KR20140065690A - 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 위암관련 치료를 위한 조성물을 개발하기 위하여 위암세포주에 항암활성 검정을 통하여 개발된 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 코프리신 펩타이드 CopA3는 항암 활성을 갖고 있고, 위암 세포주에서 세포 증식 억제 효과가 우수하기 때문에 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용하는데 효과적이다.

Description

코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprising CopA3 peptide as an active ingredient}

본 발명은 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 위암관련 치료를 위한 조성물을 개발하기 위하여 위암세포주에 항암활성 검정을 통하여 개발된 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

위암은 전 세계에서 4번째로 흔한 질병이며 암과 관련된 사망 중 두 번째로 높은 사망률을 보이는 질병이다. 위암은 외부적으로 증상이 크지 않기 때문에 대부분의 환자들에게서 발견되는 시기가 늦어 치료시기를 놓치는 경우가 많다. 현재 위암의 5년 이상의 생존률이 20%로 비교적 낮은 생존률을 보이는 이유도 위와 같은 경우라 할 수 있다. 위암의 치료는 수술이 대부분이지만 재발률이 높고 일부 화학요법을 처방하더라도 이 또한 부작용 발생이 높다고 알려져 있다. 따라서 보다 효과적인 위암 치료 방법이 필요한 실정이다.

곤충은 다양한 환경에서 생존하기 위해서 외부 미생물 및 바이러스의 침입에 효과적으로 대항할 수 있는 생체방어 시스템을 소유하고 있다. 즉, 고등동물이 지닌 후천적 면역인자와는 달리 무척추동물과 같은 세포성 면역과 체액성 면역반응을 포함하는 선천적 면역인자를 분비함으로써 자신을 효과적으로 보호하는 면역체계를 가지고 있다. 곤충의 선천성 면역반응은 세균, 곰팡이, 선충을 포함한 원생동물에 대한 식균 작용, 결절형성과 캡슐형성을 포함하며, 체액성 면역반응에서는 병원체의 침입으로 인해 다양한 종류의 단백질 및 펩타이드가 지방체 및 혈구세포에서 합성되어 혈림프로 분비되는데 이들은 병원체에 대한 강력한 방어인자로 이용된다.

이렇게 선천적 면역을 통해서 분비되는 펩타이드들은 미생물에 대한 내성이 문제시되고 있는 기존 항생제들과는 다른 작용기전과 선택성으로 내성을 유발할 가능성이 적다는 장점을 가지고 있다. 따라서 이들 곤충 유래 펩타이드는 차세대 천연 항생 물질로 이용 가능하므로 암을 비롯한 인간의 질병에 대한 가치뿐만 아니라 각종병원균에 의한 가축 및 농작물의 피해 방지 및 치료제등으로 산업적 응용 가능성이 매우 높다. 또한 펩타이드 합성 절차가 간소화 되고 합성 시간과 단가가 줄어 더 많은 환자들이 효과적으로 치료받을 수 있을 것으로 기대되며 뛰어난 항균 활성과 인체 세포에 대한 안전성으로 임상으로의 적용을 위해 많은 연구가 진행되고 있다. 뿐만 아니라 이러한 펩타이드 공학 기술을 활용하여 항진균제, 항균제, 항암제로서의 사용뿐만 아니라 생리 기능성이 조절된 의약품, 백신, 진단시약으로도 개발이 가능하다.

이에 본 발명자는 곤충 유래 펩타이드의 항암능력에 주목하고 최근 높은 발병률을 보이고 있는 위암에 관한 항암 치료제로서의 가능성에 대해서 연구한 결과 코프리신 CopA3가 위암 세포에 대해서 우수한 항암 활성을 가진 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 코프리신 펩타이드 CopA3(LLCIALRKK: 서열번호 1)를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 코프리신 펩타이드 CopA3는 서열번호 1의 아미노산을 가질 수도 있으며, 서열번호 1의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

코프리신 펩타이드 CopA3의 작용기전으로는 농작물 및 인체 유해균에 대해서 항균활성이 높으며, 특히 내성균에 대해서 항균 효과 높으며, 특히 장내 유용 미생물에는 무해하며 급성 위막성 대장염을 일으키는 균(Clostridium difficile)에 대해서 항생효과 탁월하다.

