자 중 상향- 및 하향-조절에 대한 마커로 각각 사용되는 Dip1 (Oh et al., 2005b) 및 rbcS (Jang et al., 1999) 유전자에 대해 다시 프로빙되었다. EtBr 염색은 동등한 RNA의 로딩을 측정하기 위해 사용되었다.
B. RNA 겔 블럿 분석은 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 3개의 동형접합 T5 라인 및 형질전환되지 않은 (NT) 대조구 식물체 각각의 뿌리 및 잎으로부터 준비한 총 RNA를 사용하여 수행되었다. 블럿은 OsNAC5 유전자 특이적 탐침으로 혼성화되었고, 또한 rbcS 및 튜불린에 대해 다시 프로빙되었다. EtBr 염색은 동등한 RNA의 로딩을 측정하기 위해 사용되었다. (-) 공접합자 (외래 유전자가 없는 분리주) 라인, (+) 형질전환 라인.
도 6RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 스트레스 내성을 나타낸다.
A. 가뭄 스트레스 동안 형질전환 식물체의 외형. RCc3 : OsNAC5GOS2:OsNAC5 식물체의 3개의 독립적인 동형접합 T6 라인 및 형질전환되지 않은 (NT) 대조구는 3일의 가뭄 스트레스에 이어서 7일은 재급수하면서 온실에서 4주 동안 키웠다. 이미지는 표시된 시점에 촬영했다. '+'는 정상 생장 조건 하에서 재급수하는 일수를 나타낸다.
B. 가뭄, 고염 및 저온 스트레스 조건 하에서 벼 식물체의 엽록소 형광 변화 (Fv/Fm). 14일 동안 MS 배지에서 자란 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 3개의 독립적인 동형접합 T6 라인 및 NT 대조구는 실시예 섹션에 기재된 것처럼 다양한 스트레스 조건이 처리되었다. 상기 스트레스 처리 후, Fv/Fm 값은 펄스 조절 형광계 (pulse modulation fluorometer; mini-PAM, Walze, Germany)를 사용하여 측정되었다. 모든 식물체는 스트레스 처리 전에 150 μmol m-2 S-1의 연속적인 광 조건 하에서 키웠다. 각 데이터는 3회 반복 실험의 평균±표준오차로 나타낸다 (n=10).
C. 가뭄 조건 하에서 식물의 L-밴드 (L-band)는 ΔWok = Voksample - Vokcontrol 공식을 사용하여 컴퓨터로 계산된 F o 에서 F k 까지의 차이 역학 (difference kinetics)을 통해 나타낸다; 왼쪽 축. O에서 K 단계까지의 이중 표준화; Vok = (Ft-Fo)/(Fk-Fo); 오른쪽 축.
D. 마지막 전자 수용체 (end electron acceptor)의 전체 크기 (pool size)의 차이를 예시하는 Vol≥1.0에 대한 이벤트 (events); 정상 및 가뭄 조건 하에서 Vol = (Ft-Fo)/(Fl-Fo).
도 7은 (A) 정상 및 (B) 가뭄 조건 하에서 경작지에서 자란 RCc3 : OsNAC5GOS2:OsNAC5 식물체의 농업 형질을 나타낸다. 정상 및 가뭄 두 조건 하에서 RCc3:OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 3개의 독립적인 동형접합 T5 및 T6 라인 및 해당 NT 대조구의 농업 형질의 스파이더 플롯 (Spider plots)은 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 그렸다. 각 데이터는 표 13 및 14에 열거된 평균값 (n=30)의 백분율을 나타낸다. NT 대조구의 평균 측정은 100% 기준 값으로 지정했다. CL, 줄기(culm) 길이; PL, 원추화서 길이, NP, 주 (hill) 당 원추화서의 수; NSP, 원추화서 당 작은 이삭 (spikelet)의 수; TNS, 작은 이삭의 총 수; FR, 충전율; NFG, 충전된 곡물의 수; TGW, 총 곡물 중량; 1000GW, 천립 중량.
도 8RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 뿌리 생장에서의 차이를 나타낸다.
A. RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 뿌리 부피, 길이, 건조 중량 및 직경은 NT 대조구 뿌리의 부피, 길이, 건조 중량 및 직경에 대해 표준화하였다. ** 평균 차이는 0.01 수준 (LSD)에서 유의하다. 값은 50개 뿌리 (5개 식물체 각각의 뿌리 10개)의 평균±표준편차이다.
B. 이삭이 나오는 재생산 단계까지 키운 RCc3 : OsNAC5, GOS2 : OsNAC5 및 NT 대조구 식물체의 하나의 대표적인 뿌리. 스케일 바 = 2 mm.
C. 가로로 절단된 (cross-sectioned) RCc3 : OsNAC5, GOS2 : OsNAC5 및 NT 식물체 뿌리의 광학 현미경 이미지. 후생 목부 물관 (metaxylem vessel; Me) 및 통기 조직 (Ae)의 위치를 표시했다. 스케일 바, 상단 패널에서 500 ㎛, 중간 및 하단 패널에서 100 ㎛.
도 9는 다양한 NAC1 폴리펩티드의 다중 정렬을 나타낸다. 별표는 다양한 단백질 서열 사이에서 동일한 아미노산을 가리키며, 콜론은 고도로 보존된 아미노산 치환을 나타내고, 점은 더 적게 보존된 아미노산 치환을 나타내며, 다른 위치에서는 서열 보존이 없다. 이 정렬은 보존된 아미노산을 이용할 때, 추가의 모티프 또는 시그너처 서열을 정의하는데 이용될 수 있다.
도 10은 다양한 NAC5 폴리펩티드의 다중 정렬을 나타낸다. 별표는 다양한 단백질 서열 사이에서 동일한 아미노산을 가리키며, 콜론은 고도로 보존된 아미노산 치환을 나타내고, 점은 더 적게 보존된 아미노산 치환을 나타내며, 다른 위치에서는 서열 보존이 없다. 이 정렬은 보존된 아미노산을 이용할 때, 추가의 모티프 또는 시그너처 서열을 정의하는데 이용될 수 있다.
실시예
본 발명은 단지 예시인 하기 실시예를 참고하여 기재될 것이다. 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한할 의도는 아니다. 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 종래 기술 및 식물 생물학, 분자 생물학, 생물정보학 및 식물 육종 방법을 사용한다.
DNA 조작에 대해: 달리 언급되지 않는 한, 재조합 DNA 기술은 Sambrook (2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) 또는 Ausubel 등 (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols의 Volumes 1 및 2)에 기재된 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 식물 분자 작업에 대한 표준 재료 및 방법은 Plant Molecular Biology Labfax (1993, by R.D.D. Croy, published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) 및 Blackwell Scientific Publications (UK))에 기재되어 있다.
A: 실험 절차
(i) OsNAC1 의 플라스미드 구축물 및 벼 형질전환
OsNAC1의 코딩 영역은 제조사의 지시에 따라 RT-PCR system (Promega)을 사용하여 총 RNA로부터 정방향 (5'-ATGGGGATGGGGATGAGGAG-3'), 역방향 (5'-TCAGAACGGGACCATGCCCA-3') 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다. 벼에서의 과발현을 위해서, OsNAC1의 cDNA는 Gateway system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 항시성 발현을 위한 GOS2 프로모터 및 뿌리 특이적 발현을 위한 RCc3 프로모터에 연결되었다. 플라스미드는 삼친 교배 (triparental mating)에 의해 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404로 도입되었고, 성숙 종자 유래의 배 발생 (Oryza sativa cv Nipponbare) 캘러스는 이전에 기술된 방법 (Jang et al., 1999)으로 형질전환되었다.
( ii ) OsNAC5 의 플라스미드 구축물 및 벼 형질전환
OsNAC5 (AK102475)의 코딩 영역은 제조사의 지시에 따라 RT-PCR system (Promega, Wl)을 사용하여 벼 총 RNA로부터 증폭되었다. 프라이머 쌍은 하기와 같다: 정방향 (5'-ATGGAGTGCGGTGGTGCGCT-3') 및 역방향 (5'-TTAGAACGGCTTCTGCAGGT-3'). 벼에서 OsNAC5 유전자를 과발현시키기 위해서, 상기 유전자에 대한 cDNA는 Gateway system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 항시성 발현을 위한 GOS2 프로모터 및 뿌리 특이적 발현을 위한 RCc3 프로모터에 연결되었다. 플라스미드는 삼친 교배 (triparental mating)에 의해 아그로박테리움 튜머파시엔스 LBA4404로 도입되었고, 성숙 종자 유래의 배 발생 (Oryza sativa cv Nipponbare) 캘러스는 이전에 기술된 방법 (Jang et al., 1999)으로 형질전환되었다.
( iii ) 영양 생장 ( vegetative ) 단계에서 벼 식물체의 가뭄 처리
형질전환 및 형질전환되지 않은 (NT) 벼 (Oryza sativa cv Nipponbare) 식물체의 종자는 절반 강도의 MS 고체 배지에서 발아시켰고, 28℃의 어두운 생장 챔버에 4일 동안 두었다. 실생은 토양에 이식한 후 28-30℃의 온실 (16시간 광/8시간 암 주기)에서 키웠다. 가뭄 스트레스 실험을 수행하기 전에, 각 형질전환 및 형질전환되지 않은 라인의 18개의 실생은 4주 동안 포트 (3×3×5 cm; 포트 당 1개 식물체)에서 키웠다. 가뭄 스트레스는 3-5일 동안 실생에 물을 억제하여 시뮬레이션했고, 반면에 회복 시험은 가뭄 스트레스 처리된 식물에 재급수하여 수행했으며, 7일 동안 관찰했다. 그리고 생존한 또는 계속 성장하는 식물의 수를 기록하였다.
( iv ) NAC5 RNA 블럿 분석
벼 (Oryza sativa cv Nipponbare) 종자는 토양에서 발아시켰고, 28℃의 온실 (16시간 광/8시간 암 주기)에서 키웠다. 고염 및 ABA 처리를 위해, 14일 된 실생은 표시된 기간 동안 약 1000 μmol/m2/s의 지속적인 광 조건 하의 온실의 400 mM NaCl 또는 100 μM ABA를 함유하는 영양 용액에 옮겨졌다. 가뭄 처리를 위해, 14일 된 실생을 잘라냈고, 약 1000 μmol/m2/s의 지속적인 광 조건 하에서 표시된 시간별로 공기 건조되었다. 저온 스트레스 처리를 위해, 14일 된 실생은 표시된 시간별로 150 μmol/m2/s의 지속적인 광 조건 하의 저온 챔버에서 4℃에 노출되었다. 총 RNA 준비 및 RNA 겔 블럿 분석은 이전에 보고된 방법 (Jang et al., 2002)으로 수행하였다.
(v) 노던 블럿 분석
벼 (Oryza sativa cv Nipponbare) 종자는 토양에서 발아시켰고, 22℃의 온실 (16시간 광/8시간 암 주기)에서 키웠다. 총 RNA는 표시된 시간 동안 가뭄, 고염, ABA 및 저온에 노출된 14일 된 실생으로부터 준비했다. 고염 및 ABA 처리를 위해, 실생은 표시된 기간 동안 약 1000 μmol/m2/s의 지속적인 광 조건 하의 온실의 400 mM NaCl 또는 100 μM ABA를 함유하는 영양 용액에 옮겨졌다. 가뭄 처리를 위해, 실생을 잘라냈고, 약 1000 μmol/m2/S의 지속적인 광 조건 하에서 표시된 시간별로 공기 건조되었다. 저온 스트레스 처리를 위해, 실생은 표시된 시간별로 150 μmol/m2/S의 지속적인 광 조건 하의 저온 챔버에서 4℃에 노출되었다. 10 ㎍의 총 RNA를 블럿팅하였고, OsNAC1 유전자 특이적 탐침과 혼성화하였다. 그리고 블럿은 스트레스 처리에 다른 핵심 유전자의 상향 조절에 대한 마커로 사용되는 Dip1 유전자와 함께 다시 프로빙되었다. EtBr (ethidium bromide) 염색은 동등한 RNA의 로딩을 측정하기 위해 사용되었다. RNA 겔 블럿 분석을 위한 샘플은 RCc3 : OsNAC1, GOS2:OsNAC1 및 NT 식물체 각각의 3개의 동형접합 T5 라인에 대한 잎 및 줄기 샘플의 총 RNA (10 ㎍)로부터 준비되었다. 블럿은 OsNAC1 유전자 특이적 탐침으로 혼성화였고, RbcS 및 튜불린에 대해 다시 프로빙되었다. 동등한 RNA 로딩은 EtBr 염색을 이용하여 측정되었다. 총 RNA의 준비 및 RNA 겔 블럿 분석은 Jang (2002)등에 따라 수행되었다.
( vi ) 가뭄, 고염 및 저온 조건 하에서 엽록소 형광의 측정
형질전환 및 형질전환되지 않은 벼 (Oryza sativa cv Nipponbare) 식물체의 종자는 발아시켜 절반 강도의 MS 고체 배지에서 14일 동안 키웠다. 생장 챔버는 28℃의 150 μmol m-2 s-1의 16시간 광/8시간 암 주기의 광 조건 및 암 조건의 세팅을 가졌다. 그리고 약 10개의 실생의 녹색 부분은 시험관 내 스트레스 처리 전에 가위로 잘랐다. 모든 스트레스 조건은 150 μmol m-2 s-1의 지속적인 광 하에서 수행되었다. 저온 스트레스 처리를 위해, 실생은 최대 6시간 동안 4℃의 물에서 배양되었다. 고염 스트레스는 28℃의 400 mM NaCl에서 2시간 동안 배양하여 유도되었다. 가뭄 스트레스를 시뮬레이션하기 위해, 식물체는 28℃에서 2시간 동안 공기 건조되었다. 그리고 Fv/Fm 값은 이전에 기술된 방법으로 측정되었다 (Oh et al., 2005).
( vii ) 벼 3'- 타일링 마이크로어레이 (3'- Tiling Microarray ) 분석
벼 3'-타일링 마이크로어레이는 이전에 기술된 것처럼 발현 프로파일링 (profiling) 분석을 위해 사용되었다 (Oh et al., 2009). 형질전환 및 형질전환되지 않은 벼 (Oryza sativa cv Nipponbare) 종자는 토양에서 발아시켰고, 22℃의 온실 (16시간 광/8시간 암 주기)에서 키웠다. 벼에서 스트레스 유도성 NAC 유전자를 동정하기 위해, 총 RNA (100 ㎍)는 가뭄, 고염, ABA 및 저온 스트레스를 받은 14일 된 식물의 잎으로부터 준비되었다. 고염 및 ABA 처리를 위해, 14일 된 실생은 2시간 동안 약 1000 μmol m-2 s-1의 지속적인 광 조건 하의 온실의 400 mM NaCl 또는 100 μM ABA를 함유하는 영양 용액에 옮겨졌다. 가뭄 처리를 위해, 14일 된 실생은 또한 약 1000 μmol m-2 s-1의 지속적인 광 조건 하에서 2시간 동안 공기 건조되었다. 저온 스트레스 처리를 위해, 14일 된 실생은 150 μmol m-2 s-1의 지속적인 광 조건 하의 저온 챔버에서 6시간 동안 4℃에 노출되었다. RCc3 : OsNAC1 , GOS2:OsNAC1 식물체에서 상향 조절된 유전자의 동정을 위해, 총 RNA (100 ㎍)는 정상 생장 조건 하에서 자란 14일 된 형질전환 및 형질전환되지 않은 벼 실생 (Oryza sativa cv Nipponbare)의 뿌리 및 잎 조직으로부터 준비되었다.
( viii ) 2년 (2009 및 2010) 동안 경작지에서 벼 식물체의 가뭄 처리 및 곡물 수확량 분석
정상 경작지 조건 하에서 형질전환 식물의 수확량 구성요소를 평가하기 위해, RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물체의 3개의 독립적인 T5 (2009) 및 T6 (2010) 동형접합 라인과 함께 형질전환되지 않은 (NT) 대조구는 대한민국 수원 농촌진흥청 (2009) 및 대한민국 군위 국립경북대학교 (2010)의 논 (paddy field)에 이식하였다. 임의 배치법 (randomized design)은 2번의 경작 시기 (2009-2010) 동안 3번 반복 사용되었다. 실생은 파종 후 25일에 주 (hill) 당 하나의 실생으로 15×30 cm 간격 내에 무작위로 이식되었다. 비료는 70N/40P/70K kg/ha로 마지막 패들링 (paddling) 후 및 이식 45일 후에 사용하였다. 수확량 매개변수는 시기당 형질전환 라인당 30개의 식물체에 대해 기록되었다. 가장자리에 위치한 식물은 데이터 기록에서 제외했다.
가뭄 경작지 조건 하에서 형질전환 식물의 수확량 구성요소를 평가하기 위해, RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물체 각각의 3개의 독립적인 T5 (2009) 및 T6 (2010) 동형접합 라인 및 NT 대조구는 천연의 논 흙으로 채워진 1 m 깊이의 컨테이너와 함께 제거할 수 있는 비가림 시설 (대한민국 용인 명지대학교에 위치)에 이식되었다.
실험 설계, 이식 간격, 비료의 사용, 가뭄 처리 및 농업 형질의 계산은 Oh 등 (2009)에 기술된 방법이 사용되었다. 정상 및 가뭄 조건하에서 자란 식물이 성숙에 이르고 곡물이 익었을 때, 그들은 수확되고 수작업으로 탈곡 되었다 (식물 영양생장 부분으로부터 종자의 분리). 충전되지 않은 및 충전된 곡물은 분리되었고, Countmate MC1000H (Prince Ltd, Korea)를 사용하여 독립적으로 세어졌고, 무게가 측정되었다. 하기 농업 형질이 기록되었다: 원추화서 길이 (cm), 주 (hill) 당 원추화서의 수, 원추화서 당 작은 이삭의 수, 주 당 작은 이삭의 수, 충전율 (%), 주 당 충전된 작은 이삭의 수, 총 곡물 중량 (g) 및 천립중량 (g). 3개의 독립적인 라인의 결과는 단방향 (one way) ANOVA 및 NT 대조구와 비교하여 따로따로 분석되었다. ANOVA는 형질전환 라인 및 NT 대조구의 동등한 평균의 귀무가설 (null hypothesis)을 거절하기 위해 사용되었다 (p<0.05). SPSS 버전 16.0이 상기 통계분석을 수행하기 위해 사용되었다.
상기 절차는 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체에도 사용되었다.
( ix ) 뿌리의 현미경 검사
뿌리의 현미경 검사는 Jeong 등 (2010)에 의해 기술된 방법으로 수행되었다. 개요로서, 원추화서 이삭이 나오는 단계에서 형질전환 및 형질전환되지 않은 식물의 뿌리는 변형된 Karnovsky's 고정액을 사용하여 4℃에서 밤새 고정시켰고, 동일한 버퍼를 사용하여 각각 10분 동안 3회 세척했다. 그들은 동일한 버퍼로 4℃에서 2시간 동안 후기-고정시켰고 (post-fixed), 증류수로 간단하게 2회 세척했다. 후기 고정된 뿌리 조직은 4℃에서 밤새 enbloc 염색했다. 그들은 일련의 등급의 에탄올 (30, 50, 70, 80, 95 및 100%)에서 탈수되었고, 100% 에탄올로 각각 10분 동안 3회 탈수되었다. 탈수된 샘플은 전환 유체로 프로필렌 옥시드 (propylene oxide)를 사용하여 각각 30분 동안 2회 추가로 처리했고, Spurr's 배지에 넣었다. 초박 절편 (약 1 μm 두께)은 다이아몬드 칼을 이용하여 울트라-마이크로톰 (ultra-microtome; MT-X; RMC Inc., Tucson, AZ)으로 만들었다. 절편은 1% 톨루이딘 블루 (toluidine blue)를 사용하여 염색했고, 광학 현미경 하에서 사진 촬영했다.
(x) JIP 분석
식물체의 엽록소 a 형광 통과 (transient)는 이전에 기술된 방법으로 핸디-PEA 형광계 (Handy-PEA fluorimeter; Plant Efficiency Analyzer, Hansatech Instruments Ltd., King's Lynn Norfolk, PE 30 4NE, UK)를 사용하여 측정하였다 (Redillas et al., 2011a 및 2011b). 식물은 반응 중심 (RC; reaction center)의 개방을 충분히 확실하게, 즉 RC가 충분히 산화되게 하기 위해 적어도 30분 동안 암-순응되었다. 3개의 독립적인 T6 동형접합 라인의 각각에 대해 두 식물체가 선발되었다. 각 식물체에 대해 가장 크고 시각적으로 건강해보이는 잎들을 선발하였고, 그들의 정점 (apex), 중간 및 기저부에서 측정했다. 측정값은 핸디 PEA 소프트웨어 (Handy PEA Software; 버전 1.31)를 사용하여 평균을 구했다. 핸디 PEA-형광계는 하기 프로그램을 사용하여 설정했다: 초기 형광은 O (50 μs), J (2 ms)로 설정했고, I (30 ms)는 중간, 정점 (peak)으로 P (500 ms-1s)를 설정했다. 통과 (transient)는 3개의 발광 다이오드 (light-emitting diode)에 의해 제공된 3,500 μmol photons m-2s-1의 650 nm에서 적색 빛에 의해 유도되었고, 직경 5 mm의 부위 (spot)에 초점을 맞추고, 12 비트 (bit) 해상도로 1초 동안 기록되었다. 데이터 수집은 10 μs마다 (10 μs부터 0.3 ms까지), 0.1 ms마다 (0.2부터 3 ms까지), 1 ms마다 (3부터 30 ms까지), 10 ms마다 (30부터 300 ms 까지) 및 100 ms마다 (300 ms부터 1 s까지)로 설정했다. 표준화 및 계산은 JIP-test 공식에 따라 Biolyzer 4HP 소프트웨어 (v4.0.30.03.02)를 사용하여 수행되었다. OK 단계 (Δ W OK )에 대해 계산된 차이 역학은 처리되지 않은 NT (Vokcontrol)로 샘플 (Voksample)의 표준화된 데이터를 공제 (subtract)하여 수행되었다. 각 데이터 설정에 대한 표준화는 VOK= (Ft - Fo)/(Fk - Fo) 공식으로 수행되었다. 그래프는 OriginPro 8 SR0 v9.0724 (B724)를 사용하여 만들었다.
B: 결과
실시예 1: OsNAC1 의 형질전환된 과발현은 영양 생장 단계에서 스트레스 내성을 부여한다
본 발명자는 시간별로는 가뭄, 고염, 저온 및 ABA에 노출된 14일 된 실생의 잎 및 뿌리의 총 RNA를 사용하여 RNA 겔 블럿 분석을 수행하였다. 벼 잎 및 뿌리에서 내재적 OsNAC1의 발현은 가뭄, 고염 및 ABA에 의해 현저하게 상향조절되나, 저온 조건에 의해서는 약하게 상향조절되었다 (도 1a). 형질전환 벼 식물체에서 OsNAC1을 과발현하기 위해, OsNAC1의 전체 길이 cDNA는 두 가지 다른 프로모터, 뿌리 특이적 발현을 위한 RCc3 (RCc3 : OsNAC1) 및 항시성 발현을 위한 GOS2 (GOS2 : OsNAC1)에 연결되었다. 유전자 구축물 당 15 내지 20개의 독립적인 형질전환 라인은 아그로박테리움 매개 형질전환 방법으로 제조되었다. 발육 저해 없이 정상 조건에서 자란 형질전환 라인의 T1 -6 종자를 수집했고, RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 두 식물체의 3개의 독립적인 T5 -6 동형접합 라인은 추가의 분석을 위해 선발했다. RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1의 발현은 뿌리 및 잎의 RNA 겔 블럿 분석으로 확인했다 (도 1b). 외래유전자 OsNAC1의 발현은 RCc3 : OsNAC1 식물의 잎에서는 검출되지 않았으나, 뿌리는 RCc3 프로모터의 뿌리 특이성을 검증하는 외래유전자의 높은 발현 수준을 나타냈다. 외래유전자의 발현 수준은 GOS2 : OsNAC1 식물의 뿌리 및 잎 모두에서 유사하게 증가했다. 게다가, 외래유전자의 발현 수준은 GOS2:OsNAC1 식물의 뿌리에서보다 RCc3 : OsNAC1 식물의 뿌리에서 더 높은 반면, 참조 튜불린의 발현은 일정하게 유지되었다.
