KR20140071814A - 미세유동장치 및 이를 채용한 생물학적 시료 내의 표적 물질 농축방법 - Google Patents

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Abstract

개시된 미세유동 장치는, 시료를 제1유체층과 제2유체층으로 원심분리하는 시료 챔버와, 제1유체층을 전달받아 제1미세 입자와 제1표적 물질이 결합된 제1복합체를 형성하고 밀도차에 의하여 제1복합체를 제1유체층으로부터 분리하는 제1농축부와, 제2유체층을 전달받아 제2미세 입자와 제2표적 물질이 결합된 제2복합체를 형성하고 밀도차에 의하여 상기 제2복합체를 제2유체층으로부터 분리하는 제2농축부를 포함한다.

Description

미세유동장치 및 이를 채용한 생물학적 시료 내의 표적 물질 농축방법{Microfluidic apparatus and method of enriching target in boilogical sample}
생물학적 시료 내의 표적 세포를 분리하기 위한 미세유동장치 및 표적 물질 농축 방법에 관한 것이다.
악성 종양과 관련한 사망은 대부분 최초로 종양이 발생한 지점으로부터 떨어진 조직 및 기관으로의 전이(metastasis)에 의한다. 따라서 전이를 조기에 발견하는 것은 암 환자의 생존 확률에 대한 중요한 결정 요소이며, 종양의 조기 발견 및 종양의 성장을 모니터링하는 것은 암 환자의 성공적인 치료에 매우 중요한 요소로 여겨진다. 암의 진단은 대체로 조직 병리학(histopathology)에 의한 진단 기법을 이용한다. 조직 병리학 진단 기법은 생검체로부터 얻어지는 조직 시료를 사용하여 종양을 진단하는 방법이다. 이러한 조직 병리학에 의한 접근 방법은 종양 세포를 직접적으로 관찰할 수 있도록 한다. 그러나, 생검체 시료를 얻기 위하여 선택한 조직의 위치에서 종양이 존재하는 여부가 부정확할 수 있으며, 생검체로부터 얻어지는 특정 지점에 관한 데이터만 제공하므로, 다른 지점으로 종양이 전이되었는지 여부를 아는데 한계가 있다는 점에서 종양을 진단하거나 모니터링하는데 있어서 그 적용 가능성이 제한될 수 있다.
혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)는 최초로 종양이 검출되기 이전에 환자에게서 발견된다고 알려져 있다. 따라서, CTC는 암의 조기 진단 및 예측에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 암은 대체로 혈액을 통해 전이된다는 점에서 혈중 종양 세포는 암의 전이 여부를 진단할 수 있는 표지가 될 수 있다. 또한, 수술을 통해 암 세포를 제거한 후에도 혈중 종양 세포가 발견되는 경우가 있으며, 이러한 경우 암이 재발할 가능성도 존재한다. 그러나, 이러한 혈중 종양 세포는 혈액 내에서 그 양이 매우 적고 세포 자체가 연약하여 이를 감지하고 그 수를 파악하기가 매우 어렵다. 따라서, 환자의 체내에 존재하는 혈중 종양 세포, 암 세포 또는 암 줄기 세포를 검출할 수 있는 높은 민감성을 나타내는 진단 방법이 여전히 필요하다.
생물학적 시료 내의 서로 다른 두 종류의 표적 물질을 자동화된 프로세스에 의하여 분리, 농축할 수 있는 미세유동장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따른 미세유동장치는, 회전 구동부에 장착되어 원심력에 의하여 유체의 흐름을 유발하는 미세유동 장치로서, 생물학적 시료가 수용되며, 그 내부에서 원심력에 의하여 상기 시료가 제1표적 물질을 포함하는 제1유체층과 제2표적 물질을 포함하는 제2유체층으로 분리되는 시료 챔버; 상기 시료 챔버로부터 상기 제1유체층을 전달받아 제1미세 입자와 상기 제1표적 물질이 결합된 제1복합체를 형성하고, 상기 제1복합체보다 밀도가 낮은 밀도구배물질과의 밀도차에 의하여 상기 제1복합체를 상기 제1유체층으로부터 분리하는 제1농축부; 상기 시료 챔버로부터 상기 제2유체층을 전달받아 제2미세 입자와 상기 제2표적 물질이 결합된 제2복합체를 형성하고, 상기 제2유체층과 상기 제2복합체와의 밀도차에 의하여 상기 제2복합체를 상기 제2유체층으로부터 분리하는 제2농축부;를 포함한다.
상기 제1농축부는, 상기 제1미세 입자를 수용하는 것으로서 제1시료 채널에 의하여 상기 시료 챔버와 연결되고, 상기 제1복합체가 형성되는 제1입자 챔버; 상기 밀도구배물질을 수용하는 것으로서 분리 채널에 의하여 상기 제1입자 챔버와 연결되고, 밀도차에 의하여 상기 제1복합체가 상기 미세유동장치의 회전 중심을 기준으로 하여 최하층부에 위치되는 분리 챔버; 제1회수 채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결되어 상기 제1회수 채널을 통하여 상기 제1복합체가 회수되는 제1회수 챔버;를 포함할 수 있다.
상기 제1농축부는, 상기 분리 챔버와 제1배출채널에 의하여 연결되어, 상기 제1배출채널을 통하여 상기 제1복합체의 상층물질이 배출되는 제1웨이스트 챔버;를 더 포함할 수 있다.
상기 제1농축부는, 제1세척액이 수용되며, 제1세척 채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결된 제1세척액 챔버; 순차로 개폐되는 다수의 연결채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결되어 상기 제1복합체의 상층물질 및 상기 제1세척액이 배출되는 제1웨이스트 챔버;를 더 포함할 수 있다.
상기 제2농축부는, 상기 제2미세 입자를 수용하는 것으로서 제2시료 채널에 의하여 상기 시료 챔버와 연결되고, 상기 제2복합체가 형성되어 상기 미세유동장치의 회전 중심을 기준으로 하여 최하층부에 위치되는 제2입자 챔버; 제2회수 채널에 의하여 상기 제2입자 챔버와 연결되어 상기 제2회수 채널을 통하여 상기 제2복합체가 회수되는 제2회수 챔버;를 포함할 수 있다.
상기 제2농축부는, 상기 제2입자 챔버와 제2배출채널에 의하여 연결되어, 상기 제2배출채널을 통하여 상기 제2복합체의 상층물질이 배출되는 제2웨이스트 챔버;를 더 포함할 수 있다.
상기 제2농축부는, 제2세척액이 수용되며, 제2세척 채널에 의하여 상기 제2입자 챔버와 연결된 제2세척액 챔버; 순차로 개폐되는 다수의 연결채널에 의하여 상기 제2 입자 챔버와 연결되어 상기 제2복합체의 상층물질 및 상기 제2세척액이 배출되는 제2웨이스트 챔버;를 더 포함할 수 있다.
상기 시료는 혈액이며, 상기 제1유체층은 백혈구층이며, 상기 제2유체층은 혈장층일 수 있다. 상기 제1표적 물질은 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)일 수 있다. 상기 제2표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA(miRNA), DNA, 또는 미세 지질 입자(sub-micron sized lipid particle)일 수 있다.
상기 시료 챔버 내에는 그 상부벽과 하부벽 중 적어도 하나와의 사이에 병목부를 형성하여 시료의 반경 방향의 흐름을 부분적으로 제한하는 격벽이 마련되며, 상기 병목부와 상기 상부벽과 하부벽 중 적어도 하나와의 간격은 모세관 현상을 유발하는 간격보다 클 수 있다. 상기 격벽은 상기 반경 방향으로 상기 시료 챔버의 내측으로부터 외측으로 갈수록 상기 병목부가 점차 좁아지는 형상일 수 있다. 상기 시료 챔버의 원주 방향으로 복수의 상기 격벽이 반복 배치되어 상기 복수의 격벽 사이에 개구가 형성될 수 있다. 상기 개구는 상기 반경 방향으로 내측으로부터 외측으로 갈수록 점차 좁아지는 형태일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 표적 물질 농축방법은, 미세유동장치는, 원심력에 의하여 내부에 수용된 유체의 흐름을 유발하는 미세유동장치를 이용한 표적 물질 농축 방법으로서, 상기 미세유동장치의 시료 챔버 내에서 시료를 원심분리하여, 제1표적 물질을 포함하는 제1유체층과 제2표적 물질을 포함하는 제2유체층을 형성하는 단계; 상기 제1, 제2유체층을 각각 제1, 제2농축부로 이동시키는 단계; 상기 제1유체층에 상기 제1표적 물질의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제1미세 입자를 혼합하여 상기 제1표적 물질과 상기 제1미세 입자가 결합된 제1복합체를 형성하고, 상기 제1복합체보다 밀도가 작고 상기 제1유체층보다 밀도가 큰 밀도구배물질을 이용하여 상기 제1복합체를 상기 제1유체층과 분리시키는 단계; 상기 제2유체층에 상기 제2표적 물질의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제2미세 입자를 혼합하여 상기 제2표적 물질과 상기 제2미세 입자가 결합된 제2복합체를 형성하고, 상기 제2복합체와 상기 제2유체층과의 밀도차에 의하여 상기 제2복합체를 상기 제2유체층과 분리시키는 단계; 상기 제1복합체와 상기 제2복합체를 각각 제1, 제2회수 챔버로 이동시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1복합체와 상기 제2복합체를 각각 제1, 제2회수 챔버로 이동시키기 전에 상기 제1복합체의 상층물질과 상기 제2복합체의 상층 물질을 각각 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 제1복합체의 상층물질과 상기 제2복합체의 상층 물질을 각각 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출한 후에 제1, 제2세척액을 각각 상기 제1, 제2농축부로 공급하여 상기 제1, 제2복합체를 세척하고, 상기 제1, 제2세척액을 각각 상기 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 시료는 혈액이며, 상기 제1유체층은 백혈구층이며, 상기 제2유체층은 혈장층일 수 있다. 상기 제1표적 물질은 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)일 수 있다. 상기 제2표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA(miRNA), DNA, 또는 미세 지질 입자(sub-micron sized lipid particle)일 수 있다.