본 발명의 암질환 치료용 약학적 조성물은 암질환의 종류가 특별히 제한되지는 않지만 바람직하게는 위암 질환 치료를 특징으로 하는 약학적 조성물이다.

또한 본 발명의 암질환 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 펩타이드의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 펩타이드의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 펩타이드를 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

따라서, 본 발명의 코프리신 펩타이드 CopA3는 항암 활성을 갖고 있고, 위암 세포주에서 세포 증식 억제 효과가 우수하기 때문에 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용하는데 효과적이다.

도 1은 코프리신 CopA3 펩타이드 처리에 의한 위암 세포 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 코프리신 CopA3 펩타이드 처리에 의한 위암 세포(SNU 668)의 단편화 현상을 나타낸 것이다. (A: DNA laddering, B: TUNEL assay)
도 3은 코프리신 CopA3 펩타이드 처리에 의한 AIF (apoptosis inducing factor)와 PARP, Endo G (endonuclease G)의 단백질 변화를 나타낸 것이다.
Lane 1 (0 uM), Lane 2 (12.5 uM) Lane 3 (25 uM)
A: AIF 단백질 변화, B: PARP 단백질 변화, C: Endo G 단백질 변화

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

항균 펩타이드의 화학적 합성

실험에 사용된 펩타이드는 AnyGen (Gwang-ju, Korea)사에서 98 ％ 이상의 순도로 합성하였고 0.01 ％ acetic acid에 녹여 사용하였다.

< 실시예 2>

위암세포주 배양 Cell culture 제조

연구에 이용된 인간유래 세포 주는 위암 세포주인 SNU216, SNU484, SNU638, SNU668을 이용하여 실험을 진행하였다. 37 ℃, 5 ％ CO₂ 배양기에서 항생제 (100 units/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin)와 10 ％ fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM에 배양하였으며 배양에 필요한 시약은 Gibco사에서 구입하여 사용하였다.

< 실시예 3>

펩타이드 처리에 따른 세포의 생존력 검증

96-well 배양용기에 2 X 10⁵ cell/㎖ 세포를 100 ㎕씩 분주한 후 펩타이드를 0, 5, 10, 25, 50, 75 uM 농도 의존적으로 24시간동안 처리 하였다. 이후 10 ㎕ CellTiter 96 AQ_ueous One Solution Reagent (MTT) (Promega, USA)를 첨가하고 3 ~ 4시간 반응시켰다. 세포성장의 저해는 multi detecter (Beckman DTX8800)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다.

그 결과 CopA3의 저 농도인 5, 10 uM에서는 4종류의 위암세포 성장 억제 효과가 미미한 것으로 보이나 고농도 (25 uM ~ 75 uM)의 CopA3를 처리한 경우 순차적으로 위암 세포의 성장 억제 효과를 보였다. 특히 SNU638, SNU668 위암세포에서의 세포 증식 억제 효과가 우수하였다.

< 실시예 4>

Genomic DNA 단편화 관찰

12.5, 25, 50 uM의 CopA3를 24 시간 처치 또는 버퍼가 처치된 세포를 얼음위에서 30 분간 100 ㎕ lysis buffer (10 mM Tris-HCl buffer pH 7.4, 10 mM EDTA and 0.5 ％ Triton X-100)와 반응시킨 후 4 ℃에서 15,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 상층액 만을 취하여 50 ㎍/㎖ RNase와 200 ㎍/㎖ proteinase K를 첨가하고 55 ℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 20 ㎕ 5 M NaCl과 120 ㎕ isopropanol을 첨가한 후 - 20 ℃에서 밤새 두었다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 15 분간 원심분리 하고 침전물을 취하기 위해 건조시킨 후 20 ㎕ 3차 증류수에 녹였다. 얻어진 gDNA를 ethidium bromide (EtBr)가 첨가된 2.0 ％ agarose gel에 50 V로 1 시간 전기영동 하였고 UV 투과기 (Core Bio i-MAXTM Gel Image Analysis System)를 통해 CopA3 처치에 따른 genomic DNA의 단편화 양상을 확인하였다.