영양 생장 단계에서 OsNAC1 과발현체 (overexpressor)의 스트레스 내성을 평가하기 위해, 4주령 형질전환 및 형질전환되지 않은 (NT) 대조구 식물은 최대 5일 동안 가뭄 스트레스를 겪었다 (도 2a). 형질전환 식물은 가뭄 처리 동안 NT에 비해 지연된 잎 말림이 나타났다. 재급수 후, 형질전환 식물은 회복하기 시작한 반면, NT 식물은 회복의 징후 없이 계속 시들어서, 영양 생장 단계에서 형질전환 식물의 가뭄 내성을 증명했다. 환경 스트레스는 식물의 광합성 기구에 영향을 미치므로, PSII의 최대 광화학 효율 (Fv/Fm: Fv, 가변 형광; Fm, 최대 형광)은 펄스 진폭 조절 형광계 (pulse amplitude modulation fluorometer)를 사용하여 측정하였다 (도 2b). 14일 된 식물은 시간별로 가뭄, 고염 및 저온 스트레스를 겪었고, 그들의 Fv/Fm 값이 측정되었다. 가뭄 및 고염 두 조건 하에서, RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1 식물은 스트레스 정도 및 형질전환 라인에 따라 NT 대조구 식물보다 10-30% 더 높은 Fv/Fm 값을 나타냈다. 저온 조건 하에서는, 대조적으로, 형질전환 및 NT 대조구 식물 사이의 Fv/Fm 값의 차이가 관찰되지 않았다. 동시에, 이러한 결과는 영양 생장 단계에서 가뭄 스트레스에 대한 두 형질전환 식물체의 향상된 내성을 나타낸다.
하기 표 10은 2009년 및 2010년 동안 정상 조건 하에서 RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1 식물의 종자 생산 매개변수의 분석을 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 2: OsNAC1 의 과발현은 정상 및 가뭄 두 조건 하에서 곡물 수확량을 증가시킨다
정상 및 경작지 가뭄 조건 하에서 형질전환 식물의 수확량 구성요소는 2번의 경작 시기 (2009년 및 2010년)동안 평가되었다. RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물체의 3개의 독립적인 T5 (2009) 및 T6 (2010) 동형접합 라인은 형질전환되지 않은 (NT) 대조구와 함께 논에 이식했고, 성숙기까지 키웠다. 수확량 매개변수는 3회의 반복 실험에서 형질전환 라인 당 30개의 식물에 대해 기록되었다. 2년의 경작지 시험으로부터의 데이터 세트는 일반적으로 일정했고, RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물의 총 곡물 중량은 각각 13-18% 및 13-32% 증가했다. 총 곡물 중량의 증가는 주로 RCc3 : OsNAC1 식물에서는 증가된 원추화서 길이 때문이며, GOS2:OsNAC1 식물에서는 증가된 원추화서 길이 및 원추화서 수 때문이었다 (도 3a; 표 10).
가뭄 조건 하에서 형질전환 식물체를 시험하기 위해, RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1 식물의 3개의 독립적인 T5 및 T6 라인은 제거할 수 있는 비가림 시설이 있는 논에 이식하였다. 식물은 원추화서 이삭이 나오는 단계까지 가뭄 스트레스에 노출되었다 (이삭이 나오기 10일 전부터 이삭이 나온 10일 후까지). 비가림 시설 하에서 적용된 가뭄 스트레스의 수준은 정상 생장 조건 하에서 얻은 총 곡물 중량의 40-50%를 제공하는 것과 동등했으며, 이는 정상 및 가뭄 조건 사이의 NT 식물의 총 곡물 중량 수준의 차이에 의해 입증된다 (추가의 표 S1 및 S2). 2번의 경작 시기 동안 기록된 수확량 매개변수의 통계 분석은 가뭄 조건 하에서 곡물 수확량의 감소가 NT 대조구에서 관찰된 것보다 RCc3 : OsNAC1 식물에서 현저하게 적다는 것을 보여주었다. 특히, 가뭄 처리된 RCc3 : OsNAC1 식물에서, 충전율이 가뭄 처리된 NT 식물보다 18-36% 더 높았고, 이는 형질전환 라인에 따라 28-72%의 총 곡물 중량의 증가를 야기했다 (도 3b; 표 11). 가뭄 처리된 GOS2 : OsNAC1 식물에서는, 대조적으로, 총 곡물 중량이 가뭄 처리된 NT 대조구와 유사하게 유지되었다. RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 영양 생장 단계 동안 유사한 가뭄 내성의 수준이 주어지면, 경작지 가뭄 조건 하에서 총 곡물 중량의 차이는 예상되지 않았다.
형질전환 식물의 뿌리 형태는 또한 이삭이 나오는 재생산 단계까지 자란 RCc3:OsNAC1, GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물의 뿌리 부피, 길이, 건조 중량 및 직경을 측정하여 관찰되었다. 도 4b에 나타난 것처럼, RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물의 뿌리 직경은 NT 대조구 식물의 뿌리 직경보다 각각 30% 및 7% 더 두꺼웠다. 가로로 절단된 뿌리의 현미경 분석은 뿌리 직경의 증가가 RCc3 : OsNAC1 뿌리의 확대된 중심주 (stele), 수피 (cortex) 및 외피 (epidermis) 때문이라는 것을 나타냈다. 특히, 통기 조직 (도 4b에서 ae)은 GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물과 비교하여 RCc3:OsNAC1 뿌리에서 더 컸는데, 이는 확대된 중심주와 함께 RCc3 : OsNAC1 뿌리의 확대에 기여할 수 있다. OsNAC1의 뿌리 특이적 과발현이 큰 통기 조직과 뿌리 직경을 증가시킨다는 사실은 재생산 단계에서 형질전환 식물의 향상된 가뭄 내성과 관련된다. GOS2 : OsNAC1 뿌리의 부피, 길이 및 건조 중량은 NT 뿌리에 비해 각각 50%, 20% 및 35% 증가했는데, 이는 상기 매개변수가 정상 생장 조건 하에서 식물의 곡물 수확량 증가에도 영향을 미친다는 것을 제안한다.
정상 생장 조건 하에서, 두 식물은 형질전환되지 않은 (NT) 대조구에 비해 더 높은 곡물 수확량을 나타냈다. RCc3 : OsNAC1 식물의 총 곡물 수확량의 증가는 주로 원추화서 길이의 증가 때문이었으나, GOS2 : OsNAC1 식물의 총 곡물 수확량 증가는 원추화서 길이, 원추화서의 수 및 작은 이삭의 수를 포함하는 수많은 형질 때문이었다. 가뭄 조건 하에서, 대조적으로, RCc3 : OsNAC1 식물은 주로 충전율의 증가 때문에 28-72%의 총 곡물 중량이 현저하게 향상되었으나, GOS2 : OsNAC1 식물은 어느 형질에도 현저한 변화가 나타나지 않았다.
OsNAC1의 뿌리 특이적 과발현은 특히 가뭄 조건 하에서 분명하게 벼 수확량의 증가에 중요한 역할을 수행했다. T5 또는 이후 세대에서 RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1 식물은 이전 세대에서 예비 선발 동안 분리되었다면, 생장 지연, 비정상적인 잎 모양 및 색깔, 및 원추화서 발육 불량과 같은 어떤 불필요한 다면 발현 효과를 나타내지 않았다. 따라서 NT 대조구에 비해서, T5 -6RCc3 : OsNAC1GOS2:OsNAC1 식물에 의해 나타난 반응의 변화는 전적으로 외래유전자에 의한 것이다. 이삭이 나오는 재생산 단계의 RCc3 : OsNAC1 식물의 뿌리 특성은 NT 대조구 및 GOS2:OsNAC1 식물의 뿌리 특성과 비교하여 뿌리 직경의 증가를 나타냈다. 상기 증가는 외견상 확대된 목질부, 커진 수피 (cortical) 세포 및 외피 (epidermis) 때문이었다. 확대된 목질부를 갖는 두꺼운 뿌리는 더 나은 수분 이동 (water flux)에 기여하며, 얇은 뿌리보다 낮은 공동현상 (cavitation)을 갖는다 (Yambao et ai, 1992). 또한, 큰 뿌리 직경 크기는 침투 (penetration)(Clark et ai, 2008; Nguyen et ai, 1997) 및 분지 (Fitter, 1991; Ingram et al., 1994) 능력에 관련되어 있기 때문에, 더 큰 뿌리는 가뭄 내성에 직접적인 역할을 한다.
하기 표 11은 2009년 및 2010년 동안 가뭄 스트레스 조건 하에서 RCc3:OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물의 종자 생산 매개변수의 분석을 나타낸다.
Figure pct00002
실시예 3: 과발현된 OsNAC1 에 의해 상향 조절된 유전자의 동정
발현 프로파일링 (profiling)은 OsNAC1의 과발현에 따라 상향 조절된 유전자를 동정하기 위해 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 뿌리에 대해 수행되었다. 벼 3'-타일링 마이크로어레이는 정상 조건 하에서 자란 14일 된 식물의 뿌리에서 추출된 RNA 샘플에 대해 수행되었다. 각 데이터 세트는 2회 반복 실험된 (duplicate) 생물학적 샘플로부터 얻었다. 단방향 (one-way) ANOVA (p<0.01)를 사용한 통계적 분석은 OsNAC1 과발현에 따라 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 뿌리에서 3배 이상 상향 조절된 46개 유전자를 동정했다 (표 10). 또한 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 뿌리에 특이적인 9개 및 28개 유전자가 각각 동정되었다 (표 12). 두 형질전환 뿌리에서 공통으로 높게 상향 조절된 표적 유전자는 ABA 생합성을 위한 유전자인 9-시스-에폭시카로티노이드 디옥시게나아제 (9- cis -epoxycarotenoid dioxygenase), 통기 조직 형성을 유도하는 수피 세포 사멸 (apoptosis)을 위한 Ca2 + 신호전달을 위한 구성 요소인 칼슘-수송 ATPase (calcium - transporting ATPase), 통기 조직을 둘러싼 경계 (barrier) 형성 (카스파리선; Casparian Strip)을 위한 리그닌 생합성에 관련된 유전자인 신나모일 CoA 리덕타아제 1 (cinnamoyl CoA reductase 1)을 포함한다. 흥미롭게도, 또한 경계 형성을 위해 필수적인 코르크질(suberin) 생합성을 위한 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제 (O- methyltransferase)는 RCc3 : NAC1 뿌리에서만 특이적으로 상향 조절되었다. 형질전환 뿌리에서 특이적으로 상향 조절된 상기 표적 유전자는 재생산 단계에서 뿌리 형태의 차이, 따라서 가뭄의 내성을 설명할 수 있다.
공통적인 표적 유전자는 9-시스-에폭시카로티노이드 디옥시게나아제, 칼슘-수송 ATPase 및 신나모일 CoA 리덕타아제 1을 포함한다. 크산톡신 (xanthoxin)을 생성하기 위한 9-시스-에폭시카로티노이드 디하이드로게나아제 (NCED)에 의한 시스-에폭시카로티노이드의 산화적 분해 (oxidative cleavage)는 ABA 생합성의 조절에서 결정적 및 율속 단계 (rate-limiting step)이다 (Tan et al., 1997). NCED 유전자는 가뭄 스트레스에 노출되었을 때 두 형질전환 식물에서 20배 이상 상향 조절되었으며, 이는 상기 식물의 민감도에 기여할 수 있다. Ca2 +-수송-ATPase (Ca 2 + -ATPase)는 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 각각 26배 및 32배 상향 조절되었다. 아포플라스트 공간 (apoplastic space)으로부터의 유입 또는 내부 저장소로부터의 유출 중 하나에 의해 유래된 세포질 Ca2 +의 일시적인 증가는 식물 세포에서 저온, 가뭄 및 염분 스트레스에 대한 초기 반응으로 이용된다 (Knight, 2000). 세포질 Ca2 +의 증가는 액포막 (tonoplast)의 파열과 결부되며, 이는 또한 뿌리의 수피 영역에서 기체가 채워진 공간인 통기 조직의 형성에 따라 뿌리 수피 세포의 사멸에 앞선 조기 이벤트 (events)를 나타낸다. 이는 RCc3 : OsNAC1 뿌리에서 관찰된 더 큰 수피 세포의 기여를 설명한다. 통기 조직은 벼에서 정단 분열조직 (apical meristem)에 의한 호흡을 위해 주변 토양으로 O2 손실을 최소화하는 것을 돕는 해부학적 적응으로 이용된다. 상기 구조는 코르크화된 후벽 섬유층 (hypodermis) 및 후벽 섬유층 바로 안쪽에 리그닌화된 세포의 층을 포함하며, 상기 두 층은 약간의 기체 투과성이다 (Drew et al., 2000). 흥미롭게도, 리그닌 생합성의 주요 효소 (EC 1.2.144)를 코딩하는 유전자인 신나모일-CoA 리덕타아제 (CRR)는 OsNAC1 과발현에 따라 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 상향 조절된다. CRR은 모노리그놀스 p-쿠마릴 (monolignols p-coumaryl), 코니페릴 (coniferyl) 및 시나필 알콜 (sinapyl alcohol)의 생산을 유도하는 생합성 경로에 특이적인 첫 번째 효소이며, 리그닌의 양 및 질을 조절한다 (Jones et al., 2001). 애기장대 상동체인 AtCCR1의 하향 조절은 식물의 표현형에 급격한 변형 (alteration)을 초래한다 (Goujon et al., 2003). 또한, 옥수수에서 기능 상실 돌연변이 (Zmccr1 -/- )는 리그닌 함량의 약간의 감소를 야기하며, 리그닌 구조에 있어서 현저한 변화를 초래한다 (Tamasloukht et al., 2011). 옥수수 유전자 ZmCCR2는 가뭄 조건에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌으며, 주로 뿌리에서 검출할 수 있다 (Fan et al., 2006). CCR과 함께, 리그닌 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 다른 유전자인 신나밀 알콜 디하이드로게나아제 (CAD)는 또한 두 식물에서 상향 조절되었다. CAD는 리그닌 생합성 경로에서 하이드록시신나모일 알데하이드 (모노리그날)의 모노리그놀로의 최종 전환을 촉매한다 (Sattler et al., 2009). 게다가, 코르크질 생합성에 관련된 효소 (EC=2.1.1-)를 코딩하는 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제는 RCc3 : OsNAC1 식물에서 특이적으로 상향 조절된다. 애기장대에서 O-메틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 ZRP4 mRNA는 뿌리에 우선적으로 축적되며, 잎, 줄기 및 다른 어린줄기 기관에서는 낮은 수준으로 내피 (endodermis) 영역 내에 대부분 위치해 있다는 것이 밝혀졌다 (Held et al., 1993). 뿌리 특이적 프로모터를 사용한 3가지 O-메틸로트랜스퍼라아제 유전자의 상향 조절은 코르크질 생합성에서의 그들의 관여 때문에 GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물에 비해 RCc3 : OsNAC1 식물의 향상된 가뭄 내성에 기여할 수 있다. 코르크질과 함께 리그닌은 경계 형성으로 불리는 과정에서 뿌리 주변 층 (peripheral layer) 벽의 리그닌화 및/또는 코르크화를 통해 방사형 산소 손실 (radial oxygen loss)을 방지하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 내피 및 외피 세포의 방사형 및 횡단 (transverse) 벽에 대한 경계 형성은 일반적으로 카스파리선 (Casparian Strip, CS)과 관련되어 있다. CS의 주요 기능은 뿌리에서 선택적인 아포플라스트 우회 (selective apoplastic bypass)를 방지하여 중심주 (stele)로의 수분 및 염 수송을 저해하는 것이다 (Ma et al., 2003). Cai 등 (2011)은 염 및 가뭄 내성이 있는 Liaohan 109에서 내피 및 외피에 대한 CS의 발달이 중간 정도의 염-민감성인 Tianfeng 202 및 염 민감성인 Nipponbare보다 더 일찍 발생한다는 것을 보고했다. 상기 그룹은 또한 영양 용액에 염분이 없더라도, Liaohan 109에서 CS의 발달이 앞당겨지고 증가했다는 것을 보고했다. 따라서, 마이크로어레이 결과는 뿌리에서 특이적으로 또는 전체 식물체 전역에서 OsNAC1의 과발현에 의해 영향받은 식물이 어떻게 가뭄 스트레스를 견디는지 및 어떻게 유전자를 조절하는지에 대한 이해를 우리에게 제공했다.
마이크로어레이 결과는 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 뿌리에서 공통적인 46개의 상향 조절된 표적 유전자를 나타냈다 (표 12). 게다가, 9개 및 28개 표적 유전자는 각각 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 뿌리에서 특이적으로 상향 조절되는 것이 밝혀졌다 (표 12). 공통적인 표적 유전자는 9-시스-에폭시카로티노이드 디옥시게나아제, 칼슘-수송 ATPase 및 신나모일 CoA 리덕타아제 1을 포함한다. 크산톡신 (xanthoxin)을 생성하기 위한 9-시스-에폭시카로티노이드 디하이드로게나아제 (NCED)에 의한 시스-에폭시카로티노이드의 산화적 분해 (oxidative cleavage)는 ABA 생합성의 조절에서 결정적 및 율속 단계 (rate-limiting step)이다 (Tan et al., 1997). NCED 유전자는 가뭄 스트레스에 노출되었을 때 두 형질전환 식물에서 20배 이상 상향 조절되었으며, 이는 상기 식물의 민감도에 기여할 수 있다. Ca2 +-수송-ATPase (Ca 2 + - ATPase)는 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 각각 26배 및 32배 상향 조절되었다. 아포플라스트 공간 (apoplastic space)으로부터의 유입 또는 내부 저장소로부터의 유출 중 하나에 의해 유래된 세포기질의 Ca2 +의 일시적인 증가는 식물 세포에서 저온, 가뭄 및 염분 스트레스에 대한 이른 반응을 제공한다 (Knight, 2000). 세포질 Ca2 +의 증가는 액포막 (tonoplast)의 파열과 결부되며, 이는 또한 뿌리의 수피 영역에서 기체가 채워진 공간인 통기 조직의 형성에 따라 뿌리 수피 세포의 사멸에 앞선 조기 이벤트 (events)를 나타낸다. 이는 RCc3 : OsNAC1 뿌리에서 관찰된 더 큰 수피 세포의 기여를 설명한다. 통기 조직은 벼에서 정단 분열조직 (apical meristem)에 의한 호흡을 위해 주변 토양으로 O2 손실을 최소화하는 것을 돕는 해부학적 적응으로 이용된다. 상기 구조는 코르크화된 후벽 섬유층 (hypodermis) 및 후벽 섬유층 바로 안쪽에 리그닌화된 세포의 층을 포함하며, 상기 두 층은 약간의 기체 투과성이다 (Drew et al., 2000). 흥미롭게도, 리그닌 생합성의 주요 효소 (EC 1.2.144)를 코딩하는 유전자인 신나모일-CoA 리덕타아제 (CRR)는 OsNAC1 과발현에 따라 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 상향 조절된다. CRR은 모노리그놀스 p-쿠마릴 (monolignols p-coumaryl), 코니페릴 (coniferyl) 및 시나필 알콜 (sinapyl alcohol)의 생산을 유도하는 생합성 경로에 특이적인 첫 번째 효소이며, 리그닌의 양 및 질을 조절한다 (Jones et al., 2001). 애기장대 상동체인 AtCCR1의 하향 조절은 식물의 표현형에 급격한 변형 (alteration)을 초래한다 (Goujon et al., 2003). 또한, 옥수수에서 기능 상실 돌연변이 (Zmccr1 -/- )는 리그닌 함량의 약간의 감소를 야기하며, 리그닌 구조에 있어서 현저한 변화를 초래한다 (Tamasloukht et al., 2011). 옥수수 유전자 ZmCCR2는 가뭄 조건에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌으며, 주로 뿌리에서 검출할 수 있다 (Fan et al., 2006). CCR과 함께, 리그닌 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 다른 유전자인 신나밀 알콜 디하이드로게나아제 (CAD)는 또한 두 식물에서 상향 조절되었다. CAD는 리그닌 생합성 경로에서 하이드록시신나모일 알데하이드 (모노리그날)의 모노리그놀로의 최종 전환을 촉매한다 (Sattler et al., 2009). 게다가, 코르크질 생합성에 관련된 효소 (EC=2.1.1-)를 코딩하는 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제는 RCc3 : OsNAC1 식물에서 특이적으로 상향 조절된다. 애기장대에서 O-메틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 ZRP4 mRNA는 잎, 줄기 및 다른 신초 기관에서는 낮은 수준으로 나타나고, 뿌리에 우선적으로 축적되며, 내피 (endodermis) 영역 내에 대부분 위치해 있다는 것이 밝혀졌다 (Held et al., 1993). 뿌리 특이적 프로모터를 사용한 3가지 O-메틸로트랜스퍼라아제 유전자의 상향 조절은 상기 기술된 것처럼 코르크질 생합성에서 그것 (O-메틸로트랜스퍼라아제)의 관여 때문에 GOS2 : OsNAC1 및 NT 식물에 비해 RCc3 : OsNAC1 식물의 향상된 가뭄 내성에 기여할 수 있다. 따라서, 마이크로어레이 결과는 뿌리에서 특이적으로 또는 전체 식물체 전역에서 OsNAC1의 과발현에 의해 영향받은 식물이 어떻게 가뭄 스트레스를 견디는지 및 어떻게 유전자를 조절하는지에 대한 이해를 우리에게 제공했다.