상술한 미세유동장치 및 표적 물질 농축 방법에 따르면, 시료 중의 서로 다른 두 종류의 표적 물질을 신뢰성있고 효율적으로 농축할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 농축 시스템의 개략적인 구성도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치의 상판을 제거한 상태의 사시도이다.
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 미세유동장치의 상판을 제거한 상태의 사시도이다.
도 4는 도 2 및 도 3의 A-A' 단면도이다.
도 5는 병목부의 다른 예를 보여주는 단면도이다.
도 6은 격벽과 개구가 설치된 시료 챔버의 일 실시예를 보여주는 평면도이다.
도 7a와 도 7b는 폐쇄된 밸브의 일 실시예의 단면도들이다.
도 8a와 도 8b는 열린 밸브의 일 실시예의 단면도들이다.
도 9a 내지 도 9c는 개폐형 밸브의 일 실시예의 단면도들이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 이들 실시예는 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 미세유동장치(1)를 이용한 표적 물질 농축 시스템의 일 예이다. 도 1을 보면, 회전 구동부(10)와 전자기파 발생기(20)가 도시되어 있다. 회전 구동부(10)는 미세유동장치(1)를 회전시킴으로써 시료의 원심분리와 유체의 이동을 위한 원심력을 제공한다. 회전 구동부(10)는 미세유동장치(1)에 마련된 밸브들을 전자기파 발생기(20)와 대면시키기 위하여 미세유동장치(1)를 소정 위치에 정지시킨다. 전자기파 발생기(20)는 미세유동장치(1)의 밸브들을 작동시키기 위한 것으로서, 예를 들면, 레이저 광을 조사한다. 전자기파 발생기(20)는 미세유동장치(1)의 반경방향으로 이동될 수 있다. 회전 구동부(10)는 도면에 전부가 도시되지는 않았으나, 미세유동장치(1)의 밸브들을 전자기파 발생기(20)와 정렬시키기 위하여 미세유동장치(1)의 각위치(angular position)를 제어할 수 있는 모터 드라이브(motor drive) 장치를 포함할 수 있다. 예를 들면, 모터 드라이브 장치는 스텝 모터를 이용한 것일 수도 있고, 직류 모터를 이용한 것일 수도 있다. 참조부호 30은 농축 과정을 제어하는 제어부이다.
도 2는 본 발명에 따른 미세유동장치(1)의 일 실시예로서 상판을 제거한 상태의 사시도이다. 본 실시예에 따른 미세유동장치(1)는 원심력에 의하여 내부에 수용된 유체의 흐름을 유발한다. 미세유동장치(1)에는 유체를 수용할 수 있는 공간과 유체의 통로를 제공하기 위한 미세유동구조물이 마련된다. 미세유동장치(1)는 예를 들어 회전 가능한 디스크 형상일 수 있으나, 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
미세유동장치(1)는 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴 등의 플라스틱 소재, PDMS 등의 유기 실리콘 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성, 광학적 투명성, 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다. 미세유동장치(1)는 여러 층의 판으로 이루어질 수 있다. 판과 판이 서로 맞닿는 면에 챔버나 채널 등에 해당하는 음각 구조물을 만들고 이들을 접합함으로써 미세유동장치(1) 내부에 유체를 수용할 수 있는 공간과 유체의 통로를 제공할 수 있다. 예를 들어, 미세유동장치(1)는 상부판과 하부판의 2판 구조일 수 있으며, 상부판과 하부판 및 그 사이에서 미세유동구조물을 정의하는 구획판을 포함하는 3판 구조일 수도 있다. 판과 판의 접합은 접착제나 양면 접착테이프를 이용한 접착이나 초음파 용착, 레이저 용착 등 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
미세유동장치(1)에는 하나 또는 다수의 미세유동 구조물이 마련될 수 있다. 예를 들면, 미세유동장치(1)를 수 개의 영역으로 나누고 각 영역마다 서로 독립적으로 작동되는 미세유동 구조물이 마련될 수 있다. 도 2에는 하나의 영역에 마련된 미세유동 구조물이 도시되어 있다.
본 실시예의 미세유동장치(1)는 생물학적 시료 내에 포함된 서로 다른 종류의 표적 물질을 농축할 수 있다. 도 2를 참조하면, 시료가 수용되는 시료 챔버(100)와, 시료로부터 제1표적 물질을 농축하기 위한 제1농축부(200)와, 시료로부터 제2표적 물질을 농축하기 위한 제2농축부(300)가 도시되어 있다. 시료 챔버(100)는 회전 중심(RC)으로부터 반경 방향으로 연장된 형태이다. 시료 챔버(100)에는 시료를 주입하기 위한 주입구(미도시)가 마련될 수 있다. 미세유동장치(1)의 회전에 의하여 시료 챔버(100) 내에서 시료가 원심분리된다.
제1표적 물질은 혈액 내에 존재하는 표적 세포일 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 혈중 종양 세포(CTC: circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)일 수 있다. 표적 세포는 예를 들어, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 담관암종, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비인두암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 전립선암, 갑상선암, 골육종, 횡문근육종, 활막육종, 카포시육종, 평활근육종, 악성 섬유성 조직구종, 섬유육종, 성인 T세포 백혈병, 림프종, 다발 골수종, 신경교아세포종/성상세포종, 흑색종, 중피종 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암 또는 종양 세포일 수 있다.
제2표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA(miRNA), DNA, 미세 지질 입자(sub-micron sized lipid particle) 등 혈액내 단백질일 수 있다.
시료는 제1, 제2표적 물질이 존재할 수 있는 한 어떠한 생물학적 시료라도 무방하다. 예를 들면, 생물학적 시료는 생검시료, 조직시료, 분리된 세포를 액체 매질에 현탁시킨 세포 현탁물, 세포 배양물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 시료는 혈액, 골수액, 타액, 누액, 뇨, 정액, 점막액 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들어, 혈중 종양 세포와 miRNA를 분리하기 위해, 혈액을 시료로써 사용할 수 있다.
예를 들어, 혈액을 원심분리하는 경우, 최하층은 적혈구층(L1)이며, 그 위에 백혈구층(제1유체층)(L2)과 혈장층(제2유체층)(L3)이 순차로 위치된다. 표적 세포는 주로 백혈구층(L2)에 위치되며, 혈액내 단백질들은 혈장층(L3)에 위치된다. 이 경우 제1, 제2농축부(200)(300)는 시료 챔버(100)와 회전 중심(RC)을 기준으로하여 반경 방향으로 서로 다른 위치에 연결되어 각각 백혈구층(L2)과 혈장층(L3)을 공급받아 표적 세포와 혈액내 단백질을 각각 분리, 농축할 수 있다.
[제1농축부]
도 2를 참조하면, 제1농축부(200)는 시료 챔버(100)로부터 제1표적 물질을 포함하는 제1유체층을 전달받아, 이로부터 제1표적 물질을 분리한다. 제1농축부(200)는 제1표적 물질에 제1미세 입자를 부착시켜 제1표적 물질-제1미세 입자 복합체(complex), 즉 제1복합체를 형성하고, 밀도구배물질(DGM: density gradient medium)을 이용하여 밀도차에 의하여 제1유체층로부터 제1복합체를 분리한다. 이를 위하여, 제1농축부(200)는 제1미세 입자가 수용되는 제1입자 챔버(210)와, 밀도구배물질이 수용되는 분리 챔버(220)를 구비한다.