그 결과 SNU668 위암세포에서는 25 uM CopA3 이상 처리 한 경우에는 DNA의 단편화 현상이 일어난 것을 확인 할 수가 있었다(도 2A).

< 실시예 5>

핵분열 관찰

DeadEnd^TM Fluorometric TUNEL System (Promega, USA)을 이용하여 핵분열을 관찰 하였다. 12.5, 25, 50 uM의 CopA3를 24시간 처치 또는 버퍼가 처치된 세포를 얼음위에서 phosphate-buffered saline (Bio-rad, USA)용액에 들어있는 1 ％ paraformaldehyde를 이용하여 20 분간 고정시켰다. 0.1 ％ Triton X-100으로 15분간 세포의 침투성을 증가시킨 후 상온에서 80 ㎕ Equilibration buffer를 넣어 5분간 안정화시켰다. 녹색 형광물질이 함유된 rTdT incubation buffer (Equilibration Buffer 45 ㎕, Nucleotide Mix 5 ㎕, rTdT Enzyme 1 ㎕)와 함께 37 ℃의 어두운 환경에서 60분간 반응시킨 후 DAPI solution을 이용하여 염색 하였다. 염색된 세포핵을 형광현미경 (Nikon Eclipse E600 Epifluorescence Microscope)으로 관찰하였다.

TUNEL assay 실험 방법을 이용하여 DNA 단편들을 재확인 한 결과 CopA3 농도에 의존하여 DNA 단편화 현상이 증가함을 확인 할 수 있었다(도 2B). 따라서 CopA3는 위암 세포의 Apoptosis를 유발하는 것으로 추정된다.

< 실시예 6>

Apoptosis 관련 단백질 발현여부 확인

25, 50uM CopA3로 24시간 처치 또는 버퍼가 처치된 세포를 20분간 30 ㎕ NP40 buffer (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 % NP-40 or Triton X-100 , 150 mM NaCl, Protease inhibitor cocktail)로 lysis한 후 Protein assay (Bio-rad)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 각각의 세포 추출물을 12 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)하였고 gel에 존재하는 단백질을 250 mA로 2시간 Nitrocellulose membrane (BIO-RAD)에 transfer하였다. 비 특이적인 반응을 없애기 위하여 5 % skim milk 용액으로 막의 불필요한 부분을 차단하였다. 그 후 1차 항체를 밤새 반응하고 여기에 HRP가 결합된 항-rabbit 항체 (Promega, USA), 항-mouse 항체 (Promega, USA)를 2차 항체로 2시간 ~ 3시간 동안 반응하였다. 다음 ECL system (Amersham, USA)으로 발색한 후 FluorChem (Alpha Innotech)를 이용하여 확인하였다.

단백질 발현의 결과를 보면 CopA3에 의해서 세포 성장 억제 효과가 좋았던 위암 세포 SNU638, SNU668에서는 AIF, Endo G의 발현이 처리하지 않은 시료에 비해 높은 것을 확인 할 수 있었다 (도 3A, 3C). 또한 SNU 668의 위암세포에서는 50 uM CopA3를 처리한 시료에서는 대조군과 25 uM로 처리한 시료에 비해 쪼개진 PARP 단백질이 확인 되었다(도 3B). 상기 실험 결과를 토대로 SNU638과 SNU668의 세포에서는 apoptosis가 진행되고 있음을 확인 할 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명의 코프리신 펩타이드 CopA3는 항암 활성을 갖고 있고, 위암 세포주에서 세포 증식 억제 효과가 우수하기 때문에 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer comprising CopA3 peptide as an active ingredient <130> NP12-0043 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> CopA3 <400> 1 Leu Leu Cys Ile Ala Leu Arg Lys Lys 1 5

Claims (7)

1. 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 암 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 코프리신 펩타이드 CopA3는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 암 질환은 위암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제1항의 조성물을 포함하는 의약품.
5. 제4항에 있어서 상기 의약품은 항암제인 것을 특징으로 하는 의약품.
6. 코프리신 펩타이드 CopA3를 유효성분으로 포함하는 세포사멸(apoptosis) 유도용 조성물.
7. 제6항에 있어서 상기 코프리신 펩타이드 CopA3는 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.

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