비형질전환 대조구에 비해 RCc3 : OsNAC1GOS2 : OsNAC1 식물에서 상향 조절된 뿌리 발현 유전자
유전자명 유전자좌 번호a
(IRGSP)
RCc3 : OsNAC1 GOS2 : OsNAC1 서열번호
평균b p-값c 평균b p-값c

RCc3 : OsNAC1 GOS2 : OsNAC1 식물에서 상향조절된 유전자
Protein kinase Os01g0117600 3,60 0,00 3,04 0,00 48 & 49
ABC transporter Os01g0609300 3,39 0,00 4,44 0,00 50 & 51
Peptidase aspartic Os01g0937500 3,40 0,00 3,37 0,00 52 & 53
Cytochrome P450 Os02g0601400 5,35 0,00 2,91 0,00 54 & 55
WAK3 Os02g0807900 5,02 0,00 4,47 0,00 56 & 57
Cinnamoyl CoA Reductase 1 Os02g0811800 10,65 0,00 7,47 0,00 58 & 59
Acyl-activating enzyme Os03g0130100 3,09 0,00 3,31 0,00 60 & 61
Phytosulfokine Os03g0232400 3,69 0,00 2,85 0,00 62 & 63
U-box Os03g0240600 6,16 0,00 7,27 0,00 64 & 65
Aspartyl protease Os03g0318400 3,59 0,00 3,61 0,00 66 & 67
High affinity K+ transporter 5 Os03g0575200 5,28 0,00 5,03 0,00 68 & 69
Copalyl diphosphate synthetase Os04g0178300 3,50 0,00 3,56 0,00 70 & 71
RLP (receptor-like protein kinase) Os04g0202700 4,10 0,00 4,16 0,00 72 & 73
MAPKKK9 Os04g0339800 7,17 0,00 6,91 0,00 74 & 75
WAK2 Os04g0365100 4,60 0,00 3,56 0,00 76 & 77
WAK2 Os04g0368800 3,87 0,00 3,56 0,00 78 & 79
Glutamate dehydrogenase Os04g0543900 3,13 0,00 3,00 0,00 80 & 81
Downy mildew resistnant 6 Os04g0581000 4,49 0,00 4,55 0,00 82 & 83
Oxidoreductase, 2OG-Fe(II) oxygenase Os04g0581100 70,90 0,00 61,65 0,00 84 & 85
Pyruvate kinase Os04g0677300 3,27 0,00 4,05 0,00 86 & 87
Zinc finger Os05g0404700 3,11 0,00 5,46 0,00 88 & 89
Aldo/keto reductase Os05g0456100 3,89 0,00 2,37 0,00 90 & 91
Aldo/keto reductase Os05g0456200 3,40 0,00 2,57 0,00 92 & 93
Early nodulin 93 Os06g0141600 3,06 0,00 3,47 0,00 94 & 95
Integral membrane protein Os06g0218900 3,12 0,00 2,37 0,00 96 & 97
Haem peroxidase Os06g0521500 3,01 0,00 3,44 0,00 98 & 99
Pathogenesis-related protein Os07g0129300 3,08 0,00 3,44 0,00 100 & 101
RLK (receptor lectin kinase) Os07g0129800 4,87 0,00 3,96 0,00 102 & 103
9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase Os07g0154100 20,06 0,00 25,41 0,00 104 & 105
Cloroplastosos alterados Os07g0190000 4,09 0,00 4,50 0,00 106 & 107
Leucine-rich repeat transmembrane kinase Os07g0251900 8,22 0,00 5,96 0,00 108 & 109
Leucine-rich repeat protein kinase Os08g0201700 3,53 0,00 2,26 0,00 110 & 111
Leucine-rich repeat protein kinase Os08g0203400 7,64 0,00 6,21 0,00 112 & 113
WRKY40 Os09g0417600 7,64 0,00 7,21 0,00 114 & 115
WRKY18 Os09g0417800 6,93 0,00 7,16 0,00 116 & 117
Potassium ion transmembrane transporter Os09g0448200 7,71 0,00 7,06 0,00 118 & 119
WAK2 Os10g0151100 6,63 0,00 4,06 0,00 120 & 121
Calcium-transporting ATPase Os10g0418100 26,21 0,00 32,54 0,00 122 & 123
Aspartyl protease Os10g0537800 4,59 0,00 4,28 0,00 124 & 125
Aspartyl protease Os10g0538200 4,47 0,00 3,98 0,00 126 & 127
DNA binding/ Homeodomain Os11g0282700 126,94 0,00 100,82 0,00 128 & 129
Calcium-binding EF hand family protein Os11g0600500 4,32 0,00 4,02 0,00 130 & 131
Zinc finger Os11g0687100 5,60 0,00 6,05 0,00 132 & 133
Zinc finger Os11g0702400 3,23 0,00 3,74 0,00 134 & 135
Germin-like protein 9 Os12g0154800 3,01 0,00 2,99 0,00 136 & 137
AAA-ATPase 1 Os12g0431100 3,10 0,00 4,24 0,00 138 & 139

RCc3 : OsNAC1 식물에서 상향조절된 유전자
Cytochrome P450 Os02g0601500 5,42 0,00 1,86 0,00 140 & 141
MtN3 Os05g0426000 4,03 0,00 1,27 0,07 142 & 143
Leucine-rich repeat Os08g0202300 3,34 0,00 1,52 0,03 144 & 145
O-methyltransferase Os09g0344500 3,68 0,00 1,23 0,05 146 & 147
AAA-type ATPase Os09g0445700 31,09 0,00 1,15 0,11 148 & 149
O-methyltransferase Os10g0118000 4,39 0,00 1,50 0,01 150 & 151
O-methyltransferase Os10g0118200 6,36 0,00 1,30 0,06 152 & 153
protein kinase Os11g0274700 5,00 0,00 1,95 0,00 154 & 155
Disease resistance protein Os11g0491600 59,47 0,00 1,08 0,91 156 & 157

GOS2 : OsNAC1 식물에서 상향조절된 유전자
Aminotransferase Os01g0729600 1,54 0,10 8,41 0,00 158 & 159
Xyloglucosyl transferase Os02g0280300 -2,09 0,01 4,44 0,00 160 & 161
Cinnamoyl CoA reductase 1 Os02g0808800 -1,23 0,47 9,51 0,00 162 & 163
Downy mildew resistant 6 Os03g0122300 1,78 0,01 3,01 0,00 164 & 165
Proline extensin-like receptor kinase 1 Os03g0269300 1,76 0,01 5,31 0,00 166 & 167
WRKY1 Os03g0335200 1,78 0,03 3,28 0,00 168 & 169
Salt tolerance zinc finger Os03g0437200 -1,29 0,76 3,65 0,00 170 & 171
AAA-ATPase 1 Os03g0802400 1,44 0,15 3,13 0,00 172 & 173
Hydrolase Os04g0411800 1,81 0,01 3,30 0,00 174 & 175
Hydrolase Os04g0412000 1,55 0,03 3,05 0,00 176
Membrane bound O-acyl transferase Os04g0481800 1,92 0,02 4,22 0,00 177 & 178
Cinnamyl alcohol dehydrogenase 6 Os04g0612700 -1,33 0,37 5,27 0,00 179 & 180
Leucine-rich repeat Os04g0621900 -0,05 0,50 4,18 0,00 181 & 182
Phosphofructokinase 3 Os05g0194900 1,73 0,01 4,42 0,00 183 & 184
Pyruvate decarboxylase Os05g0469600 1,61 0,00 4,65 0,00 185 & 186
L-lactate dehydrogenase Os06g0104900 1,67 0,01 4,17 0,00 187 & 188
Disease resistance protein Os06g0279900 -1,18 0,18 4,54 0,00 189 & 190
FAD-binding domain-containing protein Os06g0548200 2,00 0,00 3,78 0,00 191 & 192
Universal stress protein Os07g0673400 1,89 0,01 4,39 0,00 193 & 194
Terpene synthase/cyclase Os08g0167800 1,89 0,02 3,74 0,00 195 & 196
Acidic endochitinase Os08g0518900 1,95 0,00 4,03 0,00 197 & 198
Pin-formed 5 Os08g0529000 0,17 0,43 4,10 0,00 199 & 200
Calcium-binding EF Os09g0483100 -0,08 0,94 6,22 0,00 201 & 201
Calcium-binding EF hand Os09g0483300 1,39 0,12 3,54 0,00 203 & 204
Purple acid phosphatase 3 Os10g0116800 1,46 0,21 3,96 0,00 205 & 206
Phosphoenolpyruvate carboxykinas 1 Os10g0204400 1,53 0,05 4,42 0,00 207 & 208
HAT dimerization domain-containing protein Os10g0567900 -0,11 0,60 3,56 0,00 209 & 210
Acidic endochitinase Os11g0701000 -1,27 0,65 3,03 0,00 211 & 212
a해당 유전자의 전체 길이 cDNA 서열에 대한 서열 식별 번호. b반복 실험된 (duplicate) 생물학적 샘플의 평균. c p-값은 단방향 ANOVA (p<O.01)로 분석했다. 상기 마이크로어레이 데이터 세트는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus, GEO, Accession number)에서 찾을 수 있다.
실시예 4: OsNAC5 의 형질전환된 과발현은 가뭄 및 고염 조건에 대한 식물 내성을 증가시켰다
스트레스 조건 하에서 OsNAC5의 전사체 수준을 조사하기 위해, 본 발명자는 고염, 가뭄, ABA 및 저온에 노출된 14일 된 벼 실생의 잎 및 뿌리 조직의 총 RNA를 사용하여 RNA 겔 블럿 분석을 수행했다 (도 5A). 잎 및 뿌리 두 조직에서 OsNAC5의 발현은 가뭄, 고염 및 ABA의 처리에 의해 현저하게 유도되었으나, 저온 조건에서는 유도되지 않았다. OsNAC5의 전사체 수준은 가뭄 및 염분 처리 0.5시간 후에 증가하기 시작하여 스트레스 처리 2시간에 최대로 나타났으나, 외인성 ABA의 처리에 의해서는 전사체 수준이 6시간까지 점진적으로 증가했다.
형질전환 벼 식물에서 OsNAC5를 과발현시키기 위해, RCc3 : OsNAC5GOS2:OsNAC5의 두 발현 벡터는 뿌리 특이적 및 보존된 발현을 위해 RCc3 (Xu et al., 1995) 및 GOS2 (de Pater et al., 1992)에 OsNAC5 cDNA를 각각 융합하여 제작했다. 발현 벡터는 아그로박테리움 매개 형질전환 방법 (Hiei et al., 1994)을 이용하여 벼 (Oryza sativa cv Nipponbare)에 형질전환하였고, 유전자 구축물 당 15-20개의 형질전환 식물을 생산했다. 발육 저해 없이 정상 조건에서 자란 형질전환 라인의 T1 -6 종자를 수집하였고, RCc3 : OsNAC5 GOS2 : OsNAC5 두 식물의 3개의 독립적인 T5 -6 동형접합 라인은 추가의 분석을 위해 선발했다. 형질전환 식물에서 OsNAC5의 발현 수준을 측정하기 위해, RNA 겔 블럿 분석이 정상 생장 조건 하에서 자란 14일 된 실생의 잎 및 뿌리 조직의 총 RNA를 사용하여 수행되었다. OsNAC5 발현의 증가한 수준은 RCc3 : OsNAC5 식물의 뿌리 및 GOS2 : OsNAC5 식물의 잎 및 뿌리에서는 검출되었으나, 형질전환되지 않은 (NT) 및 공접합자 (외래 유전자가 없는 분리주) 식물에서는 검출되지 않았다 (도 5B).
가뭄 스트레스에 대한 형질전환 식물의 내성을 평가하기 위해, 1개월 된 형질전환 및 NT 대조구 식물은 온실에서 물을 억제함으로써 가뭄 스트레스를 처리했다. 시간별 가뭄 처리에서, 두 형질전환 식물은 NT 대조구보다 엽록소의 부수적인 손실을 동반한 시들음 및 잎 말림과 같은 스트레스에 의해 유도된 손상 증상이 지연되는 것을 보여주었다 (도 6A). 형질전환 식물은 또한 7일까지의 재급수 동안 더 잘 회복되었다. 형질전환 식물의 생존율은 60 내지 80%에 이르는 반면, NT 대조구 식물은 회복의 징후가 없었다.
형질전환 식물의 스트레스 내성을 더 확인하기 위해, 본 발명자는 암-순응 상태에서 광계 II (PSII)의 광화학 효율의 지표인 Fv/Fm 값의 변화를 측정하였다. 2주령의 형질전환 및 NT 대조구 식물의 잎 디스크 (leaf disc)는 표시된 시간 동안 가뭄, 고염 및 저온 처리되었다. 스트레스 처리되지 않은 식물의 Fv/Fm 값은 약 0.8이었다. 가뭄 (0.5시간) 및 고염 (2시간) 조건의 초기 단계에서, RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물의 Fv/Fm 수준은 NT 대조구의 Fv/Fm 수준보다 15-22% 더 높았다 (도 6B). 그러나, 연장된 가뭄 (2시간) 및 고염 (6시간) 스트레스뿐만 아니라 저온 조건 하에서, 상기 Fv/Fm 수준은 NT 대조구의 Fv/Fm 수준과 유사하게 유지되었으며, 이는 형질전환 식물의 내성의 적당한 (moderate) 수준을 제안한다. JIP 테스트는 암-순응된 식물의 조명 (illumination) 후 50 μs 및 300 μs 사이에 일시적인 엽록소 a 형광을 분석함으로써 대안적인 스트레스 내성 측정 방법을 제공한다 (Redillas et al., 2011a and 2011 b). 상기 JIP 테스트는 PSII 유닛의 안테나 (antenna) 사이의 연결성 (connectivity)에 대한 정보를 제공한다. 상기 연결은 소위 L-밴드 (L-band)가 나타내는 차이 역학 (difference kinetics)에 의해 도시될 수 있다. 상기 밴드는 상기 식물의 연결성이 스트레스 처리되지 않은 NT 대조구의 연결성보다 높을 때 (또는 낮을 때) 부정적 (또는 긍정적)이다. 상기 연결성은 또한 식물의 엽록소 a 형광을 측정하는 Fv/Fm 분석을 이용해서 검출할 수 없다. 본 발명자는 재생산 단계의 식물에 대해 JIP 테스트를 수행했는데, 이는 두 형질전환 식물이 가뭄 조건 하에서 NT 대조구보다 높은 연결성을 갖는다는 것을 나타냈다 (도 6C 및 D). 더 구체적으로, 연결성은 NT 대조구를 제외하고, RCc3:OsNAC5 식물 다음으로 GOS2 : OsNAC5 식물에서 높았는데, 이는 재생산 단계에서 가뭄 내성의 차이를 나타낸다.
Figure pct00003
실시예 5: OsNAC5 의 과발현은 정상 및 가뭄 두 조건 하에서 곡물 수확량을 증가시킨다
RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물의 경작지 성과는 정상 및 가뭄 조건 하의 논에서 2번의 재배 시기 동안 평가되었다. RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물체의 3개의 독립적인 T5 (2009) 및 T6 (2010) 동형접합 라인은 형질전환되지 않은 (NT) 대조구와 함께 논에 이식했고, 성숙기까지 키웠다. 수확량 매개변수는 3회의 반복 실험에서 형질전환 라인 당 30개의 식물에 대해 기록되었다. 2년의 경작지 시험으로부터의 데이터 세트는 일반적으로 일정했고, RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물의 총 곡물 중량은 각각 9-15% 및 13-26% 증가했다. 두 형질전환 식물에서 증가된 총 곡물 중량은 NT 대조구의 충전율과 유사한 충전율을 갖는 증가된 원추화서 당 작은 이삭의 수 및 총 작은 이삭의 수와 관련되어 있다 (도 7A; 표 13).
가뭄 조건 하에서 형질전환 식물체를 시험하기 위해, RCc3 : OsNAC5GOS2:OsNAC5 식물의 3개의 독립적인 T5 (2009) 및 T6 (2010) 라인은 이동할 수 있는 비가림 시설이 설치된 순화된 경작지 (refined field)에 이식하였다. 식물은 원추화서 이삭이 나오는 단계까지 가뭄 스트레스에 노출되었다 (이삭이 나오기 10일 전부터 이삭이 나온 10일 후까지). 잎 말림이 완료될 때까지 스트레스 처리한 후에, 식물은 밤새 급수되었고, 직후에 잎 말림이 완료될 때까지 2번째 가뭄 처리를 다시 수행하였다. 가뭄 처리가 완료되면, 식물이 종자 성숙 단계에서 회복할 수 있게 하기 위해 급수했다. 비가림 시설 하에서 적용된 가뭄 스트레스의 수준은 정상 생장 조건 하에서 얻은 총 곡물 중량의 40%를 제공하는 것과 동등했으며, 이는 정상 및 가뭄 조건 사이의 NT 식물의 총 곡물 중량 수준의 차이에 의해 입증된다 (표 13 및 14). 2번의 경작 시기 동안 기록된 수확량 매개변수의 통계 분석은 가뭄 조건 하에서 곡물 수확량의 감소가 GOS2 : OsNAC5 또는 NT 대조구에서 관찰된 것보다 RCc3:OsNAC5 식물에서 현저하게 적다는 것을 보여준다. 특히, 가뭄 처리된 RCc3:OsNAC5 식물에서, 작은 이삭의 수 및/또는 충전율이 가뭄 처리된 NT 식물보다 더 높았고, 이는 형질전환 라인에 따라 33-63% (2009) 및 22-48% (2010)의 총 곡물 중량을 증가시켰다 (도 7B; 표 13). 가뭄 처리된 GOS2 : OsNAC5 식물에서는, 대조적으로, 총 곡물 중량이 가뭄 처리된 NT 대조구보다 감소했거나 (2009), NT 대조구와 유사하게 (2010) 유지되었다. RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물에서 영양 생장 단계 동안 유사한 가뭄 내성의 수준이 주어지면, 경작지 가뭄 조건 하에서 총 곡물 중량의 차이는 예상되지 않았다. 이러한 관찰은 본 발명자가 형질전환 식물의 뿌리 형태를 조사하는 것을 촉구했다. 본 발명자는 이삭이 나오는 재생산 단계까지 자란 RCc3:OsNAC5, GOS2 : OsNAC5 및 NT 식물의 뿌리 부피, 길이, 건조 중량 및 직경을 측정했다. 도 4A 및 B에 나타난 것처럼, RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물의 뿌리 직경은 NT 대조구 식물의 직경보다 각각 30% 및 10% 더 컸다. 가로로 절단된 뿌리의 현미경 분석은 뿌리 직경의 증가가 RCc3 : OsNAC5 뿌리의 확대된 중심주 및 통기 조직 때문이라는 것을 나타냈다. 특히, 중심주의 주요 부위인 후생 목부 (metaxylem; Me) 및 수피 세포 사멸에 의해 생긴 조직인 통기 조직 (Ae)는 NT 뿌리에 비해 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 뿌리에서 더 컸다 (도 8C). 후생 목부 및 통기 조직의 크기는 이전에 생식생장 단계의 가뭄 내성과 관련되어 있었다 (Yambao et al., 1992; Zhu et al., 2010). RCc3 : OsNAC5GOS2:OsNAC5 뿌리의 부피 및 건조 중량도 증가했는데, 이는 직경과 함께 이러한 매개 변수가 정상 및/또는 가뭄 조건 하에서 형질전환 식물의 곡물 수확량의 증가에 기여한다는 것을 제안한다.
Figure pct00004
실시예 6: OsNAC5 과발현에 따라 상향 조절된 유전자의 동정
OsNAC5의 과발현에 의해 상향 조절되는 유전자를 동정하기 위해, 본 발명자는 정상 생장 조건 하에서 NT 대조구와 비교하여 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물의 발현 프로파일링 (profiling)을 수행했다. 상기 프로파일링은 정상 조건 하에서 자란 14일 된 식물의 뿌리에서 추출한 RNA 샘플을 사용한 벼 3'-타일링 마이크로어레이를 이용하여 수행되었다. 각 데이터 세트는 2회의 생물학적 반복 실험으로부터 얻었다. 단방향 ANOVA를 이용한 통계 분석은 OsNAC5 과발현에 따라 NT 대조구에 비해(P>0.05) 두 형질전환된 뿌리에서 3배 이상 상향 조절된 25개의 표적 유전자를 동정했다. 또한 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 뿌리에서 각각 특이적으로 상향 조절된 19개 및 18개의 표적 유전자가 동일한 분석에서 동정되었다 (표 15). 앞서 수행된 마이크로어레이 실험 (GEO 등록 번호 GSE31874)은 가뭄, 고염, 추위 및 ABA 하에서 스트레스에 의해 유도된 62개의 표적 유전자 중 22개의 전체 (각각, 공통의, RCc3 : OsNAC5-특이적 및 GOS2 : OsNAC5-특이적인 7개, 8개 및 7개 유전자)를 밝혔다 (표 15). 게다가, 세포 성장 및 발달에 관련된 유전자인 GLP (Yin et al., 2009), PDX (Titiz et al., 2006), MERI5 (Verica and Medford, 1997) 및 O-메틸트랜스퍼라아제 (Held et al., 1993)는 RCc3 : OsNAC5 뿌리에서 특이적으로 상향 조절되었는데, 이는 뿌리 형태의 변형에 있어서 그들의 역할(들)을 제시한다. OsNAC5 형질전환 뿌리에서 공통으로 또는 특이적으로 상향 조절된 상기 표적 유전자는 변형된 뿌리 형태 및 그것에 의해 증가된 가뭄 내성 표현형을 설명할 수 있다.
마이크로어레이 실험은 RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 두 식물에서 공통으로 상향 조절된 25개의 뿌리 발현 유전자에 더하여, RCc3 : OsNAC5GOS2 : OsNAC5 식물에서 각각 특이적으로 상향 조절된 19개 및 18개의 뿌리 발현 유전자를 동정했다. 스트레스 반응에서 작용하는 많은 유전자는 두 형질전환 뿌리에서 상향 조절되었다. 이들은 시토크롬 P450, ZIM, 옥시다아제, 스트레스 반응 단백질 및 열 충격 단백질을 포함한다. 또한 두 형질전환된 뿌리에서 WRKY, bZIP 및 징크 핑거 (Zinc finger)와 같은 전사인자 및 멀티코퍼 옥시다아제 (multicopper oxidase), 키티나아제 (chitinase) 및 글리코실 하이드롤라아제 (glycosyl hydrolase)와 같은 활성 산소종 제거 시스템이 동정되었다. 이러한 표적 유전자의 증가된 발현은 가뭄 조건에 대한 향상된 내성에 기여할 수 있다. RCc3 : OsNAC5 뿌리에서 특이적으로 상향 조절된 표적 유전자는 세포 성장 및 발달에 작용하는 것이 알려진 GLP, PDX, MERI5 및 O-메틸트랜스퍼라아제였다. IAA에 특이적으로 결합하는 애기장대 GLP4가 세포 성장을 조절하는 것이 제안되었다 (Yin et al., 2009). PDX는 비타민 B6 생합성에 관련되고, 애기장대 pdx1 .3 돌연변이체는 일차근 (primary root) 성장이 강하게 감소했으며, 염분 및 삼투 스트레스에 대한 과민성이 증가했다 (Titiz et al., 2006). 애기장대에서 MERI5의 과발현은 세포 팽창 변화를 갖는 비정상적인 발달을 초래했다 (Verica and Medford, 1997). 코르크질 생합성에 관련된 효소를 코딩하는 유전자인 O-메틸트랜스퍼라아제 또한 RCc3 : OsNAC5 뿌리에서 특이적으로 상향 조절되었다. 애기장대에서, O-메틸트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 ZRP4의 전사체는 뿌리에 우선적으로 축적되며, 잎, 줄기 및 다른 신초 기관에서는 낮은 수준으로 내피 (endodermis) 영역 내에 대부분 위치해 있다는 것이 밝혀졌다 (Held et al., 1993). 뿌리 특이적 프로모터에 의한 3가지 O-메틸트랜스퍼라아제 유전자의 상향 조절은 코르크질 생합성에서의 그들의 관여 때문에 GOS2:OsNAC5 및 NT 식물에 비해 RCc3 : OsNAC5 식물의 향상된 가뭄 내성에 기여할 수 있다. 리그닌 및 코르크질은 경계 형성으로 알려진 과정에서 뿌리 주변 층 벽의 리그닌화 및/또는 코르크화를 통해 방사형 산소 손실 (radial oxygen loss)을 방지하는데 중요한 역할을 한다. 종합적으로, RCc3 : OsNAC5 뿌리에서 상기 표적 유전자의 증가된 발현은 재생산 단계에서 가뭄 스트레스에 대한 내성을 향상시키는 뿌리 조직을 확대시켰다.
하기 표 15는 형질전환되지 않은 대조구에 비해 RCc3 : OsNAC5 및/또는 GOS2:OsNAC5 식물에서 상향 조절된 뿌리 발현 유전자를 나타낸다.
a해당 유전자의 전체 길이 cDNA 서열에 대한 서열 식별 번호. b(A) ABA, (C)추위, (D) 가뭄 및 (S) 염분에 대한 스트레스 반응성 유전자는 본 발명의 마이크로어레이 프로파일링 데이터 (등록 번호: GSE31874)를 기반으로 한다. C2회의 독립적인 생물학적 반복 실험 (replicate)의 평균. 굵은 글씨의 숫자는 3배 이상의 상향 조절을 나타낸다 (p<0.05). d P-값은 단방향 ANOVA로 분석했다. 명세서에서 논의된 유전자는 굵은 글씨이다. 상기 마이크로어레이 데이터 세트는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ (Gene Expression Omnibus, GEO), 등록번호: GSE31856에서 찾을 수 있다.