제1미세 입자에는 제1표적 물질의 표면 마커에 특이적인 리간드가 하나 이상 결합되어 있다. 제1미세 입자는 제1표적 물질과 결합함으로써 제1표적 물질의 밀도를 증가시키기 위한 것이다. 제1미세 입자는 시료 내의 제1표적 물질과 그 이외의 다른 세포 사이의 밀도 차이를 유발할 수 있을 정도의 밀도 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 제1표적 물질로서 암세포가 존재하는 혈액을 생물학적 시료로 사용하는 경우라면, 백혈구와 적혈구의 밀도가 각각 1.05 g/cm3 와 1.1 g/cm3 이므로, 이를 고려하여 적절한 밀도를 갖는 제1미세 입자가 선택될 수 있다. 제1미세 입자는 예를 들어, 폴리스티렌 입자, 폴리메틸메타아크릴레이트 입자, 라텍스 입자, ABS(아크릴로 니트릴, 부타디엔 및 스티렌의 테르트-폴리머)입자, 시클릭 올레핀 공중합체 입자, 멜아민 입자 및 이들의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 제1미세 입자의 직경은 분리하고자 하는 제1표적 물질, 사용하고자 하는 제1미세 입자의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 1 nm 내지 100 ㎛, 또는 10 nm 내지 10 ㎛ 정도일 수 있다. 제1미세 입자는 자성입자 또는 비자성입자일 수 있다.
표면 마커는 단백질, 당, 지질, 핵산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 표면 마커는 암 또는 종양 세포에서 특이적으로 발현되어 세포막에 전시되는 단백질, 즉 항원일 수 있으며, 예를 들어, EpCAM, c-Met, cytokeratines, CD45, Her2 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 표면 마커에 특이적인 리간드는 항원 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
밀도구배물질은 밀도 구배를 이용하여 제1복합체를 포함하는 유체로부터 제1복합체를 분리하기 위한 것이다. 밀도구배물질은 그 밀도가 제1복합체보다 작고 제1유체층보다는 큰 물질이다. 예를 들어, 밀도구배물질은 피콜(Ficoll), 퍼콜(Percoll), 다당류(polysaccharide), 염화나트륨 용액(NaCl Solution) 등일 수 있다.
제1입자 챔버(210)는 제1시료 채널(411)에 의하여 시료 챔버(100)와 연결된다. 제1시료 채널(411)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제1시료 밸브(412)가 마련된다. 제1시료 밸브(412)는 제1시료 채널(411)을 폐쇄한 상태에서 외부로부터 에너지를 공급받아 제1시료 채널(411)을 개방하는 소위 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다. 제1입자 챔버(210) 내에서 제1표적 물질과 제1미세 입자가 서로 접촉되며, 제1미세 입자가 제1표적 물질에 부착됨으로써 제1표적 물질-제1미세 입자 복합체(제1복합체)가 형성된다. 제1입자 챔버(210)에는 제1미세 입자를 주입하기 위한 주입구(미도시)가 마련될 수 있다. 미세유동장치(1)가 특정 용도 전용인 경우에는 용도에 맞는 제1미세 입자가 미리 제1입자 챔버(210)에 수용된 상태에서 미세유동장치(1)가 제조될 수도 있다.
분리 챔버(220)는 분리 채널(220)에 의하여 제1입자 챔버(210)와 연결된다. 분리 채널(421)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 분리 밸브(422)가 마련된다. 분리 밸브(422)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 분리 챔버(220)에는 밀도구배물질이 수용된다. 분리 챔버(220)에는 밀도구배물질을 주입하기 위한 주입구(미도시)가 마련될 수 있다. 미세유동장치(1)가 특정 용도 전용인 경우에는 용도에 맞는 밀도구배물질이 미리 분리 챔버(220)에 수용된 상태에서 미세유동장치(1)가 제조될 수도 있다. 원심력에 의하여 유체가 제1입자 챔버(210)로부터 분리 챔버(220)로 흐르도록 하기 위하여, 분리 챔버(220)는 회전중심(RC)을 기준으로 하여 반경 방향으로 제1입자 챔버(210)의 외측에 배치된다. 분리 챔버(220) 내에서 밀도구배물질을 사이에 두고 제1복합체와 제1유체층이 서로 나누어지게 된다. 제1복합체는 분리 챔버(220)의 최하층, 즉 회전중심(RC)을 기준으로 하여 반경 방향으로 최외측에 모인다. 분리 챔버(220)에는 제1복합체를 추출하기 위한 추출구(미도시)가 마련될 수 있다. 예를 들어 피펫 등을 이용하여 추출구를 통하여 최하층에 모인 제1복합체를 추출함으로써 제1복합체를 유체로부터 분리할 수 있다. 이에 의하여 시료 중에 미량 존재하는 제1표적 물질을 분리, 농축(enrichment)할 수 있다.
제1농축부(200)는 제1복합체를 수용하는 제1회수 챔버(230)를 더 구비할 수 있다. 제1회수 챔버(230)는 제1회수 채널(431)에 의하여 분리 챔버(220)와 연결된다. 제1회수 채널(431)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제1회수 밸브(432)가 마련된다. 제1회수 밸브(432)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 또한, 제1회수 밸브(432)는 제1회수 채널(431)을 폐쇄한 상태에서 외부로부터 에너지를 공급받아 제1회수 채널(431)을 개방하고 다시 외부로부터 에너지를 공급받아 제1회수 채널(431)을 폐쇄하는 소위 개폐형 밸브(open-close valve)일 수 있다. 제1회수 챔버(230)는 회전중심(RC)을 기준으로 하여 반경 방향으로 분리 챔버(220)의 외측에 배치된다. 분리 챔버(220)에서 제1복합체는 최하층에 모이며, 제1회수 밸브(432)에 의하여 제1회수 채널(431)이 개방되면 원심력에 의하여 제1복합체는 제1회수 챔버(230)로 유입된다. 예를 들어 피펫 등을 이용하여 추출구(미도시)를 통하여 제1회수 챔버(230)에 모인 제1복합체를 추출함으로써 제1복합체를 유체로부터 분리할 수 있다. 제1회수 밸브(432)가 개폐형 밸브인 경우 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 회수하기 전에 제1회수 채널(431)을 폐쇄할 수도 있다.
제1농축부(200)는 제1웨이스트 챔버(240)를 더 구비할 수 있다. 제1웨이스트 챔버(240)는 제1배출 채널(433)에 의하여 분리 챔버(220)와 연결될 수 있다. 제1배출 채널(433)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제1배출 밸브(434)가 마련된다. 제1배출 밸브(434)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 제1배출 채널(433)은 분리 챔버(220) 내의 분리된 층들 중에서 제1복합체를 포함하는 최하층의 위쪽에 위치되는 밀도구배물질을 포함하는 상층 물질을 배출하기 위한 것이다. 그러므로, 제1배출 채널(433)은 제1회수 채널(431)보다 회전중심(RC)에 더 가까운 위치에서 분리 챔버(220)와 연결된다. 이와 같은 구성에 의하여, 분리 챔버(220)의 최하층에 모인 제1복합체를 제외한 상층물질을 제1배출 채널(433)을 통하여 제1웨이스트 챔버(240)로 배출하고, 그 후에 제1회수 채널(431)을 개방함으로써 제1복합체를 제1회수 챔버(230)로 회수할 수 있다.
도 3을 참조하면, 제1농축부(200)는 제1세척액 챔버(250)를 더 구비할 수 있다. 제1세척액 챔버(250)에는 제1세척액이 수용된다. 제1세척액은 제1복합체를 제1회수 챔버(230)로 회수하기 전에 제1복합체의 순도를 높이기 위한 것이다. 제1세척액 챔버(250)는 제1세척 채널(441)에 의하여 분리 챔버(220)와 연결된다. 제1세척 채널(441)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제1세척 밸브(442)가 배치된다. 제1세척 밸브(442)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 이 경우, 제1배출 채널(433)은 분리 챔버(220)와 제1웨이스트 챔버(240)를 연결하는 제1연결 채널(451)과, 제1연결 채널(451)로부터 분기되어 제1웨이스트 챔버(240)와 연결된 제2연결 채널(461)을 포함할 수 있다. 제1연결 채널(451)에는 밸브(452)(453)가 각각 마련된다. 분리 챔버(220)에 더 가까운 밸브(452)는 폐쇄된 밸브이며, 분리 챔버(220)로부터 먼 밸브(453)는 제1연결 채널(451)을 개방한 상태에서 외부로부터 에너지를 공급받아 제1연결 채널(451)을 폐쇄하는 소위 열린 밸브(normally open valve)일 수 있다. 제2연결 채널(461)은 밸브(452)(453) 사이에서 제1연결 채널(451)로부터 분기된다. 제2연결 채널(461)에는 밸브(462)가 마련된다. 밸브(462)는 폐쇄된 밸브이다.
이와 같은 구성에 의하여, 밀도 구배에 의하여 제1복합체가 분리 챔버(220)의 최하층부에 모이면, 먼저 밸브(452)를 이용하여 제1연결 채널(451)을 개방하여 밀도구배물질 등 제1복합체의 상층물질을 제1연결 채널(451)을 통하여 제1웨이스트 챔버(240)로 배출한다. 그런 후, 밸브(453)를 이용하여 제1연결 채널(451)을 폐쇄한다. 다음으로, 제1세척 밸브(442)를 이용하여 제1세척 채널(441)을 개방하고, 제1세척액을 분리 챔버(220)로 공급한다. 세척완료 후에 밸브(462)를 이용하여 제2연결 채널(461)을 개방하여 제1세척액 등 제1복합체의 상층물질을 제2연결 채널(461)을 통하여 제1웨이스트 챔버(240)로 배출한다. 그런 다음, 분리 챔버(220)로부터 제1복합체를 직접 회수하거나, 제1복합체를 제1회수 챔버(230)로 이동시킨 후에 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 회수할 수 있다. 이에 의하여 순도 높은 제1복합체를 얻을 수 있다. 2회 이상의 세척 과정을 거치기 위하여는, 도 3에 도시되지는 않았지만, 각각 폐쇄된 밸브가 배치된 2 이상의 제1세척액 채널에 의하여 제1세척액 챔버(250)와 분리 챔버(220)이 연결되고, 각각 폐쇄된 밸브와 닫힘 밸브가 배치된 2 이상의 연결 채널에 의하여 분리 챔버(220)와 제1웨이스트 챔버(240)가 연결될 수 있다. 제1세척 채널들과 연결 채널들을 순차로 개방함으로써 2회 이상의 세척이 가능하다.
[제2농축부]
도 2를 참조하면, 제2농축부(300)는 시료 챔버(100)로부터 제2표적 물질을 포함하는 제2유체층을 받아, 이로부터 제2표적 물질을 분리한다. 제2농축부(300)는 제2표적 물질에 제2미세 입자를 부착시켜 제2표적 물질-제2미세 입자 복합체(complex), 즉 제2복합체를 형성함으로써 유체로부터 제2복합체를 분리한다. 이를 위하여, 제2농축부(300)는 제2미세 입자가 수용되는 제2입자 챔버(310)를 구비한다.
제2미세 입자에는 제2표적 물질의 표면 마커에 특이적인 리간드가 하나 이상 결합되어 있다. 제2미세 입자는 제2표적 물질과 결합함으로써 제2표적 물질의 밀도를 증가시키기 위한 것이다. 제2미세 입자는 유체 내의 제2표적 물질과 그 이외의 다른 물질 사이의 밀도 차이를 유발할 수 있을 정도의 밀도 값을 가질 수 있다. 예를 들어, 혈장으로부터 miRNA를 분리하고자 하는 경우에는 혈장 및 그에 포함될 수 있는 다른 물질들의 밀도를 고려하여 적절한 밀도를 갖는 제2미세 입자가 선택될 수 있다. 제2미세 입자는 제1미세 입자와 마찬가지로 예를 들어, 폴리스티렌 입자, 폴리메틸메타아크릴레이트 입자, 라텍스 입자, ABS(아크릴로 니트릴, 부타디엔 및 스티렌의 테르트-폴리머)입자, 시클릭 올레핀 공중합체 입자, 멜아민 입자 및 이들의 복합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제2미세 입자는 자성입자 또는 비자성입자일 수 있다.
제2 표적 물질은 혈장층에 존재하는 물질일 수 있다. 제2 표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA, DNA, 지질입자 또는 이들의 조합일 수 있다. 표면 마커는 미세소포체에 존재하는 당, 단배질, 지질 또는 이들의 조합일 수 있다. 표면 마커는 예를 들어 CD9, CD63, CD81, CD82, CD83, Fas Ligand, HER2, EGFR, EpCAM 또는 이들의 조합일 수 있다.
제2입자 챔버(310)는 제2시료 채널(511)에 의하여 시료 챔버(100)와 연결된다. 제2시료 채널(511)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제2시료 밸브(512)가 마련된다. 제2시료 밸브(512)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 제2입자 챔버(310) 내에서 제2표적 물질과 제2미세 입자가 서로 접촉되며, 제2미세 입자가 제1표적 물질에 부착됨으로써 제2표적 물질-제2미세 입자 복합체(제2복합체)가 형성된다. 제2입자 챔버(310)에는 제2미세 입자를 주입하기 위한 주입구(미도시)가 마련될 수 있다. 미세유동장치(1)가 특정 용도 전용인 경우에는 용도에 맞는 제2미세 입자가 미리 제2입자 챔버(310)에 수용된 상태에서 미세유동장치(1)가 제조될 수도 있다.
제2농축부(300)는 제2복합체를 수용하는 제2회수 챔버(320)를 더 구비할 수 있다. 제2회수 챔버(320)는 제2회수 채널(521)에 의하여 제2입자 챔버(310)와 연결된다. 제2회수 채널(521)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제2회수 밸브(522)가 마련된다. 제2회수 밸브(522)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 또한, 제2회수 밸브(522)는 개폐형 밸브(open-close valve)일 수도 있다. 제2회수 챔버(320)는 회전중심(RC)을 기준으로 하여 반경 방향으로 제2입자 챔버(310)의 외측에 배치된다. 제2입자 챔버(310)에서 제2복합체는 최하층에 모이며, 제2회수 밸브(522)에 의하여 제2회수 채널(521)이 개방되면 원심력에 의하여 제2복합체는 제2회수 챔버(320)로 유입된다. 예를 들어 피펫 등을 이용하여 추출구(미도시)를 통하여 제2회수 챔버(320)에 모인 제2복합체를 추출함으로써 제2복합체를 유체로부터 분리할 수 있다. 제2회수 밸브(522)가 개폐형 밸브인 경우 제2회수 챔버(320)로부터 제2복합체를 회수하기 전에 제2회수 채널(521)을 폐쇄할 수도 있다.
제2농축부(300)는 제2웨이스트 챔버(330)를 더 구비할 수 있다. 제2웨이스트 챔버(330)는 제2배출 채널(531)에 의하여 제2입자 챔버(310)와 연결될 수 있다. 제2배출 채널(531)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제2배출 밸브(532)가 마련된다. 제2배출 밸브(532)는 폐쇄된 밸브일 수 있다. 제2배출 채널(531)은 제2입자 챔버(310) 내의 분리된 층들 중에서 제2복합체를 포함하는 최하층의 위쪽에 위치되는 유체를 배출하기 위한 것이다. 그러므로, 제2배출 채널(531)은 제2회수 채널(521)보다 회전중심(RC)에 더 가까운 위치에서 제2입자 챔버(310)와 연결된다. 이와 같은 구성에 의하여, 제2입자 챔버(310)의 최하층에 모인 제2복합체를 제외한 상층물질을 제2배출 채널(531)을 통하여 제2웨이스트 챔버(330)로 배출하고, 그 후에 제2회수 채널(521)을 개방함으로써 제2복합체를 제2회수 챔버(320)로 회수할 수 있다.
도 3을 참조하면, 제2농축부(300)는 제2세척액 챔버(340)를 더 구비할 수 있다. 제2세척액 챔버(340)에는 제2세척액이 수용된다. 제2세척액은 제2복합체를 제2회수 챔버(320)로 회수하기 전에 제2복합체의 순도를 높이기 위한 것이다. 제2세척액 챔버(340)는 제2세척 채널(541)에 의하여 제2입자 챔버(310)와 연결된다. 제2세척 채널(541)에는 그를 통한 유체의 흐름을 제어하기 위한 제2세척 밸브(542)가 배치된다. 제2세척 밸브(542)는 폐쇄된 일 수 있다. 이 경우, 제2배출 채널(531)은 제2입자 챔버(310)와 제2웨이스트 챔버(330)를 연결하는 제1연결 채널(551)과, 제1연결 채널(551)로부터 분기되어 제2웨이스트 챔버(330)와 연결된 제2연결 채널(561)을 포함할 수 있다. 제1연결 채널(551)에는 밸브(552)(553)가 각각 마련된다. 제2입자 챔버(310)에 더 가까운 밸브(552)는 폐쇄된 밸브이며, 제2입자 챔버(310)로부터 먼 밸브(553)는 열린 밸브일 수 있다. 제2연결 채널(561)은 밸브(552)(553) 사이에서 제1연결 채널(561)로부터 분기된다. 제2연결 채널(561)에는 밸브(562)가 마련된다. 밸브(562)는 폐쇄된 밸브이다.
이와 같은 구성에 의하여, 밀도 구배에 의하여 제2복합체가 제2입자 챔버(310)의 최하층부에 모이면, 먼저 밸브(552)를 이용하여 제1연결 채널(551)을 개방하여 상층 유체 등 제2복합체의 상층물질을 제1연결 채널(551)을 통하여 제2웨이스트 챔버(330)로 배출한다. 그런 후, 밸브(553)를 이용하여 제1연결 채널(551)을 폐쇄한다. 다음으로, 제2세척 밸브(542)를 이용하여 제2세척 채널(541)을 개방하고, 제2세척액을 제2입자 챔버(310)로 공급한다. 세척완료 후에 밸브(562)를 이용하여 제2연결 채널(561)을 개방하여 제2세척액 등 제2복합체의 상층물질을 제2연결 채널(561)을 통하여 제2웨이스트 챔버(330)로 배출한다. 그런 다음, 제2복합체를 제2회수 챔버(320)로 이동시킨 후에 제2회수 챔버(320)로부터 제2복합체를 회수할 수 있다. 이에 의하여 순도 높은 제1복합체를 얻을 수 있다.