비형질전환 대조구에 비해 RCc3 : OsNAC5 및/또는 GOS2 : OsNAC5 식물에서 상향 조절된 유전자
유전자명 유전자좌 번호a RCc3:OsNAC5 GOS2:OsNAC3 스트레스 반응 서열번호
평균b p-값c 평균b p-값c

RCc3 : OsNAC5 GOS2 : OsNAC5 식물에서 상향조절된 유전자
Calcium-transporting ATPase Os10g0418100 10,36 0,00 6,19 0,00 C 213 & 214
Oxo-phytodienoic acid reductase Os06g0215900 10,82 0,00 15,54 0,00 215 & 216
Cinnamoyl-CoA reductase Os02g0811800 8,55 0,00 9,05 0,00 217 & 218
Chitinase Os11g0701500 7,12 0,00 14,20 0,00 219 & 220
Cytochrome P450 Os12g0150200 6,37 0,00 4,79 0,00 C, D, S 221 & 222
CBS protein Os02g0639300 6,04 0,00 3,70 0,00 223 & 224
Sulfotransferase Os01g0311600 5,24 0,00 7,60 0,00 225 & 226
Aminotransferase Os05g0244700 5,18 0,00 6,05 0,00 A, D, S 227 & 228
Chitinase Os11g0701000 4,97 0,00 14,04 0,00 229 & 230
Multicopper oxidase Os01g0127000 4,69 0,00 4,91 0,00 231 & 232
Nicotianamine synthase Os07g0689600 4,70 0,00 5,15 0,00 233 & 234
Pathogenesis-related transcriptional factor Os07g0674800 4,09 0,00 12,03 0,00 235 & 236
Cinnamoyl-CoA reductase Os02g0808800 4,14 0,00 11,52 0,00 237 & 238
Cinnamyl alcohol dehydrogenase Os04g0612700 3,90 0,00 17,61 0,00 239 & 240
ZIM Os03g0180900 4,06 0,00 3,07 0,00 A,C,D,S 241 & 242
Glycoside hydrolase Os05g0247800 4,07 0,00 4,04 0,00 A, S 243 & 244
Glutathione-S-transferase Os10g0530500 3,88 0,00 4,81 0,00 245 & 246
Iron-phytosiderophore transporter Os02g0649900 3,86 0,00 5,40 0,00 247 & 248
Aminotransferase Os01g0729600 3,21 0,00 15,45 0,00 249 & 250
Oxidase Os06g0548200 3,61 0,00 3,82 0,00 251 & 252
Disease resistance response protein Os07g0643800 3,07 0,00 3,45 0,00 253 & 254
WRKY Os06g0649000 3,39 0,00 5,62 0,00 D, S 255 & 256
Acyltransferase Os03g0245700
3,06 0,00 3,76 0,00 257 & 258
Pyruvate kinase Os04g0677300
3,01 0,00 3,66 0,00 259 & 260
Oxidative stress response protein Os03g0830500
3,32 0,00 4,07 0,00 D, S 261 & 262

RCc3 : OsNAC5 식물에서 상향조절된 유전자
GLP Os03g0694000
32,65 0,00 1,05 0,00 A, S 263 & 264
C4-dicarboxylate transporter Os04g0574700
30,10 0,00 1,11 0,00 265 & 266
O-methyltransferase Os10g0118200
16,47 0,00 -1,46 0,00 A, S 267 & 268
Fructose-bisphosphate aldolase Os08g0120600 11,27 0,00 1,01 0,00 D, S 269 & 270
O-methyltransferase Os09g0344500 8,43 0,00 -1,09 0,00 A, S 271 & 272
MtN Os05g0426000 7,86 0,00 1,62 0,00 273 & 274
O-methyltransferase Os10g0118000 7,09 0,00 -2,23 0,00 S 275 & 276
Dehydration-responsive protein Os11g0170900 6,10 0,00 1,24 0,00 D 277 & 278
Lipid transfer protein Os01g0822900 5,06 0,00 1,61 0,00 279 & 280
Oxidase Os03g0693900 4,86 0,00 1,99 0,00 A, S 281 & 282
Glutamine synthetase Os03g0712800 4,16 0,00 1,25 0,00 283 & 284
Lipid transfer protein Os11g0115400 3,71 0,00 1,87 0,00 A 285 & 286
PDX Os07g0100200 3,61 0,00 1,77 0,00 287 & 288
Cytochrome P450 Os01g0804400 3,61 0,00 1,10 0,00 289 & 290
MERI5 Os04g0604300 3,57 0,00 1,41 0,00 291 & 292
Homeobox Os06g0317200 3,33 0,00 -1,97 0,00 293 & 294
Pectin acetylesterase Os01g0319000 3,24 0,00 -1,50 0,00 295 & 296
bZIP Os02g0191600 3,20 0,00 -1,73 0,00 297 & 298
Lipid transfer protein Os12g0115000 3,08 0,00 1,76 0,00 299 & 300

GOS2 : OsNAC5 식물에서 상향조절된 유전자
Glutathione S-transferase Os09g0367700 1,30 0,00 10,26 0,00 A, D, S 301 & 302
Serine/threonine protein kinase Os03g0269300 1,51 0,00 8,70 0,00 303 & 304
WRKY Os03g0335200 1,18 0,00 7,56 0,00 305 & 306
Heavy metal transport/detoxification protein Os04g0464100 1,20 0,00 6,78 0,00 307 & 308
Stress response protein Os01g0959100 -1,09 0,00 4,76 0,00 C, D, S 309 & 310
Auxin efflux carrier Os08g0529000 1,19 0,00 4,52 0,00 311 & 312
Subtilase Os02g0270200 1,93 0,00 4,41 0,00 313 & 314
UDP-glucuronosyl/UDP-glucosyltransferase Os01g0638000 1,23 0,00 4,59 0,00 A, S 315 & 316
Disease resistance protein Os06g0279900 -2,53 0,00 4,84 0,00 317 & 318
Nitrate reductase Os02g0770800 -1,26 0,00 4,85 0,00 C 319 & 320
Heat shock protein Os01g0606900 1,66 0,00 4,44 0,00 A, D, S 321 & 322
Phosphoenolpyruvate carboxykinase Os10g0204400 1,28 0,00 3,29 0,00 323 & 324
Xyloglucan endotransglycosylase Os02g0280300 -2,13 0,00 3,95 0,00 325 & 326
Isopenicillin N synthase Os05g0560900 1,98 0,00 3,25 0,00 327 & 328
Zinc finger Os03g0820300 1,61 0,00 3,44 0,00 D, S 329 & 330
Serine/threonine protein kinase Os09g0418000 1,60 0,00 3,07 0,00 A 331 & 332
ATPase Os03g0584400 1,38 0,00 3,62 0,00 333 & 334
Malic enzyme Os05g0186300 1,88 0,00 3,06 0,00 335 & 336
실시예 7: 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4에 연관된 서열의 동정
서열번호 1 및 서열번호 2에 연관된 서열 (전체 길이 cDNA, ESTs 또는 게놈)이 BLAST (Basic Local Alignment Tool) 같은 데이터베이스 서열 탐색 도구를 사용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 Entrez 뉴클레오티드 데이터베이스 (Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; 및 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 보유된 것 중에서 동정되었다. 이 프로그램은 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 서열 데이터베이스에 비교하고, 매치 (match)의 통계적 유의성을 계산하여 서열 간에 국부적인 유사성이 있는 영역을 발견하는 데 사용된다. 예를 들면, 서열번호 1의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드는 낮은 복잡성 서열 세트 오프를 무시하기 위해, 디폴트 셋팅 및 필터를 갖는 TBLASTN 알고리즘에 대해 이용되었다. 분석 결과는 pairwise 비교로 보이게 하였으며, 확률 점수 (E-값)에 따라 순위를 매겼으며, 여기서 점수는 특정 정렬이 우연히 발생할 가능성을 반영한다 (E-값이 낮을수록 hit가 보다 유의하다). E-값 외에, 비교는 동일성 백분율에 의해서도 점수가 매겨진다. 동일성 백분율은 특정 길이에 걸쳐 두 가지 비교되는 핵산 (또는 폴리펩티드) 서열 간에 동일한 뉴클레오티드 (또는 아미노산)의 수를 말한다. 특정 경우에, 탐색의 엄격성 (stringency)을 변경하기 위하여 디폴트 매개변수를 조절할 수도 있다. 예를 들면, E-값은 덜 엄격한 일치부위를 나타내기 위해 증가될 수도 있다. 이와 같은 방식으로, 거의 정확하게 일치하는 짧은 부위가 동정될 수 있다.
NAC1 (서열번호 22 내지 서열번호 35) 및 NAC5 (서열번호 36 내지 서열번호 47) 핵산 및 폴리펩티드
식물 유래 핵산 서열번호 단백질 서열번호
필로스타치 에둘리스(Phyllostachy edulis) 서열번호 22 서열번호 23
솔굼 바이칼라(Sorghum bicolour ) 서열번호 24 서열번호 25
제아 메이즈(Zea mays) 서열번호 26 서열번호 27
트리티쿰 아에스티붐(Triticum aesticum) 서열번호 28 서열번호 29
홀데움 불가레(Hordeum vulgare) 서열번호 30 서열번호 31
엘레우신 코라카나(Eleusine coracana) 서열번호 32 서열번호 33
비티스 비니페라(Vitis vinifera) 서열번호 34 서열번호 35
필로스타치 에둘리스(Phyllostachy edulis) 서열번호 36 서열번호 37
홀데움 불가레(Hordeum vulgare) 서열번호 38 서열번호 39
솔굼 바이칼라(Sorghum bicolour ) 서열번호 40 서열번호 41
제아 메이즈(Zea mays) 서열번호 42 서열번호 43
비티스 비니페라(Vitis vinifera) 서열번호 44 서열번호 45
포푸러스 트리코카르파(Populus trichocarpa) 서열번호 46 서열번호 47
서열은 TIGR (The Institute for Genomic Research; TA로 시작)과 같은 연구 기관에 의해 시험적으로 조립되어 (assembled), 공개된다. 예를 들면, EGO (Eukaryotic Gene Orthologs) 데이터베이스는 키워드 탐색으로 또는 목적 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열로 BLAST 알고리즘을 사용하여 상기와 같은 연관 서열의 동정에 사용될 수 있다. 특별한 핵산 서열 데이터베이스는 통합 게놈 연구소 (Joint Genome Institute)에 의한 것과 같은 특정한 생물체, 예를 들면 특정한 원핵생물에 대해 생성된다. 더욱이, 사유 데이터베이스에 대한 접근은 새로운 핵산 및 폴리펩티드 서열의 동정을 허용한다.
실시예 8: NCG 폴리펩티드 서열의 정렬
폴리펩티드 서열의 정렬은 표준 세팅 (느린 정렬, 유사 매트릭스: Gonnet, 갭 끊김(opening) 벌점 10, 갭 확장 벌점: 0.2)으로 점진적인 정렬의 ClustalW 2.0 알고리즘 (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500)을 사용하여 수행되었다. 정렬을 최적화하기 위해 약간의 편집이 수작업으로 가해졌다. 도 9 및 10을 참고한다.
실시예 9: 폴리펩티드 서열 사이의 전체적인 동일성 백분율의 계산
본 발명의 방법 수행에 유용한 전체 길이의 폴리펩티드 서열 사이의 전체적인 유사성 및 동일성 백분율은 MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) 소프트웨어 (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Ledion Bitincka에 의해 호스팅되는 소프트웨어)를 이용하여 결정되었다. MatGAT는 데이터의 사전 정렬의 필요없이 DNA 또는 단백질 서열에 대한 유사성/동일성 매트릭스를 생성한다. 상기 프로그램은 Myers 및 Miller 전체적인 정렬 알고리즘을 사용하여 일련의 pair-wise 정렬을 수행하고, 유사성 및 동일성을 계산하여, 결과를 거리 매트릭스로 배열한다.
특정한 도메인의 연속을 토대로 MATGAT 표가 생성되었으며, 이는 NUG 폴리펩티드의 다중 정렬을 기반으로 할 수 있다. 보존된 서열은 MaTGAT 분석을 위해 선발되었다. 이러한 접근은 NUG 단백질 사이의 전체적인 서열 보전이 다소 낮은 곳에서 유용하다.
실시예 10: 본 발명의 방법 수행에 유용한 폴리펩티드 서열에 포함된 도메인의 동정
InterPro (The Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites) 데이터베이스는 문자 및 서열에 근거한 탐색을 위한 통상적으로 사용되는 시그너처(signature) 데이터베이스에 대한 통합된 인터페이스이다. InterPro 데이터베이스는 단백질 시그너처를 유도하기 위해 다른 방법론 및 잘 규명된 단백질에 관한 다양한 정도의 생물학적 정보를 사용하는 이들 데이터베이스를 통합한다. 협력 데이터베이스는 SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom 및 Pfam, Smart 및 TIGRFAMs을 포함한다. Pfam은 많은 일반적인 단백질 도메인 및 패밀리를 포함하는 복수 서열 정렬 및 숨겨진 마코브 (hidden Markov) 모델의 큰 집합체이다. Pfam은 영국의 생거 연구소 서버에서 호스팅된다. InterPro는 영국의 유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute)에서 호스팅된다.
실시예 11: NCG 폴리펩티드 서열의 토폴로지 ( Topology ) 예측
TargetP 1.1은 진핵세포 단백질의 세포 내 위치를 예측한다. 위치 지정은 임의의 N-말단 사전 서열 (엽록체 운반 펩티드 (cTP), 미토콘드리아 표적 펩티드 (mTP) 또는 분비 경로 신호 펩티드 (SP))의 예측된 존재에 근거한다. 최종 예측이 근거를 둔 점수는 실제로 가능성은 아니며, 하나에 반드시 추가하지는 않는다. 그러나, 가장 높은 점수를 갖는 위치는 아마 TargetP에 따른 것이며, 점수 간에 상관 관계 (신뢰성 등급)는 아마 그 예측이 얼마나 확실한가의 표시이다. 신뢰성 등급 (RC)은 1에서 5까지이며, 1은 가장 강한 예측을 나타낸다. N-말단 사전 서열을 포함하는 것으로 예측되는 서열에 대해 잠재적인 절단 부위도 예측 가능하다. TargetP는 [Technical University of Denmark]의 서버에서 유지된다.
생물체 집단 (비식물 또는 식물), 컷오프 세트 (없거나, 컷오프의 미리 정의된 세트 또는 컷오프의 사용자 지정 세트) 및 절단 부위 예측의 계산 (유 또는 무)과 같은 많은 매개변수가 서열 분석 전에 선택된다.
하기의 것을 포함하여 많은 다른 알고리즘도 이런 분석 수행에 사용될 수 있다:
● [Technical University of Denmark]의 서버상에 호스팅된 ChloroP 1.1;
● [Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australia]의 서버상에 호스팅된 Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor version 1.2;
● [University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada]의 서버상에 호스팅된 PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5;
● [Technical University of Denmark]의 서버상에 호스팅된 TMHMM
● PSORT (URL: psort.org)
● PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003).
실시예 12: 다른 작물의 형질전환
옥수수 형질전환
옥수수 (Zea mays) 형질전환은 [Ishida 등 (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50]에 기재된 방법을 변형하여 수행하였다. 옥수수에 있어서 형질전환은 유전형에 의존하며, 특정 유전형만이 형질전환 및 재분화를 받아들인다. 근교계통 A188 (University of Minnesota) 또는 양친으로서 A188과의 교배는 형질전환을 위한 공여자의 좋은 원천이나 다른 유전형도 성공적으로 사용될 수 있다. 옥수수 알을 미성숙된 배의 길이가 약 1 내지 1.2 mm일 때인 수분 후 약 11일 (DAP) 된 옥수수 식물체로부터 수확한다. 미성숙한 배는 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 공배양 되었으며, 형질전환 식물체는 기관발생 (organogenesis)을 통해 회수된다. 절단된 배는 캘러스 유도 배지에서, 다음에는 선발제 (예를 들면 이미다졸리논, 그러나 다양한 선발 마커 사용 가능)를 함유하는 옥수수 재분화 배지에서 키운다. 페트리 플레이트는 25℃의 명소 (light)에서 2 내지 3주간, 또는 어린 줄기가 발달하기까지 배양한다. 각 배에서 녹색 어린 줄기를 옥수수 발근 배지로 옮겨 25℃에서 2 내지 3주간 뿌리가 발달하기까지 배양한다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 하나의 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
밀 형질전환
밀의 형질전환은 [Ishida 등 (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50]에 기재된 방법으로 수행하였다. 재배품종 봅화이트 (Bobwhite; Mexico CIMMYT로부터 입수 가능)가 형질전환에 흔히 사용된다. 미성숙한 배는 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 공배양 되었으며, 형질전환 식물체는 기관발생을 통해 회수된다. 아그로박테리움과의 배양 후, 배는 캘러스 유도 배지에서, 다음에는 선발제 (예를 들면 이미다졸리논, 그러나 다양한 선발 마커 사용 가능)를 함유하는 재분화 배지에서 시험관 내에서 키운다. 페트리 플레이트를 25℃의 명소에서 2 내지 3주간, 또는 어린 줄기가 발달하기까지 배양한다. 각 배에서 녹색 어린 줄기를 발근 배지로 옮겨 25℃에서 2 내지 3주간 뿌리가 발달하기까지 배양한다. 발근된 어린 줄기는 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 하나의 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
대두 형질전환
대두는 Texas A&M 특허 US 5,164,310에 기재된 방법을 변형하여 형질전환되었다. 몇 가지 상업적 대두 변종은 이 방법에 의한 형질전환을 수용한다. 재배품종 잭 (Jack; Illinois Seed foundation으로부터 입수 가능)이 흔히 형질전환에 사용된다. 대두 종자는 시험관 내 파종을 위해 멸균된다. 하배축, 유근 및 자엽 하나를 7일 된 어린 실생으로부터 잘라낸다. 상배축 및 나머지 자엽은 엽액 마디가 발달할 때까지 키운다. 이 엽액 마디를 잘라내어 발현 벡터를 함유하는 아그로박테리움 투머파시엔스와 배양한다. 공배양 처리 후, 잘라낸 식물체 조각을 세척하여 선발 배지로 옮긴다. 재분화된 어린 줄기를 잘라내어 어린 줄기 신장 배지에 둔다. 1 cm가 되지 않는 어린 줄기를 뿌리가 발달하기까지 발근 배지에 둔다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 하나의 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
유채/ 캐놀라 형질전환
5 내지 6일 된 어린 실생의 자엽 엽병 및 하배축이 조직 배양을 위한 식물 절편으로 사용되었으며, Babic 등 (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188)에 따라 형질전환되었다. 상업적 재배종 웨스타 (Westar; Agriculture Canada)가 형질전환을 위한 표준 변종으로 사용되나, 다른 변종도 사용될 수 있다. 캐놀라 종자는 시험관 내 파종을 위해 표면 살균된다. 자엽이 붙어 있는 자엽 엽병 식물 절편을 시험관 내 실생으로부터 절단하여, 엽병 절편의 잘린 끝 부분을 세균 현탁액에 담가 아그로박테리움 (발현 벡터 포함)을 접종하였다. 식물 절편은 3 mg/l BAP, 3% 수크로오스, 0.7% Phytagar를 함유하는 MSBAP-3 배지에서 23℃, 16시간의 광 조건으로 2일간 배양하였다. 아그로박테리움과의 공배양 2일 후, 엽병 식물 절편을 3 mg/l BAP, 세포탁심, 카베니실린, 또는 티멘틴 (300 mg/l)을 함유하는 MSBAP-3 배지에 옮겨 7일간 둔 후, 어린 줄기가 재분화될 때까지 세포탁심, 카베니실린, 또는 티멘틴 및 선발제가 든 MSBAP-3 배지에 배양하였다. 어린 줄기의 길이가 5 내지 10 mm일 때 잘라 어린 줄기 신장 배지 (0.5 mg/l BAP 함유 MSBAP-0.5)로 옮긴다. 길이 약 2 cm의 어린 줄기는 뿌리 유도를 위하여 발근 배지 (MS0)로 옮긴다. 발근된 어린 줄기를 온실의 토양으로 이식한다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 하나의 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
알팔파 형질전환
알팔파 (Medicago sativa)의 재분화 클론은 McKersie 등 (1999, Plant Physiol 119: 839-847)의 방법으로 형질전환된다. 알팔파의 재분화 및 형질전환은 유전형 의존적이므로 재분화 식물이 요구된다. 재분화 식물을 얻는 방법이 기술되어있다. 예를 들면, 이들은 재배품종 랭그랜더 (Rangelander; Agriculture Canada) 또는 Brown DCW 및 A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112)에 의해 기재된 임의의 다른 상업적 알팔파 변종으로부터 선택할 수 있다. 대안적으로, RA3 변종 (University of Wisconsin)이 조직 배양에 사용하기 위해 선택되었다 (Walker 등, 1978 Am J Bot 65: 654-659). 엽병 식물 절편은 발현 벡터를 가진 아그로박테리움 투머파시엔스 C58C1 pMP90 (McKersie 등, 1999 Plant Physiol 119: 839-847) 또는 LBA4404와 밤새 공배양된다. 식물 절편은 288 mg/L Pro, 53 mg/L 티오프롤린, 4.35 g/L K2SO4, 및 100 μM 아세토시린곤을 함유하는 SH 유도배지 상에서 암 조건 (dark)으로 3일간 공배양된다. 식물 절편을 절반 강도의 Murashige-Skoog 배지 (Murashige and Skoog, 1962)로 세척하고, 아세토시린곤은 없으나 적절한 선발제 및 아그로박테리움 생장을 저해하는 적절한 항생제를 포함하는 동일한 SH 유도 배지 상에 둔다. 몇 주 후, 체세포 배를 생장조절제 및 항생제는 없고, 50 g/L 수크로오스가 함유된 BOi2Y 발달 배지로 옮긴다. 이어서 체세포 배는 절반 강도의 Murashige-Skoog 배지 상에서 발아시킨다. 발근된 실생은 온실의 토양으로 이식하여 키운다. T1 종자는 선발제에 내성을 보이며 하나의 카피의 T-DNA 삽입물을 가진 식물에서 생산된다.
목화 형질전환
목화는 US 5,159,135에 기재된 방법에 따라 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 형질전환된다. 목화 종자는 3% 차아염소산나트륨 (sodium hypochlorite) 용액에서 20분간 표면 살균하고, 500 ㎍/ml 세포탁심 (cefotaxime)이 함유된 증류수로 세척한다. 상기 종자는 발아를 위해 50 ㎍/ml 베노밀 (benomyl)이 함유된 SH 배지로 옮겼다. 4 내지 6일 된 실생의 상배축을 제거하고, 0.5 cm 조각으로 잘라 0.8% 아가에 두었다. 아그로박테리움 현탁액 (목적 유전자 및 적절한 선발 마커로 형질전환되어 밤새 배양된 것으로부터 약 108 세포/ml로 희석된)이 상배축 절편체의 접종에 사용되었다. 상온 및 명소에서 3일 후, 조직을 비타민 B5가 든 Murashige 및 Skoog 염 (Gamborg 등, Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0.1 mg/l 2,4-D, 0.1 mg/l 키네틴 (6-furfurylaminopurine) 및 750 ㎍/ml MgCl2, 그리고 잔존 세균을 죽이기 위해 50 내지 100 ㎍/ml 세포탁심 및 400-500 ㎍/ml 카르베니실린이 포함된 고체 배지 (1.6 g/l Gelrite) 로 옮겼다. 개별적인 세포 라인은 2 내지 3달 후에 (4 내지 6주마다 계대배양) 분리되어 조직 증식을 위해 선발 배지에 배양되었다 (30℃, 16시간 광주기). 형질전환된 조직은 체세포배를 얻기 위해 2 내지 3달간 비선발배지에서 연이어 배양되었다. 적어도 4 mm 길이의 건강해 보이는 배는 미세한 질석에 0.1 mg/l 인돌초산, 키네틴 및 지베렐린산이 첨가된 SH 배지가 들어있는 튜브로 옮겼다. 배는 30℃에서 16시간의 광주기로 배양하였고, 2 내지 3 장의 잎이 달린 단계에서 식물체를 질석 및 양분이 든 화분으로 옮겼다. 식물체가 튼튼해진 이후에 재배를 위해 온실로 옮겼다.