2회 이상의 세척 과정을 거치기 위하여는, 각각 폐쇄된 밸브가 배치된 2 이상의 제2세척액 채널에 의하여 제2세척액 챔버(340)와 제2입자 챔버(310)가 연결되고, 각각 폐쇄된 밸브와 닫힘 밸브가 배치된 2 이상의 연결 채널에 의하여 제2입자 챔버(310)와 제2웨이스트 챔버(330)가 연결될 수 있다. 제2세척채널들과 연결 채널들을 순차로 개방함으로써 2회 이상의 세척이 가능하다. 일 예로서, 도 3에는 회전 중심(RC)을 기준으로 하여 서로 다른 위치에서 제2세척액 챔버(340)와 제2입자 챔버(310)를 연결하는 세 개의 제2세척액 채널(541)이 도시되어 있다. 또한, 제2입자 챔버(310)와 제2웨이스트 챔버(330)는 두 쌍의 제1, 제2연결 채널(551)(561)에 의하여 연결되어 있다. 세척을 위하여는 반경 방향으로 회전 중심(RC)에 가장 가까운 제2세척 채널(541)부터 순차로 개방한다. 이와 같은 구성에 의하면, 상층유체의 배출 후에 3회의 세척이 가능하다.
도 2 및 도 3에 도시된 미세유동장치(1)에서, 시료 챔버(100) 내의 시료를 밀도구배에 의하여 복수의 층으로 원심분리한 후에 제1표적 물질이 포함된 제1유체층과 제2표적 물질이 포함된 제2유체층을 제1, 제2입자 챔버(210)(310)로 공급하기 위하여는, 미세유동장치(1)의 회전을 정지시킨 후에 제1, 제2시료 밸브(412)(512)에 에너지를 공급하여 제1, 제2시료 채널(411)(511)을 개방할 필요가 있다. 이 과정에서 미세유동장치(1)가 회전되지 않으므로 시료 챔버(100) 내의 시료에는 원심력이 작용되지 않으며, 시간이 경과됨에 따라서 시료 내의 분자 운동에 의하여 복수의 층이 서서히 교란될 가능성이 있다. 복수의 층의 교란은 제1, 제2표적 물질의 분리 효율을 저하시키는 요인이 될 수 있다. 이와 같은 원심 분리 후의 층 교란 가능성을 줄이기 위하여, 도 2와 도 3에 도시된 바와 같이 시료 챔버(100)에는 격벽(600)이 마련된다.
도 4는 도 2 및 도 3의 A-A' 단면도이다. 도 4를 보면, 격벽(600)은 시료 챔버(100) 내에서 시료의 반경 방향의 흐름을 부분적으로 제한한다. 격벽(600)은 시료 챔버(100)의 하부벽(1002)으로부터 상부벽(1001)을 향하여 연장될 수 있다. 격벽(600)은 시료 챔버(100)의 원주 방향의 전체 폭 중에서 일부에 형성될 수 있다. 물론, 도면으로 도시되지는 않았지만, 격벽(600)은 시료 챔버(100)의 원주 방향의 전체 폭에 걸쳐 형성될 수도 있다. 격벽(600)에 의하여 시료 챔버(100)는 반경 방향으로 회전중심(RC)에 가까운 내측 영역(111)과 회전중심(RC)으로부터 먼 외측 영역(112)으로 구분된다. 격벽(600)은 상부벽(1001)과의 사이에 병목부(601)를 형성한다. 병목부(601)에 의하여 내측 영역(111)과 외측 영역(112)이 서로 연결된다. 도면으로 도시되지는 않았지만, 격벽(600)은 시료 챔버(100)의 상부벽(1001)으로부터 하부벽(1002)을 향하여 연장되어 하부벽(1002)과의 사이에 병목부(601)를 형성할 수도 있다.
시료의 원심 분리 과정에서는 원심력에 의하여 병목부(601)를 가로질러 시료가 내측 영역(111)과 외측 영역(112)으로 이동되어 시료 챔버(100) 내에는 밀도 구배에 의한 복수의 층이 형성될 수 있다. 미세유동장치(1)가 정지되어 원심력이 제거된 상태에서는 병목부(601)로 인하여 내측 영역(111)과 외측 영역(112) 사이의 시료의 이동이 제한된다. 즉, 시료 챔버(100) 내에서 반경방향으로의 유체의 흐름이 격벽(600)에 의하여 제한되어 원심 분리된 층들의 교란 가능성을 줄일 수 있다. 병목부(601)의 간격(G1)(G2), 즉 병목부(601)와 상부벽(1001) 사이의 간격은 병목부(601)를 통하여 유체의 이동이 가능하도록 모세관 현상을 유발하는 간격보다는 크다. 병목부(601)에서 모세관 현상이 발생되면 병목부(601)가 막혀서 원심분리 과정에서의 유체의 이동이 원활하지 않기 때문이다. 본 실시예에 따르면, 병목부(601)의 간격 간격(G1)(G2)이 모세관 현상을 유발하는 간격보다 크므로 원심 분리 과정에서는 원심력에 의하여 내측 영역(111)에서 외측 영역(112)으로의 유체의 이동이 원활하게 일어나며, 원심 분리 후에는 좁은 간격 간격(G1)(G2)으로 인하여 내측 영역(111)과 외측 영역(112) 사이의 유체의 이동이 부분적으로 제한될 수 있다.
원심 분리 과정에서는 내측 영역(111)으로부터 외측 영역(112)으로의 시료의 이동을 원활하게 할 필요가 있다. 이를 위하여, 격벽(600)은 병목부(601)가 시료 챔버(100)의 내측으로부터 외측으로 갈수록 좁아지게 형성될 수 있다. 즉, 병목부(601)에 의하여 형성되는 유체 통로는 내측 간격(G1)이 외측 간격(G2)보다 넓게 형성될 수 있다. 원심분리과정에서 원심력에 의하여 시료는 내측(111)에서 외측(112)으로 흐르게 되는데, 넓은 내측 간격(G1)을 통하여 병목부(601)를 이용하게 통과하여 외측 영역(112)으로 이동될 수 있다. 반면에, 정지 상태에서는 원심력이 없으므로 좁은 외측 간격(G2)으로 인하여 시료가 병목부(601)를 잘 통과하지 못한다. 따라서, 원심분리과정에서 내측 영역(111)으로부터 외측 영역(112)으로의 시료의 흐름을 비교적 원활하게 할 수 있으며, 정지 상태에서 그 반대 방향으로의 시료의 흐름은 제한할 수 있다. 병목부(601)를 형성하기 위한 격벽의 단면 형상은 도 12에 도시된 바와 같이 꼭지(apex, 604)를 가지는 삼각형 형상일 수 있다. 이 경우, 외측 영역(112) 측의 빗변(606)의 경사각도(A2)는 내측 영역(111)측의 빗변(605)의 경사 각도(A2)보다 크다. 이와 같은 구성에 의하면, 외측 영역(112)으로부터 내측 영역(111)으로의 시료의 흐름을 더 용이하게 제한할 수 있다. 또한, 빗변(605)과 내측 영역(111)의 바닥면(113)과의 사이에 단차가 없도록 함으로써, 원심 분리시에 내측 영역(111)으로부터 외측 영역(112)으로의 시료의 흐름을 더 원활하게 할 수 있다.
도 4에서는 격벽(600)의 단면 형상이 삼각형인 경우에 대하여 설명하였으나, 이에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 도 5에 도시된 바와 같이 격벽(600)의 단면 형상은 빗변(605)(606) 및 상부벽(1001)과 나란한 상부변(607)을 구비하는 사다리꼴 형상일 수도 있다. 이외에도 격벽(600)의 단면 형상은 다양할 수 있으나, 어느 경우에도 병목부(601)의 최소 간격은 모세관 현상을 유발하는 간격보다는 크다.
예를 들어, 혈액을 시료 챔버(100) 내에서 원심분리하는 경우 시료 챔버(100)의 내측으로부터 외측으로 혈장층, 백혈구층, 적혈구층의 순서로 원심분리된다. 제1표적 물질, 예를 들어 혈중 암세포는 백혈구층에 위치되며, 제2표적 물질, 예를 들어 miRNA는 혈장층에 위치된다. 격벽(600)은 혈장층과 백혈구층 사이에 위치될 수 있다. 즉 격벽(600)은 혈장층이 내측 영역(111)에, 백혈구층과 적혈구층이 외측 영역(112)에 위치되도록 시료 챔버(100)를 구분할 수 있다. 나아가서, 격벽(410)의 외측 영역(112) 측의 빗변(606)이 혈장층과 백혈구층 사이에 위치되도록 형성될 수 있다. 이에 의하여, 원심 분리 후 혈중 암세포와 제1미세 입자와의 결합을 저해하는 단백질이 포함된 혈장층과 혈중 암세포가 포함된 층의 혼합 가능성을 줄일 수 있다.