사탕무 형질전환
사탕무 (Beta vulgaris L.)의 종자는 70% 에탄올에서 1분, 이어서 20% 차아염소산염 표백제, 예를 들어 Clorox® regular bleach (Clorox로부터 상업적으로 입수 가능, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA)에서 20분 동안 교반하여 멸균한다. 종자는 멸균수로 헹구고, 공기 건조한 후 발아 배지 (10 g/l 수크로오스 및 0.8% 아가가 보충된 B5 비타민 (Gamborg et al.; Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8.)을 포함하는 MS (Murashige and Skoog) 기초 배지 (Murashige, T., and Skoog, F., 1962. Physiol. Plant, vol. 15, 473- 497)) 상에 둔다. 하배축 조직은 Hussey 및 Hepher (Hussey, G., and Hepher, A., 1978. Annals of Botany, 42, 477-9)에 따른 어린 줄기 배양의 개시에 필수적으로 사용되고, 30 g/l 수크로오스에 더하여 0.25 mg/l 벤질아미노퓨린 및 0.75% 아가가 첨가된 pH 5.8의 MS 기초 배지 상에서 16시간 광주기로 23-25℃에서 유지된다. 선발 마커 유전자, 예를 들면 nptII를 포함하는 바이너리 플라스미드를 가진 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주가 형질전환 실험에 사용된다. 형질전환 하루 전에, 항생제를 포함하는 액체 LB 배양액은 600 nm에서 광학 밀도 (O.D.) 1에 도달할 때까지 교반기 (28℃, 150 rpm)에서 키운다. 밤새 키운 박테리아 배양액은 원심분리하여, 아세토시린곤을 포함하는 pH 5.5의 접종 배지에 다시 현탁한다 (O.D. ~1). 어린 줄기 기초 조직은 얇은 조각으로 자른다 (약 1.0 cm×1.0 cm×2.0 mm). 조직은 액체 박테리아 접종 배지에 30초 동안 침지한다. 잔여 액체는 여과지 블럿팅으로 제거한다. 공배양은 30 g/l 수크로오스를 포함하는 MS 기초 배지 상에서 24-72시간에 이어서 어린 줄기 발생을 유도하기 위한 MS 기초 배지, 30 g/l 수크로오스와 1 mg/l BAP 및 아그로박테리움을 제거하기 위한 세포탁심을 포함하는 비선택 기간 동안 일어났다. 3-10일 후에 식물체 조각을 예를 들면 카나마이신 또는 G418 (유전자형에 따라 50-100 mg/l)를 포함하는 유사한 선발 배지에 옮긴다. 조직은 선택압 (selection pressure)을 유지하기 위해 2-3주마다 신선한 배지로 옮겨준다. 어린 줄기의 매우 빠른 개시 (3-4일 후)는 새롭게 발달된 형질전환 분열조직의 기관발생보다 현존하는 분열조직의 재생을 나타낸다. 작은 어린 줄기는 여러 차례의 계대배양 후에 5 mg/l NAA 및 카나마이신 또는 G418을 포함하는 뿌리 유도 배지로 옮긴다. 추가적인 단계는 키메라 (chimeric; 부분적으로 형질전환된)인 생성된 형질전환 식물체의 잠재성을 감소시키기 위해 수행한다. 재분화된 어린 줄기로부터의 조직 샘플은 DNA 분석에 사용된다. 사탕무에 대한 다른 형질전환 방법, 예를 들면 Linsey & Gallois (Linsey, K., and Gallois, P., 1990. Journal of Experimental Botany; vol. 41, No. 226; 529-36)에 의한 방법 또는 W09623891A로 출원된 국제 출원에 게재된 방법이 당업계에 알려져 있다.
사탕수수 형질전환
줄기 (spindle)는 6개월 된 경작지에서 키운 사탕수수 식물로부터 분리된다 (Arencibia et al., 1998. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon et al., 1998. Planta, vol. 206, 20-27). 재료는 20% 차아염소산염 표백제, 예를 들어 Clorox® regular bleach (Clorox로부터 상업적으로 입수 가능, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA)에서 20분 동안 침지하여 멸균했다. 0.5 cm 정도의 횡단면은 위쪽 (top-up) 방향으로 배지에 치상했다. 식물 재료는 20 g/l 수크로오스, 500 mg/l 카제인 가수분해물, 0.8% 아가 및 5 mg/l 2,4-D가 보충된 B5 비타민을 포함하는 MS 기초 배지 상에서 암 조건으로 23℃에서 4주 동안 배양된다. 배양체는 4주 후에 동일한 신선한 배지로 옮긴다. 선발 마커 유전자, 예를 들면 hpt를 포함하는 바이너리 플라스미드를 가진 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주가 형질전환 실험에 사용된다. 형질전환 하루 전에, 항생제를 포함하는 액체 LB 배양액은 600 nm에서 광학 밀도 (O.D.) 0.6에 도달할 때까지 교반기 (28℃, 150 rpm)에서 키운다. 밤새 키운 박테리아 배양액은 원심분리하여, 아세토시린곤을 포함하는 pH 5.5의 MS 기초 접종 배지에 다시 현탁한다 (O.D. ~0.4). 사탕수수 배발생 캘러스 조각 (2-4 mm)은 조밀한 구조 및 노란 색깔과 같은 형태학적 특성을 바탕으로 선발하고, 플로우 후드 (flow hood)에서 20분 동안 건조한 후 액체 박테리아 접종 배지에 10-20분 동안 침지한다. 잔여 액체는 여과지 블럿팅으로 제거한다. 공배양은 1 mg/l 2,4-D를 함유하는 B5 비타민을 포함하는 MS 기본 배지의 상단에 놓은 여과지 상에서 암 조건으로 3-5일 동안 일어났다. 공배양 후에, 캘러스는 멸균수로 세척하고 남아있는 아그로박테리움 세포를 제거하기 위한 500 mg/l 세포탁심을 포함하는 유사한 배지 상에서 비선택적 배양기간을 갖는다. 3-10일 후에, 식물 절편을 3주 동안 25 mg/l의 하이그로마이신 (유전자형에 따라서)을 포함하며, 1 mg/l 2,4-D를 함유하는 B5 비타민을 포함하는 MS 기본 선발 배지로 옮긴다. 모든 처리는 23℃, 암 조건 하에서 이루어진다. 저항성 캘러스는 어린 줄기 구조의 발생을 유도하기 위해 16시간 광주기로 2,4-D가 결여되고 1 mg/l BA 및 25 mg/l 하이그로마이신을 포함하는 배지 상에서 더 배양한다. 어린 줄기를 분리하고 선택적 발근 배지 (20 g/l 수크로오스, 20 mg/l 하이그로마이신 및 500 mg/l 세포탁심을 포함하는 MS 기본 배지) 상에서 키운다. 재분화된 어린 줄기로부터의 조직 샘플은 DNA 분석을 위해 사용된다. 사탕수수에 대한 다른 형질전환 방법, 예를 들면 WO2010/151634A로 출원된 국제 출원 및 유럽 등록 특허 EP1831378의 방법이 당업계에 알려져 있다.
[참고문헌]
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VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa can be Ser or Asn <400> 14 Ser Xaa Asp Asp Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 15 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Motif 11 <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Met, Val or Ile <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Arg or Lys <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Leu, Ile or Ala <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Thr, Ala or Ser <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa can be Cys or Gly <400> 15 Asp Ser Xaa Pro Xaa Xaa His Xaa Xaa Ser Ser Xaa Ser Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer (OsNAC1) <400> 16 atggggatgg ggatgaggag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer (OsNAC1) <400> 17 tcagaacggg accatgccca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer (OsNAC5) <400> 18 atggagtgcg gtggtgcgct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer (OsNAC5) <400> 19 ttagaacggc ttctgcaggt 20 <210> 20 <211> 2194 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 20 aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60 aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120 catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180 tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240 tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300 aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360 atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420 ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480 ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540 gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600 tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660 tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720 aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780 aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840 acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900 tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960 aaccaagcat cctccttctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020 ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080 cgaccgcctt ctcgatccat atcttccggt cgagttcttg gtcgatctct tccctcctcc 1140 acctcctcct cacagggtat gtgcctccct tcggttgttc ttggatttat tgttctaggt 1200 tgtgtagtac gggcgttgat gttaggaaag gggatctgta tctgtgatga ttcctgttct 1260 tggatttggg atagaggggt tcttgatgtt gcatgttatc ggttcggttt gattagtagt 1320 atggttttca atcgtctgga gagctctatg gaaatgaaat ggtttaggga tcggaatctt 1380 gcgattttgt gagtaccttt tgtttgaggt aaaatcagag caccggtgat tttgcttggt 1440 gtaataaagt acggttgttt ggtcctcgat tctggtagtg atgcttctcg atttgacgaa 1500 gctatccttt gtttattccc tattgaacaa aaataatcca actttgaaga cggtcccgtt 1560 gatgagattg aatgattgat tcttaagcct gtccaaaatt tcgcagctgg cttgtttaga 1620 tacagtagtc cccatcacga aattcatgga aacagttata atcctcagga acaggggatt 1680 ccctgttctt ccgatttgct ttagtcccag aatttttttt cccaaatatc ttaaaaagtc 1740 actttctggt tcagttcaat gaattgattg ctacaaataa tgcttttata gcgttatcct 1800 agctgtagtt cagttaatag gtaatacccc tatagtttag tcaggagaag aacttatccg 1860 atttctgatc tccattttta attatatgaa atgaactgta gcataagcag tattcatttg 1920 gattattttt tttattagct ctcacccctt cattattctg agctgaaagt ctggcatgaa 1980 ctgtcctcaa ttttgttttc aaattcacat cgattatcta tgcattatcc tcttgtatct 2040 acctgtagaa gtttcttttt ggttattcct tgactgcttg attacagaaa gaaatttatg 2100 aagctgtaat cgggatagtt atactgcttg ttcttatgat tcatttcctt tgtgcagttc 2160 ttggtgtagc ttgccacttt caccagcaaa gttc 2194 <210> 21 <211> 1264 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 21 tcgacgctac tcaagtggtg ggaggccacc gcatgttcca acgaagcgcc aaagaaagcc 60 ttgcagactc taatgctatt agtcgcctag gatatttgga atgaaaggaa ccgcagagtt 120 tttcagcacc aagagcttcc ggtggctagt ctgatagcca aaattaagga ggatgccaaa 180 acatgggtct tggcgggcgc gaaacacctt gataggtggc ttacctttta acatgttcgg 240 gccaaaggcc ttgagacggt aaagttttct atttgcgctt gcgcatgtac aattttattc 300 ctctattcaa tgaaattggt ggctcactgg ttcattaaaa aaaaaagaat ctagcctgtt 360 cgggaagaag aggattttgt tcgtgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 420 gaaggaggag gaggattttc aggcttcgca ttgcccaacc tctgcttctg ttggcccaag 480 aagaatccca ggcgcccatg ggctggcagt ttaccacgga cctacctagc ctaccttagc 540 tatctaagcg ggccgaccta gtagccacgt gcctagtgta gattaaagtt gccgggccag 600 caggaagcca cgctgcaatg gcatcttccc ctgtccttcg cgtacgtgaa aacaaaccca 660 ggtaagctta gaatcttctt gcccgttgga ctgggacacc caccaatccc accatgcccc 720 gatattcctc cggtctcggt tcatgtgatg tcctctcttg tgtgatcacg gagcaagcat 780 tcttaaacgg caaaagaaaa tcaccaactt gctcacgcag tcacgctgca ccgcgcgaag 840 cgacgcccga taggccaaga tcgcgagata aaataacaac caatgatcat aaggaaacaa 900 gcccgcgatg tgtcgtgtgc agcaatcttg gtcatttgcg ggatcgagtg cttcacagct 960 aaccaaatat tcggccgatg atttaacaca ttatcagcgt agatgtacgt acgatttgtt 1020 aattaatcta cgagccttgc tagggcaggt gttctgccag ccaatccaga tcgccctcgt 1080 atgcacgctc acatgatggc agggcagggt tcacatgagc tctaacggtc gattaattaa 1140 tcccggggct cgactataaa tacctcccta atcccatgat caaaaccatc tcaagcagcc 1200 taatcatctc cagctgatca agagctctta attagctagc tagtgattag ctgcgcttgt 1260 gatc 1264 <210> 22 <211> 1146 <212> DNA <213> Phyllostachys edulis <400> 22 actcgagatc gtcgcagaat tcacaagaca cagccagagc agaagcggag taagaagagg 60 tcagtaactt tcttgaattc aaggatcaag aagagagatc aagaatgggg atggcggtga 120 ggagggagag ggacgcggag gcggagctga acctgccgcc ggggttccgg ttccacccga 180 cggacgagga gctcgtggag cactacctct gcaggaaggc ggcggggcag cgcttgccgg 240 tgcccatcat cgccgaggtc gacctctaca agttcgaacc ctgggacctg cccgagcggg 300 cgctgttcgg gaccaaggag tggtacttca ccacgcccag ggaccgaaag taccccaacg 360 ggtcgcgccc caaccgcgcc gccgggaacg ggtactggaa ggccaccggc gccgacaagc 420 ccatcgcgcc gcgggggcgc accttgggga tcaagaaggc gctcgtcttc tacgccggca 480 aggccccccg cggggtcaag accgactgga tcatgcacga gtaccgcctc gccgacgaga 540 gccgcgccac cacaggtgcc aagaagggat ccctcaggtt ggatgattgg gtgctgtgcc 600 gattgtgcaa caagaagaac aagtggggga agatgcagct ggggaaggag accaaggaag 660 aggcgtcgga catgatcacc tcgcagtccc actcccactc gtggggcgag acgcgcacgc 720 cggagtcgga gatcgtggac aacgacccgt tcccggcgtt ccaggacccg gcggcgcaga 780 tgacgatgat ggtgcccaag aaggagcagg aggtggacgg gggcgcgcgg aacgccagga 840 acgacctgtt cgtggacctc agctacgacg acatccagag catgtacagc ggcctcgaca 900 tgctaccgcc cggggacgac ttctactcgt cgctcttcgc gtcgccgcgg gtcaaggcga 960 atcagcccgg cgccggcggc atggccccct tctgaagaag acggcgtggg gagaagacgt 1020 ttccaagtcg caacctctgt taatatagaa taggaatggg acattcttcc gttttttact 1080 tttactcgga cggtagatac acgcagctct gccttctctt taatagaacc gaccaaattt 1140 tgttgt 1146 <210> 23 <211> 296 <212> PRT <213> Phyllostachys edulis <400> 23 Met Gly Met Ala Val Arg Arg Glu Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Glu 20 25 30 His Tyr Leu Cys Arg Lys Ala Ala Gly Gln Arg Leu Pro Val Pro Ile 35 40 45 Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Glu Pro Trp Asp Leu Pro Glu 50 55 60 Arg Ala Leu Phe Gly Thr Lys Glu Trp Tyr Phe Thr Thr Pro Arg Asp 65 70 75 80 Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Asn Gly 85 90 95 Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro Ile Ala Pro Arg Gly Arg 100 105 110 Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro 115 120 125 Arg Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp 130 135 140 Glu Ser Arg Ala Thr Thr Gly Ala Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp 145 150 155 160 Asp Trp Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys Lys Asn Lys Trp Gly Lys 165 170 175 Met Gln Leu Gly Lys Glu Thr Lys Glu Glu Ala Ser Asp Met Ile Thr 180 185 190 Ser Gln Ser His Ser His Ser Trp Gly Glu Thr Arg Thr Pro Glu Ser 195 200 205 Glu Ile Val Asp Asn Asp Pro Phe Pro Ala Phe Gln Asp Pro Ala Ala 210 215 220 Gln Met Thr Met Met Val Pro Lys Lys Glu Gln Glu Val Asp Gly Gly 225 230 235 240 Ala Arg Asn Ala Arg Asn Asp Leu Phe Val Asp Leu Ser Tyr Asp Asp 245 250 255 Ile Gln Ser Met Tyr Ser Gly Leu Asp Met Leu Pro Pro Gly Asp Asp 260 265 270 Phe Tyr Ser Ser Leu Phe Ala Ser Pro Arg Val Lys Ala Asn Gln Pro 275 280 285 Gly Ala Gly Gly Met Ala Pro Phe 290 295 <210> 24 <211> 1472 <212> DNA <213> Sorghum bicolor <400> 24 acaccgcgga aaccatccac aggacacaca gagccgagcc acccaccatc gacagcaccc 60 agccgccgga gcgcgagctt ctttacacag caggccggag aaacacaggc agccaaagcc 120 gccaccgctt ttaccgaccg accgatcggt gttgccgccg cctgtcgggt ttaagcaacc 180 aaccagacca agccatggga ttgccggtga tgaggaggga gagggacgcg gaggcggagc 240 tgaacctgcc gccggggttc cggttccacc ccacagacga cgagctggtg gagcactacc 300 tgtgccggaa agcggcgggg cagcgcctcc cggtgcccat catcgcggag gtggacctat 360 acaagttcga cccctgggac ctgccggagc gcgcgctgtt cggggtcagg gagtggtact 420 tcttcacgcc cagggaccgc aagtacccaa acgggtcccg ccccaaccgc gccgccggca 480 acgggtactg gaaggccacc ggcgccgaca agcccgtcgc gccgcggggc cgcacgctcg 540 ggatcaagaa ggcgctcgtc ttctacgccg ggaaggcgcc gcgtggggtc aagacggact 600 ggatcatgca cgagtacagg ctcgcggacg ccggccgcgc agccgcctcc aagaagggat 660 cgctcaggct ggatgactgg gtgctgtgcc gcctgtacaa taagaagaac gagtgggaga 720 agatgcagct ggggaaggag tccgccgccg gcgtcggcac cgccaaggag gaggcgatgg 780 acatgaccac ctcgcactcg cactcccact cgcagtcgca ctcgcactcg tggggcgaga 840 cgcgcacgcc ggagtcggag atcgtggaca acgacccgtt cccggagctg gactcgttcc 900 cggcgttcca ggacccggcg gcggcgatga tgatggtgcc caagaaggag caggtggacg 960 acggcagcgc cgccgccaac gccgccaaga gcagcgacct gttcgtggac cttagctacg 1020 acgacatcca gggcatgtac agcggcctcg acatgctgcc cccgccaggg gaggacttct 1080 tctcctcgct cttcgcgtcg cccagggtca aggggaacca gcccgccgga gccgccgggt 1140 tggggccatt ctgaggctga ggcgagcgag gatggagcca tggatcagga gaagacagcg 1200 ttgcaaggtt gcgaactctg taaatacagc ataggagtcg aacctgaacc cgactctgaa 1260 cctggtcggg gttacagggt tatgggtgtc ggtgttagcg tacatggagc cggccggccc 1320 agtgttggcg aggctcattc tttagtttca ctttcaacgc agaagacggt agatatatgt 1380 gtagctgttc actttcatca cttcctcttc aacagaaccg acgaaatttt gctgctcttg 1440 ttaacaactt acgagtacta ccgtgtgtcc gt 1472 <210> 25 <211> 319 <212> PRT <213> Sorghum bicolor <400> 25 Met Gly Leu Pro Val Met Arg Arg Glu Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu 1 5 10 15 Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Asp Glu Leu Val 20 25 30 Glu His Tyr Leu Cys Arg Lys Ala Ala Gly Gln Arg Leu Pro Val Pro 35 40 45 Ile Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Asp Leu Pro 50 55 60 Glu Arg Ala Leu Phe Gly Val Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Asn 85 90 95 Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro Val Ala Pro Arg Gly 100 105 110 Arg Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala 115 120 125 Pro Arg Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala 130 135 140 Asp Ala Gly Arg Ala Ala Ala Ser Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp 145 150 155 160 Asp Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys Lys Asn Glu Trp Glu Lys 165 170 175 Met Gln Leu Gly Lys Glu Ser Ala Ala Gly Val Gly Thr Ala Lys Glu 180 185 190 Glu Ala Met Asp Met Thr Thr Ser His Ser His Ser His Ser Gln Ser 195 200 205 His Ser His Ser Trp Gly Glu Thr Arg Thr Pro Glu Ser Glu Ile Val 210 215 220 Asp Asn Asp Pro Phe Pro Glu Leu Asp Ser Phe Pro Ala Phe Gln Asp 225 230 235 240 Pro Ala Ala Ala Met Met Met Val Pro Lys Lys Glu Gln Val Asp Asp 245 250 255 Gly Ser Ala Ala Ala Asn Ala Ala Lys Ser Ser Asp Leu Phe Val Asp 260 265 270 Leu Ser Tyr Asp Asp Ile Gln Gly Met Tyr Ser Gly Leu Asp Met Leu 275 280 285 Pro Pro Pro Gly Glu Asp Phe Phe Ser Ser Leu Phe Ala Ser Pro Arg 290 295 300 Val Lys Gly Asn Gln Pro Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Phe 305 310 315 <210> 26 <211> 994 <212> DNA <213> Zea mays <400> 26 ctccagctcc atccaaatcc accgccagca agcaagccgg cgccatgggt ctgccgatga 60 ggagggagag ggacgcggag gcggagctga acctgccgcc ggggttccgg ttccacccca 120 cggacgacga gctggtggag cactacctgt gccgcaaggc ggcggggcag cgcctccccg 180 tgcccatcat cgccgaggtg gacctgtaca ggttcgaccc ctgggacctg ccggagcgcg 240 cgctcttcgg ggcccgcgag tggtacttct tcacgcccag ggaccgcaag taccccaacg 300 gctcccgccc caaccgcgcc gccggcaacg ggtactggaa ggccaccggc gccgacaagc 360 ccgtcgcgcc gcgcggccgc acgctcggga tcaagaaggc tcttgtcttc tacgccggta 420 aggcgccgcg cggggtcaag acggactgga tcatgcacga gtacaggctc gccgacgccg 480 gccgcgccgc cgccgccaag aaggggtcgc ttaggttgga tgactgggtg ctgtgccggc 540 tgtacaacaa gaagaacgag tgggagaaga tgcagctggg gaagaccgcc gtcgccggcg 600 tcggcgccac caaggaggag gcgatggaca tggccacctc gcacacgcac tcccactccc 660 aatcacactc gcactcgtgg ggcgagacgc gcacgccaga gtcggagatc gtggacaacg 720 acccgttccc ggagctggac tcgttcccgg cgttccagga cccggcgatg atgatgacgg 780 tgcccaagga ggagcaggtg gacggctgca gcgccaagag cggcaacctg ttcgtggacc 840 tcagctacga cgacatccag ggcatgtaca gcggcctcga catgctgccg ccgcccgggg 900 aggacttcta ctcctcgctc ttcgcgtctc ccagggtcaa ggggaaccag cccgccggag 960 ccgccgggtt gggacagttc tgagctgagt cgag 994 <210> 27 <211> 312 <212> PRT <213> Zea mays <400> 27 Met Gly Leu Pro Met Arg Arg Glu Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Asp Glu Leu Val Glu 20 25 30 His Tyr Leu Cys Arg Lys Ala Ala Gly Gln Arg Leu Pro Val Pro Ile 35 40 45 Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Asp Leu Pro Glu 50 55 60 Arg Ala Leu Phe Gly Ala Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg Asp 65 70 75 80 Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Asn Gly 85 90 95 Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro Val Ala Pro Arg Gly Arg 100 105 110 Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro 115 120 125 Arg Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp 130 135 140 Ala Gly Arg Ala Ala Ala Ala Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp Asp 145 150 155 160 Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys Lys Asn Glu Trp Glu Lys Met 165 170 175 Gln Leu Gly Lys