도 6에는 시료의 반경 방향의 이동을 제한하기 위한 격벽구조의 다른 예가 도시되어 있다. 도 6을 참조하면, 시료 챔버(100)의 원주 방향으로 복수의 격벽(610)이 서로 이격되게 배치되어 복수의 격벽(610) 사이에 하나 이상의 개구(620)가 형성된다. 개구(620)의 폭은 예를 들어 약 200㎛ 내지 1㎝ 정도일 수 있다. 복수의 격벽(610)은 그 길이가 동일할 수도 있으며, 복수의 격벽(610) 중 적어도 하나는 나머지와 길이가 다를 수 있다. 복수의 격벽(610)은 예를 들어 하부벽(1002)으로부터 상부벽(1001)을 향하여 연장되어 형성될 수 있다. 이에 의하여 시료 챔버(100)는 반경 방향으로 회전중심(RC)에 가까운 내측 영역(111)과 회전중심(RC)으로부터 먼 외측 영역(112)으로 구분된다. 개구(620)에 의하여 내측 영역(111)과 외측 영역(112)이 서로 연결된다. 도 6에 도시된 바와 같이 개구(620)는 시료 챔버(100)의 내측으로부터 외측으로 갈수록 좁아지게 형성될 수 있다. 이에 의하여, 내측 영역(111)으로부터 외측 영역(112)으로의 시료의 흐름을 비교적 원활하게 할 수 있으며, 그 반대 방향으로의 시료의 흐름은 제한할 수 있다. 나아가서, 복수의 격벽(610) 중 적어도 하나는 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 상부벽(1001)과의 사이에 병목부(601)를 형성할 수 있다. 도면으로 도시되지는 않았지만, 복수의 격벽(410)은 시료 챔버(100)의 상부벽(1001)으로부터 하부벽(1002)을 향하여 연장될 수도 있다.
도 7a와 도 7b는 폐쇄된 밸브(normally closed valve)의 일 실시예를 도시한 단면도이다. 폐쇄된 밸브는 상온에서 고체 상태인 밸브 물질(V1)을 포함할 수 있다. 밸브물질(V1)은 고화된 상태로 채널(C)에 존재함으로써 도 7a에 도시된 바와 같이 채널(C)을 차단한다. 밸브물질(V1)은 고온에서 용융되어 채널(C) 내의 공간으로 이동하며, 도 7b에 도시된 바와 같이 채널(C)을 개방한 채로 다시 응고된다. 외부에서 조사되는 에너지는 예를 들면 전자기파일 수 있으며, 에너지원은 레이저 빔을 조사하는 레이저 광원이거나, 가시광선 또는 적외선을 조사하는 발광소자(light emitting diode) 또는 제논램프(Xenon)일 수 있다. 레이저 광원인 경우 적어도 하나의 레이저 다이오드(laser diode)를 포함할 수 있다. 외부에너지원은 밸브 물질(V1)에 포함된 발열 입자가 흡수할 수 있는 전자기파의 파장에 따라 선택될 수 있다. 밸브물질(V1)로서는 COC(cyclic olefin copolymer), PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PFA(perfluoralkoxy), PVC(polyvinylchloride), PP(polypropylene), PET(polyethylene terephthalate), PEEK(polyetheretherketone), PA(polyamide), PSU(polysulfone), 및 PVDF(polyvinylidene fluoride) 등의 열 가소성 수지가 채용될 수 있다. 또, 밸브물질(V1)로서, 상온에서 고체 상태인 상전이 물질이 채용될 수 있다. 상전이 물질은 왁스(wax)일 수 있다. 왁스는 가열되면 용융하여 액체 상태로 변하며, 부피 팽창한다. 왁스로는, 예컨대 파라핀 왁스(paraffin wax), 마이크로크리스탈린 왁스(microcrystalline wax), 합성 왁스(synthetic wax), 또는 천연 왁스(natural wax) 등이 채용될 수 있다. 상전이 물질은 겔(gel) 또는 열가소성 수지일 수도 있다. 겔로는, 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 폴리아크릴레이트(polyacrylates), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylates), 또는 폴리비닐아미드(polyvinylamides) 등이 채용될 수 있다. 밸브 물질(V1)에는 전자기파 에너지를 흡수하여 발열하는 다수의 미세 발열입자가 분산될 수 있다. 미세 발열입자는 대략 0.1 mm 깊이와 1 mm 폭을 갖는 미세한 채널(C)을 자유롭게 통과할 수 있게 1 nm 내지 100 ㎛ 의 직경을 가질 수 있다. 미세 발열입자는 예컨대 레이저광 등에 의하여 전자기파 에너지가 공급되면 온도가 급격히 상승하여 발열하는 성질을 가지며, 왁스에 고르게 분산되는 성질을 갖는다. 이러한 성질을 갖도록 미세 발열입자는 금속 성분을 포함하는 코어(core)와, 소수성(疏水性) 표면 구조를 가질 수 있다. 예컨대, 미세 발열입자는 Fe로 이루어진 코어와, Fe에 결합되어 Fe를 감싸는 복수의 계면활성성분(surfactant)을 구비한 분자구조를 가질 수 있다. 미세 발열입자들은 캐리어 오일(carrrier oil)에 분산된 상태로 보관될 수 있다. 소수성 표면구조를 갖는 미세 발열입자가 고르게 분산될 수 있도록 캐리어 오일도 소수성일 수 있다. 용융된 상전이 물질에 미세 발열입자들이 분산된 캐리어 오일을 부어 혼합하고, 이 혼합물질을 채널(C)에 주입하고 응고시킴으로써 채널(C)을 막을 수 있다. 미세 발열입자는 위에서 예로 든 중합체(polymer) 입자에 한정되는 것은 아니며, 퀀텀 도트(quantum dot) 또는 자성비드(magnetic bead)의 형태도 가능하다. 또한, 미세 발열입자는 예컨대, Al2O3, TiO2, Ta2O3, Fe2O3, Fe3O4 또는, HfO2 와 같은 미세 금속 산화물일 수 있다. 한편, 폐쇄된 밸브는 미세 발열입자를 반드시 포함하여야 하는 것은 아니며, 미세 발열입자 없이 상전이 물질만으로 이루어질 수도 있다.
도 8a와 8b는 열린 밸브의 일 예를 보이는 단면도이다. 열린 밸브는 채널(C)과, 채널(C)로부터 채널(C)의 폭방향으로 연장된 밸브챔버(VC), 및 밸브챔버(VC) 내에 충전되는 밸브물질(V1)을 포함한다. 도 8a에 도시된 바와 같이 외부 에너지가 공급되기 전에는 밸브물질(V1)이 밸브챔버(VC) 내에 존재하기 때문에 채널(C)은 개방된 상태로 유지된다. 그러다가. 밸브물질(V1)에 외부에너지가 공급되면, 밸브물질(V1)이 용융, 팽창하면서 채널(C)로 유입되고 다시 응고되면서 채널(C)을 통한 유체의 흐름을 차단한다.
도 9a 내지 도 9c는 개폐형 밸브(open/close valve)의 일 예를 보여주는 단면도이다. 도 9a를 참조하면, 개폐형 밸브는 채널(C)과, 채널(C)의 상부에 위치되는 밸브챔버(VC), 밸브챔버(VC) 내에 충전되는 밸브물질(V1), 및 채널(C) 내부의 밸브챔버(VC)의 아래쪽에 밸브챔버(VC)와 부분적으로 어긋나게 돌출된 단차부(VS)를 포함할 수 있다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 외부 에너지가 공급되기 전에는 밸브물질(V1)이 밸브챔버(VC) 내에 존재하기 때문에 채널(C)은 개방된 상태로 유지된다. 밸브물질(V1)에 외부에너지가 공급되면, 밸브물질(V1)이 용융, 팽창하면서 단차부(VS)로 유입되고 다시 응고되면서 도 9b에 도시된 바와 같이 채널(C)을 통한 유체의 흐름을 차단한다. 다시 더 강한 외부 에너지가 응고된 밸브물질(V1)에 공급되면 단차부(VS)의 밸브물질(V1)이 재용융되면서 유동성이 생긴다. 밸브물질(V1)은 단차부(VS)를 벗어나서 채널(C)로 흘러들어간다. 이에 의하여, 도 9c에 도시된 바와 같이 채널(C)은 다시 개방된다.
<실시예>
미세유동장치(1)를 이용한 표적 물질 농축 방법의 실시예를 설명한다. 본 실시예에서는 시료로서 혈액을 사용하며, 혈액 중에 포함된 혈중 암세포와 miRNA를 분리한다.
[준비]: 제1, 제2표적 물질로서, 혈중 암세포와 miRNA가 포함된 혈액을 시료 챔버(100)에 주입한다. 제1, 제2표적 물질과 특이적으로 결합하는 제1, 제2미세 입자를 각각 제1, 제2입자 챔버(210)(310)에 주입한다. 본 실시예에서는 제1미세 입자를 혈중 암세포와 결합시켜, 백혈구와 밀도 차이를 유발함으로써, 혈액 내에서 암세포만을 분리한다. 제1미세 입자는 예를 들어 멜아민 입자로서 그 밀도는 예를 들어 약 1.57 g/cm3정도로서 혈액에 존재하는 생물학적 입자들의 밀도 약 1.05~1.1g/cm3 보다 크다. 제2미세 입자는 혈장과 miRNA와의 침강속도 차이를 유발하는 것으로서, 밀도차를 유발할 수 있는 밀도를 가질 수 있다. 제2미세 입자의 표면에는 miRNA에 결합할 수 있는 물질, 예를 들어 miRNA에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드, 또는 miRNA에 전기적 결합에 의하여 결합할 수 있는 물질이 고정되어 있다. 또, 적절히 선정된 밀도구배물질을 주입분리 챔버(220)에 주입한다. 필요에 따라서 제1, 제2세척액 챔버(250)(340)에 제1, 제2세척액을 각각 주입한다. 제1, 제2세척액은 Tween20, Triton X-100, DMSO 또는 이들의 조합을 포함하는 버퍼, PBS 또는 이들의 조합일 수 있다.
[혈액의 원심 분리]: 미세유동장치(1)를 회전 구동부(510)에 장착한 후 예를 들어 약 4000rpm으로 약 5분간 회전시킨다. 그러면, 시료 챔버(100) 내에서 혈액은 밀도차에 의하여 복수의 층으로 분리된다. 가장 무거운 적혈구를 포함하는 적혈구층이 반경 방향으로 가장 외측에 위치된다. 그 다음으로 내측으로 백혈구층과 혈장층이 위치된다. 백혈구와 혈중 암세포는 물리적인 성질이 유사하여 밀도 구배를 이용하는 원심 분리를 수행하게 되면 동일한 층에 분리가 된다. 혈구를 제외한 혈액 내의 단백질들은 대체로 혈구들에 비하여 가벼우므로 혈장층에 위치된다. 따라서, miRNA는 혈장층에 위치된다.
[혈장의 배출]: 미세유동장치(1)의 회전을 멈추고, 제2시료 밸브(512)에 전자기파 발생기(20)를 이용하여 전자기파, 예를 들어 레이저 빔을 조사하여 제2시료 채널(511)을 개방한다. 다시 미세유동장치(1)를 회전시키면 원심력에 의하여 혈장은 제2시료 채널(511)을 통하여 제2입자 챔버(310)로 이동된다. 이때, miRNA도 함께 제2입자 챔버(310)로 이동된다.
[백혈구층의 배출]: 미세유동장치(1)의 회전을 멈추고, 제1시료 밸브(412)에 전자기파 발생기(20)를 이용하여 전자기파, 예를 들어 레이저 빔을 조사하여 제1시료 채널(411)을 개방한다. 다시 미세유동장치(1)를 회전시키면 원심력에 의하여 백혈구층은 제1입자 챔버(210)로 이동된다. 이때, 혈중 암세포도 함께 제1입자 챔버(210)로 이동된다.
미세유동장치(1)의 회전이 정지된 상태에서 밸브를 개방하는 동안에 백혈구층과 혈장층과의 교란가능성은 격벽(600 또는 610)에 의하여 저하될 수 있다.
[제1복합체의 형성]: 미세유동장치(1)를 회전 구동부(510)에 장착한 후에 소정 시간, 예를 들어 약 1시간 정도 정/역회전을 반복하여 쉐이킹(shaking)과정을 수행하여 제1미세 입자와 혈중 암세포를 서로 접촉시킨다. 그러면, 제1미세 입자가 혈중 암세포에 부착되어, 제1입자 챔버(210) 내에서 제1복합체가 형성된다.
[밀도차 분리]: 전자기파 발생기(20)를 이용하여 분리 밸브(422)에 레이저 빔을 조사하여 분리 채널(421)을 개방한다. 그리고, 미세유동장치(1)를 회전시키면 원심력에 의하여 제1복합체를 포함한 유체가 분리 챔버(220)로 이동된다. 미세유동장치(1)를 예를 들어 약 4000rpm으로 약 10분간 회전시키면 제1복합체와 밀도구배물질의 밀도차에 의하여 제1복합체가 분리 챔버(220)의 최하층으로 이동된다.
[제1복합체의 회수]: 미세유동장치(1)의 회전을 멈추고, 도시되지 않은 추출구를 통하여 예를 들어 피펫 등을 이용하여 분리 챔버(220)로부터 제1복합체를 추출할 수 있다. 이에 의하여, 혈액으로부터 혈중 암세포를 분리, 농축할 수 있다.
제1회수 챔버(230)로 제1복합체를 이동시킬 수도 있다. 전자기파발생기(20)를 이용하여 제1회수 밸브(432)에 전자기파, 예를 들어 레이저 빔을 조사하여 제1회수 채널(431)을 개방한다. 미세유동장치(1)를 예를 들어 약 4000rpm으로 약 30초간 회전시켜 분리 챔버(220)에 수용된 유체 중에서 제1복합체를 제1회수 챔버(230)로 이동시킨다. 미세유동장치(1)의 회전을 멈추고, 도시되지 않은 추출구를 통하여 예를 들어 피펫 등을 이용하여 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 추출할 수 있다.
분리 챔버(220) 내의 제1복합체 이외의 물질을 제1웨이스트 챔버(240)로 빼낸 후에 제1복합체를 회수할 수도 있다. 예를 들어, 전자기파발생기(20)를 이용하여 제1배출 밸브(434)에 전자기파, 예를 들어 레이저 빔을 조사하여 제1배출 채널(433)을 개방한다. 미세유동장치(1)를 회전시켜 분리 챔버(220)에 수용된 유체 중에서 제1복합체의 상층부에 위치되는 밀도구배물질 및 다른 유체를 제1웨이스트 챔버(240)로 배출시킨다. 그런 다음, 미세유동장치(1)의 회전을 멈추고, 도시되지 않은 추출구를 통하여 예를 들어 피펫 등을 이용하여 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 추출할 수 있다. 나아가서, 제1복합체를 제1회수 챔버(230)로 이동시킨 후에 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 추출할 수도 있다.
도 3에 도시된 미세유동장치(1)를 이용하면 제1복합체를 회수하기 전에 세척과정이 수행될 수도 있다. [밀도차 분리]과정이 수행된 후에 밸브(452)를 작동시켜 제1연결 채널(451)을 개방하여 분리 챔버(220) 내의 상층 물질을 제1웨이스트 챔버(240)로 배출하고, 밸브(453)를 작동시켜 제1연결 채널(451)을 폐쇄한다. 그런 다음, 제1세척 밸브(442)를 작동시켜 제1세척 채널(441)을 개방한다. 미세유동장치(1)를 회전시켜 제1세척액 챔버(250)로부터 제1세척액을 분리 챔버(220)로 이송시킨다. 필요에 따라 쉐이킹 과정을 거친 후에 밸브(462)를 작동시켜 제2연결 채널(461)을 개방하고 제1세척액을 제1웨이스트 챔버(240)로 배출한다. 그런 다음, 분리 챔버(220)로부터 또는 제1회수 챔버(230)로부터 제1복합체를 회수한다.
[제2복합체의 형성]: 제1복합체를 형성하는 동안에 제2입자 챔버(310) 내에서는 제1미세 입자와 혈장은 이미 쉐이킹되어 있다. 추가적으로 예를 들어 약 1~3시간 정도 더 쉐이킹 과정을 수행할 수 있다. 이에 의하여, 제2미세 입자가 miRNA에 부착되어, 제2입자 챔버(310) 내에서 제2복합체가 형성되며, 제2복합체는 제2입자 챔버(310)의 최하층에 모인다.
[유체의 배출]: 전자기파발생기(20)를 이용하여 제2배출 밸브(532)에 전자기파, 예를 들어 레이저 빔을 조사하여 제2배출 채널(531)을 개방한다. 미세유동장치(1)를 회전시켜 제2입자 챔버(310)에 수용된 유체 중에서 제2복합체의 상층부에 위치되는 유체를 제2웨이스트 챔버(330)로 배출시킨다.
[제2복합체의 회수]: 그런 다음, 제2회수 밸브(522)를 작동시켜 제2회수 채널(521)을 개방하고, 제2복합체를 제2회수 챔버(320)로 이동시킨 후에 제2회수 챔버(320)로부터 제2복합체를 추출할 수 있다. 이에 의하여, 혈액으로부터 miRNA를 분리, 농축할 수 있다.
도 3에 도시된 미세유동장치(1)를 이용하면 제2복합체를 회수하기 전에 세척과정이 수행될 수도 있다. [제2복합체의 형성]과정이 수행된 후에 밸브(552)를 작동시켜 제1연결 채널(551)을 개방하여 제2입자 챔버(310) 내의 제2복합체의 상층 물질을 제2웨이스트 챔버(330)로 배출하고, 밸브(553)를 작동시켜 제1연결 채널(551)을 폐쇄한다. 그런 다음, 제2세척 밸브(542)를 작동시켜 제2세척 채널(541)을 개방한다. 미세유동장치(1)를 회전시켜 제2세척액 챔버(340)로부터 제2세척액을 분리 챔버(220)로 이송시킨다. 필요에 따라 쉐이킹 과정을 거친 후에 밸브(562)를 작동시켜 제2연결 채널(561)을 개방하고 세척액을 제2웨이스트 챔버(330)로 배출한다. 그런 다음, 제2회수 채널(521)을 개방하고, 제2복합체를 제2회수 챔버(320)로 이동시킨 후에 제2회수 챔버(320)로부터 제2복합체를 회수한다.