Thr Ala Val Ala Gly Val Gly Ala Thr Lys Glu Glu 180 185 190 Ala Met Asp Met Ala Thr Ser His Thr His Ser His Ser Gln Ser His 195 200 205 Ser His Ser Trp Gly Glu Thr Arg Thr Pro Glu Ser Glu Ile Val Asp 210 215 220 Asn Asp Pro Phe Pro Glu Leu Asp Ser Phe Pro Ala Phe Gln Asp Pro 225 230 235 240 Ala Met Met Met Thr Val Pro Lys Glu Glu Gln Val Asp Gly Cys Ser 245 250 255 Ala Lys Ser Gly Asn Leu Phe Val Asp Leu Ser Tyr Asp Asp Ile Gln 260 265 270 Gly Met Tyr Ser Gly Leu Asp Met Leu Pro Pro Pro Gly Glu Asp Phe 275 280 285 Tyr Ser Ser Leu Phe Ala Ser Pro Arg Val Lys Gly Asn Gln Pro Ala 290 295 300 Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gln Phe 305 310 <210> 28 <211> 1075 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 28 tcatcgacca actctcttcc aagtttcgat tcaacggaca tggggatgcc ggcggtgagg 60 aggagggaga gggacgcgga ggcggagctc aacctgccgc cgggcttccg cttccacccc 120 accgacgacg agctcgtgga gcactacctg tgccgcaagg cggccggcca gcgcctgccc 180 gtgcccatca tcgccgaggt cgacctctac cgcttcgacc cgtgggcgct ccccgaccgc 240 gccctcttcg gcacccgcga gtggtacttc ttcaccccgc gcgaccgcaa gtaccccaac 300 ggctcccgcc ccaaccgcgc cgccggcaac ggatactgga aggccaccgg cgccgacaag 360 cccgtcgcgc cccgcggtgg gaggaccatg gggatcaaga aggccctggt gttttacgcc 420 ggcaaggcgc ccaagggggt taagaccgac tggatcatgc atgagtaccg cctcgccgac 480 gccggccgcg ccgccgccag caagaagggc tcgctcaggc tggacgactg ggtgctctgc 540 cggctctaca acaagaagaa cgagtgggag aagatgcagc tccagcagca ggggggagag 600 gagatgatgg tggagcccaa ggaggagcac gccgcgtcgg acatggtggt cacctcgcac 660 tcccactcgc agtcccagtc gcactcgcac tcctggggcg aggcgcgcac gcccgagtcg 720 gagatcgtcg acaacgaccc gtcgctgttc cagcaggcgg cggcgttcca ggcccagagc 780 cccgccgccg cggcggcgca ccaggagatg atggccacgc tgatggtgcc caagaaggag 840 gcggcggacg aggccggcag gaacgacctg ttcgtggacc tcagctacga cgacatccag 900 agcatgtaca acggcctcga catgatgccg ccaggggacg atctgctcta ctcgtccctc 960 ttcgcctccc caagggtccg ggggagccag cccggcgccg gcggcatgcc ggccccgttc 1020 taagcagagc caagacacag accgtcagat accgagatcg acagaagtgg aacgg 1075 <210> 29 <211> 327 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 29 Met Gly Met Pro Ala Val Arg Arg Arg Glu Arg Asp Ala Glu Ala Glu 1 5 10 15 Leu Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Asp Glu Leu 20 25 30 Val Glu His Tyr Leu Cys Arg Lys Ala Ala Gly Gln Arg Leu Pro Val 35 40 45 Pro Ile Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Arg Phe Asp Pro Trp Ala Leu 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sativa <400> 78 atggcgttcc agttccacac gctactatca gccgtaacaa tatggctggg cgtagcggct 60 gctacggcga ggctccatgc cgccgtcgcc ggagcacgag cgccgccgcc gccgccgccg 120 cccggcaact gccaaaggaa gtgcggcgac gtagacatcc cctacccgtt cggcgtctgg 180 aacggcagcg agtccgacgg ctgcgccgtt ccaggcttct acctgaactg cgacgtcgac 240 gacaaccacg tctacaggcc gttccacggg aatgtggagg ttctcagcat ctccctgccg 300 accgggcagg cccgggtgac gaactccatc tcctccgctt gctacaacac cagctcccgc 360 gacatggact acaacgactg gcagatcaac ttcaccggca cgccgctgac gatctccgac 420 gccgacaaca agttcaccgt cgtcgggtgc cagacgctgg cgtacatcac cgacgacgac 480 aacatgggca agtacacgag cgggtgcgtc gccatgtgcc agggaggcga cctgacgagc 540 ctcgccacca acgggtcgtg ctccgggata ggctgctgcc agacagccat ccccaggggt 600 ctgaagtact accgcgtcag gttcgacacg ggcttcaaca cctcggagat ctacaacgtc 660 agccgctgca gctacgcggt gctgatggag tcgaaggcct tcagcttccg gacgagctac 720 gtgagctcgc tggaatttaa cagcagcaac ggtggcaggg tgccgttggt ggtggattgg 780 gctatcggaa acgagacttg tgataaagcc cgcagaaagg ttgacaccta tgcatgtgtc 840 agccacaaca gcaagtgctt caactcgtcc aacggaccag gctacatctg caactgctcc 900 gaagggtacc aaggtaaccc ctacctgcag gacgggcagc acggttgcac agatatagac 960 gagtgtgcgg atccgaagta cccttgttcc gtgcctggaa cttgccataa tcttcctggc 1020 gggttcgagt gcttatgccc tcgcagtcgt cccaaaggca acgcattcaa tgggacatgc 1080 gagagagatc aaacccttca tactggagga aaagtagcta ttggaatttc cggttttgct 1140 atcgttggcc tcgttgtttt tcttgtacga gaagtgatcc agcacaaacg aagtatcaaa 1200 agacaagctc tgcagagaca gactgacatg tattttcaac aacacggagg acagatctta 1260 ctagaactga tgaaagtaga gagcagcgct gagttcaccc tctacgacag agagaagatc 1320 gaggtagcca caaacaattt cgccaaggag aacattgttg gcaaaggagg gcaggggacc 1380 gtttacaagg ctgtcctcga cggcaccact gttgcgataa agaggtgcaa cgaggttgat 1440 gagagcagaa gagccgactt cgtgcaggag ctggtcatac tctgtcgtgt caaccaccca 1500 aatatcgtca aactagtcgg ctgctgcctg cagttcgagg cccccatgct aatctatgag 1560 ttcgtgcaga acaagacact gcaagagcta ctggacctcc aaaggagtag gaagttccac 1620 gtcacactgg cgacccgctt aaggattgct gcagaatccg ccaatgcact tgcacatctc 1680 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cacctacggc ctgccggggc acaaggaccc caatgccatc 780 acgctgctgc tccaggacgg cgtctccggc ctgcaggtcc agcgcaacgg ccgctgggtg 840 gccgtcaacc ccgtgcccga cgccctggtc atcaacatcg gagatcaaat ccaggcgctg 900 agcaacgacc ggtataagag cgtgctccac cgggtgatcg tgaacagcga gagcgagagg 960 atctccgtgc cgacgttcta ctgcccgtcc ccggacgcgg tgatcgcgcc ggccggcgcg 1020 ctggtggacg gcgccctgca cccgctggcg taccggccct tcaagtacca ggcctactac 1080 gacgaattct ggaacatggg cctccagtcc gccagctgct tagaccggtt ccggcctaac 1140 gatcaggccg tctgattatg gtccataaac ttttcttgaa aaaggaaaag attgtgatcc 1200 ataaacaggc catgcaaaat atccttacat ccgatgcgac gtgttatacc actaaaaaag 1260 gtgctcctct accctagctt tctcgaaaaa aataaaacaa agtggagcac taccaatcta 1320 gatctatgtg acgctaaaca atagacatgt gagtgaaata tgttttggc 1369 <210> 85 <211> 352 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 85 Met Ala Pro Ala Ile Ala Lys Pro Leu Leu Ser Asp Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Ser Gly Gln Val Pro Ser Ser His Ile Arg Pro Val Gly Asp Arg Pro 20 25 30 Asp Leu Asp Asn Val Asp His Glu Ser Gly Ala Gly Ile 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cgacgtgaac gcgacggcgg 420 cgacggtgag cgacgcgttc gaggtggagg tgacgtcgac gaacccgaac cggcggatcg 480 ggatctacta cgacggcggc gaggtgacgg cgtcgttcaa cggcacggag ctgtgccgcg 540 gcgggttccc ggcgctgtac cagggccacc ggagcacggt gcgccccgtc atcctgctcg 600 ccggcgagac gcggctggac agcgccgtgg cgctgcagct ggcgcggcag cagcaggccg 660 ggttcgtgcc gctcacggtg tgggcgcgcg tgccgatccg catcaagttc ggcaccatca 720 agctgtggaa gatgaccggg aaggcgacct gcaacctcgt cgtcgacaac ctcgtcgccg 780 gcaggcagat ccgcatccgc tccaacagct gcagcttcaa gctcaaggtc tgatcgagct 840 ttgtagaggc gttgatccat ctccatttct gtgaatccat ccgttgagtt gagattagca 900 ggtggtagag gcgcgtattt ttacattttt accaatacta gtttctgtga atccatccgt 960 ttttggaagc tctgctactc agattaggtt taatgtatga gcaccgatgt atatatgaaa 1020 atgcatacgc gatgaatttc tttgaaaatg gcaataaaga tggcgaattt gttcgtctgg 1080 catgccccaa ctgaagcaat ttcagtat 1108 <210> 87 <211> 255 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 87 Met Asp Tyr His Arg Ile His Pro Val Gly Val Gly Ser Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Asp Ser Gln Gln Gln Val Gly 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cgggggcgag cggcgcggcg ccggacctcg 1020 tgttcacgtt ccggggcggc gccgccatga cggtgccggc gacgaactac ctgctcgact 1080 acaagaacgg cacggtgtgc ctcgccatgc tgagctcggc gcggctgaac tcgacgacgg 1140 agctgagctt gctgggaagc ttgcagcagg agaacatcca tttcctcttc gacctcgaca 1200 aggagacgct ctccttcgag cctgcagact gcactaaact ctcctagcta atcaatggct 1260 gctgctactt aattactttc ttcatatgta tgtgtacttc tgaataacgc agccttgcgg 1320 catgagctgc agcatgctca tgttggtgaa aataatactc cattcttatt attattctgt 1380 ggcgatctgg cctacttcga tttc 1404 <210> 125 <211> 394 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 125 Met Gly Arg Pro Val Ala Thr Leu Leu Val Leu Cys Phe Ile Ser Val 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ala Ala Ala Phe Arg Val His Gly Arg Leu Leu Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Thr Glu Gly Gly Ala Val Val Pro Ile His Trp Thr Gln Ala 35 40 45 Met Asn Tyr Val Ala Asn Phe Thr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Pro Ala 50 55 60 Ser Ala Val Ile Asp Leu Ala Gly Glu Leu Val Trp Thr Gln Cys Lys 65 70 75 80 Gln Cys Gly Arg Cys Phe Glu Gln Gly Thr Pro Leu Phe Asp Pro Thr 85 90 95 Ala 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aagcaggaga gtgcaggcta tatgtatgtg 1320 tacttctgaa taacgcagcc atatatgcgg catgagctgc acgctgctca tgttggtgaa 1380 aataataccc ccattcttat t 1401 <210> 127 <211> 394 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 127 Met Gly Arg Pro Val Ala Thr Leu Leu Val Leu Cys Phe Ile Ser Val 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ala Ala Ala Phe Arg Val His Gly Arg Leu Leu Ala Asp 20 25 30 Ala Ala Thr Glu Gly Gly Ala Val Val Pro Ile His Trp Thr Gln Ala 35 40 45 Met Asn Tyr Val Ala Asn Phe Thr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Pro Ala 50 55 60 Ser Ala Val Ile Asp Leu Ala Gly Glu Leu Val Trp Thr Gln Cys Lys 65 70 75 80 Gln Cys Ser Arg Cys Phe Glu Gln Asp Thr Pro Leu Phe Asp Pro Thr 85 90 95 Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Glu Pro Cys Gly Thr Pro Leu Cys Glu 100 105 110 Ser Ile Pro Ser Asp Ser Arg Asn Cys Ser Gly Asn Val Cys Ala Tyr 115 120 125 Gln Ala Ser Thr Asn Ala Gly Asp Thr Gly Gly Lys Val Gly Thr Asp 130 135 140 Thr Phe Ala Val Gly Thr Ala Lys Ala Ser Leu Ala Phe Gly Cys Val 145 150 155 160 Val Ala Ser Asp Ile Asp Thr Met Gly Gly Pro Ser Gly 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ttgagattta aaattaaaat tgaacatcaa 120 ttgattaccg ggagcgaggt aatcataatt gagattcaaa attggtgttt gtgtggacat 180 gtgaactcaa cacagtggcg gcgctgaacg cgattctggg gaggtggggc acgaagccgc 240 cgacgacatg gaacatcacc ggcgaccctt gcagcggcat cgccatcgac gaaacgaccg 300 acatcgataa cagcgaaacc atcaacccgg gcatcaagtg cgactgctcc tacgacaaca 360 cgaccgtctg ccacatcacc aagctgaggg tgtacgcgtt ggatgttgtc ggtccgatac 420 ctgcagaact ggagaatctc acctatctag ctaacttgaa tttacagcaa aattatttga 480 caggatcttt accggcattt attggagaaa tgacggcatt gcagtatctt ttggtgggaa 540 tcaatgcgtt aactggaatt ttaccaaggg agcttggcaa tctcaacaat ctccttgcgt 600 tatgggcatc cgacaatgat ttcactggga gaatacctga ttatattggg agcttatcag 660 atttgacaga gttgaggatt caaggaaaca attttgatgg tcccatccct acaagttttt 720 ctaatctcgt caatttgaca tctttgcgaa taggcgattt agtgagtggg agttcttcat 780 tggcttttat gtcaaacatg acatccttga ttgttctaac actgaggaat tgcaggatat 840 ctgacaacct tgcttcagtg gacttctcaa aatttgtagg actttattac ttggacttga 900 gttttaacaa catcactggc aaagtgcctt cagtcctttt 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gccaacaaca acaacaatgg cgagaagcag ctggtctgtg 180 tgaccggagc aggtggcttc attgggtcgt gggtggtgaa ggagctcctc atccgtggct 240 accacgtcag gggaacagcc agggatcctg ctgacagcaa gaatgctcac ctgcttgagc 300 tggagggagc cgacgagagg ctctccctct gccgcgccga cgtcctcgac gccgccagcc 360 tccgcgccgc cttcagcggg tgccacggcg tcttccatgt cgcctccccg gtgtctaacg 420 accctgacct tgttccggtt gcagtggagg ggacgaggaa cgtgatcaac gcagcggcgg 480 acatgggcgt gcgccgcgtg gtgttcacgt cgtcgtacgg cgccgtgcac atgaacccca 540 accggagccc cgacgccgtc ctcgacgaga cctgctggag cgactacgaa ttctgcaagc 600 aaacagacaa cctgtactgc tgcgccaaga tgatggcgga gatgacggcg acggaggagg 660 cggcgaagag ggggctggag ctggcggtgg tggtgccgtc gatgacgatg ggtcccatgc 720 ttcagcagac gctcaacttc agcaccaacc acgtcgcccg ctacctcatg ggcaccaaga 780 agtcctaccc caacgccgtc gcggcctacg tcgacgtccg cgacgtcgcc cgcgcacacg 840 tcctcgtcta cgagcgcccc gaggcacgcg gccgctacct ctgcatcggc accgtgctcc 900 accgcgccga gctcctccgg atgctcaggg agctcttccc acggtaccct gccactgcaa 960 agtgtgagga tgatgggaag ccgatggcga agccgtataa gttctcgaac cagaggctca 1020 aggatttggg tttggagttc actccactga ggaagagttt gaatgaggcg gtcctatgca 1080 tgcagcagaa gggtcacctg cctctgattt atcccgttcc aaaacgtgct tacctataaa 1140 atcaagataa aaatacgaat tcgtctgttg cgatgggaaa cagagagcaa cagggaaaaa 1200 acaaaggaaa aaaaaggaaa cacaagggct ctgagattgt ttatttgtgc aagtgtagta 1260 ggcatttata ttttgttctt acacatgtaa agcccttctg taatgaacaa taaggtccca 1320 tggagggaac ggcaaatgca aatatggcct tcatttgtat tctgggcttc aggatgtaaa 1380 tttgaatatc attgtattta ttttctatgt tgcagggaat ttccgagt 1428 <210> 163 <211> 338 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 163 Met Ser Ser Asn Phe Glu Ala Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Lys Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Val Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Gly Ser Trp Val Val 20 25 30 Lys Glu Leu Leu Ile Arg Gly Tyr His Val Arg Gly Thr Ala Arg Asp 35 40 45 Pro Ala Asp Ser Lys Asn Ala His Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ala Asp 50 55 60 Glu Arg Leu Ser Leu Cys Arg Ala Asp Val Leu Asp Ala Ala Ser Leu 65 70 75 80 Arg Ala Ala Phe Ser Gly Cys His Gly Val Phe His 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atagcaattt cgcgatgccc tgagctgatc 900 tcgtccttgg tgcataacaa cagaaaggat gagcaggtga acggaagatg gctcctcccg 960 ccatcaattg tagaacttga gattcaagat gataattatc tacaaatgtt gcagccctgc 1020 tttccaggga gcctcaccca cctgaaaaga ctacaagtac agggaaaccc aaatttaaca 1080 tctctgcagc tgcattcctg cacagagctc caagagttga taattcaaag ctgtaggtca 1140 cttaattctc tacaaggctt gcaatcactc tgcaacctca ggttgctgcg ggcatacaga 1200 tgcctcggcg atcttggagg agatgaaagg tgtctccttc cgcaatcaat tgaggaactt 1260 gatatcgacg agtattttca agaaactctg cagccattct ttccaaggaa tctcacctgc 1320 ctaaaaaaat tacgagtatc aggcactaca agttttaaat ctctagaact gatgtcatgc 1380 actgcactcg aacatttgaa gattgaaggt tgtgcatcgc ttgctacatt agtgggcttg 1440 caatccctcc acagcctcag gcatttggaa gtatttagat gccctagctt gcctctatgt 1500 ttggagagtt tgtcagggca gggctatgag ctatgccctc gattggaaag gctccagatc 1560 gatgacctct ctatccttac tacgtcgctc tgccagcacc tcatctcagt ccaattccta 1620 gagctttacg gagatccata cctttacatt cgtggagtcg aagtggcaag actaacggat 1680 gagcaagaga gagcgcttca gctcctcacg tccttgcaag agctccaatt caagtctcat 1740 gacagtcttg tagatcttcc tacagggctg cataaccttc cttccctcaa gaggttgaag 1800 atcgataatt gcaagagcat catgaggctg ccagagaagg gtctcccacc ttcgttggaa 1860 gaattgcata tcagcaattg cagcaaagag ctagctgacc attgcagaat gctagaaagc 1920 aagctgatgg tatcaactga ttga 1944 <210> 182 <211> 647 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 182 Met Gly Asp Leu Asn Ser Ser Leu Arg Val Leu Lys Ile Glu Gln Cys 1 5 10 15 Pro Val Leu Lys Val Phe Pro Leu Phe Gln Asn Ser Gln Gln Phe Lys 20 25 30 Ile Glu Arg Met Ser Trp Leu Ser Ser Leu Thr Lys Leu Thr Ile Asn 35 40 45 Asp Cys Pro His Leu His Val His Asn Pro Leu Pro Pro Ser Thr Ile 50 55 60 Val Ser Glu Leu Phe Ile Ala Gly Val Ser Thr Leu Pro Arg Val Glu 65 70 75 80 Gly Ser Ser His Gly Thr Leu Arg Ile Gly Arg His Pro Asn Asp Ile 85 90 95 Phe Ser Phe Asp Ser Asp Asp Ile Leu Glu Leu Met Ile Leu Asp Asp 100 105 110 Lys Ser Leu Ser Phe His Ser Leu Arg Ser Leu Thr Arg Leu Val Ile 115 120 125 Asp Gly Cys Lys Asn Leu Met Ser Val Leu Phe Glu Ser Leu Arg Gln 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Oryza sativa <400> 214 Met Val Leu Ala Arg Cys Thr Val Tyr Val Gly Ala Asp Gly Ala Ala 1 5 10 15 Arg Glu Leu Gly Val Glu Gln Arg Arg Lys Leu Glu Gln Val Ile Asn 20 25 30 Asp Met Ala Ala Ala Ser Leu Arg Cys Ile Ala Phe Ala Tyr Lys Gln 35 40 45 Val Val Asp Gly Gly Asp Ser Asp Asn Ala Lys Ile Asp Asp Glu Gly 50 55 60 Leu Thr Leu Leu Gly Phe Val Gly Leu Lys Asp Pro Cys Arg Pro Glu 65 70 75 80 Val Lys Ser Ala Ile Glu Ala Cys Thr Lys Ala Gly Ile Ala Val Lys 85 90 95 Met Val Thr Gly Asp Asn Val Leu Lys Ala Arg Ala Ile Ala Lys Glu 100 105 110 Cys Gly Ile Ile Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ala Ala Gly Val Val Ile 115 120 125 Glu Gly His Glu Phe Arg Ala Met Ser Glu Gln Glu Gln Leu Ala Ile 130 135 140 Val Asp Asn Ile Arg Val Met Ala Arg Ser Leu Pro Leu Asp Lys Leu 145 150 155 160 Val Leu Val Gln Arg Leu Lys Gln Lys Gly His Val Val Ala Val Thr 165 170 175 Gly Asp Gly Thr Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Glu Ala Asp Val Gly 180 185 190 Leu Ser Met Gly Val Gln Gly Thr Glu Val Ala Lys Glu Ser Ser Asp 195 200 205 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accgcagcga cgagtacggt ggcagcctcg agaaccggtg ccgcttcgtt gtcgaggtga 720 tcgacgccat cgtcgccgag gttggagcgc accgtgtggg gatcaggctg tcaccgttca 780 tcgactatat ggactgcgtc gactccgacc cggtggctct cggctcgtac atggtgcagc 840 agctcaacaa gcacccgggg tttctctact gccacatggt ggagccaaga atggccatcg 900 tggaaggacg caggaagatc acccatggcc tcctgccatt ccggaagctg ttcaatggca 960 ctttcatcgc tgccggagga tacgatcggg aggaaggaaa caaggtgata gccgatggat 1020 atgctgacct cgtcgcctac gggaggcact tcttggccaa tccggacttg cccaagaggt 1080 tcgcgatcaa cgcaccattg aacaagtata ataggtccac cttttacata caggatcctg 1140 ttgttggcta cacggactat cctttccttg atgagaaaga cgagggcgct gctacttatg 1200 cttaatcctc aattaaattg tcaaattgaa atgttcggtt tagtaatgtg cactatattt 1260 gtgatacact cataagtgac cctcacttcc atccg 1295 <210> 216 <211> 374 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 216 Met Ala Arg Glu Ala Glu Lys Asp Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ile Pro 1 5 10 15 Leu Leu Thr Pro Tyr Lys Met Gly Arg Phe Glu Leu Ser His Arg Val 20 25 30 Val Leu Ala Pro Leu Thr Arg Asn Arg Ser Tyr 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atccgccatg 120 gaggtggagt tgccatgggg cgcgcggtgc gcggcggcgg cgttcttcgt gtcctcgctg 180 tgcgtggcgg cgctcggcgt cgtgctcctg ctcctcaggc ggtggccgtg gtgcggctgc 240 catgtctgcc gcgcctacct ggccgggtcg tggaggaggg agttcgccaa cctcggcgac 300 tggtacgccg acctgctccg ccgctcgccg acgggcaccg tccacgtcca cgtcctcggc 360 tgcaccgtca cggcgaaccc ggcgaacgtg gagtacatgc tcaagacgcg cttcgacaac 420 ttccccaagg ggaggccgtt cgccgcgctc ctcggcgacc tcctcggcga cggcatcttc 480 aacgtcgacg gcgacgcgtg gcgccaccag cggaagatgg ccagcctcga gctggggagc 540 gtcgccgtga gatcctacgc gtacaagatc gtcgcccagg aggtggaggc ccgcctcatg 600 ccggtgctcg ccaacgccgc cgacagcggc gccgtggtcg acctgcagga cgtgttccgc 660 cgcttcgcct tcgacaccat ctgcaagatc tccttcggcc tcgacccggg ctgcctcgac 720 cgggagatgc ccgtgtcgga gctcgccgac gcgttcgacg ccgcgtcgcg gctgtccgcc 780 atgcgtggcg cggcggcgtc gccgttgctg tggaagatga agcggtttct caacgtcggg 840 tcggagaggg agctcaagaa ggccatcaag ctcatcgacg ggctcgcggc ggcgatgatc 900 cgggagcgcc ggaagcttgg cgtcgcgaac agccacgacc tcctgtcccg gttcatggcc 960 tcctccggcg acgacgcgcg cggcgccgcc gacgacaagt tcctccgcga catcgtcgtc 1020 agcttcctcc tcgccggccg ggacacggtg tcctccgcgc tcaccactct gttcatgatc 1080 ctgtccaaga accccgacgt ggcggccgcc atgcgcgcgg aggccggcgc cgccgccggc 1140 gagagcgccg ccgtcagcta cgagcacctg aagcggctga actacaccca cgccgtgctg 1200 tacgagaaca tgcggctgtt cccgccggtg cagttcgact ccaagttctg cgccgccgcc 1260 gacgtgctcc ccgacggcac ctacgtcgac ggcggcgcgc gcgtcatgta ccacccctac 1320 gccatgggcc gcatgccgcg catctggggc gccgactgcg acgcgttccg gccggagcgg 1380 tggctcaccg gcgccggcgg cgcgttcgtg ccggagagcc tcttcaagta cccggtgttc 1440 caggccggcc tccgcgtgtg cctcggcaag gagctcgcca tcaccgagat gaaggcggtc 1500 agcgtcgccg tcgtgagggc attcgacgtc gaggtcgtcg gcgagaatgg ccggtgcggc 1560 ggcggcgccg ccgccgcgcc aagattcgtg ccggggctca ccgcgtccat cagcggtggg 1620 ctcccagtga agatcagacg cgtttagact tgcacacagc atagtagaca gacttctttt 1680 tcattcactg tatcaacaaa ttggataaga aattaaatag gcatgtacat agaacaaaaa 1740 agggagaaat caatatacca aatttttcat ct 1772 <210> 222 <211> 509 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 222 Met Glu Val Glu Leu Pro Trp Gly Ala Arg Cys Ala Ala Ala Ala Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Ser Leu Cys Val Ala Ala Leu Gly Val Val Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Arg Arg Trp Pro Trp Cys Gly Cys His Val Cys Arg Ala Tyr Leu 35 40 45 Ala Gly Ser Trp Arg Arg Glu Phe Ala Asn Leu Gly Asp Trp Tyr Ala 50 55 60 Asp Leu Leu Arg Arg Ser Pro Thr Gly Thr Val His Val His Val Leu 65 70 75 80 Gly Cys Thr Val Thr Ala Asn Pro Ala Asn Val Glu Tyr Met Leu Lys 85 90 95 Thr Arg Phe Asp Asn Phe Pro Lys Gly Arg Pro Phe Ala Ala Leu Leu 100 105 110 Gly Asp Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Val Asp Gly Asp Ala Trp 115 120 125 Arg His Gln Arg Lys Met Ala Ser Leu Glu Leu Gly Ser Val Ala Val 130 135 140 Arg Ser Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Ala Gln Glu Val Glu Ala Arg Leu 145 150 155 160 Met Pro Val Leu Ala Asn Ala Ala Asp Ser Gly Ala Val Val Asp Leu 165 170 175 Gln Asp Val Phe Arg Arg Phe Ala Phe Asp Thr Ile Cys Lys Ile Ser 180 185 190 Phe Gly Leu Asp Pro Gly Cys Leu Asp Arg Glu Met Pro Val Ser Glu 195 200 205 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tggatcggct gctgctatct gcatccaaag caaagatcag ctccccattc 360 tcccgcgaaa cacttcgcgc cattttggtg cagatgacgg ctgcgtccaa gtgcaggaat 420 ggctcgatca agtactggct cagcgccggc cccggcgact tcctcctctc gccaaagggc 480 tgcactgcgc cggcgttcta cgccgtcgtc atcgcgtccg ccaccgccgc cgccgccggc 540 gggcacccgc ggctcaggga gggcgtgagg gcgatcacgt cgacggtgcc gatgaaggac 600 ccgttcttcg cggcgatgaa gagcgtcaac tacctggcga acgcgctggc catggcggag 660 gcagaggagc gcggcgcgta cgcgtcggtg tgggtggacg gcgacggggg cgtggcggag 720 ggcccgatga tgaacgtggc gttcgtcacg ggcggcggcg acctggtggt gccggcgttc 780 gacagggtcc tcagcgggtg cacggcgagg cggctgctcg cgctggcgcc caggctggtg 840 gacgccggcg tgctcaggag cgtcggcgcg gcgaggatct ccgccgccga cgcgaggagg 900 tgcgccgaga tgatgttcgt cggcagcggc ctcccgttgc tgcccatcgt cgaatgggac 960 ggccagccgg ttggcgatgg tcaagtgggg aaaattgccc ttgccctatc tgacatgctt 1020 tgcgaagaca tcaaggccgg tctcgacaga gtacttgttc cttatgatca agcgagctag 1080 acgacgacta atagagcttt ggaagatcaa ctttgtataa taataataat aatgtaatac 1140 ttccatttat gtgaacgaaa tttttccgta ttatgagtgg aggatccgtc acattgacag 1200 aattg 1205 <210> 228 <211> 340 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 228 Met Gln Gly Glu His His Asp His Val Pro Val Tyr Glu Ser Gly Thr 1 5 10 15 Glu Val Phe Gln Lys Leu Gln Glu Lys Trp Asn Ser Thr Lys His Lys 20 25 30 Arg Tyr Arg Ala Met Tyr Ser Ser Val Val Gly Gly Ile Ile Leu Asp 35 40 45 Pro Ser Met Met Val Ile Pro Ile Asp Asp His Met Val His Arg Gly 50 55 60 His Gly Val Phe Asp Thr Ala Met Leu Ser Asp Gly Tyr Leu Tyr Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ser His Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ser Lys Ala Lys 85 90 95 Ile Ser Ser Pro Phe Ser Arg Glu Thr Leu Arg Ala Ile Leu Val Gln 100 105 110 Met Thr Ala Ala Ser Lys Cys Arg Asn Gly Ser Ile Lys Tyr Trp Leu 115 120 125 Ser Ala Gly Pro Gly Asp Phe Leu Leu Ser Pro Lys Gly Cys Thr Ala 130 135 140 Pro Ala Phe Tyr Ala Val Val Ile Ala Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly His Pro Arg Leu Arg Glu Gly Val Arg Ala Ile Thr Ser Thr 165 170 175 Val Pro Met Lys Asp Pro Phe Phe Ala Ala Met Lys Ser Val 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gcggcggaga 300 tccgcgaccc ggcgaagggc gcgcgcgtct ggctcggcac cttcgccacc gccgaggcgg 360 cggcccgcgc ctacgactgc gccgcccgcc gcatccgcgg ggccaaggcc aaggtcaact 420 tccccaacga ggacccgcca ctcgacgacc cggccgccga cggccacagc cacggcggcg 480 ccgccatccc gtgcagggag ttcatggact acgacgccgt catggcgggc ttcttccacc 540 agccctacgt cgtcgccgac ggcgtgccgg ccgtgccggc ggaggaggcg cccacggtgg 600 cgtacgtgca ccaccacctg ccgccgcagc cgcagcagga cgcggggctg gagctctgga 660 gctttgataa catccacacg gccgtgccga tgtgagatcg atctgatgat cattcagatc 720 gatgctagct catgtgtttt ttaattatat cttcacagca gaaacaaaaa aaagttcaat 780 tcagtttatt ttgttgttat acgttttaaa atgtttcatt aggttttcat gttataggag 840 tgatttatcg gattgaactc tcaagtgacc gacttctgag ttctt 885 <210> 236 <211> 216 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 236 Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Phe Ile Pro Gln Arg Glu Ala 1 5 10 15 His Arg Ala Ala Thr Gly Ser Lys Arg Ala Leu Cys Ala Ser Asp Phe 20 25 30 Trp Pro Ser Ala Ser Gln Glu Ala Ala Asp Phe Asp His Leu Thr Ala 35 40 45 Pro Cys Thr Phe Thr 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gccaacaaca acaacaatgg cgagaagcag ctggtctgtg 180 tgaccggagc aggtggcttc attgggtcgt gggtggtgaa ggagctcctc atccgtggct 240 accacgtcag gggaacagcc agggatcctg ctgacagcaa gaatgctcac ctgcttgagc 300 tggagggagc cgacgagagg ctctccctct gccgcgccga cgtcctcgac gccgccagcc 360 tccgcgccgc cttcagcggg tgccacggcg tcttccatgt cgcctccccg gtgtctaacg 420 accctgacct tgttccggtt gcagtggagg ggacgaggaa cgtgatcaac gcagcggcgg 480 acatgggcgt gcgccgcgtg gtgttcacgt cgtcgtacgg cgccgtgcac atgaacccca 540 accggagccc cgacgccgtc ctcgacgaga cctgctggag cgactacgaa ttctgcaagc 600 aaacagacaa cctgtactgc tgcgccaaga tgatggcgga gatgacggcg acggaggagg 660 cggcgaagag ggggctggag ctggcggtgg tggtgccgtc gatgacgatg ggtcccatgc 720 ttcagcagac gctcaacttc agcaccaacc acgtcgcccg ctacctcatg ggcaccaaga 780 agtcctaccc caacgccgtc gcggcctacg tcgacgtccg cgacgtcgcc cgcgcacacg 840 tcctcgtcta cgagcgcccc gaggcacgcg gccgctacct ctgcatcggc accgtgctcc 900 accgcgccga gctcctccgg atgctcaggg agctcttccc acggtaccct gccactgcaa 960 agtgtgagga tgatgggaag ccgatggcga agccgtataa gttctcgaac cagaggctca 1020 aggatttggg tttggagttc actccactga ggaagagttt gaatgaggcg gtcctatgca 1080 tgcagcagaa gggtcacctg cctctgattt atcccgttcc aaaacgtgct tacctataaa 1140 atcaagataa aaatacgaat tcgtctgttg cgatgggaaa cagagagcaa cagggaaaaa 1200 acaaaggaaa aaaaaggaaa cacaagggct ctgagattgt ttatttgtgc aagtgtagta 1260 ggcatttata ttttgttctt acacatgtaa agcccttctg taatgaacaa taaggtccca 1320 tggagggaac ggcaaatgca aatatggcct tcatttgtat tctgggcttc aggatgtaaa 1380 tttgaatatc attgtattta ttttctatgt tgcagggaat ttccgagt 1428 <210> 238 <211> 338 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 238 Met Ser Ser Asn Phe Glu Ala Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Lys Gln 1 5 10 15 Leu Val Cys Val Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Gly Ser Trp Val Val 20 25 30 Lys Glu Leu Leu Ile Arg Gly Tyr His Val Arg Gly Thr Ala Arg Asp 35 40 45 Pro Ala Asp Ser Lys Asn Ala His Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ala Asp 50 55 60 Glu Arg Leu Ser Leu Cys Arg Ala Asp Val Leu Asp Ala Ala Ser Leu 65 70 75 80 Arg Ala Ala Phe Ser Gly Cys His Gly Val Phe His Val Ala Ser Pro 85 90 95 Val Ser Asn Asp Pro Asp Leu Val Pro Val Ala Val Glu Gly Thr Arg 100 105 110 Asn Val Ile Asn Ala Ala Ala Asp Met Gly Val Arg Arg Val Val Phe 115 120 125 Thr Ser Ser Tyr Gly Ala Val His Met Asn Pro Asn Arg Ser Pro Asp 130 135 140 Ala Val Leu Asp Glu Thr Cys Trp Ser Asp Tyr Glu Phe Cys Lys Gln 145 150 155 160 Thr Asp Asn Leu Tyr Cys Cys Ala Lys Met Met Ala Glu Met Thr Ala 165 170 175 Thr Glu Glu Ala Ala Lys Arg Gly Leu Glu Leu Ala Val Val Val Pro 180 185 190 Ser Met Thr Met Gly Pro Met Leu Gln Gln Thr Leu Asn Phe Ser Thr 195 200 205 Asn His Val Ala Arg Tyr Leu Met Gly Thr Lys Lys Ser Tyr Pro Asn 210 215 220 Ala Val Ala Ala Tyr Val Asp Val Arg Asp Val Ala Arg Ala His Val 225 230 235 240 Leu Val Tyr Glu Arg Pro Glu Ala Arg Gly Arg Tyr Leu Cys Ile Gly 245 250 255 Thr Val Leu His Arg Ala Glu Leu Leu Arg Met Leu Arg Glu Leu Phe 260 265 270 Pro Arg Tyr Pro Ala Thr Ala Lys Cys Glu Asp Asp Gly Lys Pro Met 275 280 285 Ala Lys Pro Tyr Lys Phe Ser Asn Gln Arg Leu Lys Asp Leu 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ccgggaagca 660 cgtcggcgtg gtggggctcg gcgggctcgg ccacgtcgcc gtcaagttcg ccagggcgtt 720 cgggatgagg gtgacggtga tcagcacgtc gccggtgaag aggcaggagg ccctggagag 780 gctcggcgcc gacggcttca tcgtcagcac caacgccagt gagatgaagg ctgcgatggg 840 caccatgcat ggcatcatca acacggcctc tgcaagcaca tccatgcact cttacctggc 900 actcttgaag cccaagggca agatgatctt ggttggcctg cctgagaagc ctctccagat 960 cccaaccttc gctttggttg gagggggcaa gatactagct gggagctgca tggggagcat 1020 cagtgaaacg caggagatga tcgacttcgc cgccgagcac ggggtggccg ccgacatcga 1080 gctgatcggc gccgacgagg tgaacacggc catggagcgc ctcgccaagg gcgacgtcag 1140 gtaccgcttc gtcgtcgaca tcggcaacac cctcaggtcg gattgactag ggagctcact 1200 gtcactggtc tcagctctgt agcataccgg acctgcaatc ctgcaaagta gtgcaatctt 1260 cttgctacaa gacatacata tcacctctac ttggtgtcaa taaatgtagc aaaagaggta 1320 cattgttgt 1329 <210> 240 <211> 379 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 240 Met Ala Pro Thr Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Glu Gln Ala Pro Pro 1 5 10 15 Pro Gln His Thr Arg Lys Ala Val Gly Leu Ala Ala His Asp Asp 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accaagagca actcggcgga 1860 caaggaagaa gaggagaaaa cagaatgaag cgcaactcag aaatcagaac caggaattga 1920 tgatgcatgt ataaatggtc aggatatagc cacagggaat aacattcacg aacaaggaag 1980 atgatgtaca cgacatataa gttagatcga ttaccatcac atataaaacc aatcacgcat 2040 catgtaatga aatgtctaaa agccatacgg cagattatca taccgcgac 2089 <210> 266 <211> 510 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 266 Met Asp Lys Val Gly Lys Asn Gly Gly Arg Gly Gln Gln Arg Ala Leu 1 5 10 15 Pro Arg Ser Gly Lys Ser Leu Gly Val Leu Asn His Thr Gly Ala Leu 20 25 30 Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Gly Ala Ala Arg Arg Gly Asp Phe Ser 35 40 45 Met Phe Arg Thr Lys Ser Thr Leu Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Pro 50 55 60 Ser Arg Ile Arg Glu Pro Asp Leu Glu Leu Pro Pro His Val Glu Gly 65 70 75 80 Pro Ser Val Gly Arg Gln Gly Gly Glu Asp Pro Leu Asn Lys Ser Val 85 90 95 Pro Ala Gly Arg Tyr Phe Ala Ala Leu Arg Gly Pro Glu Leu Asp Glu 100 105 110 Val Arg Asp Tyr Glu Asp Ile Leu Leu Pro Lys Asp Glu Val Trp Pro 115 120 125 Phe Leu Leu Arg Phe Pro Val Gly Cys Phe Gly Val 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<400> 274 Met Glu Asp Leu Ala Lys Phe Leu Phe Gly Val Ser Gly Asn Val Ile 1 5 10 15 Ala Leu Phe Leu Phe Leu Ser Pro Val Pro Thr Phe Trp Arg Ile Ile 20 25 30 Arg Arg Lys Ser Thr Glu Asp Phe Ser Gly Val Pro Tyr Asn Met Thr 35 40 45 Leu Ile Asn Cys Leu Leu Ser Ala Trp Tyr Gly Leu Pro Phe Val Ser 50 55 60 Pro Asn Asn Ile Leu Val Ser Thr Ile Asn Gly Ala Gly Ala Val Ile 65 70 75 80 Glu Thr Ala Tyr Val Val Val Phe Leu Val Phe Ala Ser Thr His Lys 85 90 95 Thr Arg Leu Arg Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Val Ala Ser Val Phe 100 105 110 Ala Ala Val Ala Leu Val Ser Leu Leu Ala Leu His Gly Gln His Arg 115 120 125 Lys Leu Leu Cys Gly Val Ala Ala Thr Val Cys Ser Ile Cys Met Tyr 130 135 140 Ala Ser Pro Leu Ser Ile Met Arg Leu Val Ile Lys Thr Lys Ser Val 145 150 155 160 Glu Tyr Met Pro Phe Leu Met Ser Leu Ala Val Phe Leu Cys Gly Thr 165 170 175 Ser Trp Phe Ile Tyr Gly Leu Leu Gly Arg Asp Pro Phe Val Thr Ile 180 185 190 Pro Asn Gly Cys Gly Ser Phe Leu Gly Ala Val Gln Leu Val Leu Tyr 195 200 205 Ala Ile Tyr 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600 ccctcatatc gtcgccgagg ctcccaccac ccatagcaac atccagttcg tcggtggtga 660 ctttttcgag tttattccag cagctgatgt tgtgctactt aagtatattt tgcatgcttg 720 gcaagatgat gattgtgtca agattctgcg gcggtgcaaa gaggcaatcc tggcaaggga 780 tgctggggga aaggtgataa ttattgaggt ggttgttggg attggaccca aggaaattgt 840 tcccaaggag atgcaaattt tgtttgatgt tttcatgatg tacgttgatg gcatcgagcg 900 agaggagcat gaatggaaga agattttctt agaggctgga ttcagtgact acaaaatcac 960 accagtgcta ggtgcccgat cgatcatcga ggtttaccct tgatgcttct gaaggtgtag 1020 atgtgcatct ctgcgtggaa cctattctag ttcagtagcc ttgaggcatg cgcgtgttca 1080 cgtcgaggcc atcatttttt gtttttctgt tgtcatatgt gctatagtat attgtgcgtt 1140 gtgggatggc acaactcatg catgtcgtgg cttaagtctc gggcatattg gtagcctcga 1200 tttccatttc tatattcatc acaataagag gaagagaaaa ccaaaagcta caaggcagtt 1260 tgtagcgcc 1269 <210> 276 <211> 216 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 276 Met Thr Pro Phe Glu Val Ala His Gly Cys Thr Arg Trp Glu Ile Ile 1 5 10 15 Ala Asn Asp Ala Lys Asp Gly Ser Val Phe Asn Thr Ala Met Val Glu 20 25 30 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tcacctatgg ctgaactacc tcaccgtgca gatgatggtc aacgcaacta 960 caagttatca gtttcacctg ctgctgaact acctcaccgt gtagatgatg gtcaacgcaa 1020 ttacaagtta tcagttttac ctgccactga actagttcac tatacagatg gtcaacgcaa 1080 ttacaagtca tcagttttgg agacgccaga acttctcaaa gaccccgaca tggcgctctt 1140 cttccttgag aagaatcttc aacaaggtaa aaaaattaat aacgccctcc acttcgccaa 1200 cttgttggcc actacgaact ccaagttcct gccacgaggc aaggcggact ccatcccgtt 1260 ctcctctaaa gaactacccg agatcctgga ccggttcggg gtgcggccgg gctccgacga 1320 cgcggctgag atgagtgcta cgctgcagga ctgcgagctg ccggcgaata agggagagaa 1380 gaaggcctgc gccacgtcgc tggagtctat agtcgacttc gtcacatcca gctttggggc 1440 cagtgacgtc gacgccgcct ccaccgttgt gctcagtaag gcggtggagt cttcttcgct 1500 ggcgcaggac tacacggtga gcggcgtgag gcgaatggcc ggaaccggcc agctcatcgc 1560 ttgccatccg gagtcgtacc cgtacgctgt gttcatgtgc cacctcacag aggcgacgac 1620 gagggcgtac aaggcctcat tggtcggcaa agatggtact gcggtggagg cggtcgccgt 1680 gtgccacacc gacacgtcgg actggaaccc agagcacgct gccttccatg tgctcggcgt 1740 caagcctggg 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ctagaggatg gcgatgatgg agaggattga ggtcaccaag cttcatcatc 660 atcttcttct tcttgttctt cttctcgtcg tcgccgccgc cggcggcggc agcgtacagg 720 cggcggagga ggatgagatg agcggccgga ggaggagaag caggcggcgg cgtgcggcgg 780 acgtgatggt gcccatcacc atcctcaact ccgccgtcga caagggagcc gtgtgcatgg 840 acgggacgcc gccggcgtac cacctggacc cgggctccgg cggcggcaac cggagctggg 900 tggtcaacct ggagggcggc gggtggtgca acaacgcccg cacgcgccgc ttccgcaccg 960 ccagccgcca cggctcctcc gaccacatgg agcgccgcat cgccttcacc ggcatcatga 1020 gctccgccgc cgccgacaac cccgatttcc acagctggaa ccgcgtcaag atccgctact 1080 gcgacagcgg gtccttcgcc ggcgacgcct tcaacgaggg attgaagctg caattccggg 1140 ggcagcgcat ctggggggcg gtgatccagc acctgctcga cgtcggcatg gcctccgccg 1200 agcatgtgct gctcaccggc tgctccgccg gcggcctcgc cgcgatcctc cactgcgacc 1260 agctccgcgc cctcctcccc gccgccgcca ccgtcaagtg cctctccgac ggcggcctct 1320 tcctcgacgc cgtggacgtc gccggcggca ggagcctgag gtcatactac ggcgacgtcg 1380 tcggcctgca ggcggtggcg cccaaccttc ccgagacctg caccgaccat ctcgacgcca 1440 cctcgtgctt cttccctcag aacataatcg acggcataaa gacacccatc ttcctgctga 1500 atgcggcgta cgacgtctgg cagatcgagc agagcctggc ccctaacgca gctgacacca 1560 gcggcacctg gcgagtctgc aagttcaacc gcgcagcctg caacgcgtct cagctgcagt 1620 tcctgcaagg tttcagagat cagatggtgg cagcggtgag agtcttctcc gagtcgagga 1680 gcaacgggct gttcatcaac tcgtgcttcg ctcactgcca gtccgagctg acggccacct 1740 ggaatggtgg ctctcctgct ctccagaaca agggaattgc aaagtctgtt ggtgactggt 1800 actttggtcg agctgaggtg aaggccatcg attgccccta cccctgtgac aaaacatgcc 1860 acaacatcat atgacatcat gcactgacgt ttactcgcct cgaccgaatg gagtgacaca 1920 catttttgcc tcgaagtcct ctcaagttct tcactctagc tagtagctat atacatgtag 1980 aactatcgag ttcagagcca aaacatacaa aacagagaac ctcacacaaa cagatacaaa 2040 ggaagcaaaa caaagttaac aaaagcaaat aggaaggggg agaggggcag ggcacattaa 2100 tatcgggaag cagtgtggtg gagtcatggg tgtataattt cacctattaa gaataaatta 2160 cagtattcac 2170 <210> 296 <211> 418 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 296 Met Ala Met Met Glu Arg Ile Glu Val Thr Lys Leu His His His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Val Leu Leu Leu Val Val Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Val Gln Ala Ala Glu Glu Asp Glu Met Ser Gly Arg Arg Arg Arg Ser 35 40 45 Arg Arg Arg Arg Ala Ala Asp Val Met Val Pro Ile Thr Ile Leu Asn 50 55 60 Ser Ala Val Asp Lys Gly Ala Val Cys Met Asp Gly Thr Pro Pro Ala 65 70 75 80 Tyr His Leu Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Asn Arg Ser Trp Val Val 85 90 95 Asn Leu Glu Gly Gly Gly Trp Cys