상술한 과정에 의하여 하나의 미세유동장치(1)를 이용하여 혈액의 혈구층으로부터 혈중 암세포를, 혈장측으로부터 miRNA를 분리, 농축할 수 있다.
상기한 설명에서 많은 사항이 구체적으로 기재되어 있으나, 그들은 발명의 범위를 한정하는 것이라기보다, 실시 가능한 구성의 예시로서 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 의하여 정하여 질 것이 아니라 특허 청구범위에 기재된 기술적 사상에 의해 정하여져야 한다.
1...미세유동장치 10...회전 구동부
20...전자기파 발생기 30...제어부
100...시료 챔버 200...제1농축부
210, 310...제1, 제2입자 챔버 220...분리 챔버
230, 3209...제1회수챔버 240, 330...제1, 제2웨이스트 챔버
250, 340...제1,, 제2세척액 챔버 411, 511...제1, 제2시료 채널
412, 512...제1, 제2시료 밸브 421...분리 채널
422...분리 밸브 431, 521...제1, 제2회수 채널
432, 522...제1, 제2회수 밸브 433, 531...제1배출채널
434, 532...제1배출 밸브 441, 541...제1, 제2세척 채널
442, 542...제1, 제2세척 밸브 451, 551...제1연결 채널
461, 561...제2연결 채널 500...장착부
600, 610...격벽 601...병목부
620...개구 RC...회전 중심

Claims (20)

  1. 회전 구동부에 장착되어 원심력에 의하여 유체의 흐름을 유발하는 미세유동 장치로서,
    생물학적 시료가 수용되며, 그 내부에서 원심력에 의하여 상기 시료가 제1표적 물질을 포함하는 제1유체층과 제2표적 물질을 포함하는 제2유체층으로 분리되는 시료 챔버;
    상기 시료 챔버로부터 상기 제1유체층을 전달받아 제1미세 입자와 상기 제1표적 물질이 결합된 제1복합체를 형성하고, 상기 제1복합체보다 밀도가 낮은 밀도구배물질과의 밀도차에 의하여 상기 제1복합체를 상기 제1유체층으로부터 분리하는 제1농축부;
    상기 시료 챔버로부터 상기 제2유체층을 전달받아 제2미세 입자와 상기 제2표적 물질이 결합된 제2복합체를 형성하고, 상기 제2유체층과 상기 제2복합체와의 밀도차에 의하여 상기 제2복합체를 상기 제2유체층으로부터 분리하는 제2농축부;를 포함하는 미세유동장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1농축부는,
    상기 제1미세 입자를 수용하는 것으로서 제1시료 채널에 의하여 상기 시료 챔버와 연결되고, 상기 제1복합체가 형성되는 제1입자 챔버;
    상기 밀도구배물질을 수용하는 것으로서 분리 채널에 의하여 상기 제1입자 챔버와 연결되고, 밀도차에 의하여 상기 제1복합체가 상기 미세유동장치의 회전 중심을 기준으로 하여 최하층부에 위치되는 분리 챔버;
    제1회수 채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결되어 상기 제1회수 채널을 통하여 상기 제1복합체가 회수되는 제1회수 챔버;를 포함하는 미세유동장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1농축부는,
    상기 분리 챔버와 제1배출채널에 의하여 연결되어, 상기 제1배출채널을 통하여 상기 제1복합체의 상층물질이 배출되는 제1웨이스트 챔버;를 더 포함하는 미세유동장치.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제1농축부는,
    제1세척액이 수용되며, 제1세척 채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결된 제1세척액 챔버;
    순차로 개폐되는 다수의 연결채널에 의하여 상기 분리 챔버와 연결되어 상기 제1복합체의 상층물질 및 상기 제1세척액이 배출되는 제1웨이스트 챔버;를 더 포함하는 미세유동장치.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제2농축부는,
    상기 제2미세 입자를 수용하는 것으로서 제2시료 채널에 의하여 상기 시료 챔버와 연결되고, 상기 제2복합체가 형성되어 상기 미세유동장치의 회전 중심을 기준으로 하여 최하층부에 위치되는 제2입자 챔버;
    제2회수 채널에 의하여 상기 제2입자 챔버와 연결되어 상기 제2회수 채널을 통하여 상기 제2복합체가 회수되는 제2회수 챔버;를 포함하는 미세유동장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제2농축부는,
    상기 제2입자 챔버와 제2배출채널에 의하여 연결되어, 상기 제2배출채널을 통하여 상기 제2복합체의 상층물질이 배출되는 제2웨이스트 챔버;를 더 포함하는 미세유동장치.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2농축부는,
    제2세척액이 수용되며, 제2세척 채널에 의하여 상기 제2입자 챔버와 연결된 제2세척액 챔버;
    순차로 개폐되는 다수의 연결채널에 의하여 상기 제2 입자 챔버와 연결되어 상기 제2복합체의 상층물질 및 상기 제2세척액이 배출되는 제2웨이스트 챔버;를 더 포함하는 미세유동장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 혈액이며,
    상기 제1유체층은 백혈구층이며,
    상기 제2유체층은 혈장층인 미세유동장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1표적 물질은 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)인 미세유동장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA(miRNA), DNA , 또는 미세 지질 입자(sub-micron sized lipid particle)인 미세유동장치.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료 챔버 내에는 그 상부벽과 하부벽 중 적어도 하나와의 사이에 병목부를 형성하여 시료의 반경 방향의 흐름을 부분적으로 제한하는 격벽이 마련되며,
    상기 병목부와 상기 상부벽과 하부벽 중 적어도 하나와의 간격은 모세관 현상을 유발하는 간격보다 큰 미세 유동 장치.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 격벽은 상기 반경 방향으로 상기 시료 챔버의 내측으로부터 외측으로 갈수록 상기 병목부가 점차 좁아지는 형상인 미세유동장치.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 시료 챔버의 원주 방향으로 복수의 상기 격벽이 반복 배치되어 상기 복수의 격벽 사이에 개구가 형성된 미세유동장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 개구는 상기 반경 방향으로 내측으로부터 외측으로 갈수록 점차 좁아지는 미세유동장치.
  15. 원심력에 의하여 내부에 수용된 유체의 흐름을 유발하는 미세유동장치를 이용한 표적 물질 농축 방법으로서,
    상기 미세유동장치의 시료 챔버 내에서 시료를 원심분리하여, 제1표적 물질을 포함하는 제1유체층과 제2표적 물질을 포함하는 제2유체층을 형성하는 단계;
    상기 제1, 제2유체층을 각각 제1, 제2농축부로 이동시키는 단계;
    상기 제1유체층에 상기 제1표적 물질의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제1미세 입자를 혼합하여 상기 제1표적 물질과 상기 제1미세 입자가 결합된 제1복합체를 형성하고, 상기 제1복합체보다 밀도가 작고 상기 제1유체층보다 밀도가 큰 밀도구배물질을 이용하여 상기 제1복합체를 상기 제1유체층과 분리시키는 단계;
    상기 제2유체층에 상기 제2표적 물질의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 제2미세 입자를 혼합하여 상기 제2표적 물질과 상기 제2미세 입자가 결합된 제2복합체를 형성하고, 상기 제2복합체와 상기 제2유체층과의 밀도차에 의하여 상기 제2복합체를 상기 제2유체층과 분리시키는 단계;
    상기 제1복합체와 상기 제2복합체를 각각 제1, 제2회수 챔버로 이동시키는 단계;를 포함하는 표적 물질 농축 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제1복합체와 상기 제2복합체를 각각 제1, 제2회수 챔버로 이동시키기 전에 상기 제1복합체의 상층물질과 상기 제2복합체의 상층 물질을 각각 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출하는 단계;를 더 포함하는 표적 물질 농축 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1복합체의 상층물질과 상기 제2복합체의 상층 물질을 각각 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출한 후에 제1, 제2세척액을 각각 상기 제1, 제2농축부로 공급하여 상기 제1, 제2복합체를 세척하고, 상기 제1, 제2세척액을 각각 상기 제1, 제2웨이스트 챔버로 배출하는 단계;를 더 포함하는 표적 물질 농축 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 혈액이며,
    상기 제1유체층은 백혈구층이며,
    상기 제2유체층은 혈장층인 표적 물질 농축 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제1표적 물질은 혈중 종양 세포(circulating tumor cell), 암 줄기 세포(cancer stem cell) 또는 암 세포(cancer cell)인 표적 물질 농축 방법.
  20. 제20항에 있어서,
    상기 제2표적 물질은 미세소포체(micro-vesicle), 마이크로RNA(miRNA), DNA, 또는 미세 지질 입자(sub-micron sized lipid particle)인 표적 물질 농축 방법.
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