Asn Asn Ala Arg Thr Arg Arg Phe 100 105 110 Arg Thr Ala Ser Arg His Gly Ser Ser Asp His Met Glu Arg Arg Ile 115 120 125 Ala Phe Thr Gly Ile Met Ser Ser Ala Ala Ala Asp Asn Pro Asp Phe 130 135 140 His Ser Trp Asn Arg Val Lys Ile Arg Tyr Cys Asp Ser Gly Ser Phe 145 150 155 160 Ala Gly Asp Ala Phe Asn Glu Gly Leu Lys Leu Gln Phe Arg Gly Gln 165 170 175 Arg Ile Trp Gly Ala Val Ile Gln His Leu Leu Asp Val Gly Met Ala 180 185 190 Ser Ala Glu His Val Leu Leu Thr Gly Cys Ser Ala Gly Gly Leu Ala 195 200 205 Ala Ile Leu His Cys Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala 210 215 220 Thr Val Lys Cys Leu Ser Asp Gly Gly Leu 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420 cggcctcggc ttcgagatgg gccaggcgct cggcggacac atgcggcgcc accgcgagga 480 gatggccgcc gccggcggtg gatcctccgc cgacgactgg gtctggcgct gcgacgcgcg 540 gccggagggg atcgccgccg agccaccggt gttgctggag ttgttcgcct agttaccgct 600 ggtctccatt agtttcgtcc aagttttgaa ctgacgcagt gtgtgtcacc attaattagt 660 tcatgtacat gtctagaaaa aaaaagtcag gttcatcgat cttgtaacta tgataggggt 720 ttaatttttt tttcattagc gtttgggttg ttcggttttg aatcggtcag tttttgaacc 780 gtttggtgga gatttgttga gttcagatgt atatacacac acagatgtaa tataattctt 840 tcattcatag cc 852 <210> 330 <211> 170 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 330 Met Lys His Pro Arg Gln Glu Glu Glu Val Ser Leu Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ser Thr Asp Cys Ser Ser Thr Ala Ser Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Gly Ala Ala Arg Arg Lys Arg Ala Arg Arg Arg Ser Val Val Ala 35 40 45 Thr Ser Gly Glu Gly Glu Phe Val Cys Lys Thr Cys Ser Arg Ala Phe 50 55 60 Pro Thr Phe Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Thr Ser His Leu Arg Gly 65 70 75 80 Arg Ser Asn Gly Leu Asp Leu Gly Ala Ile Gly Asp Lys Ala Ile 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cgagcagctg cgacaggacg gcctcctcca cacgcagtgc ggcaccccgg 540 cgtacgtcgc gcccgaggtg ctccggaagc gcggctatga cggcgcccgc gccgacctct 600 ggtcctgcgg cgtcgtgctc tacgtgctcc tctgcggctt cctcccgttc cagcacgaga 660 actacgccaa gatgtaccag aagatcttca aggcggagta ccaggtgccg ccgtgggtgt 720 ccggcgacgc gcgccgcctc atcgtccgcc tgctcgtcgt cgacccggcc aagcgcatct 780 ccatcccgga gatcatgcgc acgccatggt tcaagaaggg cttcgtgccg cccgtcccca 840 cctcccctgt ctcccccaag aaatgggaag aagacgatgt cctcctcgac ggcggcgact 900 ccggcgccat gtcgccccgg acgtgcaacg cgttccagct catatcctcc atgtcctccg 960 ggttcgacct gtcggggatg ttcgagagcg agcagaaggc cgccacggtg ttcacgtcgc 1020 gcgcgccggc ggccaccgtc atccagaagc tggaggccgt ggggcgatcg ctgggttaca 1080 gcgccacgag agggaaaggg tggaagctga ggttggaggc gacggcgtcc gttcagcgcg 1140 acgtgaaatc tgtaggatgt attagcttta gcttctttgc tcgcggttat gtacaggcca 1200 aatcgagaga tgtgtaaata caaaagtttt gttacttgat c 1241 <210> 332 <211> 348 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 332 Met Val Glu Gln Leu Arg Arg Glu Ile Ser Ile Met Arg Met Val Arg 1 5 10 15 His Pro Asn Val Val Gly Ile Arg Glu Val Leu Ala Ser Arg Ala Arg 20 25 30 Val Phe Val Val Met Glu Tyr Ala Arg Gly Gly Glu Leu Phe Ala Lys 35 40 45 Val Ala Arg Gly Arg Leu Thr Glu Glu His Ala Arg Arg Tyr Phe Gln 50 55 60 Gln Leu Val Ala Ala Val Gly Phe Cys His Gly Arg Gly Val Ala His 65 70 75 80 Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Glu Gly Arg Leu 85 90 95 Lys Val Thr Asp Phe Gly Leu Ala Ala Leu Pro Glu Gln Leu Arg Gln 100 105 110 Asp Gly Leu Leu His Thr Gln Cys Gly Thr Pro Ala Tyr Val Ala Pro 115 120 125 Glu Val Leu Arg Lys Arg Gly Tyr Asp Gly Ala Arg Ala Asp Leu Trp 130 135 140 Ser Cys Gly Val Val Leu Tyr Val Leu Leu Cys Gly Phe Leu Pro Phe 145 150 155 160 Gln His Glu Asn Tyr Ala Lys Met Tyr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Glu 165 170 175 Tyr Gln Val Pro Pro Trp Val Ser Gly Asp Ala Arg Arg Leu Ile Val 180 185 190 Arg Leu Leu Val Val Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Ile Pro Glu Ile 195 200 205 Met Arg Thr Pro Trp Phe Lys Lys Gly Phe Val Pro Pro Val Pro Thr 210 215 220 Ser Pro Val Ser Pro Lys Lys Trp Glu Glu Asp Asp Val Leu Leu Asp 225 230 235 240 Gly Gly Asp Ser Gly Ala Met Ser Pro Arg Thr Cys Asn Ala Phe Gln 245 250 255 Leu Ile Ser Ser Met Ser Ser Gly Phe Asp Leu Ser Gly Met Phe Glu 260 265 270 Ser Glu Gln Lys Ala Ala Thr Val Phe Thr Ser Arg Ala Pro Ala Ala 275 280 285 Thr Val Ile Gln Lys Leu Glu Ala Val Gly Arg Ser Leu Gly Tyr Ser 290 295 300 Ala Thr Arg Gly Lys Gly Trp Lys Leu Arg Leu Glu Ala Thr Ala Ser 305 310 315 320 Val Gln Arg Asp Val Lys Ser Val Gly Cys Ile Ser Phe Ser Phe Phe 325 330 335 Ala Arg Gly Tyr Val Gln Ala Lys Ser Arg Asp Val 340 345 <210> 333 <211> 1408 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 333 agcttcgacg ccgagcacac cgacacggcg ctcgagcgct acgtcccctt cgtcatggcc 60 acggcggagc agctccagcg gcgggagcgc gtgctcagga tcttcatgaa cgaggtgcgc 120 tcgtggcacg gcttcaacca ccaccacccg gcgacgttcg acacgatcgc catggaaccc 180 gacctcaaga agtccatcgt cgacgacctc gaccgcttcc tgaagcggaa ggagtactac 240 cgccgcatcg gcaaggcgtg gaaacgcggg tacctcctcc acggcccgcc cggcaccggc 300 aagtccagcc tcgtcgccgc catggccaac tacctccgct tcaacctcta cgacctcgac 360 ctctccgagg tgcgcgtcaa cgccgcgctg cagcgcctgc tcatcagcat gcccaacaaa 420 tccatcctcg tcatcgagga catcgactgc tgcttcgacg ccaacccaag agaagcccac 480 aagatcacca cggcggcgct cgaccaggcc gaggacttcg acttctcctc gtcggactcc 540 gacgacgccg tcggcgcgcc gcccagagcg cgccgcgcgg gagatctcca gcagcagaag 600 ctgacgctgt ccgggctgct caacttcatc gacgggctgt ggtccacgag cggcgaggag 660 cgcgtcatcg tcttcaccac aaactacaag gagcgcctcg atccggcgct gctccggccg 720 gggcggatgg acatgcacgt ctacatgggc tactgcggct gggaggcgtt caagacgctc 780 gcgcacaact acttcctcgt cggcgaccac ccgctgttcc cggagatacg gcagctgctc 840 gccggcgtgg aggtgacgcc ggccgaggtg tcggagatgc tgctgcgcag cgaggacgcc 900 gacgccgcgc tccggggcct cgtggagttc ctccgtgaga ggacgcggcg gagggcaaga 960 caagaggcag cgatcgacga caaccaagtg gtagcagaaa aaggcaatgc agcttaacaa 1020 atcttcagag aatttacttc acaataacga gatgagatga ttgggttgca tgatcacgac 1080 agtagcaaac ttggtactag tagtacttac tgaattaata atcatttgtc atgctcacta 1140 taatttctgt tgcaaatctg caagcaatgg catagctagg caaggcaaca gagaacagaa 1200 gagagtgcag agcgtctggt catggattaa ctgttgcttt ctgaaaagct gggcttatct 1260 taaaacaaat gatgagctgt ggttttagtt tcaaccccag cctaacttaa cagagtagca 1320 tataaacata tgacaggaaa ctactccgcg ttggaggggt aagaaatggg actctgcatt 1380 ttctgaataa tgagacactt tctgaatc 1408 <210> 334 <211> 320 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 334 Met Ala Thr Ala Glu Gln Leu Gln Arg Arg Glu Arg Val Leu Arg Ile 1 5 10 15 Phe Met Asn Glu Val Arg Ser Trp His Gly Phe Asn His His His Pro 20 25 30 Ala Thr Phe Asp Thr Ile Ala Met Glu Pro Asp Leu Lys Lys Ser Ile 35 40 45 Val Asp Asp Leu Asp Arg Phe Leu Lys Arg Lys Glu Tyr Tyr Arg Arg 50 55 60 Ile Gly Lys Ala Trp Lys Arg Gly Tyr Leu Leu His Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Thr Gly Lys Ser Ser Leu Val Ala Ala Met Ala Asn Tyr Leu Arg Phe 85 90 95 Asn Leu Tyr Asp Leu Asp Leu Ser Glu Val Arg Val Asn Ala Ala Leu 100 105 110 Gln Arg Leu Leu Ile Ser Met Pro Asn Lys Ser Ile Leu Val Ile Glu 115 120 125 Asp Ile Asp Cys Cys Phe Asp Ala Asn 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gagcagatcg atcgtttcct 60 ttttatttct gaggagaaga ggatcgatcg tttcgttcga tcgtttggtt tttgaatttt 120 gaggagaaga gaagagaaga ggatcggaag agatggccgg cggcggcgtg gaggacacgt 180 acggcgagga cagggccacc gaggatcagc tcatcacccc atggtccttc tccgtcgcca 240 gcgggtacac gctgctgaga gacccgcggc acaacaaggg tttggccttc tcggaggcgg 300 agcgcgacgc gcactacctc cgcggcctcc tcccgccatc catcgtctcg caggagctcc 360 aggagaagaa gctcatgcac aacctccgca actacaccgt ccccctccag cgctacatcg 420 ccatgatgga cctccaggag aggaatgaga ggctgttcta caagctcctg atcgacaacg 480 tggaggagct gctgccggtg gtgtacacgc cgacggtcgg ggaggcctgc cagaagtacg 540 gcagcatcta caggcggcca cagggcctgt acatcagcct caaggacaag gggaagatcc 600 ttgaggtgct caagaactgg ccggagagga gcatccaggt gatcgtcgtc accgacggcg 660 agcgcattct tggccttgga gatcttggtt gtcagggaat gggtattcct gtcggcaaac 720 tgtctctgta cactgccctt ggaggagttc gcccatcagc ttgccttcca atcacaattg 780 atgttggtac caacaatgag tcactgctca acgacgaatt ctacattgga ctcaagcaac 840 gccgtgctac cggagaggaa taccacgagc ttcttgagga gtttatgacc gcagttaagc 900 aaaactacgg cgagaaagtg ctcgttcagt ttgaagactt tgccaaccac aatgcttttg 960 acttgcttgc aaagtacagc aagagccacc ttgtcttcaa cgacgacatt cagggaacag 1020 catcagtggt cctcgcaggt ctgattgcgg cgctcaaggt ggtcggtgga actcttgcag 1080 atcacactta cctgttcctt ggcgccggtg aggctggaac tggcatcgca gagctcattg 1140 ccctcgagat gtcaaagcag acggagattc cgatcaatga ttgccggaag aaggtgtggc 1200 tggtggactc gagggggctg atcgtggagt cgaggaagga gtcgctgcag cacttcaagc 1260 agccattcgc gcacgagcac gagccggtga agacgctgct ggaggccgtg cagtccatca 1320 agccgaccgt gctcatcggc acttccggcg tcggcaagac attcacccag gaggtcgtcg 1380 aggccatggc cgccttcaac gagaaacctg tcatcttcgc gctctccaac ccgacgtcgc 1440 actcggaatg caccgcggag gaggcataca cctggaccaa gggaagtgcg gtgttcgcga 1500 gcgggagccc gttcgacgcg gtggagtacg aggggaagac gtacgtgccg gggcaatcga 1560 acaacgccta catcttcccg gggttcgggc tgggcgtggt gatctcgggc gccatccgcg 1620 tccacgacga catgctgctg gcggcgtcgg aggcgctggc ggagcaggtg agcgaggaca 1680 acttcgccag ggggctcatc ttcccgccct tcaccaacat ccgcaagatc tccgcacaca 1740 tcgccgccaa ggtcgccgcc aaggcgtacg agctcggcct cgccagccgc ctcccgcgcc 1800 ccgacgacct cgtcaagtac gccgagagct gcatgtacac cccggcctac cgctgctacc 1860 gctgatcgag cacgagccca ccgaggagga agacgatcga tcgaattaag caataaaatt 1920 tttattcaaa tcttggcgcg agcgttagct gccattagag gggttttcat ttttaatttt 1980 ttttgtgtac ccatacatat acgtatacgt gtactgcata catactagag cacctgatgg 2040 tgcttgtcgt cgtcgattct tttgaccgat ttgaagtttg gtagggtgta atagcactta 2100 cttttgagtt ttccacattg agttgattcg gtgtaatagg agtcaaattt gagtttctta 2160 tgatggttgt tcatgatcag tttctgatgc aatgcgtcgt gtcattttta cccaataaaa 2220 gcagagatgc ttacttagtg g 2241 <210> 336 <211> 570 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 336 Met Ala Gly Gly Gly Val Glu Asp Thr Tyr Gly Glu Asp Arg Ala Thr 1 5 10 15 Glu Asp Gln Leu Ile Thr Pro Trp Ser Phe Ser Val Ala Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Leu Leu Arg Asp Pro Arg His Asn Lys Gly Leu Ala Phe Ser Glu 35 40 45 Ala Glu Arg Asp Ala His Tyr Leu Arg Gly Leu Leu Pro Pro Ser Ile 50 55 60 Val Ser Gln Glu Leu Gln Glu Lys Lys Leu Met His Asn Leu Arg Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Val Pro Leu Gln Arg Tyr Ile Ala Met Met Asp Leu Gln Glu 85 90 95 Arg Asn Glu Arg Leu Phe Tyr Lys Leu Leu Ile Asp Asn Val Glu Glu 100 105 110 Leu Leu Pro Val Val Tyr Thr Pro Thr Val Gly Glu Ala Cys Gln Lys 115 120 125 Tyr Gly Ser Ile Tyr Arg Arg Pro Gln Gly Leu Tyr Ile Ser Leu Lys 130 135 140 Asp Lys Gly Lys Ile Leu Glu Val Leu Lys Asn Trp Pro Glu Arg Ser 145 150 155 160 Ile Gln Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly Leu Gly 165 170 175 Asp Leu Gly Cys Gln Gly Met Gly Ile Pro Val Gly Lys Leu Ser Leu 180 185 190 Tyr Thr Ala Leu Gly Gly Val Arg Pro Ser Ala Cys Leu Pro Ile Thr 195 200 205 Ile Asp Val Gly Thr Asn Asn Glu Ser Leu Leu Asn Asp Glu Phe Tyr 210 215 220 Ile Gly Leu Lys Gln Arg Arg Ala Thr Gly Glu Glu Tyr His Glu Leu 225 230 235 240 Leu Glu Glu Phe Met Thr Ala Val Lys Gln Asn Tyr Gly Glu Lys Val 245 250 255 Leu Val Gln Phe Glu Asp Phe Ala Asn His Asn Ala Phe Asp Leu Leu 260 265 270 Ala Lys Tyr Ser Lys Ser His Leu Val Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly 275 280 285 Thr Ala Ser Val Val Leu Ala Gly Leu Ile Ala Ala Leu Lys Val Val 290 295 300 Gly Gly Thr Leu Ala Asp His Thr Tyr Leu Phe Leu Gly Ala Gly Glu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Gly Ile Ala Glu Leu Ile Ala Leu Glu Met Ser Lys Gln 325 330 335 Thr Glu Ile Pro Ile Asn Asp Cys Arg Lys Lys Val Trp Leu Val Asp 340 345 350 Ser Arg Gly Leu Ile Val Glu Ser Arg Lys Glu Ser Leu Gln His Phe 355 360 365 Lys Gln Pro Phe Ala His Glu His Glu Pro Val Lys Thr Leu Leu Glu 370 375 380 Ala Val Gln Ser Ile Lys Pro Thr Val Leu Ile Gly Thr Ser Gly Val 385 390 395 400 Gly Lys Thr Phe Thr Gln Glu Val Val Glu Ala Met Ala Ala Phe Asn 405 410 415 Glu Lys Pro Val Ile Phe Ala Leu Ser Asn Pro Thr Ser His Ser Glu 420 425 430 Cys Thr Ala Glu Glu Ala Tyr Thr Trp Thr Lys Gly Ser Ala Val Phe 435 440 445 Ala Ser Gly Ser Pro Phe Asp Ala Val Glu Tyr Glu Gly Lys Thr Tyr 450 455 460 Val Pro Gly Gln Ser Asn Asn Ala Tyr Ile Phe Pro Gly Phe Gly Leu 465 470 475 480 Gly Val Val Ile Ser Gly Ala Ile Arg Val His Asp Asp Met Leu Leu 485 490 495 Ala Ala Ser Glu Ala Leu Ala Glu Gln Val Ser Glu Asp Asn Phe Ala 500 505 510 Arg Gly Leu Ile Phe Pro Pro Phe Thr Asn Ile Arg Lys Ile Ser Ala 515 520 525 His Ile Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Tyr Glu Leu Gly Leu Ala 530 535 540 Ser Arg Leu Pro Arg Pro Asp Asp Leu Val Lys Tyr Ala Glu Ser Cys 545 550 555 560 Met Tyr Thr Pro Ala Tyr Arg Cys Tyr Arg 565 570

Claims (26)

  1. 서열번호 4로 표시된 NAC5 폴리펩티드 또는 서열번호 2로 표시된 NAC1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 서열번호 4 또는 서열번호 2에 대해 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 이의 상동체의 식물로의 도입 및 발현을 포함하는, 비생물학적 스트레스 조건 하에서 자란 식물의 수확량 관련 형질 향상 및/또는 뿌리 형태를 변형시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터, 더 바람직하게는 RCc3 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 유래의 RCc3 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 항시성 (constitutive) 프로모터, 바람직하게는 GOS2 프로모터, 더 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 증가된 종자 또는 곡물 수확량을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 뿌리 형태는 하기의 어느 하나 이상의 증가 또는 변화를 포함하거나, 하기의 어느 하나 이상의 증가 또는 변화 때문인 것을 특징으로 하는 방법: 생체 중량 또는 건조 중량 형태의 뿌리 생물량의 증가, 증가된 뿌리의 수, 증가된 뿌리 직경, 확대된 뿌리, 확대된 중심주 (stele), 확대된 통기 조직 (aerenchyma), 증가된 통기 조직 형성, 확대된 수피 (cortex), 확대된 수피 (cortical) 세포, 확대된 목질부, 변형된 분지, 향상된 침투 (penetration) 능력, 확대된 외피 (epidermis), 어린줄기에 대한 뿌리 비율의 증가.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 향상된 수확량 관련 형질은 가뭄 스트레스 또는 염분 스트레스 조건 하에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NAC5 또는 NAC1 폴리펩티드는 서열번호 5 내지 서열번호 15로 표시된 모티프의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NAC5 또는 NAC1을 코딩하는 핵산은 식물 유래, 바람직하게는 단자엽 식물 유래, 더 바람직하게는 벼과 (family Poaceae) 유래, 더욱 바람직하게는 벼속 (genus Oryza) 유래, 가장 바람직하게는 벼 (Oryza sativa) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NAC5 또는 NAC1을 코딩하는 핵산은 표 16에 열거된 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하거나, 상기 핵산의 일부이거나, 상기 핵산과 혼성화가 가능한 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 표 16에 제시된 어느 하나의 폴리펩티드의 오쏘로그 (orthologue) 또는 패럴로그 (paralogue)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 4로 표시된 NAC5 폴리펩티드를 코딩하거나, 서열번호 2로 표시된 NAC1 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 표 16에 제시된 NAC5 폴리펩티드 또는 NAC1 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능한 식물체, 또는 식물체의 일부, 또는 식물 세포.
  13. 하기를 포함하는 유전자 구축물 (construct):
    (i) 표 16에 제시된 NAC5 폴리펩티드 또는 NAC1 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산;
    (ii) 하나 이상의 조직 특이적 프로모터를 포함하는 (i)의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 하나 이상의 조절 서열; 및 선택적으로
    (iii) 전사 종결 서열.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산은 식물 유래의 항시성 프로모터에, 바람직하게는 식물 유래의 중간 강도의 항시성 프로모터에, 더 바람직하게는 GOS2 프로모터에, 가장 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 구축물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조직 특이적 프로모터는 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터, 더 바람직하게는 RCc3 프로모터인 것을 특징으로 하는 구축물.
  16. 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질, 바람직하게는 증가된 종자 수확량 및/또는 증가된 생물량 및/또는 변형된 뿌리 형태를 갖는 식물을 제조하는 방법에 대한 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구축물의 용도.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 유전자 구축물로 형질전환된 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포.
  18. 하기 단계를 포함하는, 대조구 식물에 비하여 향상된 수확량 관련 형질, 바람직하게는 대조구 식물에 비하여 증가된 및/또는 증가된 종자 수확량 및/또는 증가된 생물량을 갖는 형질전환 식물의 제조 방법:
    (i) 표 16에 제시된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 식물 세포 또는 식물에 도입 및 발현하는 단계; 및
    (ii) 비생물적 스트레스 조건 하에서, 증가된 종자 수확량 및 변형된 뿌리 형태를 갖는 상기 (i)단계의 식물 세포 또는 식물을 배양하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 핵산은 조직 특이적 프로모터, 바람직하게는 뿌리 특이적 프로모터, 더 바람직하게는 RCc3 프로모터, 더욱 바람직하게는 벼 유래의 RCc3 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 핵산은 항시성 프로모터, 바람직하게는 GOS2 프로모터, 더 바람직하게는 벼 유래의 GOS2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 표 16에 제시된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산의 조절된 발현으로 인하여 대조구 식물에 비해 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 형질전환 식물.
  22. 제12항, 제17항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물은 비트, 사탕무 또는 알팔파와 같은 작물; 또는 사탕수수와 같은 단자엽 식물; 또는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호맥 (rye), 라이밀 (triticale), 수수 (sorghum), 에머밀 (emmer), 스펠트밀 (spelt), 외알밀 (소맥, einkorn), 테프 (teff), 마일로 (milo) 또는 귀리 같은 곡물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물 또는 상기 형질전환 식물로부터 유래된 형질전환 식물 세포.
  23. 수확 가능한 부분은 바람직하게는 뿌리 생물량 및/또는 종자인 것을 특징으로 하는, 제22항에 따른 식물의 수확 가능한 부분.
  24. 제22항에 따른 식물 및/또는 제23항에 따른 식물의 수확 가능한 부분 유래의 산물.
  25. 대조구 식물에 비해 식물에서 수확량 관련 형질을 향상시키기 위한, 표 16에 제시된 NAC1 또는 NAC5 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 패럴로그 또는 오쏘로그를 코딩하는 핵산의 용도.
  26. 제12항, 제17항, 제21항 또는 제22항 중 어느 한 항에 따른 식물의 재배 단계 및 종자를 포함하는 상기 식물 또는 식물의 일부로부터 또는 종자를 포함하는 상기 식물 또는 식물의 일부를 이용하여 산물을 생산하는 단계를 포함하는, 산물의 제조 방법.
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